T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2010/116
Farklı Ortamlardan İzole Edilen Mikroorganizmalar Kullanılarak Pinus sylvester, Carpinus
betulus ve Populus canadensis Ağaçlarının Talaşlarından Etil Alkol Üretimi
Proje Yöneticisi
Yrd. Doç. Dr. İsa Karaman
Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi
Araştırmacılar ve Birimleri
Merve Dilmaç
(Ağustos-2011)
TEġEKKÜR
Tüm dünyada insanların yaĢam tarzları ve ekonomik süreçlerinde büyük bir öneme sahip olan fakat ekosistem üzerinde oldukça tehlikeli yan etkiler bırakan fosil yakıtlarını kabul etmekle beraber global ekonominin çevre üzerinde daha az olumsuz etkisi olabilecek alternatif yakıtların geliĢtirilmesi konusunda çaba sarfetmesi gerektiği görülmektedir. Bu hassas konuya yönlenmenin bir yolu alternatif ve yenilenebilir bir enerji kaynağı olarak biyoatıkların ve biyokütlelerin değerlendirilmesidir. Bitki hücrelerinin morfolojik yapı elemanlarından olan, selüloz, hemiselüloz ve lignoselülozik maddeler gibi yapılar biyoürün geliĢimi için atıkları önemli bir hale getirir ve biyoteknolojik iĢlemler sayesinde doğal çevrenin korunmasına yardım etmede bir fırsat sunduğu görülmektedir.
Maddi manevi her türlü çalıĢma imkanını sunan, bu projeye çalıĢma fikri veren ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Ġsa Karaman‟a içten teĢekkürlerimi sunarım. Ayrıca bu çalıĢmada kullanılan biyokütle teminini sağlayan Tokat sanayi esnaflarına, kimyasal malzeme temini sağlayan Turhal mermer‟e, laboratuvar malzemelerini kullanmama izin veren ve yardımlarını esirgemeyen Kimya Bölümü hocaları, ArĢ. Gör. Hayrettin Gezegen, Uzm. Hüseyin AkĢit ve Uzm. Özkan
ġen‟e, çalıĢmamda emeğini esirgemeyen Y. Lisans Öğr. Mine Farımaz ve diğer arkadaĢlarıma teĢekkür ederim.
Merve DĠLMAÇ 2011 ĠÇĠNDEKĠLER
Sayfa
ÖZET ... i ABSTRACT ... .ii TEŞEKKÜR ... iii ĠÇĠNDEKĠLER ... iv SĠMGE VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ ... vi ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... viii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... xi 1. GİRİŞ ... 1 2. LĠTERATÜR ÖZETLERĠ ... 10 3. MATERYAL VE METOD ... 15 3.1. Materyal ... 15 3.1.1. Biyokütle ... 15 3.1.2. Kullanılan Besiyerleri ... 15
3.1.2.1. Bakteriler Ġçin Genel Besi Ortamı ... 15
3.1.2.2. Mayalar için Genel Besi Ortamı ... 16
3.1.3. Mikroorganizmaların Ġzolasyonu ... 17
3.1.4. Mikroorganizmaların Yağ Asidi Metil Esterlerinin SaflaĢtırılmasında Kullanılan Çözeltiler ... 22
3.2. Metod ... 25
3.2.1. Mikroorganizmaların Seçimi ... 25
3.2.2. Biyoetanol Üretiminde Kullanılacak Hammaddeler ... 26
3.2.3. Kültür Ortamının Hazırlanması ... 26
3.2.3.1. Bakteriler için genel besi ortamının hazırlanması ... 26
3.2.3.3. Müller Hinton Besi Yerinin Hazırlanması ... 27
3.2.3.4. Brain Heart Infusion Agar Besi Yerinin hazırlanması ... 27
3.2.3.5. Mayalar Ġçin Genel Besi Ortamının Hazırlanması ... 27
3.2.3.5.1. Yeast Pepton Glukoz Agar ... 27
3.2.3.5.2. Yeast Pepton Dekstroz Agar ... 28
3.2.3.5.3. Yeast Pepton Mannitol Agar... 28
3.2.3.6. Fermantasyon Ortamının Hazırlanması ... 28
3.2.4. Sakkarafikasyon ... 28
3.2.5. Nötralizasyon ... 30
3.2.6. Antron Testi ... 32
3.2.7. Dietil Eter Muamelesi ... 32
3.2.8. Fermantasyon ... 33
3.2.9. Biyoetanolün Verimlilik Testi ... 34
3.2.10. Fraksiyonel Destilasyon Prosesi ... 34
3.2.11. Kromik Asit Testi ... 36
3.2.12. Ġzole Edilen Mikroorganizmaların Morfolojik ve Biyokimyasal Testleri ... 37
3.2.12.1. Katalaz Testi ... 37
3.2.12.2. Gram Reaksiyon Testi ... 37
3.2.12.3. Oksidaz Testi ... 38
3.2.13. Mikroorganizmaların Yağ asidi Analizi ... 38
4. BULGULAR ... 40
Sayfa 4.1. Etanol Üretiminde Kullanılan Mikroorganizmalar ... 40
4.2. Anaerobik Ortamda Biyoetanol Üretimi ... 42
4.3. Aerobik Ortamda Biyoetanol Üretimi ... 45
5. SONUÇ ve TARTIġMA ... 52
KAYNAKLAR ... 56
EKLER ... 59
SĠMGE VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ Simgeler Açıklama μg mikrogram 0 C santigrad dk dakika h saat atm atmosfer w/v ağırlık/hacim ml mililitre M molar kg kilogram g/L gram/Litre mg/Litre miligram/Litre
Kısaltmalar Açıklama
ddH2O Double distile su
CaCO3 Kalsiyum karbonat
H2SO4 Sülfürik asit
Na2Cr2O7 Sodyum dikromat
K2Cr2O7 Potasyum dikromat
TCA Trikarboksilik asit CO2 Karbondioksit
H2 Hidrojen
C5H8O4 Ksilan
H2O2 Hidrojen peroksit
KOH Potasyum hidroksit NaOH Sodyum hidroksit YPM Yeast pepton mannitol YPG Yeast pepton glukoz YPD Yeast pepton dekstroz ATP Adenozin trifosfat TSA Triptik soy agar FTS Fizyolojik Tuzlu Su GC Gaz Kromotografisi
NMR Nükleer Manyetik Rezonans HMF Hidroksi metil furfural
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
Sayfa
ġekil 1.1. Saccharomyces cerevisiae ... 8
ġekil 3.1. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan iri siyah üzüm (öküz gözü) örneği ... 18
ġekil 3.2. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taĢ kara) örneği ... 18
ġekil 3.3. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taĢ kara) örneği genel görüntüsü ... 19
ġekil 3.4. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (güzel üzüm) örneği ... 19
ġekil 3.5. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (misket) örneği ... 20
ġekil 3.6 Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (narenciye) örneği ... 20
ġekil 3.7. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan siyah üzüm (kömüĢ ciciği) örneği ... 21
ġekil 3.8. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (kadın parmağı) örneği ... 21
ġekil 3.9. Yağ asidi analizinde kullanılan çözeltiler ... 23
ġekil 3.10. Yağ asidi analizinde çalkalayıcının kullanılması ... 23
ġekil 3.11. Çalkalama sonrası tüplerde oluĢan faz ... 24
ġekil 3.13. Steril kabinde mikroorganizma inokülasyonu ... 25
ġekil 3.14. Biyokütlenin sakkarafikasyon aĢaması ... 29
ġekil 3.15. Nötralizasyon iĢlemi ... 30
ġekil 3.16. Nötralizasyon iĢleminde CaCO3 ilavesi ... 31
ġekil 3.17. Vakumlama ... 31
ġekil 3.18. Dietil eter muamelesi ... 32
ġekil 3.19. Fermantasyon ... 34
ġekil 3.20. Fraksiyonel Destilasyon ... 35
ġekil 3.21. Kromik asit testi36 ġekil 3.22. Kromik asit testi sonucu etil alkol varlığı ... 36
ġekil 4.1. Kullanılan Mikroorganizmalar ... 40
ġekil 4.2. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD-3 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 43
ġekil 4.3. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD-77 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 43
ġekil 4.4. Aerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaĢı için kromik asit testi ... 46
ġekil 4.5. Aerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaĢı için kromik asit testi ... 46
ġekil 4.6. Aerobik ortamda Populus canadensis (kavak) talaĢı için kromik asit testi .... 47
ġekil 4.7. Aerobik ortamda Pinus sylvester (çam) talaĢı için kromik asit testi ... 47
ġekil 4.8. Aerobik ortamda etil alkol üretimi ... 49
ġekil 1.1. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD-22 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 60
ġekil 1.2. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 42 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 60
Sayfa ġekil 1.3. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 25 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 61
ġekil 1.4. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 27 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 61
ġekil 1.5. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 57 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 62
ġekil 1.6. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 55 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 62
ġekil 1.7. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 44 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 63
ġekil 1.8. Carpinus betulus (Gürgen) talaĢı için MD- 70 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 63
ġekil 1.9. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-3 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 64
ġekil 1.10. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-77 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 64
ġekil 1.11. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD- 77 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucunda ortaya çıkan yan ürünler .. 65
ġekil 1.12. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-22 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 65 ġekil 1.13. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-42 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 66 ġekil 1.14. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-25 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 66 ġekil 1.15. Populus canedensis (Kavak) talaĢı için MD-27 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 67 ġekil 1.16. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-57 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 67 ġekil 1.17. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD- 55 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu68
ġekil 1.18. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD-44 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 68 ġekil 1.19. Populus canadensis (Kavak) talaĢı için MD- 70 mikroorganizması
kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 69 ġekil 1.20. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-3 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 69 ġekil 1.21. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-77 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 70 ġekil 1.22. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-22 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 70 ġekil 1.23. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-42 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 71 ġekil 1.24. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-25 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 71 ġekil 1.25. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-27 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 72 Sayfa ġekil 1.26. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-57 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 72 ġekil 1.27. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-55 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 73 ġekil 1.28. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-44 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 73 ġekil 1.29. Pinus sylvester (Çam) talaĢı için MD-70 mikroorganizması kullanılarak etanol üretiminin NMR sonucu ... 74
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Sayfa Çizelge 1.1. Ülkelere / Bölgelere Göre Etanol Üretimi (2005) ... 9 Çizelge 4.1. Kullanılan mikroorganizmaların suĢ kodları ve tür adları ... 41 Çizelge 4.2. Anaerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaĢı için etil alkol üretim
sonuçları ... 44 Çizelge 4.3. Anaerobik ortamda Populus canadensis (kavak) talaĢı için etil alkol üretim
sonuçları ... 44 Çizelge 4.4. Anaerobik ortamda Pinus sylvester (çam) talaĢı için etil alkol üretim
sonuçları ... 45 Çizelge 4.5. Aerobik ortamda Carpinus betulus (gürgen) talaĢı için etil alkol üretim
sonuçları ... 48 Çizelge 4.6. Aerobik ortamda Populus canadensis (kavak) talaĢı için etil alkol üretim
sonuçları ... 48 Çizelge 4.7. Aerobik ortamda Pinus sylvester (çam) talaĢı için etil alkol üretim
sonuçları ... 49 Çizelge 4.8. TeĢhisi yapılan mikroorganizmaların biyokimyasal, morfolojik ve
ÖZET(*)
FARKLI ORTAMLARDAN ĠZOLE EDĠLEN MĠKROORGANĠZMALAR KULLANILARAK Pinus sylvester, Carpinus betulus ve Populus canadensis
AĞAÇLARININ TALAġLARINDAN ETĠL ALKOL ÜRETĠMĠ
Kullanılan fosil yakıtların ekosisteme verdikleri zarar doğrudan veya dolaylı olarak tüm canlılığı etkilemektedir. Bilim insanları ve insanlık artık çevre dostu yakıtların kullanılma zamanının bir zorunluluk olduğunu vurgulamaktadır. Etanol bu çevre dostu yakıtlardan birini temsil etmektedir. Biyoetanol üretiminde kullanılan substratlar oldukça fazla çeĢitlilik göstermektedir. Bu çalıĢmada kullanılan substratlardan sadece 3 bitkiye ait talaĢ örnekleri tercih edilmiĢtir. Fosil yakıtlarla kıyaslandığında bu örnekler oldukça düĢük maliyetlidir. Biliyoruz ki biyoetanol benzinli motorlu araçlarda % 30- 35‟lere varan düzeyde yakıta katılarak kullanılabilmektedir. ÇalıĢmanın neticesinde biyoetanol üretiminde oldukça verimli olan suĢlar belirlenerek bundan sonraki çalıĢmalarda insanlara ıĢık tutması ve bu mikroorganizmalar üzerine dikkat çekilmesi hedeflenmektedir. Tokat Ġli, Zile Ġlçesi‟nde yetiĢen üzüm bağlarından toplanan üzüm meyvelerinin yüzeyleri FTS ile yıkanıp örnekler alınarak mikrobiyal izolasyonlar yapılmıĢtır. Ġzolasyonlar neticesinde ortaya çıkan mikrobiyal çeĢitlilik içerisinden bu çalıĢma için mikroorganizmalar tercih edilmiĢtir. Bu iĢlemlerin neticesinde bu bölgede yetiĢen üzüm meyveleri üzerinde simbiyotik olarak yaĢayan mikroorganizma izolatları belirlenmiĢtir. Deneylerde kullanılmak üzere elde edilen hedef suĢlar biyokimyasal ve morfolojik testlerle genus bazında identifikasyonları yapılmıĢ ve biyoetanol eldesinde yapılacak olan testlerde kullanılmak üzere saflaĢtırılarak stok kültüre alınmıĢtır. Biyoetanol elde etme sürecinde en verimli olan mikroorganizma suĢları tespit edilmiĢtir. Anaerobik ortamda, Carpinus betulus (gürgen) talaĢı için MD-77 mikroorganizması ile yapılan denemede etanol üretiminin gerçekleĢmediği, MD-3, MD-22, MD-42, MD-25, MD-27, MD-57, MD-55, MD-44 ve MD-70 ile yapılan denemelerde ise etanol
üretiminin gerçekleĢtiği görülmüĢtür. Populus canadensis (kavak) talaĢı için MD-77 mikroorganizması ile yapılan denemede etanol üretiminin oldukça az olduğu, diğer mikroorganizmalarda ise etanol üretimi oldukça fazla olduğu görülmüĢtür. Pinus
sylvester (çam) talaĢı için, MD-3 mikroorganizması ile yapılan denemede etanol varlığı
tespit edilememiĢ, MD-55 mikroorganizması ile yapılan denemede ise etanol üretiminde olumlu bir sonuca ulaĢılmıĢtır. Ancak diğer mikroorganizmalarla gerçekleĢtirilen fermantasyon sonuçlarında etanol üretiminin çok az olduğu NMR sonuçları ile ortaya konulmuĢtur. Aerobik ortamda ise, 3 ayrı talaĢ örneği (Carpinus betulus, Populus
canadensis ve Pinus sylvester) ile hazırlanan mediumların inkübasyonu sonucu etil
alkol üretip üretmediğini kontrol etmek için kromik asit testi uygulanmıĢtır. Carpinus
betulus (gürgen) talaĢı için aerobik ortamda MD-48, MD- 47, MD-23, MD-35, MD-76,
MD-33, MD-4, MD-70b ve MD-52 kodlu suĢlar, Populus canadensis (kavak) talaĢı için aerobik ortamda, MD-52 kodlu suĢu ve Pinus sylvester (çam) talaĢı için aerobik ortamda, MD-33, MD-76, MD-70b, MD-4 ve MD-52 kodlu suĢlar pozitif sonuçlar verdiği tespit edilmiĢtir.
2011, xi + 77 sayfa
Anahtar kelimeler: Biyokütle, Etil alkol, Mikroorganizma, Sakkarafikasyon, Fermantasyon
ABSTRACT
ETHANOL PRODUCTION FROM WOOD CHIPS OF Pinus sylvester, Carpinus betulus and Populus canadensis TREES USING MICROORGANISMS
ISOLATED FROM DIFFERENT SAMPLES.
The damage given to ecosystem by used fossil fuels effects all living beings. Scientists and humanity emphasize the necessity of using of friendly fuels for environment. Ethanol is one of those friendly fuels. Substrates used in bioethanol production vary. In this project, only three sawdust samples from used substrates were choosed. These samples are so inexpensive when they are compared with fossil fuels. As we know , bioethanol can be used in 30-35% ratio in vehicles by petroleum. In the result of this study, strains that are highly productive in bioethaanol production were determined. In the next studies, it is aimed that this study could light the way for human and take attention upon these microorganisms. Grape samples were collected from grape orchards in Tokat, Zile and they were washed with FTS and then microbial isolations were made from samples. In the result of microbial isolations, microorganisms were choosed for study. In the results of the proseses, simbiotic microorganism strains which live upon the grapes were choosed. Biochemical and morphological tests, identifications were made from collected strains for using in the experiments and then were prepared cultures. The most productive mikroorganism strains were determined. In anaerobic fermantation, for Carpinus betulus sawdust, bioethanol production didn‟t take place for MD-77 strain and was taken place for MD-3, MD-22, MD-42, MD-25, MD-27, MD-57, MD-55, MD-44, MD-70 strains. Also, for Populus canadensis sawdust, bioethanol
production was seen in low level for MD-77 strain and in the others were seen high level. For Pinus sylvester sawdust, bioethanol wasn‟t obtained for MD-3 but for MD-55 strain. However, bioethanol production in the fermantation results occured by the other microorganisms was observed to be little by the NMR results. Also, in aerobic medium, cromic acid test was applied to control whether in media prepared by 3 different sawdust samples ethyl alcohol is produced or not. For Carpinus betulus with the help of MD-48, MD-47, MD-23, MD-35, MD-76, MD-33, MD-4, MD-70b and MD-52 strains, for Populus canadensis with the help of MD-52 strain and for Pinus sylvester sawdust with the help of MD-33, MD-76, MD-70b, MD-4, MD-52 strains were determined giving the positive results.
2011, xi + 77 pages
Key words: Biomass, Ethanol, Mikroorganism, Saccarafication, Fermantation
1. GĠRĠġ
Ekonomistlere göre, dünya çapındaki gerilemenin ana sebebi enerji üretiminin oldukça pahalı olması ve bu durumun ancak enerji tasarrufu ve alternatif yakıt üretiminde yeni teknolojilerin kullanılmasıyla dengeleneceğidir. Kaçınılmaz olarak fosil yakıt üretimi yerine, “biyokütle” fikri olabilirlik sınırları içinde, oldukça popüler olmuĢtur. Biyokütle enerji problemine kısmı bir çözüm sağladığı düĢünülmektedir. Bu kısmi çözüm içerisinde, alıĢılagelmiĢ otomotiv yakıtı yerine geçecek alkol ve diğer uçucu bileĢiklerin üretiminde, “biyokütle Ģeker içeriğinin fermantasyonu” izlenecek yollardan birisi olarak görülmektedir. Bazı bitkisel atıklar ya da biyokütle atık olarak görünse de aslında bunların içerdikleri karbonhidratlar bakımından oldukça zengin oldukları bilinmektedir. Endüstriyel iĢletmelerde özellikle Ģeker fabrikalarında atık olarak nitelendirilen melas bugün biyoetanol üretiminde birinci sırayı almıĢtır. Petrol ve kömürün büyük tüketimleri yüzünden atmosferdeki CO2 birimi küresel ısınma ve iklim değiĢiminin
Bu yüzden etanol, metan ve hidrojen gibi alternatif enerji kaynakları araĢtırılmaktadır. Petrol yerine biyoetanol kullanımı araçların CO2 salınımını %90 azaltabilir (Ward ve
Singh, 2002).
GeniĢ çapta üretilen endüstriyel alkolün yakıt olarak kullanılabilmesi yanında; günümüzde alkolün teknikte yaygın bir kullanım alanı vardır. Eritken madde olarak birçok maddelerin hazırlanmasında, suni ipek yapımında, renk maddelerinin yapılmasında, sirke yapımında, kimyasal birçok ecza ve kimyasal maddelerin hazırlanmasında, parfümeride, nitrosellüloz ve patlayıcı maddelerin yapılmasında, konservecilikte ve içki yapımında kullanılmaktadır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Günümüzde alkol üretimi büyük ölçüde fermantasyona dayanmaktadır. Fermantasyonda kullanılacak karbon kaynağının ucuz olması, biyolojik yapısı ve kimyasal bileĢiminin kullanılan rnikroorganizmaların fizyolojik gereksinimlerine cevap verebilmesi
gerekmektedir. Selülozik atıklar, bugün dünya üzerinde biyokütlenin en çok kullanılan formudur. Ama bu atıkların enerji içeriklerini, direk yanma ile düzenlemek çok daha ekonomiktir. Yararlanılabilir Ģekerin doğal selülozdan çıkarılması için kullanılan, geliĢmekte olan bu yöntemlerin problemi dünya çapında kabul görmemektir. Bugün fermantasyon endüstrisinde en gerçekçi substratlar, Ģeker deposu olan enerji ürünleri veya hidrolize polisakkaritlerdir. Bu substratlar, biyokütle dönüĢümü için özel olarak yetiĢtirilmiĢ olabilecekleri gibi, gıda üretimi sırasında açığa çıkmıĢ atıklar veya bozulmuĢ ürünler de olabilirler. Bu tür hammadde, güneĢ ıĢığının bol bulunduğu ve iĢgücünün ucuz olduğu geliĢmekte olan ülkelerde bulunmaktadır. Fermantasyonda kullanılan substratlara örnek olarak; hububat sap ve samanları ile hububat kepekleri, Ģeker melası ve küspesi, meyve-sebze artıkları, peynir altı suyu, niĢasta artıkları veya yan ürünleri ile üretim fazlası meyve ve sebzeler verilebilir. ġeker kamıĢı, mısır niĢastası gibi tahıl kaynaklı substratlardan etanol üretimi iyi geliĢmiĢ bir teknolojidir (Çelebi ve Güngör, 1997).
Ülkemiz, tarımsal ve gıda prosesi artıkları, tüketimi az olan hammaddelerin değerlendirilmeleri, fermantasyonda yararlanılmaları açısından çok etkileyici ve çekici imkanlar sergilese bile; değerlendirilmeyen veya kısmen değerlendirilen çok miktarda artık bulunmaktadır.
Çoğu bitki materyalinin kuru ağırlığının yaklaĢık %90‟ı selüloz, hemiselüloz, pektin ve lignin oluĢumunda depolanır. Atık materyallerden selüloz ve hemiselülozun Ģekere dönüĢümü yakıt etanolü için bir hammadde sağlar ve somut olarak atıkların miktarını azaltır (Iranmahboob ve ark., 2002).
Atıkların değerlendirilmesiyle ilgili olarak birçok çalıĢma yapılmaktadır. Özellikle etil alkol üretimi, son zamanlarda önem kazanmakta birçok sanayi atığı, Ģehir kanalizasyon atığı ve diğer katı atıkları hammadde olarak kullanıp, etil alkol üretilmeye çalıĢılmıĢtır. Bu kaynakların hammadde olarak kullanılması için bazı ön iĢlemlerden geçirilmesi ve hidroliz yoluyla maya ve bakterilerin fermantasyon sırasında kullanabilecekleri karbon
kaynaklarının oluĢturulması gerekmektedir. Bunun için birçok yöntem
Pressurization-Depressurization prosesi)‟ ve sellülaz enzimi ile hidroliz bu yöntemlerden bazılarıdır. Bu yöntemlerle elde edilen verimi arttırmak için bazı kombinasyonlar da uygulanır. Hidroliz olayında dikkat edilecek en önemli nokta yan ürün olarak oluĢan hidroksi metil furfural (HMF) ve Ģeker asitleri gibi maddelerin alkol fermentasyonu sırasında mayaların çalıĢmasını inhibe etmeleridir. Bu problemi ortadan kaldırmak için genetik olarak adapte edilmiĢ mayalar kullanılarak etil alkol üretimi gerçekleĢtirilmiĢtir. Bir çalıĢmada iki aĢamalı asit hidrolizi sonucunda sellülaz enzimi kullanarak Ģeker verimi %75‟e çıkartılmıĢ, hidroliz yan ürünleri olan inhibitörlere adapte edilmiĢ
Saccharomyces cerevisiae ile %90 etil alkol üretilebilmiĢtir. Fermentasyon sonucunda
elde edilen etil alkol destilasyon yoluyla ortamdan ayrılır. Bu yolla elde edilen etil alkol, alkollü içkilerde ana madde olarak ve kimyasal ürünlerin hammaddesi olarak kullanılmaktadır. Etil alkolün en önemli özelliği ise yanma sonucu açığa çıkardığı enerjiyle, diğer enerji kaynaklarına alternatif olmasıdır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Biyolojik veya kimyasal proses atıklarının, alkol üretiminde kullanılmasındaki amaç hızlı artan ihtiyacı karĢılamakla birlikte, tarımsal ve endüstriyel atıkları substrat olarak kullanmak ve çevre kirlenmesi sorununa çözüm getirirken, sonuçta ekonomik değeri olan bir ürün elde etmektir (Çelebi ve Güngör, 1997).
Etil alkol üç amaç için üretilmektedir; alkollü içkiler için, ana madde olarak ve kimyasal ürünlerin hammaddesi olarak. Alkollü içkilerde Ģekerin fermentasyonu sonucu etil alkol oluĢur. Bunun yanında etil alkol çözgen olarak, önemli iĢlemlerde, sudan sonra ikinci sırada bulunur. Etil alkol çözgenler, ekstraktlar, boyalar, farmasotikler, lubrikantlar, adezivler, deterjanlar, pestisidler, plastisizerler, yüzey kaplama maddeleri, kozmetikler, patlayıcı maddeler, sentetik liflerin yapılmasında kullanılan reçineler gibi diğer organik maddelerin sentezinde bir substrat olarak kullanılırlar. Ayrıca asetaldehit, etil asetat, asetik asit, etilen dibromür, glikoller ve etil klorür gibi kimyasal maddelerin hammaddesini yine etil alkol oluĢturur. 2. Dünya SavaĢından sonra lastik üretiminde de kullanılmaya baĢlanmıĢtır (Ergin ve Çetin, 2001).
Etil alkol son zamanlarda enerji sektöründe de önem kazanmıĢtır. Kullanılmakta olan enerji kaynaklarının yerine alternatif olabilecek enerji kaynakları araĢtırılmaktadır.
Petrol, gaz ve kömür gibi Ģu an kullanılan enerji kaynaklarının sınırlı oluĢu ve 2100 yılına kadar tükenmesi beklendiği için etil alkolünde bir enerji kaynağı olarak kullanılması tasarlanmaktadır. Ayrıca bu kaynakların „Sera Etkisi‟ne sebep oldukları bilinmekte ve kullanımlarının mümkün olduğunca azaltılması istenmektedir. 1975 yılından itibaren Brezilya enerji kaynağı olarak etil alkol kullanmakta ve 1996 yılında artık Brezilya‟daki yakıtların %30‟unu Ģeker pancarından elde edilen etil alkol oluĢturur (Ergin ve Çetin, 2001).
Etanol üretiminde dünya ülkeleri arasında lider konumunda olan Brezilya 2005 yılı verilerine göre 16500 milyon litre ile dünyadaki toplam üretimin % 45,2‟lik dilimine sahiptir. Topraklarının 50000 m2‟sinde etanol üretiminde kullanılmak üzere Ģeker
kamıĢı yetiĢtirilirken, tarım ayağından baĢlayan biyoetanol üretim zincirinde 1 milyon kiĢi istihdam edilmektedir (Dereli, 1999).
Biyoethanol‟ün 12 milyon litresini kullanan Ġsveç gazın 5.5 milyar litrenin yaklaĢık %0.22‟sini kullanmıĢtır. Ethanol için talebin 2010 yılına kadar artacağı düĢünülmüĢtür (Senthilkumar ve Gunasekaran, 2005).
Etanol üretimine uygun besin stoğunun seçilmesi
Ġçilebilir alkol üretim endüstrisi, kendi teknolojisini geliĢtirmiĢ, pratik ve karlı bir sistemdir. Bu endüstri dalı, düĢük ücretli lüks pazarlara sunmaktadır. Bu endüstrinin teknikleri, enerji ve hammaddenin ucuz olduğu, kirlenme ile mücadelenin bir sosyal ihtiyaç olmadığı dönemlerde belirlenmiĢtir.
Hammaddeleri fermantasyona uygun hale getirmek için bir ön iĢlem gerekmektedir. GeçmiĢte, substratın orijinal kompozisyonunun getirdiği fiziksel kısıtlamalarda göz önüne alınarak mümkün olduğunca ideale yakın hammadde üretimine yeterli önem verilmemiĢtir.
Ġdeal fermantasyon iĢlemi için substratın aĢağıdaki özellikleri içermesi gerekir;
1. Fermente olabilecek Ģeker konsantrasyonu, belirli fermantasyon metoduna uygun olacak Ģekilde düzenlenmeli ve iĢlem sonunda arta kalan Ģeker miktarının minimum seviyede tutulacağından emin olunmalıdır.
2. Substrat uygun sıcaklık derecesinde ve optimum pH‟da berraklaĢtırılmalı ve maya için gerekli besin maddelerini yeterli miktarda içermelidir.
3. Ġnokulum hariç diğer mikroorganizmalar, pastörizasyon, antibiyotik veya antiseptik ilavesi, sterilizasyon metodlarının biriyle yok edilmelidir. Seçilen yok etme metodu ve derecesi, çalıĢmakta olan fermantasyon sistemine bağlıdır.
4. Maya üzerinde toksik etkiye sahip maddeler, uygun derecede azaltılmalı veya tamamen kaldırılmalıdır.
5. Osmotik basıncın ters etkisi uygun seviyelerde tutulmalıdır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Mayalar
Alkol üretiminde kullanılan Saccharomyces cinsi mayalar; Endomycetaceae familyasının Ascomycetes sınıfında yer alırlar. Tek hücreli ve mikroskobik yapıdadırlar. Büyüklükleri 7-10 µm arasında değiĢir. Özellikle ekmek yapımında ve alkollü içki sektöründe kullanılırlar. Glikoz içeren hammaddeler, Saccharomyces türleri ile fermente edilirse seyreltik alkol çözeltisi elde edilir (Çelebi ve Güngör, 1997).
Saccharomyces cerevisiae‟ın biyoetanol üretiminde tercih edilme nedenleri ;
Ökaryotik ve kararlı yapıdadırlar.
Yüksek etanol fermantasyon hızı
Güçlü invertaz üretimi
Melastaki inhibitör bileĢenlerinde yüksek tolerans
Kolaylıkla korunabilir ve çoğalabilir.
ġekil 1.1. Saccharomyces cerevisiae
Mayaların geliĢmesi için gerekli optimum sıcaklıkları türlere bağımlıdır. Örneğin, optimum sıcaklık Saccharomyces cerevisiae türü için 27-30°C, S. ellipsoideus için 25°C dir. Vikarii ve ark. (1981), tarafından yürütülen fusarium türü mantarların fermentasyonu yoluyla, iki anaerobik termofilik bakteri (Clostridium thermorellum ve
Thermoanaero bacterethanolicus) kullanarak ksilozun ethanole fermentasyonu
sağlanmıĢtır. Optimum pH ise bira mayaları için 3.4-3.9‟dur. Besi yerlerindeki suyun, besinlerin, osmotik basıncın, oksijenin ve ıĢığın da mayaların geliĢmesi üzerine etkisi fazladır.
Bakteriler
Mikroorganizmalar kullandıkları enerji kaynaklarına göre iki gruba ayrılır. Bunlar ıĢık enerjisini kullanan fototroflar ve kimyasal bağ enerjisini kullanan kemotroflardır.
Kemotroflar da organik maddelerin kimyasal bağ enerjilerini kullananlar (organotroflar) ile inorganik maddelerin kimyasal bağ enerjilerini kullanan litotroflar olmak üzere iki kısımda incelenirler. Glikozun tamamen okside edilerek CO2 ve H2O haline
dönüĢtürülmesine solunum adı verilir. Ancak bazı mikroorganizmalar bu iĢlemi sonuna kadar yürütemezler. Glukoz ancak kısmen parçalanabilir. Bu iĢleme de fermantasyon adı verilir. Fermantasyonda çok daha az enerji elde edilir ve son ürün olarak da oldukça kompleks ve halen enerji taĢıyan organik maddeler üretilir (Hasanekoğlu ve YeĢilyurt, 2002).
Glikoliz de glukoz pürivik aside okside edilir. Glikoliz sonucu glukoz molekülünde saklanan enerjilerin bir kısmı açığa çıkar. Bu olayda iki molekül ATP kullanılarak glukoz, iki molekül 3 C‟lu pürivik asit haline dönüĢtürülür ve 4 molekül ATP ile 2 molekül NADH üretilir. Reaksiyon 10 basamaktan oluĢur her basamağı özel bir enzim katalize eder. Bu reaksiyonlar sonucunda her bir glukoz molekülü baĢına net 2 molekül ATP enerjisi kazanılmıĢ olur.
Glukozun pürivik aside okside olmasından sonra pürivik asit ya solunumda kullanılmak üzere trikarboksilik asit (TCA) çemberine (Krebs çemberi) gider veya fermantasyona maruz kalır. Fermentasyon yapan bakterilere bir örnek Yersinia pestis olabilir. Özellikle biyokütle gibi öncesinde enzimatik hidroliz olan hammaddelerin fermantasyonunda en çok çalıĢılmıĢ olan Zymomonas mobilis‟tir (Dereli, A., 1999).
Fermantasyonda kullanılan enzimlerin çeĢidine bağlı olarak bu maddeler NADH tarafından indirgenir ve etil alkol, laktik asit, asetik asit ve diğer birçok metabolik yan ürün ortaya çıkar. Fermantasyonda son elektron alıcısı olarak organik madde kullanılır. Fermantasyonda moleküler oksijene gerek yoktur.
Glukoz fermantasyonunun son ürünü olan maddeler kimyasal bağlarında henüz önemli miktarda enerji taĢımaktadırlar. Bazı bakteriler bu molekülleri fermente ederek enerji elde ederler. Örneğin Acetobacter etil alkolü sirkeye dönüĢtürür. Propionibacteria ise enerjilerini diğer bir fermantasyon ürünü olan laktik asidi propiyonik asit, asetat ve karbondioksit haline dönüĢtürerek kazanırlar (Hasanekoğlu ve YeĢilyurt, 2002).
Etil Alkolün Kullanım Alanları
Etil alkol üç amaç için üretilmektedir; alkollü içkiler için, ana madde olarak ve kimyasal ürünlerin hammaddesi olarak. Alkollü içkilerde Ģekerin fermentasyonu sonucu etil alkol oluĢur. Bunun yanında etil alkol çözgen olarak, önemli proseslerde, sudan sonra ikinci sırada bulunur. Etil alkol çözgenler, ekstraktlar, boyalar, farmasotikler, lubrikantlar, adezivler, deterjanlar, pestisidler, plastisizerler, yüzey kaplama maddeleri, kozmetikler, patlayıcı maddeler, sentetik liflerin yapılmasında kullanılan reçineler gibi diğer organik maddelerin sentezinde bir substrat olarak kullanılırlar . Ayrıca asetaldehit, etil asetat, asetik asit, etilen dibromür, glikoller ve etil klorür gibi kimyasal maddelerin hammaddesini yine etil alkol oluĢturur. 2. Dünya SavaĢından sonra lastik üretiminde de kullanılmaya baĢlanmıĢtır (Çelebi ve Güngör, 1997).
Etil alkol son zamanlarda enerji sektöründe de önem kazanmıĢtır. Kullanılmakta olan enerji kaynaklarının yerine alternatif olabilecek enerji kaynakları araĢtırılmaktadır. Petrol, gaz ve kömür gibi Ģu an kullanılan enerji kaynaklarının sınırlı oluĢu ve 2100 yılına kadar tükenmesi beklendiği için etil alkolünde bir enerji kaynağı olarak kullanılması tasarlanmaktadır. Etanol yüksek oktanlı bir yakıt olup, petrolde oktan artırıcı olarak kullanılır. Etanol ile benzin karıĢtırılarak emisyonu azaltmak ve tam bir yanma sağlamak mümkündür. Yaygın olarak karıĢtırılan kullanma oranları %10 etanol ve %90 petrol Ģeklindedir (Ballesteros ve ark., 1991). Ayrıca bu kaynakların „Sera Etkisi‟ne sebep oldukları bilinmekte ve kullanımlarının mümkün olduğunca azaltılması istenmektedir.
Çizelge 1.1.Ülkelere / Bölgelere Göre Etanol Üretimi (2005) (Licht, 2005) Ülke / Bölge 2005 Etanol Üretimi
(Milyon Litre) Toplamdaki Payı (Yüzde) Brezilya 16500 45,2 A.B.D. 16230 44,5 Çin 2000 5,5 Avrupa Birliği 950 2,6 Hindistan 300 0,8 Kanada 250 0,7 Kolombiya 150 0,4 Tayland 60 0,2 Avustralya 60 0,2 Dünya Toplamı 36500 100 Biyoetanol‟ün Avantajları
Biyoetanol‟ün avantajlarını aĢağıdaki gibi sıralamak mümkündür: Yerli, yenilenebilir bir yakıt kaynağıdır.
Petrol için dıĢa bağımlılığı azaltır. Temiz bir yakıt kaynağıdır.
DüĢük maliyet ile yakıt oktan sayısını artırır.
Genelde benzinle çalıĢan araçlarda %30 oranında yakıta katılarak kullanılabilir. Üretimi ve muhafaza edilmesi kolaydır.
Biyoyakıtlar fosil yakıtlardan % 40-80 daha az sera gazı yayar. Asit yağmurunu azaltır.
Daha az su kirliliği oluĢturur. Daha az atık oluĢturur.
2. LĠTERATÜR ÖZETLERĠ
Broder ve Barrier (1988), Broder ve ark. (1995), ÇeĢitli Ģekerleri üretmek için 3 temel hidroliz süreci vardır; seyreltik asit hidrolizi, konsantre asit hidrolizi ve enzimatik hidroliz. Seyreltik asit, biyokütleyi glukoza hidrolize etmek için kullanılmıĢtır. Hidroliz biyokütlenin hemiselüloz ve selüloz kısmından maksimum Ģeker üretimi için iki aĢamadan meydana gelir. Konsantre asit hidrolizinde kullanılan asit konsantrasyonu %10-30 arasındadır. Konsantre asit hidrolizi seyreltik asit prosesinden daha yüksek bir etanol verimiyle sonuçlandığını kanıtlamıĢlardır.
Çelebi ve Güngör (1997), Tarımsal ve endüstriyel atıkları substrat olarak kullanmak ve çevre kirlenmesi sorununa çözüm getirmek, sonuçta ekonomik değeri olan bir ürün elde etmek için kurutulmuĢ meyve atıklarından etil alkol üretimi yapmıĢlardır. Denemelerinde, hurda incirden alkol üretilmesinde optimum Ģartları araĢtırmıĢlardır. Bu çalıĢmalarında; Ģeker içeriğinin büyük bir kısmı indirgen Ģekerlerden oluĢan incir, alkol hammaddesi olarak kullanılmıĢtır. Bu çalışma ile hurda incirin etanol verimliliğini maksimum seviyeye çıkarmanın yolları araştırılmıştır.
Kadam ve Newman (1997), Biyokütleden etanol üretimi için düĢük maliyetli fermantasyon ortamının geliĢimini çalıĢmıĢlardır. ÇalıĢmalarında Saccharomyces
cerevisiae mikroorganizmasını kullanmıĢlar ve etanol konsantrasyonunu kromotografi
yöntemi ile belirlemiĢlerdir. Glukoz belirlenmesi için yellow spring instruments analyzer kullanılmıĢtır.
Patrick ve ark. (1997), Broder ve ark. (1995), Optimum Ģartlarda hemiselüloz seyreltik asit ile kolayca hidrolize edilir, fakat selülozun hidrolizi için daha fazla ekstrem Ģartlara ihtiyaç duyulur. Seyreltik asit konsantrasyonunda asit konsantrasyonu %2-5 oranındadır.
Sudha ve ark. (1998), O‟Brien ve ark. (2004), Japonyada yetersiz tahıl kaynakları yüzünden bu substratlardan büyük miktarda etanol üretimi imkansızdır, bu yüzden son
çalıĢmalar bir alternatif substrat olarak lignoselülozik biyokütle kullanma üzerine odaklanmıĢtır.
Sreenath ve Jeffries (1999), Pichia stipitis ve Candida shehatae maya suĢlarını kullanarak odun hidrolizatından etil alkol üretimini sağlamıĢlardır. Etanol üretimi pH 5.5-6.0 ayarlaması yapılarak fermantasyonda 0.41-0.46 g/g verim elde etmiĢlerdir. C.
Shehatae ile gerçekleĢtirilen etanol üretiminin P. stipitis den daha yüksek verimle elde
edildiğini bulmuĢlardır.
Ergin ve ark. (2001), yaptığı çalıĢmada, atık olan Ģeker pancarı küspesinden etil alkol üretimi yapılmıĢtır. Selülozik maddeler içeren, kurutulmuĢ ve öğütülmüĢ Ģeker pancarı küspesi öncelikle selülaz enzimi kullanarak 8 saatlik bir hidroliz iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Sonuç olarak %10 Ģeker pancarı küspesi %1 enzim kullanılarak hazırlanan alkol üretim ortamında 8 saatlik hidroliz sonucu 13.79 g/l00ml glikoz elde edilmiĢtir. Fermentasyon sonucu aynı ortamda besin elementleri ilavesi olmadan % 5.92; besin elementi ilavesiyle %6.3 alkol elde edilmiĢtir.
Nigam (2001), Pichia stipitis ile buğday samanı hemiselülaz hidrolizatından etanol üretimini gerçekleĢtirmiĢtir. Etanol verimliliğini ve üretkenliğini sırasıyla 2.4+0.10 ve 5.7+0.24 oranında nötralize hidrolizatı karĢılaĢtırarak arttırmıĢlardır. Hidrolizattaki asetik asit, furfurallar ve ligninlerin mikrobiyal büyüme ve etanol verimliliğini inhibe ettiğini bulmuĢlardır.
Zaldivar ve ark., (2001), Helle ve ark., (2004), Son yıllarda pek çok araĢtırmacı heksoz ve pentoz Ģekerleri etanole dönüĢtürebilen mühendis bakteri ve mayaları çalıĢmıĢtır.
Iranmahboob ve ark. (2002), ÇeĢitli talaĢ örneklerini kullanarak iki aĢamalı asit hidroliz yöntemi sayesinde fermantasyonla Ģekerin etil alkole dönüĢümünü sağlamıĢlardır. Dekstroz verimliliğini etkileyen faktörlerin asit konsantrasyonu ve ısı olduğunun farkına vararak, 2 saatlik ısınma süresiyle %26‟lık sülfürik asit konsantrasyonunda en yüksek verimi elde etmiĢlerdir.
Galbe ve Zacchi (2002), Hemiselüloz ve selüloz hidrolizi üzerine odaklı yumuĢak odunlardan etanol üretimi için Ģu an ki teknolojinin durumu ile ilgili çalıĢma yapmıĢlardır. Asit hidrolizi, enzimatik hidroliz öncesi ön muamele, enzimatik hidroliz ve fermantasyon, etil alkolün ekonomisi ve geliĢiminin geleceği hakkında bilgiler verilmiĢtir.
Sun ve Cheng (2002), Etanol üretimi için lignoselülozik materyallerin hidrolizinde yapılabilecek iĢlemler hakkında bir çalıĢma yapmıĢlardır. Lignoselülozik materyallerin ön muamelesi, selülozun enzimatik hidrolizi, enzimatik hidrolizi etkileyen faktörler ve etanol endüstrisinin geleceği hakkında bilgiler verilmiĢtir.
Ratnam ve ark. (2003), Sıcaklık, pH ve fermantasyon zamanının kalitatif etkilerini
Zymomonas mobilis ve glucoamylase (AMG) ile sago niĢastasından etanol
fermantasyonu ve sakkarafikasyonu (SSF) üzerine incelemiĢlerdir. Sakkarafikasyon ve fermantasyon sürecini serbest enzim ve serbest hücreleri kullanarak çalıĢmıĢlar ve 140 g/l lik niĢasta konsantrasyonunu kullanarak maksimum 70.68 g/l lik ethanol konsantrasyonunu elde etmiĢlerdir. Verimlilik için optimum Ģartların 36.74 0
C, pH 5.02 ve fermantasyon süresinin 17 saat olduğunu bulmuĢlardır.
Yu ve Zhang (2004), Selülozik pirolizatın glukoza ve fermantasyonunun etanole dönüĢümü için asit hidrolizini incelemiĢler. Maksimum % 17.4 glukoz verimini 1210
C, 20 dakikada otoklav kullanarak, 0.2 mol/l sülfirik asit hidrolizi ile elde etmiĢlerdir. 31.6 g/l glukoz içeren hidrolizat ortamının Saccharomyces cerevisiae ile gerçekleĢtirilen fermantasyon sonucu 24 saat sonra 14.2 g/l etanol verdiğini, ancak 31.6 g/l saf glukozun 18 saat sonra 13.7 g/l etanol verdiğini bulmuĢlardır. Sonuçlar asit-hidrolizat pirolizatının etanol üretimi için kullanılabileceğini göstermiĢtir.
Senthilkumar ve Gunasekaran (2005), Farklı mikroorganizmalar kullanarak E.coli,
Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Clostridium cellulolyticum, Lactobacillus casei
Gaspar ve ark. (2007), Hemiselüloz ve etanol üretimi için hammadde olarak mısır lifini kullanmıĢlardır. ÇalıĢmalarında mısır lifinin etanole ve diğer ürünlere dönüĢümünü incelemiĢlerdir. NiĢastasız mısır lifi farklı alkalin solüsyonları kullanarak ön muameleden geçirilmiĢtir. Çoğunlukla selüloz içeren materyal selülozik enzimlerle hidroliz edilmiĢ ve Saccharomyces cerevisiae ile etanol içerisinde fermente edilmiĢtir.
Balat ve ark. (2008), Biyoetanol elde etme sürecindeki ilerlemeleri (ön muamele iĢlemleri, hidroliz, fermantasyon), biyoetanolün yakıt özelliklerini, biyoetanol üretimi için kullanılabilecek olan hammaddeleri (sükroz içerikli, niĢastalı hammaddeler ve lignoselülozik biyokütle) incelemiĢlerdir.
Tozluoğlu ve ark. (2009), Tarımsal atık bileĢenlerinden (yıllık bitkilerden) kimyasal ve enerji üretiminde faydalanma konusunda benzer literatürleri inceleyerek değerlendirme yapmıĢlardır.
Laopaiboon ve ark. (2009), Yüksek yerçekimi teknolojisini kullanarak, fermantasyon ve çeĢitli karbon ve nitrojen kaynakları altında Saccharomyces cerevisiae ile etanol üretimini araĢtırmıĢlardır.
Ma ve ark. (2009), Steril olmayan fermantasyon altında mutfak atığından etanol üretimini baĢarmak amacıyla, aside toleranslı Zymomonas mobilis seçilmiĢ ve fermantasyon sisteminde uygulamıĢlardır. Bu yöntemle etanol üretiminin mümkün olduğunu kanıtlamıĢlardır. Distile atığın kullanımı ile aside tolere bakterinin kullanımının etanol verimini artırabileceği, enerji tasarrufu ve etanol üretim maliyetinin azaltılabileceği ile iliĢkili olduğu düĢünülmüĢtür.
Hamelinck ve ark. (2005), Lignoselülozik biyokütleden etanolün kısa, orta ve uzun dönem tekno-ekonomik performansı hakkında inceleme yapmıĢlardır. Onların teknik performansları analiz edilmiĢ ve sonuçlar ekonomik değerlendirmeler için kullanılmıĢtır. Biyokütleden etanole dönüĢüm için seyreltik asit hidrolizine dayalı olan Ģu anki mevcut teknoloji yaklaĢık %35 etkinliğe sahip olduğunu ve tüm verimliliğin %60 olduğunu tespit etmiĢlerdir. Biyoteknolojideki ilerlemeler ve ön muameledeki
geliĢimler, özellikle kombinasyon süreci boyunca %48 etanol etkinliği getirebileceğini ve tüm etkinliğin %68 olduğunu vurgulamıĢlardır. 5 kat daha büyük etanol
tesislerindeki gelecek teknolojinin 900 k€/kWHHV yatırımlar getirebilceğini
3. MATERYAL ve METOD
3.1. Materyal
Bu çalıĢmada mikroorganizmaların substrat olarak kullanılmaları için aĢağıdaki biyokütle kaynakları seçilmiĢtir.
3.1.1. Biyokütle
Gürgen TalaĢı (Hızar TalaĢı) Kavak TalaĢı
Çam TalaĢı
Bu üç farklı biyokütlenin tercih edilmesinin nedenleri Ģu Ģekilde sıralanabilir. a. Yeterince bol bulunması
b. Maddi açıdan oldukça ucuz olması
c. Bu Ģekliyle ekonomik değere sahip olmaması
d. Karbonhidrat içeriği bakımından oldukça zengin olması
3.1.2. Kullanılan Besi Yerleri
3.1.2.1. Bakteriler Ġçin Genel Besi Ortamı
Glikoz 1.0 g Maya ekstraktı 0.5 g CaCO3 1.0 g Standart tuz çözeltisi 50.0 g
Ġz element Çözeltisi 2.0 g Agar-Agar 15.0 g Su 1000 ml pH 7.0-7.2
3.1.2.2. Mayalar Ġçin Genel Besi Ortamı
YPG Medium 10 g yeast ekstrakt 20 g pepton 20 g agar
Toplam hacim 600 ml olana kadar ddH2O Ayrı bir erlende
-30 ml Gliserol -370 ml H2O
Sterilizasyon uygulaması, 20 dk otoklavlama
BirleĢtirme ve petrilere dökme.
YPD Medium
10 g yeast ekstrakt 20 g pepton 20 g glukoz 20 g agar
YPM Medium Distile su 1 lt Agar 12 g Mannitol 25 g Pepton 3 g Yeast ekstrakt 5 g Fermantasyon Medium Karbonhidrat kaynağı……….. 100-250 g Yeast Ekstrakt………..10 g Distile su………..1 lt pH………...6.5 3.1.3. Mikroorganizmaların Ġzolasyonu
Tokat Ġli, Zile Ġlçesi‟nde yetiĢen üzüm bağlarından toplanan 7 farklı üzüm meyvesinin yüzeyleri FTS ile yıkanarak örnekler alınmıĢtır. Bu üzümler çeĢitleri sırasıyla; öküz gözü (iri siyah üzüm), taĢ kara (küçük taneli siyah üzüm), güzel üzüm (yeĢil üzüm), misket (yeĢil üzüm), narenciye (yeĢil üzüm), kömüĢ ciciği (siyah üzüm), kadın parmağı (yeĢil üzüm)‟dır. Materyal ve metod kısmında seçilmiĢ olan besi ortamları kullanılarak mikrobiyal izolasyonlar yapılmıĢtır. Yapılan izolasyon çalıĢmaları neticesinde ortaya çıkan mikroorganizmalar içerisinden maya ve bakteri suĢları tercih edilmiĢtir.
ġekil 3.1. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan iri siyah üzüm (öküzgözü) örneği
ġekil 3.2. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taĢ
ġekil 3.3. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan küçük siyah üzüm (taĢkara) örneği genel görüntüsü
ġekil 3.4. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (güzel üzüm) örneği
ġekil 3.5. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (misket) örneği
ġekil 3.6. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (narenciye) örneği
ġekil 3.7. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan siyah üzüm (kömüĢ ciciği) örneği
ġekil 3.8. Tokat‟ın Zile ilçesindeki üzüm bağlarından toplanan yeĢil üzüm (kadın parmağı) örneği
3.1.4. Mikroorganizmaların Yağ Asidi Metil Esterlerinin SaflaĢtırılmasında Kullanılan Çözeltiler
Mikroorganizmaların yağ asitlerini saf olarak elde etmek için 4 farklı çözelti kullanılmıĢtır.
Çözelti 1 : Saponification (Hücre parçalayıcı)
Sodyum hidroksit (ACS grade) 45 g Metil alkol (HPLC grade) 150 ml Saf su 150 ml
Önce metil alkol ve su, 1 lt‟lik renkli çözelti ĢiĢesine ilave edilir, daha sonra katı formundaki sodyum hidroksit eklenip iyice çözülünceye kadar
karıĢtırılır.
Çözelti 2 : Methylation (metilasyon=metilleĢtirme)
Hidroklorik asit (6.00 N) 325 ml Metil alkol (HPLC grade) 275 ml
1 litrelik çözelti ĢiĢesine ilave edilip çözülünceye kadar karıĢtırılır.
Çözelti 3 : Extraction (saflaĢtırma)
Hekzan (HPLC grade) 200 ml Metil-ter- butil eter (MTBE, HPLC grade) 200 ml MTBE, hekzan ilave edilerek karıĢtırılır.
1 litrelik renkli çözelti ĢiĢesine ilave edilip çözününceye kadar karıĢtırılır.
Çözelti 4 : Base wash (bazik yıkama)
Sodyum hidroksit (ACS grade) 10.8 g Saf su (Deiyonize) 900 ml
1 litrelik renkli çözelti ĢiĢesine katı formdaki sodyum hidroksit su içerisinde iyice çözününceye kadar karıĢtırılır.
ġekil 3.9. Yağ asidi analizinde kullanılan çözeltiler
ġekil 3.11. Çalkalama sonrası tüplerde oluĢan faz
3.2. Metod
3.2.1. Mikroorganizmaların Seçimi
Tokat Ġli, Zile Ġlçesi‟nde yetiĢen üzüm bağlarından toplanan üzüm meyvelerinin yüzeyleri FTS ile yıkanarak örnekler alınmıĢtır. Elde edilen bu solüsyonlardan materyal kısmında değinilen katı besiyerlerine ekimleri yapılarak izolasyon ve saflaĢtırma iĢlemleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Ġzolasyonlar sonucunda elde edilen mikrobiyal izolatlar (bakteriler ve mayalar) saflaĢtırılarak fermantasyonda kullanılmak üzere stok kültüre alınmıĢtır. BaĢlangıçta bu izolatların identifikasyonları yapılmadığı için herhangi bir isim verilmemiĢtir. Çünkü bu bir survey çalıĢmasıdır. Her organizmanın tanılanmasının yerine fermantasyon prosesinde etkili olanların tanılanması amaçlanmaktadır. Bu Ģekilde bir yolu izlenmesi gereksiz harcamaların önüne geçmek için yapılmaktadır. Bu çalıĢma sonucu elde edilen mikrobiyal izolatlar içerisinden hedef olarak seçilenler biyoetanol üretiminde kullanılacaktır.
3.2.2. Biyoetanol üretiminde kullanılacak hammaddeler
Biyoetanol 3 temel ham maddeden üretilebilmektedir:
ġeker Bazlı Hammaddeler (ġeker kamıĢı, Ģeker pancarı)
NiĢasta Bazlı Hammaddeler (Hububat: mısır, buğday, arpa soya fasulyesi, patates…vb.)
Selüloz ve Hemiselüloz Bazlı Hammaddeler (odun, saman…vb.)
Biyokütleyi oluĢturan polisakkaritlerin (selüloz, polyazlar) Ģekerlere hidrolizi sakkarafikasyon yöntemlerinin temelini oluĢturmaktadır. Sakkarafikasyon iĢleminin ana ürünü selüloz ve kısmen mannandan elde edilen glukozdur (Fengel and Wegener, 1984). ÇalıĢmamızda kullanılacak olan ham madde selüloz ve hemiselüloz bazlı maddeler (odun, saman…vb.) olarak seçilmiĢtir. Seçtiğimiz hammaddeler Pinus
sylvester, Carpinus betulus ve Populus canadensis ağaçlarının talaĢları olarak
belirlenmiĢtir. Kullanılacak olan talaĢ örnekleri bu aĢamadan itibaren asit hidrolizine maruz bırakılmıĢtır. Sakkarafikasyon iĢlemlerinde kullanılan kimyasallar daha çok sülfürik ve hidroklorik asit olarak belirlenmiĢtir (Tozluoğlu ve ark., 2009). Bu çalıĢmada % 5 ve % 10‟luk sülfürik asit çözeltisi kullanılmıĢtır.
3.2.3. Kültür Ortamının Hazırlanması
3.2.3.1. Bakteriler Ġçin Genel Besi Ortamının Hazırlanması
1 g glukoz, 0.5 g maya ekstraktı, 1 g CaCO3, 50 g standart tuz çözeltisi, 2 g iz element çözeltisi, 15 g agar, 1000 ml H2O, pH 7-7.2 olarak hazırlanıp otoklavlanmıĢtır.
3.2.3.2. Nurient Agar Besi Yerinin Hazırlanması
Dehidre besi yeri 20,0 g/L olacak Ģekilde damıtık su içinde ısıtılarak eritilip, otoklavda 121 oC de 15 dakika sterilize edilmiĢ ve 45-50 oC sıcaklığa geldiğinde steril petri kutularına 20'Ģer ml dökülmüĢtür. HazırlanmıĢ besi yeri berrak ve sarımsı kahve renkte olup, 25 °C de pH'sı 7,0±0,2'dir (Anonim, 1992).
3.2.3.3. Müller Hinton Besi Yerinin Hazırlanması
Müller-Hinton besi yeri, antibiyotik duyarlılık deneylerinde tercih edilen bir besi yeridir. Dehidre besi yeri, 34,0 g/L konsantrasyonda damıtık su içinde ısıtılarak eritilmiĢ, otoklavda 115 oC'da 10 dakika sterilize edilip, steril Petri kutularına 20'Ģer mL dökülmüĢtür. Besiyeri berrak, meneviĢli (yanar-döner) ve sarımsı kahverengindedir. 25
o
C'da, pH 7,4±0,2'dir (Müller ve Hinton, 1942).
3.2.3.4. Brain Heart Infusion Agar Besi Yerinin Hazırlanması
Dehidre besiyeri 52,0 g/L olacak Ģekilde damıtık su içinde ısıtılarak eritilmiĢ, otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilmiĢ ve steril Petri kutularına 20'Ģer mL dökülmüĢtür. Sterilizasyon sonrası 25 o
C de pH'sı 7,4±0,2'dir. HazırlanmıĢ besi yeri berrak ve bazen hafif opalesent (meneviĢ, yanar döner) ve kahverengidir (Anonim, 1998).
3.2.3.5. Mayalar Ġçin Genel Besi Ortamının Hazırlanması
3.2.3.5.1. Yeast Pepton Glukoz Agar (YPG)
10 g yeast ekstrakt, 20 g pepton, 20 g agar, toplam hacim 600 ml olana kadar ddH2O
ilave edilmiĢtir. Ayrı bir erlende 30 ml gliserol, 370 ml H2O hazırlanıp, 20 dk
otaklavlanmıĢtır. Otoklavlama iĢleminden sonra iki ayrı erlendeki karıĢımlar birleĢtirilerek petrilere dökülmüĢtür.
3.2.3.5.2. Yeast Pepton Dekstroz Agar (YPD)
10 g yeast ekstrakt, 20 g pepton, 20 g glukoz, 20 g agar konularak 1 lt‟ye tamamlanacak kadar ddH2O ilave edilerek otoklavlanıp, petrilere dökülmüĢtür.
3.2.3.5.3. Yeast Pepton Mannitol Agar (YPM)
12 g agar, 25 g mannitol, 3 g pepton, 5 g yeast ekstrakt ve 1000 ml distile H2O ilave
edilerek otaklavlanıp, petrilere dökülmüĢtür.
3.2.3.6. Fermantasyon Ortamının Hazırlanması
Nötralize edilmiĢ ve dietil eter ekstraksiyonunun sulu fazından alınan sakkarafikasyon örneğimizden 200 ml (biyokütle), 10 g yeast ekstrakt ilave edilerek pH‟sı 6.5‟a ayarlanmıĢtır (Ratnam ve ark., 2003). ÇalıĢmamızda 500 ml‟lik erlenlerde 200 ml‟lik mediumlar hazırlanmıĢtır. Nötralizasyon aĢamasından sonra elde ettiğimiz 200 ml sulu Ģeker çözeltisine 2 g yeast ekstrakt tartılarak pH kontrolü yapılmıĢ ve fermantasyona hazır hale getirilmiĢtir.
3.2.4. Sakkarafikasyon
Birinci aĢama hemiselüloz hidrolizi için daha optimum koĢullar altında meydana gelirken ikinci aĢama daha dayanıklı selülozu hidroliz etmek için optimize edilmektedir.
Biyokütle:H2SO4 1/5‟lik oranı kullanılarak iki aĢamalı hidroliz iĢlemi
gerçekleĢtirilmiĢtir. Ġlk adımda 170-190 0C de % 10‟luk H
2SO4 (konsantre asit)
kullanılarak 1 saat Pasteur fırınında bekletilmiĢtir. Biyokütledeki ligninleri uzaklaĢtırıp hemiselülozu parçalamak için yapılır (ġekil 3.14). Ġkinci adımda ise, 200-230 0
C de %5‟lik H2SO4 (seyreltik asit) kullanılarak 2 saat Pasteur fırınında bekletilmiĢtir. Bu
aĢamada ise, biyokütlenin selülozunu hidrolize etmek için uygulanmaktadır (Yu ve Zhang, 2004; Tozluoğlu ve ark., 2009).
3.2.5. Nötralizasyon
Hidroliz iĢlemi gerçekleĢtikten sonra biyokütle + H2SO4 karıĢımı nötr hale getirilerek
fermentasyon için hazır hale getirilmesi gerekmektedir. Fermentasyon ortamında kullanılan mikroorganizmanın yaĢayabilmesi için optimum pH‟sının ayarlanması gerekmektedir. Bunun için 500 ml lik hazırlanan karıĢımımıza (biyokütle + H2SO4), 200
g CaCO3 ilavesi ile birlikte 200 ml H2O ilave edilerek pH 6.5‟a ayarlanmıĢtır.
Nötralizasyon iĢlemi tamamlandıktan sonra elde ettiğimiz karıĢım vakum pompası yardımı ile katı ve sıvı faz olarak birbirinden ayrılmıĢtır (ġekil 3.17). Katı faz atılarak, sulu faz fermantasyon mediumda kullanılmak üzere hazır hale getirilmiĢ ve nötralizasyon tamamlanmıĢtır (Ratnam ve ark., 2003).
ġekil 3.16. Nötralizasyon iĢleminde CaCO3 ilavesi
3.2.6. Antron Testi
Sakkarafikasyon sonucunda elde edilen sıvı nötralizasyon iĢlemine alınmıĢtır. Nötralizasyon iĢlemi sonunda elde edilen sıvı içerisinde glukoz varlığının anlaĢılabilmesi için uygulanan bir yöntemdir. Toz halindeki kimyasal madde (antron), 5 ml sülfürik asit çözeltisi için 0.01 g tartılarak hazırlanır. Nötralize edilmiĢ (pH 6.5) sakkarafikasyon numunesinden plastik pastör pipeti ile alınarak cam tüpteki antron çözeltisi içerisine bir miktar damlatılarak renk değimi gözlemlenmiĢtir. Tüp içerisinde yeĢil rengin oluĢması ortamda glukoz‟un varlığını göstermektedir. Bunu dıĢındaki renk oluĢumlarında ise glukoz varlığının olmadığını ortaya koymuĢtur.
3.2.7. Dietil Eter Muamelesi
Nötralizasyon iĢlemi tamamlandıktan sonra elde edilen sıvı ayırma hunisi kullanılarak 3 aĢamada ekstraksiyon iĢlemleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Ekstraksiyon iĢlemi sonrasında ayırma hunisinde 2 farklı faz oluĢmuĢtur (ġekil 3.18). Deneylerde sadece alt faz kullanılmıĢ, Ģeker asitleri, furfurallar ve çüzünebilen lignin gibi maddelerin bulunduğu üst faz ise ayrı bir toplama kabında biriktirilmiĢtir (Nigam, 2001).
3.2.8. Fermantasyon
Ġncelenecek bakterinin üreyebileceği besiyerinin terkibinde sadece asit hidrolizi, nötralizasyon ve dietil eter ekstraksiyon aĢamalarından geçmiĢ olan biyokütleye ait sıvı, maya ekstraktı ve denenecek olan mikroorganizmanın bulunduğu karıĢımda biyoetanolün oluĢup oluĢmadığının izlenmesi ile gerçekleĢir. Burada dikkat edilecek nokta besiyeri içerisinde denenecek Ģekerden baĢka karbonhidrat bulunmaması gerektiğidir. Böylece mikroorganizma, ortamdaki yegane karbonhidratı kullanmaya zorlanır. Mikroorganizmalar karbonhidratın türüne göre laktik asit, süksinik asit, asetik asit ve formik asit oluĢturabilirler. Hidroliz süreci biyokütlenin selülozlu kısmını zayıflatıp etonole dönüĢtürmek üzere fermente edilebilir hale getirmiĢtir. Saf mikroorganizma kültürüne ait koloniden bir öze dolusu alınıp, mikroorganizma için uygun olan ve içerisinde sadece biyokütle örneği bulunan besiyerine (Fermantasyon medium) ekilir. Fermantasyonun gerçekleĢebilmesi için anaerobik bir ortamın hazırlanması gerekmektedir. Böyle bir ortamın oluĢturulabilmesi için 2.5 lt „lik anaerobik jarların (Merck) ve anaerobik ortamın oluĢturulması için AnaeroGen (Oxoid) paketleri kullanılmıĢtır. Mikroorganizmanın biyoetanole dönüĢümünü gerçekleĢtirmek için fermantasyon ortamı hazırlanmıĢtır. 10 g yeast extrackt, 1 L distile su, , 50 ml lik hacme 5 ml organizma süspanse edilerek (Wang ve ark., 2009), 300
C de 48 h de anaerobik jarlarda inkübasyona bırakılmıĢtır (Sreenath ve Jeffries, 2000).
Fermantasyon 28-320 C sıcaklıkta 2 gün içinde tamamlanmıĢtır (ġekil 3.19). Fermantasyonun pozitif yönde ilerlediğini ortaya koyan bir diğer faktör ise ortamda gaz (CO2 ve H2 gibi) kabarcıklarının oluĢtuğunun kalitatif olarak gözlemlenmesidir.
ġekil 3.19. Fermantasyon
3.2.9. Biyoetanolün Verimlilik Testi
Bu çalıĢmada biyoetanol‟ün eldesinde verimliliği belirlemek için 2 farklı yöntem kullanılmıĢtır. Bunlar; Fraksiyonel Destilasyon ve NMR ölçüm teknikleri kullanılmıĢtır. Burada esas olarak izole ettiğimiz mikroorganizmaların anaerobik ve aerobik ortamlarda biyoetanol üretip üretmediğinin belirlenmesi hedef seçilmiĢtir.
3.2.10. Fraksiyonel Destilaston Prosesi
Elde edilen etanol hala az miktarda su içermektedir. Fraksiyonel destilasyon prosesiyle, etanol-su karıĢımı kaynatılır. Etanolün kaynama sıcaklığı 780C, suyun ise 1000C dir. Dolayısıyla etanol sudan daha önce kaynama noktasına ulaĢıp gaz formuna dönüĢür ve tekrar yoğunlaĢtırılarak sudan tamamen ayrılmıĢ olur (ġekil 3.20). AyrıĢtırılmıĢ olan
sıvı içerisinde etanolün olup olmadığı kromik asit ve NMR tekniği yardımı ile belirlenmiĢtir.
ġekil 3.20. Fraksiyonel Destilasyon
3.2.11. Kromik Asit Testi
Bu çözelti için 5 g Na2Cr2O7 veya K2Cr2O7 (Merck 1.04952) 5 mL saf suda çözülür,
yavaĢça 100 mL deriĢik sülfürik asit katılır. Sıcaklık bu sırada 70-80°C‟ a ulaĢır. KarıĢım yaklaĢık 40°C‟a soğutulur ve cam kapaklı bir ĢiĢeye alınarak saklanır. Bu çözelti baĢta turuncu renktedir (Anonim, 2008). Aerobik ve anaerobik ortamdaki mikroorganizmaların etanol üretip üretmediğini kontrol etmek için kullanılmıĢtır. Fermantasyon için mediumlar hazırlanmıĢ ve termoshaker‟a yerleĢtirilip 2 gün boyunca inkübasyona bırakılmıĢtır. Ġnkübasyon sonrası elde edilen medium içerisinde etanolün varlığının anlaĢılabilmesi için kromik asit çözeltisi kullanılmıĢtır. Cam tüpler içerisinde kromik asit ile muamele edilen fermantasyon sıvısında yeĢil rengin meydana gelmesi ortamda biyoetanolün üretildiği anlamına gelmektedir. YeĢil rengin olması test edilen
mikroorganizmanın biyoetanol ürettiğini (ġekil 3.22), olmaması ise biyoetanolün üretilmediğini göstermiĢtir.
ġekil 3.21. Kromik asit testi
3.2.12. Ġzole Edilen Mikroorganizmaların Morfolojik ve Biyokimyasal Testleri
Ġzole edilen mikroorganizmalar çeĢitli morfolojik ve biyokimyasal testlere tabi tutulmuĢtur. BaĢlıca biyokimyasal testler olarak katalaz, oksidaz ve gram reaksiyon testleri yapılmıĢtır. Morfolojik testler mikroorganizmanın koloni renkleri (beyaz, sarı, kirli beyaz vb.), koloni Ģekilleri (düz, pürüzlü, yuvarlak, mukoid gibi), hareketlilik ve bakteri Ģekilleri (kok, basil, kokobasil) mikroskop altında incelenmiĢtir.
3.2.12.1. Katalaz Testi
Bir organizmanın katalaz enziminin olup olmadığını anlamak için yapılan testtir. Belirlenmek istenen bakteri bir öze ile alınıp boĢ bir petri kabına konulmuĢ ve üzerine H2O2 (Hidrojen peroksit) damlatılmıĢtır. Damlatıldıktan sonra bakteri numunesi
üzerinde birçok hava kabarcıkları oluĢuyorsa (tükürük Ģeklinde) katalaz enzimi taĢıyor demektir (Klement ve ark.,1990).
3.2.12.2. Gram Reaksiyon Testi
Önce %3‟lük KOH çözeltisi hazırlanır. Petri kabından öze ile alınan herhangi bir bakteri kümesi üzerine (boĢ bir petri kabında) bir damla KOH damlatılıp karıĢtırılmıĢtır. Özeyi bakteri KOH karıĢımına batırıp çıkardığımızda yukarı doğru bir uzama (sümüksü, yumurta akı gibi) meydana gelirse gram negatif, eğer uzama meydana gelmezse gram pozitif demektir. Buradaki uzamanın nedeni %3‟lük KOH çözeltisi bakterinin hücre duvarını ve zarını parçalayarak hücrenin sitoplazmasının dıĢarı çıkmasına neden olur. Gram- bakterilerin KOH ile muamelesi sonucu, hücre duvarının parçalanması ile sitoplazma ve nikleer materyalin açığa çıkması nedeniyle bir viskoz yapının oluĢtuğu bilinmektedir (Fahy ve Hayward, 1983).
3.2.12.3. Oksidaz Testi
Bakteride sitokrom c enziminin olup olmadığını anlamak için bu test uygulanır. Bakteri tanısında karakteristik olarak kullanılan enzimdir. Ġçerisinde p-aminodimethylaniline bulunan hazır standart diskler geliĢtirilmiĢtir. BoĢ bir petri kabına konulup disklere dıĢarıya taĢırmadan bolca su emdirilmiĢtir. Diskler yeterince su emdikten sonra öze ile bakteri kümesi su emdirilmiĢ diskin üzerine bırakılıp 1 dk bekletilmiĢtir. Diskin üzerinde koyu mavi veya lacivert bir renk oluĢursa bu bakteri sitokrom c enzimini taĢıyor demektir (Kovacs, 1956).
3.2.13. Mikroorganizmaların Yağ Asidi Analizi
7 farklı üzüm örneğinden izole edilen mikroorganizmalardan seçilmiĢ 21 hedef mikroorganizmanın teĢhisi için Atatürk Üniversitesinde bulunan GC tekniğinden faydalanılmıĢtır. Mikroorganizmalarımızın teĢhisi için laboratuarımızda, organizmaların yağ asitleri hazırlanarak tür tayinlerinin yapılması için hazır hale getirilmiĢtir. Hazırlanan 4 farklı çözelti kullanılarak aĢağıda belirtilen yöntem ile aerobik bakterilerden yağ asidi metil esterlerinin saflaĢtırılması analizi ve GC‟e verilinceye kadar izlenen yol (Karaman, 2005);
1- Steril bir öze ile test edilecek aerobik bakterinin tek bir kolonisinden, TSA katı besiyerine 4 fazlı çizgi ekim yapılır. Her bir petri silinmeyecek Ģekilde etiketlendirilir.
2- Ekim yapılmıĢ petriler 280C de 24 h süre ile inkübasyona bırakılırlar. Klinik aerobik bakteriler 350C de inkübasyona bırakılırlar. YavaĢ geliĢen bakteriler için 48 h ile inkübasyon yapılabilir.
3- Ġnkübasyon periyodunu takiben, 4 fazlı çizim yapılmıĢ petrilerin 3 ve 4 numaralı fazlarından canlı bakteri hücreleri steril bir öze ile toplanarak (yaklaĢık 40 mg) steril bir cam test tüpüne (5 ml) aktarılır. Test tüpleri etiketlenerek ağızları kapatılır.
4- Her bir test tüpüne 1 ml çözelti 1 ilave edilir ve 5-10 sn çalkalanır, sonra test tüpleri 5 dk süre ile 1000
C lik su banyosunda bekletilir. Tekrar 5-10 sn çalkalanan test tüpleri 25 dk süre ile 1000C lik su banyosunda inkübasyona
bırakılır. Bu iĢlem ile canlı hücreler parçalanarak, yağ asitlerinin serbest kalması sağlanır.
5- Test tüplerine 2 ml çözelti 2 (metilasyon) eklenir. 5-10 sn çalkalamadan sonra 800C de 10 dk süre ile su banyosunda bekletilir ve en kısa sürede 10 dk süre ile buz veya soğuk su içerisinde soğutulur. Bu uygulama ile serbest yağ asitlerini ester bağlarına metil eklenmiĢ olur ve yağ asitlerinden yağ asit metil esterleri elde edilir. Bu durum yağ asitlerine yüksek sıcaklıklarda uçuculuk özelliği kazandırır.
6- SoğutulmuĢ tüplere 2.5 ml çözelti 3 (saflaĢtırma) eklenir ve 10 dk süre ile çalkalayıcı ile çalkalanır. Bu aĢamada tüp içerisinde 2 ayrı faz oluĢur. Bu tüplerin alt kısmında asidik, üst kısmında da organik sıvı fazlar oluĢur. Yağ asit metil esterleri asidik fazdan ayrıĢarak organik faz bölgesinde toplanır. Bu nedenle pastör pipeti kullanarak tüplerin alt kısmındaki asidik faz atılır ve organik faz muhafaza edilir.
7- En son aĢamada her tüpe 3 ml çözelti 4 (bazik yıkama) ilave edilip, 5 dk süre ile çalkalandıktan sonra 10 dk süre ile oda sıcaklığında bekletilir. Çözelti 4, bazik bir çözelti olup serbest yağ asit metil esterlerini daha saf olarak elde etmemize yardımcı olur. Tüp içerisinde yine 2 ayrı faz oluĢur. Üst fazda toplanan ve yağ asit metil esterleri içeren faz, pastör pipeti ile alınarak 2 ml gaz kromatografisi tüplerine transfer edilir. Burada, üst fazdan alma iĢlemi yapılırken alt fazdan kesinlikle alınmaması gerekmektedir. Dikkat edilmez, alınırsa yağ asidi esterlerinin saflığı bozulmakta ve cihaz yanlıĢ okuma yapmakta veya hata vermektedir. Ağızları sıkıca kapatılan bu tüpler GC cihazı üzerindeki örnek depolama aparatına yerleĢtirilir. Daha sonra cihaz çalıĢtırılarak, sistem kılavuzunda belirtildiği gibi örnekler tek tek analiz edilip tanı sonuçları alınmıĢtır.
