Denizli ili, Buldan yayla gölü Pelophylax bedriagae popülasyonunun kan biyokimyasi ve hematolojisi

T.C.

PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DENİZLİ İLİ, BULDAN YAYLA GÖLÜ Pelophylax

bedriagae POPÜLASYONUNUN KAN BİYOKİMYASI VE

HEMATOLOJİSİ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DÜZGÜN CAN ERDOĞAN

T.C.

PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DENİZLİ İLİ, BULDAN YAYLA GÖLÜ Pelophylax bedriagae

POPÜLASYONUNUN KAN BİYOKİMYASI VE

HEMATOLOJİSİ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DÜZGÜN CAN ERDOĞAN

KABUL VE ONAY SAYFASI

DÜZGÜN CAN ERDOĞAN tarafından hazırlanan “DENİZLİ İLİ, BULDAN YAYLA GÖLÜ Pelophylax bedriagae POPÜLASYONUNUN KAN BİYOKİMYASI VE HEMATOLOJİSİ” adlı tez çalışmasının savunma

sınavı 16.08.2019 tarihinde yapılmış olup aşağıda verilen jüri tarafından oy birliği / oy çokluğu ile Pamukkale Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı olarak kabul edilmiştir.

Jüri Üyeleri İmza

Danışman

Prof. Dr. Eyüp BAŞKALE

Pamukkale Üniversitesi ...

Üye

Prof. Dr. Yusuf KATILMIŞ

Pamukkale Üniversitesi ...

Üye

Dr. Müge GİDİŞ

Kütahya Dumlupınar Üniversitesi ...

Pamukkale Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu’nun ………. tarih ve ………. sayılı kararıyla onaylanmıştır.

... Prof. Dr. Uğur YÜCEL

Bu tezin tasarımı, hazırlanması, yürütülmesi, araştırmalarının yapılması ve bulgularının analizlerinde bilimsel etiğe ve akademik kurallara özenle riayet edildiğini; bu çalışmanın doğrudan birincil ürünü olmayan bulguların, verilerin ve materyallerin bilimsel etiğe uygun olarak kaynak gösterildiğini ve alıntı yapılan çalışmalara atfedildiğine beyan ederim.

i

ÖZET

DENİZLİ İLİ, BULDAN YAYLA GÖLÜ Pelophylax bedriagae POPÜLASYONUNUN KAN BİYOKİMYASI VE HEMATOLOJİSİ

YÜKSEK LİSANS TEZİ DÜZGÜN CAN ERDOĞAN

PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

(TEZ DANIŞMANI:PROF. DR. EYUP BAŞKALE) DENİZLİ, AĞUSTOS ; 2019

Bu çalışma ile P. bedriagae türünün; Denizli ilinin, Buldan ilçesinde bulunan Buldan Yayla Göletindeki popülasyonundan 5 erkek, 5 dişi toplam 10 bireyin toplanıp, türün kan sonuçlarına bakılmıştır. Kan çalışmaları olarak biyokimyasal parametre çalışmaları COBAS 8000 cihazından ölçülmüş olup, Eritrosit ve lökosit sayımları Neubaer hemositemetrisine göre yapılmıştır. Biyokimyasal testlerden Albümin, Alanin Aminotransferaz, Aspartat Aminotransferaz, Aspartat Aminotransferaz, Kalsiyum, Total Kolesterol, C Reaktif Protein, Demir, Magnezyum, Fosfor, Total Protein ve Demir Bağlama parametreleri çalışılmıştır.

Periferik yayma ile her bir bireyin kanı yayılarak eritrositlerin ve nukleuslarının mikroskop ile ölçümleri yapılmıştır. Her bir yaymadan 10’ar tane eritrosit ve nukleus seçilip, en ve boyları ölçülmüştür. Eritrositlerin uzunluğu erkek bireylerde ortalama 21,7174, dişi bireylerde ise 12,488 olarak tespit edilmiştir ve eritrosit boyları erkeklerin 21,7174, dişilerde ise 21,4502 olarak hesaplanmıştır. Erkek bireylerin nukleus uzunlukları 9,5272, dişi bireylerde 9,1518 ve erkek bireylerin nukleuslarının eni 5,6308, dişi bireylerin nukleuslarının eni 5,303 olarak hesaplanmıştır.

ANAHTAR KELİMELER: Amphibia, Pelophylax bedriagae, Kan Biyokimyası,

ii

ABSTRACT

THE BLOOD CHEMİSTRY AND HEMATOLOGY OF Pelophylax bedriagae POPULATİON İN LAKE BULDAN YAYLA, DENİZLİ.

MSC THESIS

DÜZGÜN CAN ERDOĞAN

PAMUKKALE UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE BİOLOGY

(SUPERVISOR:PROF. DR. EYUP BAŞKALE) DENİZLİ, AUGUST 2019

In this study of the P. bedriagae species; A total of 10 individuals (5 male, 5 female) were collected from the population of Buldan Yayla Pond in Buldan district of Denizli province and their blood results were examined. In terms of blood biochemical parameters were measured using COBAS 8000 device while erythrocyte and leukocyte counting were measured NEUBAER hemocytometer. Albumin, Alanine Aminotransferase, Aspartate Aminotransferase, Aspartate Aminotransferase, Calcium, Total Cholesterol, C Reactive Protein, Iron, Magnesium, Phosphorus, Total Protein and Iron Binding parameters were studied from biochemical tests.

The blood of each individual was spread by peripheral smear and erythrocytes and nuclei were measured with microscope. Ten erythrocytes per each spreading were selected from each smear and their width, length, width and length of the nuclei were measured. The mean length of erythrocytes was found to be 21.7174 in male individuals and 12.488 in female subjects. Nucleus lengths of male individuals were calculated as 9.5272, 9.1518 in female individuals and 5.6308 in male nuclei and 5.303 in female nuclei.

KEYWORDS: Amphibia, Pelophylax bedriagae, blood biochemistry, erythrocyte and leukocyte count

iii

İÇİNDEKİLER

2.2 Popülasyonda Cinsiyet Tespiti ve Boy Ölçümü ... 5

2.3 Bireylerden Kan Alımı ... 5

2.4 Yayma Preperatı Hazırlama ... 5

2.5 Eritrosit Sayımı ... 8 2.6 Lökosit Sayımı ... 9 2.7 Kan Biyokimyası ... 11 2.8 İstatistiksel analizler ... 12 3. BULGULAR ... 13 4. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 17 5. KAYNAKLAR ... 19 6. ÖZGEÇMİŞ ... 22

iv

ŞEKİL LİSTESİ

Sayfa

Şekil 2. 1:Buldan Yayla Gölü/Denizli ... 4

Şekil 2. 2: Yayma Preparat Hazırlama ... 6

Şekil 2. 2: Yayma Preparat Hazırlama (devamı) ... 7

Şekil 2. 3: Eritrosit Pipeti ve Hayem Eriyiği ... 8

Şekil 2. 4: Lökosit Pipeti ve Turk Eriyiği ... 9

Şekil 2. 5: Thoma lamı ve sayım kamarasının görünümü ... 10

Şekil 2. 6: NÜVE NF 048 Santrifüj ... 11

Şekil 2. 7:Cobas 8000 Cihazının c 702 Analizörü ... 12

Şekil 3. 1: Kan hücrelerinin görüntüleri; ERİ: Eritrosit, EOS: Eosinofil, BASO: Bazofil, TRO: Trombosit, LYM: Lenfosit, MON: Monusit, NÖT: Nötrofil ... 14

v

TABLO LİSTESİ

Sayfa

Tablo 3. 1: Toplanan Bireylerin SVL Uzunlukları ... 13 Tablo 3. 2: Erkek Bireylerin Eritrosit ve Nukleuslarının En-Boy Ölçümler .... 15 Tablo 3. 3: Dişi Bireylerin Eritrosit ve Nukleuslarının En-Boy Ölçümleri ... 15 Tablo 3. 4: Dişi bireylerde çalışılan biyokimya kan sonuçları ... 16 Tablo 3. 5: Erkek Bireylerde çalışılan biyokimya kan sonuçları ... 16

vi

SEMBOL LİSTESİ

ALB : Albümin

ALT : Alanin Aminotransferaz AST : Aspartat Aminotransferaz BASO : Bazofil

Ca : Kalsiyum

CHO2 : Total Kolesterol CRP : C Reaktif Protein EOS : Eozinofil ERİ : Eritrosit Fe : Demir MG : Magnezyum P : Fosfor TP : Total Protein UIBC : Demir Bağlama PLT : Trombosit NÖT : Nötrofil LYM : Lenfosit MON : Monosit M : Metre

SVL : Burun ucu-kloak arası mesafe µm : Mikrometre

µg/dL : Mikrogram/desilitre mg/dL : Miligram/desilitre ıu/L : İnternasyonal ünite/litre g/L : Gram/litre

vii

ÖNSÖZ

Yüksek lisans tez konusunun belirlenmesinde, araştırılmasında ve yazımı esnasında sahip olduğu bilgi birikimi ve tecrübesi ile çalışmamı yönlendiren, yardımlarını esirgemeyen saygıdeğer danışman hocam Prof. Dr. Eyup BAŞKALE’ye sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım

Yaptığım çalışmalarda desteğini ve yardımını eksik etmeyen Pamukkale Üniversitesinde görev yapmakta olan Sevay Ayşe ULUBELİ, preperat hazırlamalarında ve arazi çalışmalarında yardımcı olan Yüksek Lisans Öğrencisi Yağmur ÖZYILMAZ’a, tez ile ilgili literatür bilgilerini paylaşıp yardımcı olan Arş. Gör. Okan ÇON’a teşekkür ederim.

Çalışmalarım sırasında desteklerini her zaman hissettiren, başta annem ve eşim olmak üzere tüm aile ve dostlarıma çok teşekkür ederim.

1

1. GİRİŞ

Amphibia sınıfı; omurgalılar içinde, sürüngenler arasında yer alırlar ve morfolojik olarak birbirinden farklı 3 ordo’ya sahiptirler (Kuyruksuz kurbağalar, kuyruklu kurbağalar ve bacaksız kurbağalar). Yaklaşık 7000’den fazla olan bu canlılar, çeşitliliği en fazla olan omurgalılardandır. Eski yunanca da Amphi=iki, Bios=yaşam olarak adlandırılmış ve hem karada hem suda yaşadıklarından dolayı iki yaşamlılar anlamına gelen “Amphibia” adı günümüzde kullanılmaktadır. Amfibiler balıklar ile sınıf olarak benzer oldukları düşünülse de birbirinden ayıran özellikleri çoktur. Amfibilerde akciğer olması, hem karada hem de suda işlev görebilen duyu organlarının olması farklı olduğunu kanıtlayan niteliklerdendir (Demirsoy 2005).

Amfibiler, hem karada hem suda hayatlarını devam ettirebilmeleri ve yüksek ölçülü geçirgenlikte deriye sahip olmalarından dolayı yaşadıkları habitatta oluşabilecek değişimlere karşı oldukça hassastırlar (Alford ve Richards 1999; Barinaga 1990; Blaustein 1994; Blaustein ve Wake 1995; Phillips 1990). Bu nedenle, habitatta meydana gelebilecek olan insan kaynaklı olumsuz faktörler, ani iklim değişimleri veya suyun kimyasal yapısındaki değişimler amfibiler tarafından kolaylıkla algılanır ve türe özgü korunma davranışları gösterirler. Olumsuz çevre şartları altında dış göç ya da kitlesel ölümler de gözlenebilir (La Marca ve diğ., 2005).

Öyle ki geniş dağılım gösteren Pelophylax bedriagae türü farklı coğrafik koşullar altında yaşam tarzını değiştirerek kısa süre içerisinde uyum sağlama yeteneğindedir. Örneğin aktif dönem süresi, üreme dönemi demografik yapılar ve bireylerin ebatları farklı coğrafik koşullarda değişim gösteren temel yaşam tarzlarıdır. Hematolojik parametreler de farklı coğrafik koşullarda değişim gösteren temel parametrelerdendir. Diğer yandan kan biyokimyasının çalışılması, söz konusu tür üzerine ilk kez gerçekleştirilecek olan ana konulardan bir tanesidir.

Türkiye’de bulunan su kurbağaları arasında üç türün yaşadığı tespit edilmiştir. Bunlar; P. ridibundus, P. caralitanus ve P. bedriagae türleridir. Bu

2

çalışmada konu edilen P. bedriagae genellikle suyu terk etmeyen, suyun kenarında, suyun içinde veya yüzeyinde bulunan; çalı, yaprak, dal parçası gibi nesnelerin üzerinde görülmektedir (Başoğlu ve diğ. 1994). Genel olarak ovalık alanda bulunan Levanten bataklık kurbağaları, deniz seviyesinden 2250 m’ye kadar Baran (1969) yüksek rakımlardaki göllerde de görülebilmektedir. Ergin dişi kurbağaların vücut boyları 10-15 cm aralığında farklılık göstermektedir.

Öyle ki yaygın dağılım gösteren P. bedriagae türü coğrafik koşulların farklılığıyla doğru orantılı olarak yaşam tarzını değiştirir ve kısa süre içerisinde yeni yaşam alanına uyum sağlayabilme yeteneğine sahiptir. Örneğin; aktif dönem süresi, üreme dönemi, demografik yapılar ve bireylerin ebatları, farklı coğrafik koşullarda değişim gösteren temel yaşam tarzlarıdır.

Genel olarak hayvanlar, özelde ise amfibiler; insan kaynaklı etkilerin neden olduğu büyük bir stres içinde yaşamak zorundadırlar. Bunun için popülasyonların yaş kompozisyonları, üzerinde yapılan çalışmalar doğanın izlenmesi açısından çok önemlidir. Bireylerin yaşam tarzları ve çevreye verdiği tepkilerin, ekolojik faktörler ile birlikte yorumlanması hedef türlerin korunması ve nesillerini devam ettirmesi açısından çok önemlidir. Örneğin, su ve tuz dengesini korumak için gerekli fizyolojik ayarlamalar, mevsimsel aktivite ve davranış değişikliklerine eşlik eden metabolik ayarlamalar canlının sisteminde mevcuttur. Kurbağaların da ortamdaki yaşamsal faaliyetleri bize bilgi vermektedir. Vücutlarındaki fizyolojik dengeye, sulardaki kirlilik ve temizliğin saptanmasına, kan biyokimyalarına bakarak anlaşılabilir. Metabolik değişiklikler, özellikle hemoglobin değerlerinin kan biyokimyasında değişmesiyle, sudaki oksijen miktarının saptanması mümkündür. Biyoçeşitlilik krizinden etkilenen pek çok takson arasında, amfibilerin dünya çapında özellikle büyük çaplı nüfus düşüşleri geçirdiği tespit edilmiştir (IUCN 2019). Amfibiler; morfolojik, fizyolojik, yaşam öyküsü ve üreme özelliklerini sergileyerek onları kirleticilere karşı maruz bırakabilir veya duyarlı hale getirebilir. Örneğin, hassas ve oldukça su geçiren yumurta kapsülleri ve cilt kimyasalların akışına karşı az dirençlidir. Kirleticilerin zararlı sinerjilere maruz kalma potansiyelini güçlendirerek, kirleticiler patojenlere, avcılara, ultraviyole radyasyona veya iklim değişikliğine karşı savunmasızlığı da artırabilirler (Carey ve diğ. 2001; Little ve diğ. 2000; Relyea ve Mills 2001).

3

Diğer yandan hematolojik parametreler; çevresel şartlarda meydana gelen değişimleri kısa sürede algılayıp, cevap verebildiği için çevresel indikatör rolü oynamaktadır ve çevresel stresin ölçülmesinde sıkça kullanılan bir yöntemdir. Ancak amfibilerin şu ana kadar sadece kan hematolojileri üzerine çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmada eritrosit, kırmızı-beyaz kan hücrelerinin sayıları ve ebatları üzerine yoğunlaşılmıştır. Rana macrocnemis (Uludağ kurbağası) türünün hematolojik çalışmasında bazı parametreler ve periferal hücrelerin (eritrosit, lökosit, trombosit) morfolojisindeki mevsimsel değişimler istatiksel ve histolojik yöntemlerle incelenmiştir (Arserim ve Mermer 2008). Rana pipiens’te ise kan hücre sayımı, kanın pH’ı, hematokrit ve hemoglobin gibi çalışmalar yapılmıştır (Rouf 1969).

1.1 Amaç

Bu çalışmada Denizli ili, Buldan yayla gölü lokasyonunda yaşayan Pelophylax bedriagae türünün hematolojik ve biyokimyasal parametrelerinin araştırılması amaçlanmıştır.

4

2. MATERYAL VE METOT

2.1 Arazi Alanı

Denizli ilinin Buldan ilçesi sınırlarında Süleymanlı Köyünün doğusundaki, Süleymanlı Yaylasındadır(38°03'29.0"K, 28°46'24.9"D). Denizli merkeze 51 kilometre uzaklıkta olup, yüksekliği yaklaşık olarak 1156 m’dir. Yüzölçümü 50 hektardır (Şekil 2.1). Gölün suları tatlıdır. Nilüferlerin gelişmesi ve alanın % 15 inde ağaçlık alan oluşmaya başlaması gölün derinliğinin az olduğunun göstergesi sayılmaktadır. Göl çevresinde özellikle küçükbaş olmak üzere hayvancılık yapılır. I. Derece Doğal Sit Alanı içerisinde yer alan göl ve çevresi turistik bir kamp yeri olarak kullanılmaktadır. Aynı zamanda kara avcılığı yapılabilmektedir. Göç eden kuşların kısa süreli konaklama yeri olan gölde sazan ve yayın balığı bulunur. Göl çevresinde yabani tavşan, domuz, oklu kirpi, porsuk, yeşilbaş ördek, ak pelikan, sakar meke gibi yabani hayvanlar sıklıkla görülür. Amfibi türlerinden ise Hyla orientalis, Bufotes variabilis, Bufo bufo ve Triturus ivanbureschi türleri ile simpatrik olarak yaşamaktadır.

5

2.2 Popülasyonda Cinsiyet Tespiti ve Boy Ölçümü

Yapılan arazi çalışmasında kurbağaların yakalanması için elle ve balık kepçesi ile yakalama metodları kullanılmıştır. Yakalanan bireylerin cinsiyet tayini; erkeklerde ses kesesi ve ön ekstremitenin baş parmağında üreme döneminde bulunan nasır ile yapılmıştır. Bireylerin boy ölçümleri; Snout Vent Length (burun ucu ile kloak arası) 0,01mm hassasiyetindeki dijital kumpas yardımıyla ölçülüp kaydedilmiştir.

2.3 Bireylerden Kan Alımı

Her bir bireyin kalbin karıncık (ventriculus) bölgesinden steril heparinli enjektör yardımıyla 1-2 cc kadar kan alınmıştır. Alınan kan örnekleri, 2 saat içerisinde laboratuvar ortamında kan taşıma çantası ile taşınıp çalışmalara başlanmıştır. Kan alım işlemleri bittikten sonra kurbağalar yayılış gösterdikleri habitata geri bırakılmıştır.

2.4 Yayma Preperatı Hazırlama

Yayma preperatların hazırlanmasında ilk olarak; barkodlamaları yapılan lamların baş kısmına hematokrit çubuk yardımıyla bir damla kan damlatılıp, ardından farklı bir lam kullanarak 30 derecelik açı ile yayma işlemi gerçekleştirilmiştir (Şekil 2.2. A, B, C, D). Kanın kuruması için lam, 30 dakika bekledikten sonra, hücrelerin daha net gözlemlenmesi amacıyla, üzerine birkaç damla alkol damlatılarak, numune 10 dakika boyunca tekrar kurumaya bırakılmıştır (Şekil 2.2. E). Alkolle bekleyen numune, saf su ile yıkandıktan sonra May Grunwald metodu ile boyanıp 5 dakika boyunca beklemeye bırakılmıştır (Şekil 2.2. F, G, H). Bekleme sonunda tekrar saf su ile yıkanmış (Şekil 2.2. I, J) ve daha sonra Giemsa ile 15 dakika boyunca boyama işlemi gerçekleştirilmiştir (Şekil 2.2. K). Süre bitiminde saf su ile yıkayıp bir süre kurumasını bekledikten sonra Xylol solüsyonunda 15 dakika daha bekletilmiştir (Şekil 2.2. L). Lam üzerindeki numunenin üzerine Entellan solüsyonundan damlatıp kapama işlemi gerçekleştirilmiştir. Son olarak, Kameram marka görüntüleme sistemli Olympus CX 31 mikroskop kullanılarak kan hücrelerinin ölçümleri yapılmıştır.

6

A

B

C

D

E

F

7

G

H

I

J

K

L

8

2.5 Eritrosit Sayımı

Sayımlar Neubaer hemositemetrisine göre yapılmıştır. Bireyden alınan kanın seyreltilmesi için eritrosit pipetinden faydalanılmıştır (Şekil 2.3). Eritrosit sulandırmasında Hayem Eriyiği kullanılmıştır ve bu sayede lökositlerin parçalanmasını sağlanmıştır.

Şekil 2. 4: Eritrosit Pipeti ve Hayem Eriyiği

Eritrosit pipetiyle tam kandan 0.5 seviyesine kadar kan pipet içerisine alınmış ve ardından 101 seviyesine kadar Hayem Eriyiğinden çekilmiştir. Pipetin iki ucunu da kapatıp hafifçe birkaç defa alt üst edildikten sonra iki damla dışarıya, üçüncü damlayı da Thoma lamının üstüne damlatıp, lamelle kapatılmıştır. Eritrositleri incelemek üzere Thoma lamı mikroskoba takılmış ve küçük olan karelerin (4x4, 5 adet) içinde kaç tane eritrosit bulunduğu sayılmıştır. Her bir karede bulunan eritrosit sayısı not edilmiş ve çıkan 5 değerin hesaplamaları yapılmıştır.

9

2.6 Lökosit Sayımı

Lökosit sayımında da Neubaer hemositemetresinden yararlanarak hesaplamaları yapılmıştır (Şekil 2.4). Bireyden alınan kanın seyreltilmesi için lökosit pipetinden faydalanılmıştır. Lökosit sulandırmasında, Turk Eriyiği kullanılmış ve bu sayede asetik asit eritrositlerin parçalanmasını sağlanmıştır. Aynı zamanda metilen mavisi de lökositlerin mavi renge boyanmasını sağlamıştır.

Şekil 2. 5: Lökosit Pipeti ve Turk Eriyiği

Şekil 2.4’te görülen bu pipet üzerinde 0.5, 1 ve 11 çizgileri bulunmaktadır. Pipetin 1 ve 11 çizgilerinin arasında kalan kısmında balon mevcuttur ve burada kan Turck solüsyonu ile karıştırılarak seyreltilmektedir. Balon içindeki beyaz yuvarlak cisim, kanın solüsyon ile karışmasını kolaylaştırmak için kullanılmaktadır.

10

Thoma lamı Şekil 2.5’te de görüldüğü gibi özel olarak hazırlanmış, enine ve boyuna çizgilerin olduğu, mikroskopla görülebilen bir lamdır.

Lökosit pipetiyle tam kandan 0.5 seviyesine kadar pipetleme yapılmış ve ardından seyreltilmesi için 11 seviyesine kadar Turck solüsyonundan çekilmiş ve iki ucunu da kapatarak yavaşça alt üst edilmiştir. Karıştığından emin olduktan sonra iki damla dışarıya damlatılıp üçüncü damlası Thoma lamına damlatılmış üzeri lamel ile kapatılarak mikroskop altında sayımları gerçekleştirilmiştir.

11

2.7 Kan Biyokimyası

Ortalama 1 cc seviyesinde alınıp ependorf tüpüne aktarılan tam kan örneği, 5000 rpm devirde 10 dakika NÜVE NF 048 marka santrifüj cihazı ile serum ve plazmasına ayrılmıştır (Şekil 2.6). Santrifüjleme işleminin sonunda kan hücreleri ile kan serumu birbirinden ayrılmış ve otomatik pipet yardımı ile serumu plazmadan ayırarak farklı bir ependorf tüpüne koyup, -20 derecede muhafaza edilmiştir. Çalışmaların yapıldığı gün; kan oda sıcaklığında çözündükten sonra, cihazda belirlediğimiz parametreleri tanımlayıp numuneleri çalışmak üzere COBAS 8000 marka cihazında analiz edilmiştir (Şekil 2.7).

12

Şekil 2. 8:Cobas 8000 Cihazının c 702 Analizörü

Analizör üzerinden; Albümin, Alanin Aminotransferaz, Aspartat Aminotransferaz, Aspartat Aminotransferaz, Kalsiyum, Total Kolesterol, C Reaktif Protein, Demir, Magnezyum, Fosfor, Total Protein ve Demir Bağlama testleri çalışılmıştır.

2.8 İstatistiksel analizler

Elde edilen veriler SPSS veri analiz paket programında analiz edilmiştir. Öncelikle verilerin normal dağılış gösterip göstermedikleri Kolmagrov-Simirnov testi ile analiz edilmiş ve çıkan sonuca göre parametrik ve parametrik olmayan testler ile olası farklılıklar arasındaki varyasyonlar tespit edilmiştir.

13

3. BULGULAR

Bu çalışmada, 5 erkek 5 dişi P. bedriagae türünden elde edilen kan örnekleri hematolojik ve biyokimyasal açıdan değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçlar aşağıda verilmiştir.

Erkek ve dişi bireylerin SVL uzunlukları Tablo 3.1’de belirtilmiştir. Ölçülen erkek ve dişi bireylerin ortalama SVL uzunlukları 74,62 mm olarak hesaplanmıştır. Bulgulara göre en uzun birey 86,73 mm dişi, en kısa birey 63, 48 mm erkek olarak saptanmıştır.

Tablo 3. 1: Toplanan Bireylerin SVL Uzunlukları

Örn. No CİNSİYET SVL UZUNLUK (mm) 1 ERKEK 86,7 2 DİŞİ 79,8 3 ERKEK 74,23 4 DİŞİ 86,73 5 DİŞİ 67,75 6 DİŞİ 66,6 7 DİŞİ 70,82 8 ERKEK 75,35 9 ERKEK 74,77 10 ERKEK 63,48

Hematolojik çalışmalar sonucunda; periferik yayma preparatlarından elde edilen kan hücrelerine ait görüntüler Şekil 3.1’de verilmiştir.

14

Şekil 3. 1: Kan hücrelerinin görüntüleri; ERİ: Eritrosit, EOS: Eosinofil, BASO: Bazofil, TRO: Trombosit, LYM: Lenfosit, MON: Monusit, NÖT:

Nötrofil

Erkek ve dişi bireylere ait Eritrosit ve Nukleus Ölçümleri Tablo 3.2 ve 3.3’te verilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre erkek ve dişi bireylerin eritrositlerinin ve nükleuslarının en ve boyları arasında istatistiksel bakımdan önemli bir fark saptanamamıştır (P>0,05).

15

Tablo 3. 2: Erkek Bireylerin Eritrosit ve Nukleuslarının En-Boy Ölçümler

CİNSİYET ERİTROSİT ENİ _(µm) ERİTROSİT BOYU _(µm) NUKLEUS ENİ _(µm) NUKLEUS BOYU _(µm)

ERKEK 13,26 19,921 5,878 8,838 ERKEK 13,094 25,259 4,787 9,978 ERKEK 11,86 21,034 6,172 9,73 ERKEK 13,353 20,007 6,314 9,943 ERKEK 13,311 22,366 5,003 9,147 Ortalama 12,9756 21,7174 5,6308 9,5272

Tablo 3. 3: Dişi Bireylerin Eritrosit ve Nukleuslarının En-Boy Ölçümleri

CİNSİYET ERİTROSİT ENİ _(µm) ERİTROSİT BOYU _(µm) NUKLEUS ENİ _(µm) NUKLEUS BOYU _(µm)

DİŞİ 11,481 21,594 6,14 10,382 DİŞİ 12,653 21,816 5,201 9,333 DİŞİ 12,849 21,788 4,984 8,504 DİŞİ 12,574 20,722 5,106 8,736 DİŞİ 12,883 21,331 5,084 8,804 Ortalama 12,488 21,4502 5,303 9,1518

Buldan yayla gölünde yaşam gösteren P. bedriagae türüne ait kan biyokimyası verileri Tablo 3.4 ve 3.5’te verilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre erkek ve dişi bireyler arasında biyokimyasal parametrelerin hiçbirinde istatistiksel bakımdan önemli bir fark saptanamamıştır (P>0,05).

16

Tablo 3. 4: Dişi bireylerde çalışılan biyokimya kan sonuçları

PARAMETRELER CİNSİYET ALB (g/L) ALT (IU/L) AST (IU/L) Ca (mg/dL) CHO2L (mg/dL) CRP (mg/dL) GLUC (mg/dL) Fe (µg/dL) Mg (mg/dL) P (mg/dL) TP (g/L) UIBC (µg/dL) DİŞİ 10,1 25 22 11,67 132 0,009 20 22 1,64 5,08 26,3 108 DİŞİ 12,1 58 197 9,91 107 0,013 30 49 1,95 5,45 31,1 177 DİŞİ 9,1 35 82 9,85 76 0,007 58 19 1,43 6,16 24 60 DİŞİ 12,1 49 141 8,31 54 0,006 30 17 1,52 3,24 31,2 93 DİŞİ 11,6 34 33 8,92 123 0,011 29 11 1,3 4,6 22,2 56 Ortalama 11 40,2 95 9,732 98,4 0,0092 43,2 23,6 1,568 4,906 26,96 98,8

Tablo 3. 5: Erkek Bireylerde çalışılan biyokimya kan sonuçları

PARAMETRELER CİNSİYET ALB (g/L) ALT (IU/L) AST (IU/) Ca (mg/dL) CHO2L (mg/dL) CRP (mg/dL) GLUC (mg/dL) Fe (µg/dL) Mg (mg/dL) P (mg/dL) TP (g/L) UIBC (µg/dL) ERKEK 14,3 73 147 9,39 48 0,002 40 27 1,4 3,57 31,3 123 ERKEK 9,2 65 26 9,94 79 0,009 40 33 1,64 4,64 34,3 120 ERKEK 8,1 30 71 8,36 61 0,006 36 31 1,6 4,63 21,2 89 ERKEK 9,3 31 83 10,34 88 0,007 46 22 1,41 5,67 25,5 61 ERKEK 5,2 40 97 8,85 56 0,011 54 89 2,53 13,62 16,6 248 Ortalama 9,22 47,8 84,8 9,376 66,4 0,007 33,4 40,4 1,716 6,426 25,78 128,2

17

4. TARTIŞMA VE SONUÇ

Yapılan bu çalışma sonunda, P. bedriagae türüne ait Denizli ilinde bulunan, Buldan Yayla Gölü popülasyonunun kan çalışmaları yöntemi ile biyokimyasal parametrelerinden; Albümin, Alanin Aminotransferaz, Aspartat Aminotransferaz, Aspartat Aminotransferaz, Kalsiyum, Total Kolesterol, C Reaktif Protein, Demir, Magnezyum, Fosfor, Total Protein ve Demir Bağlama kapasiteleri ortaya çıkarılmıştır. Çalışmada Denizli ili, Buldan Yayla Gölü popülasyonuna ait bireyler, 5 dişi, 5 erkek toplam 10 bireyin kan parametrelerini saptamak amacıyla analizler gerçekleştirilmiştir.

Omurgalı hayvanlar arasında en büyük eritrositler urodela takımında olduğu bilinmektedir. Anurlar ise urodellerden daha küçük, ancak daha çok sayıda eritrositlere sahiptirler (Foxon, 1964; Hartman ve Lessler, 1964; Kuramoto, 1981). Evans (1939), Amfibilerde eritrosit büyüklüğü ile aktivite arasında bir korelasyon bulunduğunu, buna dayanarak da daha aktif türlerin daha küçük eritrositlere sahip olduğunu, enerji tüketimi düşük hayvanların ise daha büyük eritrositlere sahip olduğunu rapor etmiştir. Vernberg (1955), Amerika'daki iki eyalette yaşayan bazı urodel türleri üzerinde yaptığı hematolojik bir çalışmada, eritrosit büyüklüğü ile vücut ağırlığı arasında pozitif korelasyon olduğunu ve ayrıca tamamen sucul hayvanların daha büyük eritrositlere sahip olduklarına dikkat çekmiştir. Haden (1940), Altman ve Dittmer (1961), Harris (1963) eritrosit büyüklüğü üzerinde çeşitli çevresel faktörlerin önemli rol oynadığını ileri sürmüşlerdir. Atatür ve diğ. (1999) tarafından yapılan Türkiye'den bazı anur türlerinde eritrosit büyüklükleri ile ilgili çalışmada, tamamen suya bağlı türlerin daha büyük eritrositlere sahip olduğu, buna karşın yarı sucul ve karasal türler de ise nispeten daha küçük eritrositlere sahip olduğu tespit edilmiştir. Dağ kurbağalarındaki eritrosit büyüklüğü ile ilgili değerler, ranidlerden Rana ridibunda'ya ait değerler ile karşılaştırıldığında, dağ kurbağalarının R. ridibunda'dan daha küçük eritrositlere sahip olduğu görülmüştür (Atatür ve diğ. 1999). Bu da muhtemelen yüksekliğe bağlı bir varyasyon olarak değerlendirilebilir.

18

Bu çalışmada elde edilen eritrosit ve nukleusları elipsoid şekillidir. Buldan Yayla gölünde popülasyonunun dişi bireylerinin eritrosit boyu ortalama 21,5µm eni ise ortalama 12,5 µm olarak saptanmıştır. Nükleusların boyu 9,2 µm olarak hesaplanırken eni ortalama 5,3 µm olarak saptanmıştır. Erkek bireylerde ise eritrosit boyu ortalama 21,7 µm eni ise ortalama 12,9 µm olarak saptanmıştır. Nükleusların boyu 9,5 µm olarak hesaplanırken eni ortalama 5,6 µm olarak saptanmıştır. Erkek bireylerin eritrosit boy ve enleri ile nükleuslarının boy ve enleri hafif bire şekilde dişilerden büyük olmasına rağmen aradaki fark istatistiksel bakımdan anlamsızdır.

Diğer yandan türün kan biyokimyası ilk kez araştırılmıştır. Biyokimyasal parametrelerin hiçbiri erkek ve dişi bireyler arasında anlamlı bir fark göstermemiştir. Bu kapsamda türün yayla gölü popülasyonundaki bireylerdeki ortalama albümin miktarı 10,03 g/L, ALT 44,4 IU/L, ortalama AST 89,4 IU/L, ortalama kalsiyum 9,5 mg/dL ortalama CHO2L 80,9 mg/dL, ortalama CRP 0,008 mg/dL, ortalama Glukoz 37,9 mg/dL, ortalama demir 32,8 µg/dL, Ortalama Mg 1,7 mg/dL, ortalama fosfor 5,7 mg/dL, ortalama Total protein 26,3g/L ve ortalama Demir bağlama 114,8 µg/dL olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak elde edilen bu veriler ileride yapılacak olan çalışmalara referans olma niteliğindedir.

19

5. KAYNAKLAR

Alford, R.A. and Richards, S.J., “Global amphibian declines: a problem in applied Ecology”, Annual Reviews of Ecology and Systematics, 30, 133–165, (1999).

Altman, P.L., Dittmer, D.S., Biologists, Washington, D.C. American Society for Veterinary Clinical Pathology, (2013.09.08), http://www.asvcp.org/pubs/qas/newQas/nonmammal, (2013).

Arıkan, H., ”Rana ridibunda (Anura, Ranidae) populasyonlarının kan hücrelerinin sayısı bakımından incelenmesi”, Turkish Journal of Zoology, 13(2), 54-59, (1989).

Arserim, S.K., Mermer, A., ”Hematology of the Uludağ Frog, Rana macrocnemis Boulenger, 1885 in Uludağ National Park”, E.Ü. Su Ürünleri Dergisi, 25(1), 39-46, (2008).

Atatür, M.K., Arıkan, H., Çevik, İ.E. “Erythrocyte sizes of some anurans from Turkey”, Turkish Journal of Zoology, 23, 111- 114, (1999).

Baran, İ., “Anadolu dağ kurbağaları üzerinde sistematik araştırma”, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi İlmi Raporlar Serisi, 80, (1969).

Barinaga, M., ”Where have all the froggies gone?”, Science, 247, 1033– 1034, (1990).

Başoğlu, M., Özeti, N., Yılmaz, Ġ., Türkiye Amfibileri(The Amphibians of Turkey), Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Kitaplar Serisi No. 151, Izmir Turkey: Ege University Publishing House, (1994).

Blaustein, A.R., Wake, D.B., ”Declining amphibian populations: a global phenomenon”, Trends in Ecology and Evolution, 5, 203– 204, (1990).

20

Blaustein, A.R., Wake, D.B., Sousa, W.P., ”Amphibian declines: Judging stability, persistence, and susceptibility of populations to local and global extinctions”, Conservation Biology, 8, 60-71, (1994).

Blaustein, A.R., ”Amphibians in a bad light”, Natural History, 103, 32– 39, (1994).

Demirsoy, A., Yaşamın temel kuralları, II, Ankara: Seçkin Yayıncılık, (2005).

Evens, G., ”Factors in fluencing the oxygen consumption of several species of plethodontid salamanders in aerial and aquatic media” Ecology, 20, 74-95, (1939).

Foxon, GEH., ” Blood and respiration”, (ed: J.A. Moore), In physiology of the Amphibia, ss.151209, New York: Academic press, (1964).

Haden, R.L., Factors affecting the size and shape of the red cell, E 27-33, E R. Moulton, A.A.A.S. Pub. No: 13: Science Press, Lancester, (1940).

Harris, J., The red cell, Cambridge, Mass, Harvard Univ. Press, (1963).

Hartman, E.A., Lessler, M.A., ”Erythrocyte measurements in Fisches, Amphibia and Reptiles”, BioL. Bull., 126, 83-88, (1964).

Kuramoto, M., ”Relationships between number size and shape of red blood cells in amphibians”, Comparative Biochemistry and Physiology, 69, 771-775, (1981).

La Marca, E., Lips, K.R., Lötters, S., Puschendorf, R., Ibáñez, R., “Catastrophic population declines and extinctions in Neotropical harlequin frogs (Bufonidae: Atelopus)”, Biotropica, 37, 190–201, (2005).

21

Relyea, R.A., Mills, N., Predator-induced stress makes the pesticide carbaryl more deadly to gray treefrog tadpoles (Hyla versicolor), (27 Şubat 2001), https://www.pnas.org/content/98/5/2491, (2001).

Rouf, M.A., “Hematology of the Leopard frog, Rana pipiens” Copeia, 4, 682-687, (1969).

Vernberg, J.E., ”Hematological studies on salamanders in relation to theirecology”, Herpetologica, ll, 129-133, (1955).

Zaga, A., Little, E.E., Raben, C.F., Ellersieck, M.R., ”Environ”, Toxicol. Chem., 17, 2543–2553, (1998).

22

6. ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Düzgün Can ERDOĞAN

Doğum Yeri ve Tarihi : ANTALYA – 16/07/1992

Lisans Üniversite : Pamukkale Üniversitesi