Q-Fever Şüphesi Olan Hasta Serum ve Kan Örneklerinde Nested-PCR Yöntemiyle
Coxiella burnetii
’nin Saptanması
Detection of Coxiella burnetti by Nested-PCR in Blood and Serum Samples of Q-Fever Suspected Patients
Egemen AKGÜN *, Meral YILMAZ**, Ergün PINARBAŞI***
ÖZET2003 yılının Nisan-Ağustos ayları arasında C.Ü. Araştırma Hastanesi’nde Q-Fever şüphesi ile gözlem altına alınmış hastaların kan ve serum örneklerinde Coxiella burnetii’nin saptanması için Nested-PCR yöntemi kullanıldı. Bunun için C. burnetii genomuna ait 27 kDa büyüklüğünde bir dış membran proteinini kodlayan com-1 genini amplifiye etmek için dizayn edilmiş iki çift nükleotid primerinden yararlanıldı. 15 hastanın kan ve serum örneklerinde com-1 gen fragmenti amplifiye edildi. Nested-PCR yöntemi, son yıllarda bölgemizde sıkça gözlenmeye başlayan C. burnetii’nin direkt olarak tanımlanması için kullanışlı bir yöntem olabilir.
Anahtar kelimeler : Com-1 geni, Coxiella burnetii, Nested-PCR, Q-fever.
SUMMARY
A Nested-PCR method was used for the detection of
Coxiella burnetii in blood and serum samples of the patients who were observed for Q fever suspicion at the Hospital of Cumhuriyet University between April and August 2003. Two pairs of nucleotide primers were used to amplify a 438 bp fragment of the com1 gene encoding a 27-kDa outer membrane protein of C. burnetii. The com-1 gene fragment was amplified from the blood and serum samples of 15 patients. The Nested-PCR can be a useful method for the detection of C. burnetii which has often appeared in our region recently.
Key words Com-1 gene, Coxiella burnetii, Nested-PCR, Q-fever.
C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 28 (2): 50 – 54, 2006
GİRİŞ
Q fever, zoonoz bir hastalık olup, etkeni çevre
etkilerine karşı oldukça dayanıklıdır.
C. burnetii
hücre
içine yerleşen ve Q fever hastalığına neden olan gram
negatif bir bakteridir (1-3). Etken rezervuar olarak başta
keneler olmak üzere arthropodları, çiftlik hayvanlarını,
kedi ve köpekleri kullanmaktadır (1, 2, 4, 5).
C. burnetii
enfeksiyonları akut ve kronik Q fever olmak üzere iki
farklı klinik seyir izler. Akut Q fever genellikle ani ve
yüksek ateş, bitkinlik, ürperme ve baş ağrısı gibi
semptomlarla seyreden grip benzeri bir hastalıktır (1, 6,
7). Kronik Q fever’da ise en sık rastlanılan bulgular
endokarditis ve hepatitis olup bunların yanında vasküler
enfeksiyonlar, osteomyelitis ve uzun süreli ateş de
gözlenebilmektedir (1, 2, 7 - 9).
* Vet. Hek., Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas ** Biyolog, Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas *** Doç. Dr., Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas
Q fever’in rutin tanısı genellikle, çok zaman alan
ve uygulaması zor olan serolojik testlerle yapılmaktadır.
Bu testler arasında en sık kullanılan metot indirect
immunofluorescence (IFA) testidir. Ancak
serolojiktestler retrospektif teşhise imkan verdiklerinden
şimdiki veya daha önce gerçekleşen bir enfeksiyonun
ayrımı kesin olarak yapılamaz. Bunun yanında
enfeksiyonun erken dönemlerinde antikorların kanda
bulunmayışı bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir
(10).
Son dönemlerde PCR (Polimerase Chain
Reaction) yöntemi, klinik örneklerde hastalık
etkenlerinin saptanması için oldukça kullanışlı bir araç
haline gelmiştir (11-14). PCR yöntemi, çok az miktardaki
örneklerde dahi hedef DNA sekansının ortaya
çıkartılabilmesini sağladığından Q-fever enfeksiyonlarının
laboratuar teşhisinde oldukça duyarlı bir metot olarak
karşımıza çıkmaktadır.
Biz bu çalışmamızda OMP1, OMP2, OMP3 ve
OMP4 primerlerini kullanarak hastalık şüphesi ile gözlem
altına alınmış bireylerin kan ve serum örnekleri üzerinde
yaptığımız Nested-PCR analizi sonucunda
C. burnetii
genomuna ait 27 kDa büyüklüğünde, bir dış membran
proteinini kodlayan
com-1
genini amplifiye ettik.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışma Grubu ve Örneklerin Alınması
19 Nisan - 10 Ağustos 2003 tarihleri arasında,
gribal enfeksiyon ve gastro-intestinal sistem bozuklukları
(bulantı, kusma, ishal, vb.) şikayetleri ile C.Ü. Tıp
Fakültesi Uygulama ve Araştırma Hastanesi İntaniye
Kliniğine başvuran toplam 80 hasta, Q-fever şüphesi ile
gözlem altına alınmıştır.
Hastalardan, EDTA’lı steril tüpler içinde 5 ml
venöz kan ve 1 ml serum toplandı. Örnekler çalışma
anına kadar – 85 °C de saklandı.
DNA İzolasyonu
Hastalığın lökopeniyle birlikte seyretmesi ve buna
bağlı olarak DNA izolasyonunda yaşanılabilecek
olumsuzluklardan dolayı venöz kan yanında hasta
serumlarından da yararlanıldı.
Kandan genomik DNA izolasyonu için “yüksek tuz
konsantrasyonu ile DNA izolasyon yöntemi” kullanıldı.
Klinik bulgular arasında yer alan lökopeniye ve
hastaların ilaç kullanımına bağlı olarak 80 hastanın
sadece 58’inde genomik DNA elde edilebildi (Şekil 1).
Şekil 1. Hasta kanlarından “yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA izolasyon yöntemi” ile elde edilen DNA örneklerinin agaroz jel görüntüsü (1,2,3…15 nolu hasta kanlarından elde edilen genomik DNA örnekleri).
Serum örneklerinden genomik DNA izolasyonu
için her bir serum örneğinden 10 μl alınıp 40 μl çalışma
tamponu (%1’lik Nonidet P-40, %1’lik Tween 20, 10
mM Tris-HCl) ile karıştırıldı. Karışım 10 dakika kaynatıldı
ve ardından 12.000 X g de 5 dakika santrifüj edildi.
Süpernatant direkt olarak PCR analizi için kullanıldı. Her
çalışma için yeniden DNA izolasyonu yapıldı (15).
DNA Amplifikasyonu
Hastalık tanısı için Nested-PCR yöntemi
kullanılarak genotipleme yapıldı. Nested-PCR, iki aşamalı
amplifikasyon yöntemidir (16). Bu iki aşamalı
yöntemdeki amaç, kan ve serum örneklerinden elde
edilen bakteri DNA konsantrasyonunun düşük olmasına
bağlı olarak PCR ürünlerinin saptanabilirliğini artırmaktır.
Bunun için de ilk PCR sonucunda elde edilen ürünler
ikinci PCR için kalıp DNA olarak kullanılır. Bu çalışmada
Nested-PCR yöntemi için ilk amplifikasyonda OMP1,
OMP2 ve ikinci amplifikasyonda ise OMP3 ve OMP4
primerleri kullanıldı. Tüm nükleotid primerleri ticari bir
kaynaktan elde edilmiştir (IONTEK). OMP1 (5’-AGT AGA
AGC ATC CCA AGC ATT G-3’), OMP2 (5’-TGC CTG CTA
GCT GTA ACG ATT G-3’),OMP3 (5’-GAA GCG CAA CAA
GAA GAA CAC-3’) ve OMP4 (5’-TTG GAA GTT ATC ACG
CAG TTG-3’) primerleri Nested-PCR analizi için kullanıldı.
Bu primerler, 21
C.burnetii
soyunda da korunmuş
nükleotid sekansına sahip
com-1
geni için dizayn
edilmiştir. Kullanılan primerlerin sekans özgüllüğünü
kontrol etmek için GeneBank veri bankası taranmış,
diğer viral ve bakteriyel organizmaların gen
sekanslarıyla herhangi bir homoloji göstermedikleri
saptanmıştır (10).
İlk amplifikasyon 25μl’lik reaksiyon hacminde
gerçekleştirilmiş olup reaksiyon karışım içeriği; 50 ng
genomik DNA, 10 pmol OMP1 ve OMP2 primerleri, her
bir dNTP’den (deoksiribonüklotidtrifosfat) 5nmol
(fermentase), 1 ünite Taq DNA polimeraz (fermentase),
10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl ve 1,5 mM MgCl
2olacak şekilde dizayn edildi. Birinci tur PCR reaksiyonu
için program, 94 °C’de 1 dk, 58 °C’de 1 dk, 72 °C’de 1
dk olarak uygulandı ve 36 döngüde istenilen ürün
amplifiye edildi. İkinci tur PCR reaksiyonu için ilk PCR
reaksiyonundan elde edilen üründen 5 μl alınarak
reksiyon karışımı hazırlandı ve 94 °C’de 30 sn, 58 °C’de
30 sn ve 72 °C’de 1 dk olacak şekilde PCR programı
uygulanarak
com-1
gen fragmenti amplifiye edildi.
Amplifiye edilmiş PCR ürünlerinin her birinden 10
μl alınıp, ethidium bromide (0.5 μg/ml) ile boyanmış
%1’lik agaroz jele yüklenmiştir. Daha sonra agaroz jel
elektroforezi gerçekleştirilmiş ve jel, UV ışığı altında
incelenip fotoğraflanmıştır.
BULGULAR
Hasta serum ve kanlarından elde edilen DNA
örneklerinde OMP-1 ve OMP-2 primerleri kullanılarak
yapılan birinci tur PCR analizi sonucunda 501 bç (baz
çifti), OMP-3 ve OMP-4 primerleri kullanılarak yapılan
ikinci tur PCR (Nested-PCR ) analizi sonucunda ise 438
bç uzunluğunda bir fragment elde edilmiştir. Kan ve
serum örneklerinden PCR ürünü elde edilen hastalar
Q-fever (+) olarak değerlendirilmiştir.
Biz çalışmamızda Q-fever şüphesi ile müşahede
altına alınan 80 hastanın 15’inde (%18,75) Q-fever (+)
sonucuna ulaştık (Şekil 2)
Şekil 2. Q-fever (+) hastalarının OMP-3 ve OMP-4 primerleri kullanılarak elde edilmiş Nested-PCR ürünleri: M:Gene RulerTM DNA Ladder Mix (100 bp), 1: kan örneği, 2: serum örneği, N: negatif kontrol. Amplifikasyon ürünlerinin her birinden 10 μl alınıp, ethidium bromide (0.5 μg/ml) ile boyanmış %1’lik agaroz jele yüklenmiştir. Soldaki numaralar baz çifti sayısını göstermektedir.
Not: 1. tur PCR sonucu OMP-1 ve OMP-2 primerlerine ait PCR ürünleri jelde gözlenemediğinden jele yüklenmemiştir.
Çalışmada, Japonya Gifu Üniversitesi, veteriner
fakültesi, mikrobiyoloji bölümünden sağlanan
C. burnetii
Nine Mile soyuna ait bakteri genomu pozitif kontrol
olarak kullanılmıştır.
TARIŞMA
Coxiella burnetii
hücre içine yerleşen gram (-)
bir bakteridir. Yüksek enfeksiyon yeteneği ve çevre
şartlarına direnci nedeniyle,
C. burnetii
’nin biyolojik silah
olarak kullanılabileceği düşünülmektedir (10). Dünya
genelinde birçok salgın rapor edilmiştir. Endemilerin
çoğu direkt veya indirekt olarak çiftlikler ve çiftlik
hayvanları ile ilişkilendirilmiştir ancak şehir endemileri
de tanımlanmıştır (17–23). Bununla birlikte son iki yıl
içinde ülkemizde bu hastalığın semptomlarına benzer
semptomlar taşıyan vakalarda gözlenen ani artış
oldukça kaygı vericidir. Bakterinin insana transferinde
özellikle enfekte olmuş çiftlik hayvanları dikkati
çekmektedir. Hastalıkla ilgili olarak hayvanlarda, nadir
oranlarda görülen düşükler ve üreme ile ilgili diğer
problemlerin dışında herhangi bir klinik bulgu rapor
edilmemiştir (24). Buna karşın hastalık, insanlarda
endokarditis ve hepatitis gibi çok ciddi bulgularla
karşımıza çıkmaktadır. Bununla birlikte akut ve kronik
Q-fever antibiyotik tedavisine cevap veren hastalıklardır.
C. burnetii
’nin klinik örneklerden hızla tanımlanması,
antibiyotik tedavisine hızla başlanmasına olanak
vereceğinden hastalığa yakalanan bireylerde tedavinin
daha sağlıklı olmasına olanak verecektir (10, 25).
C. burnetii
’nin hastalardan izolasyonu zaman
alıcı, oldukça zor ve tehlikelidir. Bunun yanında kültür
ortamında farklı
C. burnetii
soyları farklı büyüme
koşulları göstermektedir (26).
C. burnetii
’nin rutin
teşhisi, indirect immunofluorescence testi (IF) (27-29),
komplemen fiksasyon testi (30-32), ELISA (33-35)
testlerini de içeren serolojik testlerle
gerçekleştirilmektedir. Ancak hastalık etkeninin kandan
çekilmesinden yıllar sonra dahi kanda bulunabilen
antikorların varlığı nedeniyle şimdiki veya daha önce
geçirilen bir hastalığın ayrımının yapılamaması ve bazen
de hastalığın erken dönemlerinde antikorların
belirlenememesi gibi nedenler bu testlere bazı
sınırlamalar getirmektedir. Bu durum PCR yönteminin
avantajlarını açıkça göstermektedir.
KAYNAKLAR
1. Maurin M, Raoult D: Q fever. Clin Microbiol Rev, 1999; 12: 518–53
2. Marrie TJ: Coxiella burnetii (Q fever). In: Mandell GL, Douglas RG, Bennett JE eds: Principles and practice of infectious diseases. New York, Churchill Livingstone, 2000; 2043-48
3. Raoult D, Marrie TJ: Q fever. Clin Infect Dis, 1995; 20: 489–96
4. Fournier PE, Marrie TJ, Raoult D: Diagnosis of Q fever. J Clin Microbiol, 1998; 36: 1823–24
5. Welsh HH, Lennette EH, Abinanti FR, Winn JF: Air-borne transmission of Q fever: the role of parturifi cation in the generation of infective aerosols. Ann NY Acad Sci, 1958; 70: 528–40
6. Tissot-Dupont H, Raoult D, Brouqui P et al: Epidemiologic features and clinical presentation of acute Q fever in hospitalized cases: 323 French cases. Am J Med, 1992; 93: 427–34
7. Raoult D, Tissot-Dupont H, Foucault C et al: Q fever 1985-1998. Clinical and epidemiologic features of 1,383 infections. Medicine, 2000; 79: 109–23
8. Brouqui P, Tissot-Dupont H, Drancourt M et al: Chronic Q fever: ninety- two cases from France, including 27 cases without endocarditis. Arch Intern Med, 1993; 153: 642–48 9. Weir, W. R. C., B. Bannister, S. Chambres, K. D. Coke, and H. Mistry. Chronic Q fever associated with granulomatous hepatitis. J. Infect. 1984;8:56–60
10. Zhang, G. Q., S. V. Nguyen, T. Ho, M. Ogawa, A. Hotta, T. Yamaguchi, H. J. Kim, H. Fukushi, And K. Hirai. Clinical evaluation of a new PCR assay for detection of Coxiella burnetii in human serum samples. J. Clin. Microbiol. 1998;36:77-80
11. Stein, A., and D. Raoult. Detection of Coxiella burnetii by DNA amplification using polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1992;30:2462–66.
12. Willems, H., D. Thiele, R. Frolich-Ritter, and H. Krauss. Detection of Coxiella burnetii in cow’s milk using the polymerase chain reaction (PCR). Zentralbl. Veterinaermed. B 1994;41:580–87.
13. Willems, H., D. Thiele, and H. Krauss. Plasmid based differentiation and detection of Coxiella burnetii in clinical samples. Eur. J. Epidemiol.1993; 9:411–18.
14. Yuasa, Y., K. Yoshiie, T. Takasaki, H. Yoshida, and H. Oda. Retrospective survey of chronic Q fever in Japan by using PCR to detect Coxiella burnetii DNA in paraffin-embedded clinical samples. J. Clin. Microbiol. 1996;34:824–87.
15. Ho, T., N. Kako, G. Q. Zhang, H. Otsuka, M. Ogawa, O. Ochiai, Sa V. Nguyen, T. Yamaguchi, H. Fukushi, N. Nagaoka, M. Akiyama, K. Amano, and K. Hirai. Q fever pneumonia in children in Japan. J. Clin. Microbiol. 1996;34:647–51.
16. Persing D. H. In vitro nucleic acid amplification techniques. In: Persing D. H., Smith T. F., Tenover F. C., White T. J. Diagnostic Molecular Microbiology, Washington DC. 1993;51-87,
17. Salmon M, Howells B, Glencross E, Evans A, Palmer S. Q fever in an urban area. Lancet. 1982;1:1002–4.
18. Hawker JI, Ayres JG, Blair I, Evans MR, Smith DL, Smith EG, et al. A large outbreak of Q fever in the West Midlands: windborne spread into a metropolitan area? Commun Dis Public Health. 1998;1:180–7.
19. Suputtamongkol Y, Rolain JM, Losuwanaruk K, Niwatayakul K, Suttinont C, Chierakul W, Pimda K, Raoult D. Q fever in Thailand. Emerg Infect Dis. 2003 Sep;9(9):1186-7
20. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/00000362 .htm
21. http://wonder.cdc.gov/wonder/prevguid/m0045670/m004 5670.asp
22. Tissot-Dupont H, Amadei MA, Nezri M, Raoult D. Wind in November, Q fever in December. Emerg Infect Dis 2004; 10(7):1264–9
23. Hugo C. van Woerden, Brendan W. Mason, Lika K. Nehaul, Robert Smith, Roland L. Salmon, Brendan Healy, Manoj Valappil, Diana Westmoreland, Sarah de Martin, Meirion R. Evans, Graham Lloyd, Marysia Hamilton-Kirkwood, and Nina S. Williams. Q Fever Outbreak in Industrial Setting. Emerg Infect Dis 2004; 10(7):1282–9 24. Lorenz H., Jager C., Willems H. and Baljer G. PCR
detection of Coxiella burnetii from different clinical specimens, especially bovine milk, on the basis of DNA preparation with a slica matrix. Applied and Environmental Microbiology.1988; 64(11):4234–7.
25. Zhang G.Q., Hotta A., Mizutani M., Ho T., Yamaguchi T., Fukushi HPer. and Hirai K. Direct identification of Coxiella burnetii plasmids in human sera by nested PCR. J. Clin. Microbiology. 1998;36(8):2210-3,
26. Stein,A., and D. Raoult. Phenotypic and genotypic heterogeneity of 8 new human Coxiella bumetii isolates. ActaVirol. (Prague)1992;36:7-12.
27. Dupuis, G., O. Peter, M. Peacock, W. Burgdorfer, and E. Haller. Immunoglobulin responses in acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 22:484–7.
28. Guigno, D., B. Coupland, E. G. Smith, I. D. Farrell, U. Desselberger, and E. O. Caul. 1992. Primary humoral antibody response to Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever. J. Clin. Microbiol. 1985;30:1958–67. 29. Nagaoka, H., M. Akiyama, M. Sugieda, T. Nishio, S.
Akahane, H. Hattori, T. Ho, H. Fukushi, and K. Hirai. Isolation of Coxiella burnetii from children with influenza-like symptoms in Japan. Microbiol. Immunol. 1996;40:147–51.
30. Field, P. R., J. G. Hunt, and A. M. Murphy. Detection and persistence of specific IgM antibody to Coxiella burnetii by enzyme-linked immunosorbent assay: a comparison with immunofluorescence and complement fixation tests. J. Infect. Dis. 1983;148:477–87.
31. Peter, O., G. Dupuis, W. Burgdorfer, and M. Peacock. Evaluation of the complement fixation and indirect immunofluorescence tests in the early diagnosis of primary Q fever. Eur. J. Clin. Microbiol. 1985;4:394–6. 32. Peter, O., G. Dupuis, M. G. Peacock, and W. Burgdorfer.
Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and complement fixation and indirect fluorescent-antibody tests for detection of Coxiella burnetii antibody. J. Clin. Microbiol. 1987;25:1063–7.
33. Peter, O., G. Dupuis, D. Bee, R. Luthy, J. Nicolet, and W. Burgdorfer. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of chronic Q fever. J. Clin. Microbiol. 1988;26:1978–82.
34. Schmeer, N. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the demonstration of IgG1, IgG2, and IgM antibodies in bovine Q fever infection. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infectionskr. Hyg. Abt. 1. Orig. 1985;259: 20–34.
35. Schmeer, N., H. P. Muller, W. Baumgartner, J. Wieda, and H. Krauss. Enzyme-linked immunosorbent fluorescence assay and high-pressure liquid chromatography for analysis of humoral immune responses to Coxiella burnetii proteins. J. Clin. Microbiol. 1988;26:2520–5.
Yazışma Adresi : Doç. Dr. Ergün PINARBAŞI
Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas
epinar@cumhuriyet.edu.tr
