A. O. Vet. Fak. Derg. 34 (3)' 54ı-548. ı987
ECTHYMA CONTAGiOSUM ViRUSUNUN (ELMADAG) SUŞU) FİZİKSEL VE KİMYASAL ÖZELLİKLERİ İLE ELEKTRONMİKROSKOP1sİ ÜZERİNDE
ARAŞ-TIRMALAR
İbrahim Burgu
*
Asuınan Toker**Studies on the pbysicochem.ical characteristics and electronm.icroscopic investi. gatl.on of Elm.adağ strain of Ecthyma contagiosum. virus
Sumınary: Ph)'sicochemical characteristics and electronmicroscopic exa-mination of Elmadağ strain of Ecth)'ma contagiosum virus that was isolated from fetal lamb kidnq eel! culture were investigated. The virus was also grown in fetal ca!f kidnf;Y eel! culture as wel! as fetal lamb kidney eel! culture. But it was not grown on MDBK, BHK-21, HeIa, Vcro and MA-I04 eel! cultures.
The infectivity titer of the virus did not showaı!) change at 50 oC but dissap-peared completef.y at 60 oC.
The irifectivity titer of the virus decreased at pH 3.0-4. O, but was stabil at pH 6.0-7.0 and 8.0.
The virus did not showand infectivity af ter treating with aether and chlo-roform. Af ter treatement with t~ypsin, the infectivi(y of virus was decreased about
10°.25
10.
i ml.The type of virus was detected as 0pe Ila b)' electronmicroscopical exa-mination.
Özet: Klinik olarak Ecth)'ma contagiosum semptomları gösteren bir kuzunun gingivasından fötal kuzu böbrek hücre kültüründe izole edilen Ecthyma contagiousm virusunun (Elmadal suşu) fiziksel ve kimyasal özellikleri ile elektronmikroskopisi incelendi. Izole edilen virus homolog hücre kültürü )'anında fötal dana böbrek hücre kültüründe de ürediği halde MDBK, BHK-21, HeIa,
Vero ve MA-I04 hücre kültürlerinde üremedi. Isı duyarlılık testi sonunda virus,
50 oC de enfeksiyözitesini korumasına karşılık, 60 oC de enfeksiyözitesini tamamen kaybetti.
* Prof. Dr., A.Ü. Veteriner Fakültesi, Viroloji Bilim Dalı, Ankara.
512 İURAHİM BURGU .:- ASUMAN TOKER
/ \
Virus pH 3. O ve 4. O değerlerinde erifeksiyözilesini kaybetmesine karşm, pH 6. O - 7. O ve 8. O de,~erlerinde engreksryözite gücünü korudu.
Eter 1'e kloroformdan etkilendi. Tripsinle muamelede ise 100•25/0. i ml
delerinde enfeksi]ö_;.itegiiç ka)'bma uğradı.
Elektroııınikroskopik kontmlda viruS/ııı lij) a gijrünümünde olduğu sap-tandı.
Giriş
Plowright ve ark. (14), eethyma eontagiosum (orf) virusunun koyun ve sığırların böbrek ve testis primer hüere kültürlerinde ürel'e-bildiğini bildirmişlerdir. Liess (9), insan ve koyun orijinli eethyma eontagiosum viruslarını dana testis hüere kültürlerinde izole ettiğini ve bu kültürlerde seri pasajlarının yapılabildiğin~ belirtmiştir. Pre-eausta ve Stellman (15), kuzu böbrek primer hücre kültürlerinde eethy-ma eontagiosum virusunu izole ve idantifiye ettiklerini bildirmiş-lerdir. l\agington ve Whittle (I 2), eethyma eontagiosum virusunun insan amnion primer hüere kültürlerinde ve maymun böbrek hücre kültüründe üreyebildiğini, buna karşılık insan orijinli HcLa hücre kültüründc üremediğini belirtmişlerdir. Nagington (ll) ise koyundan izolc edilen ccthyma contagiosum virusunun başlangıçta yalnızca koyun orijinli hücre kültürlerinde üreyebildiğini bildirmiştir.
Türkiye'de cethyma eontagiosum virusunun ilk izolasyonu Ergin vc Köklü (5) tarafından koyun troid hücre kültürlerinde gcrçekleş-tirilmiştir. Aynı araştırıcılar (5), izo1c ettikleri virusu kuzu ve dana böbrek hücre kültürlerine de adapte etmişlerdir.
Burgu ve Toker (4), kuzu orijinli cethyma contagiosum virusunu fötal kuzu böbrek (FKB) hücre kültürlerinde izole ettiklerini bildir-mişlerdir.
Berkin ve ark. (2) ise doku kültürlerinde virus izolasyonu yapıl-maksızın, klinik olarak ecthyma contagiosum tanılı koyunlardan elde ettikleri materyallcrden yaptıkları deneysel transmisyon çalışmalarmda başarılı sonuç aldıklarını bildirmişlcrdir.
Ecthyma contagiosum virusu ısıya karşı oldukça dayanıklıdır (I 6). Prccausta ve SteIIman (I 5), izole ve idantifiye ettikleri ccthyma coııtagiosum virusunun 50 °C'de 30 dakika süreyle stabilolduğunu bildirmişlerdir. Robimon ve Balassu (16), Sawlıney, Buxton ve
Fra-ECTHYMA CONTAGI0SUM YIRUSUNUN ... 543
ser'in bulgularına dayanarak virusun 60 oC de 30 dakikada en feksi-yözitesini tamamen kaybettiğini, 55 oC de 30 dakika sonra en feksi-yözite gücünde kayıplar olduğunu belirtmi~lerdir.
Ecthyma contagiosum virusunun pH duyarlılığı üzerinde sınırlı sayıda ara~tırıcı çalı~ml~tır. Bu ara~tıncılardan Precausta ve Stellman
(15), \"İrusun pH 3 değerinde çok duyarlı olduğunu ve enfeksiyözite yönünden oldukça fazla etkilendiğini bildirmişlerdir.
Precausta ve Stellman (I 5), ecthyma contagiosum virus suşlarının oda derecesinde 30 dakika süre ile yağ eriticilerinden eterle karşılaş-tırıldıkIarında enCeksiyözite güçlerinde 101.5-102•5 azalma meydana
~eldiğini, aynı virus suşlarının aynı süre ve ısı derecesinde klorolomla karşıla~tırıldıklarında ise l'l1feksiyözite güçlerinin 104 oranında
aza-labildiğini belirtmişlerdir.
Rolle ve Mayer (17), ecthyma contagiosum virusunun tripsin enzimi ile kaqıla~tırıldığında yapısının bozulduğunu bildirmişlerdir.
Ecthyma contagiosum virusunun elektron mikroskopisi üzerinde çeşitli araştırıcılar çalışmı~lardır (7, 13). Nagington ve Home (I 3), elektron mikroskop ta ecthyma contagiosum virusunun iki ayrı form da görülebildiğini, bu formlardan tip i a olarak isimlendirdikleri for-mun en çok rastlanan form olduğunu diğer tip i b, tip 2 a ve tip 2b'-nin ise daha az görüldüğünü ve gerek iç strüktür, gerekse dış görünüm olarak tip 1 a'dan büyük farklar gösterdiklerini belirtmişlerdir. Aynı araştırıcılar (13), virusun elektron mikroskopta görünümü ile konakçı arasında ilişki olmadığını, iki insan ve koyun orijinli cctlıyma conta-giosuın viruslarının elektron mikroskopta aynı partikül yapısını gös-terdiklerini bildirmişlerdir.
Bu araştırma, Burgu ve Toker (1.) tarafından klinik olarak ecthy-ma contagiosum semptomları gösteren bir kuzunun gingivasındaki lezyonlardan izole ve idantifiye edilen ecthyma contagiosum (Elma-. dağ) virus suşunun fiziko-kimyasal özellikleri ile elektron mikroskopik yapısını araştırmak amacıyla yapılml~tır.
Materyal ve Metot
Virus: Araştırmada kullanılan virus, FKB hücre kültürü 17. pasajdan elde edilmi~tir (DKIDso: 106/0.1 ml).
Hücre kültürü: Virus suşunun fiziko-kimyasal özelliklerinin araş-tırılması ve elektron mikroskopik kontrol amacıyla virusun üretilmesi
İBRAHIM BURGU - ASUMAN TOKER
için
%
20 inaktif dana serumlu Hanks vasatında üretilen FKB hücre kültürleri kullanılmıştır. Virus suşunun farklı hücre kültürlerinde üre-tilme denemelerinde ise fötal dana böbrek (FDB), Vero, HeLa, BHK-21, ve MA-l04 hücre kültürlerinden yararlanılmıştır. Hücre üretme vasatı olarak FDB hücre kültürü için%
20 inaktif dana se-rumlu Hanks vasatı, diğer hücre kültürleri için ise%
10 inaktif dana serumlu Eagle MEM vasatı kullanılmıştır.Virus inokulasyonu: İzole edilen ecthyma contagiosum virusu-nun farklı hücre kültürlerinde üretilme denemeleri adsorbsiyona bağlı yöntemle gerçekleştirilmiştir. Her hücre sisteminde 8 pasaj yapılmış-tır. Virus üretme vasatı olarak yarı yarıya karıştırılmış
%
5 fötal dana serumlu Earle-+
Eagle MEM vasatı kullanılmıştır.Fiziko-kimyasal reaksiyonlar: İzole edilen vİrusun ısı duyarlılık ile eter ve kloroform duyarlılık testleri Akashi ve ark. (I )'nın; pH ve tripsin duyarlılık testleri de Burgu (3) nun bildirdiği yöntemlerle ya-pılmıştır. Isı, pH, eter, kloroform ve tripsin duyarlılık testlerinin sap-tanmasına esas teşkil eden enfeksiyözite güç kontrolları için mikro-titrasyon (6), enfeksiyözite güç değerlendirmesi için ise Kaerber (8)
yönteminden yararlanılmıştır.
İzole edilen virusun elektron mikroskopik kontrolu amac.ıyla virus FKB hücre kültüründe üretildikten sonra, hücreler 2000 devirde LO dakika santrifüj edilerek çöktürülmüştür. Dipte oluşan hücre sed i-menti elektron mikroskopik kontrol amacıyla bir damla distile su ile sulandırılarak Poly-L-Lysine ile kaplanmış karbonlu gridler üzerine damlatılmıştır. Gridler daha sonra fosfotungustik asit ile boyanarak E.M. 9 Zeiss elehron mikroskopta kontrol edilmiştir (I O).
Bulgular
Ecthyma contagiosum (Elmadağ) virus suşunun çqitli hücre kültürlerinde yapılan inokulasyon denemeleri sonunda yalnızca FKB ve FDB hücre kültürlerinde sitopatolojik effekt oluşturduğu tesbit edilmiştir.
Isı duyarlılık testinde virus 50 oC de 1 saat beldetildiğinde kont-rol virusa oranla (DKIDso: 106/0. i ml) herhangibir enfeksiyözite kaybı saptanamamış (DKIDso: 106/0. i ml), buna karşılık 60 °C'de
ise bir saatlik süre sonunda enfeksiyözitc gücünün tamamen kaybol-duğu tesbit edilmiştir.
ECTHYMA CONTAGİOSUM VİRUSUNUN ... 545
pH duyarlılık testinde virusun pH 3.0 ve pH 4.0 de enfeksiyözite gücünün bulunmadığı; pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0'de ise enfeksiyözite gücünde kontrol virusa oranla herhangibir azalma olmadığı saptan-mıştır.
Eter ve kloroform duyarlılık testi sonucunda virusun klorofomla karşılaştırıldığında enfeksiyözite gücün(i tamamen kaybettiği, eterle karşılaştırıldığında ise enfeksiyözite gücünde kontrol virusa oranla (DKIDso: 106/0.1 ml) büyük ölçüde azalma olduğu (DKIDso: 102/0.1
ml) gözlenmiştir.
Tripsin duyarlılık testi sonunda ise virusun enfeksiyözite gücünde kontrol virusa oranla i00.25 değerinde bir azalmanın olduğu tesbit
edilmiştir.
Elektran mikroskopik kontralda virusun tip i a görünümünde olduğu saptanmış ve iç yapısı belirgin şekilde gözlenmi~tir (Şekil I).
Şekil i. Ecılıyma contagiosum virus u (Elmadağ suşu). Elekıronmikroskopik görünum. x 84 000.
Figure i. Ectlıyma contagiosum virus (Elmadağ strain). Elcctronmicroscopica! appearan-ce. x84 000.
ıBRAHiM nURGU .- ASUMAN TOKER
Tartışma ve Sonuç
Ecthyma contagiosum vinısu üremc yönünden geni~ hir hücre
spektnımuna sahip olup, koyun (5, 14), sl,ğır (9, 14), maymun (12),
insan am nion primer hücre kültürü (I 2) gibi hücre kültürlerinele iire.
tilmiştir. Bu çalışma da izole edilen virus FKB ve FDB hücre
kültiir-lerinde üretilmiş buna karşılık MDBK, BH K-21, HeLa ve maymun
hücre kültürlerinden Vero ''c :'vl1\-i04'de üretilememiştir.
N agington (I i), koyunlardan izole edilen eetl1yma contagiosum
virusunun başlangıçta sadece koyun hücre kültürlerinde ürediğini,
devamlı pasajlar ile heterolog hücre kültürlerinde de üreyebildiğini
belirtmiştir. Ergin ve Köklü (:» ise koyun troid hüere kültilrlerindc
izole ettikleri ecthyma contagiosum virusunu, daha sonra troid
kültür-lerinde pasajlamak suretiyle dana böbrek hücre kültürlerinede
ad:ı.p-te ettiklerini hildirmişlerdir.
Bu çalışmada da bir kuzunun gingivasından FKB.h(icre
kültür-lerinde izole edilen virus, devamlı pasajiara gereksinim göstermeksizin
FDB hücre kültüründe ilk inokulasyoncla, FKB hücre kültüründeki
ti treyle üreme göstermiş! ir.
Precausta ve Stellman (15), izole ettikleri ectl1yma contagiosum
virusunun 5 farklı suşunun 50 °C'dc 30 dakika süreyle ısı duyarlılık
testi uygulanma~;ı sonunda enfchiyözite güçlerinin değişmediğini
bil-dirmişlerdir. Robinson \T Balassu (16), Sawhney, Puxton ve fraser'c
atfen ecthyma contagiosum "irusunun 60 °C'de 30 dakika da enICk.
siyözite gücünü tamamen kaybettiğini, 55 °Cde ise 30 dakika sonra
enfeksiyözite gücünde kayıplar olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmada
ise izole edilen ectl1yma contagiosum (Elmadağ) virus suşunun iSi
duyarlılık testi sonucunda Precausta ve Stellman (I 5) 'in bildirdikleri,
50 °elik ısıda i saat tutulduğunda dahi inaktive olmadığı, buna
karşılık Robinson ve Balassu (16)'nun Sawhney, Buxton ve Frascr'e
atfen bildirdikleri gibi 60 "e'de ise cnfeksiyözite güeünü tamamen
kaybettiği saptanmıştır.
pH duyarlılık testi sonuçlarına göre izole edilen ecthyma con.
tagiosum . (Elmadağ) virus suşımun Precausta. ve Stellman (I 5) 'in
bildirdiği pH 3 değerinde enfekSiyözite gücünü kaybetmesi yanında,
pH 4'dc de enfeksiyözitcsinin tamamen kaybolduğu, pH 6, pH 7 ve
pH 8 değerlerinde ise enfeksiyözite gücünde kontrol virusa oranla
ECTHYMA CONT AGİOSUM VİRUSUNUN ... 547
Yağ eriticilerinden eter ve kloroforma kar~ı duyarlılık araştırması sonucunda virusun Precausta ve Stellman (15) 'in bildirdiği gibi etere, kloroforma oranla daha az duyarlı olduğu görülmüştür.
Rollc ve Mayer (17), tripsin enzimi ile ecthyma contagiosum vi. rusunun kar~ılaştırıldığında parçalandığını ve cnfeksiyözite gücünü kaybettİğini bildirmi~lerdir. Yapılan bu çalışmada ise Rolle ve Mayer (I 7)'in bildirdiklerinin aksine virusun enfeksiyözite gücünün devam ettiği, meydana gelen cnfeksiyözitc güç kaybının kontrol virusa oranla 10°.25
fO.
1 ml değeri gibi önemsiz bir güç kay bı olduğu tesbitedil-mi~tir.
Elektron mikroskoptaki kontrol sonunda kuzudan izole edilen bu virusun tip 1fa yapısında olduğu, Güne~ ve ark. (7)'nin insandan izole ederek elektron mikroskopik olarak tipini tesbit ettikleri ecthyma contagiosum virusu ilc aynı morfolojik yapıyı gösterdiği saptanmı~tır. Bu durum Nagington ve Home (13)'nun da iki insan ve bir koyun orijinli ecthyma contagiosum virus suşları arasında saptadıkları mor-folojik ayrılığın bulunmadığı görü~ü ile de uyum göstermektedir.
Sonuç olarak ecthyma contagiosum klinik semptomları gösteren bir kuzunun diş etinden izole edilen ecthyma contagiosum (Elmadağ) virus su~unun bazı ara~tırıcıların (ll), bildirdiğinin aksine heterolog hücre kültürlerinde üretilmesinde seri pasajIara gereksinim gösterme-diği fiziko-kimyasal özellikleri daha önce çe~itli ara~tırıcılar (15) tarafından ara~tırılan ccthyma contagiosum virusları ile kar~ıl~tırıl-dığında ısı duyarlılık yönünden virusun daha stabil olduğu, ayrıca tripsine duyarlı olduğu bildirilen ecthyma contagiosum virusunun bu çalışmada duyarlılık göstermediği saptanmıştır.
Diğer taraftan İse bu çalışma, Türkiye'de hücre kültürlerinde üretilen virusların elektron mikroskopik kontrolları yönünden yeni bir metot uygulanmasına imkan sağlamış ve Güne~ ve ark. (7)'ndan sonra hayvansal kökenli ecthyma contagiosum vİrusunun Türkiye'de ilk elektronmikroskopik çalışmasını ortaya koymuştur.
Literatür
i. Akashi, H., Inaba, Y., Miura, Y.,. Tokuhisa, S., Sato, K. and Satoda, K. (1980). Properties of a coronavirus ısolated from a cow with epizootic diarrhea. Vet. MicrobioI. 5: 265-276.
548 İBRAHİM BURGU - ASUMAN TOKER
2 .. Berldn, ş., Kahraman, M., Hazıroğlu, R., İzgür, M. ve Yonguç, A.D. (1985). Enzootik Ecthyma Contagiosum ovis-Nccrobacillosis. A.ü. Vet. Fak. Der!!. 32 (I): 157-171. 3. Burgu,L(1979).Koyımlarda abortyapaıı orbiviruslara dahil bir serotipi"l özellikleri ilc Tiir~
kiye'deki durumu üzerinde maftmnalar. A.ü. Vet. Fak. Derg. 26 (3-4): 135-150. 4. Burgu,t.ve Toker, A. (1984).Bir kuzunun dif eıiilden Ecıh)'TTIaCoıııagiosll'n (orf) virusu
izolasyonu. A.ü. Vet. Fak. Der~. 31 (2): 230-239.
5. Ergin, H. ve Köklü, A. (1973).Ektima virusunıııı dokıı kültürlerinde pasaj, ve anlijCllik özel-liklerinin incelenmesi. Pendik Vet. Bakt. Sero!. Emt. Derg. 5 (2): 12-20.
6. Frey, H.R. und Liess, B. (1971).Vemıehrungs kineıik u'ıd verwendbarkeit einer stark z)'to-patlwgenen VD-MD virusslammesfrir diagnostisclıe UntersllChımgeıı mil der Mikroıiler-Alet/tode. Zbl. Vet. Med. 18: 61-71.
7. Güneş, A.T., Gezen, C., Kapdağlı, H. und Marschall, H.J. (I 982).Ect~yıııa
COIi-tagiosum Epidemien in der Türkei. Der Hautant 33: 384-387.
8. Kaerber, G. (I964)./ııdiagnosıic procedures for virus mıd riekelsial disease. Public Heal tlı Assn. (New York), 3: 48-50.
9. Liess, B. (1962). BeobachtUlıge,1 und Untersuclıuııgeıı riber den LipPClıgriııd (8clll)'lııa conla-giosum) der Schafe als ZoomııhropollOse. Zentbl. Bakt. 185: 289-304.
ıo.
Menzies, J. (Personal communication) Moredun Rcsc:ırch Institute Dep.Elcctron Microscopy.lL. Nagington, J. (1968). The growll, of paramcdna riruses in limlt e:dlure. Vet. Rel'. 82: 437-482.
12. Nagington, J. and Whfttle, C.H. (1961).Huıııaıı orf: isolalioıı of ıhe virus by lissuc eu/-ture. Br. Med ..1.2: 1324-1326.
13. Nagington, J. and Home, R.W. (1962).Moıl,lıologica/ sıudies of orf and Vaeeinia viruses. Virology 16: 248-260.
14. Plowright, W., Whitcomb, M.A. and Ferris, R.D. (1959).Studies wiı/ı a straiıı of eonlagious puslular demıa!iHs virus i.1 lissue cııllurc. Arch. gcs Yirusforsch. 9: 214-231. 15. Precausta, P. and Ste11man,C.H. (1973).Isolaıion and eomparative sıudy "iıı vilro"
~r
five sıra im of eorıtagiosıl/JIecıkyıııa of sheep. Zb!. Vet. :\1ed. 20: 340-355.
16. Robinson, A.J. and Balassu, T.C. (1981).Conlagious puslular dermalilis (orf). Yet. Bull. 51 (10): 771-782.
17. Rolle, M. und Mayr. A. (1966). Microbiologie und Allgeme;ııe seııehenlehre. Ferdinan! Enke Verlag Stuttgart.
