Yüksek fruktozlu diyetin ve egzersizin kardiyak akuaporin 7 gen ifadesine etkisi

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI

Tez Yöneticisi

Doç. Dr. Selma Arzu VARDAR

YÜKSEK FRUKTOZLU DİYETİN VE EGZERSİZİN

KARDİYAK AKUAPORİN 7 GEN İFADESİNE ETKİSİ

(Uzmanlık Tezi)

Dr. Aziz KARACA

TEŞEKKÜR

Uzmanlık eğitimim sürecinde, yetişmemde büyük katkı ve emeği geçen, ayrıca tez konusunun olgunlaşmasında bilgi ve tecrübeleri ile her zaman yol gösterici olan değerli danışman hocam Doç. Dr. Selma Arzu VARDAR’a, Anabilim Dalı Başkanımız Prof. Dr. Levent ÖZTÜRK’e, değerli öğretim üyeleri Prof. Dr. Nurettin AYDOĞDU ve Yrd. Doç. Dr. Mevlüt YAPRAK’a, deney aşamasının gerçekleştirilmesinde tecrübeleriyle yardımcı olan Dr. Orkide PALABIYIK’a, Yrd. Doç. Dr. Ebru TAŞTEKİN ve çalışma ekibine, Yrd. Doç. Dr. F. Nesrin TURAN’a ve araştırmanın maddi desteğini sağlayan Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi Birimi’ne teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

KALBİN ENERJİ METABOLİZMASI ... 3

EGZERSİZ VE KALP ... 4

AKUAPORİNLER ... 8

FRUKTOZ VE METABOLİZMASI ... 14

GEN İFADESİ VE ÇALIŞMA YÖNTEMLERİ ... 19

PROTEİN İFADESİ VE ÇALIŞMA YÖNTEMLERİ ... 23

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

TARTIŞMA

SONUÇLAR

ÖZET

SUMMARY

KAYNAKLAR

EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR

AQP : Akuaporin ATP : Adenozin trifosfat

cDNA : Komplamenter Deoksiribonükleikasit Ct : ‘Threshold cycle’ (Eşik döngü değeri) DNA : Deoksiribonükleikasit

E : Egzersiz grubu

GAPDH : Gliseraldehit 3-P dehidrogenaz GLUT : Glukoz taşıyıcı protein

GZ-PZR : Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu İHK : İmmunohistokimyasal boyama

KA / TU : Kalp ağırlığı / tibia uzunluğu oranı

K : Standart normal yemle beslenen kontrol grubu

mRNA : ‘Messenger RNA’ (Haberci ribonükleikasit)

qPZR : Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu

PBS : ‘Phosphate buffered saline’ (Fosfat tampon salin solüsyonu)

RNA : Ribonükleikasit SVK : Sol ventrikül kalınlığı

YF : Yüksek fruktozla beslenen grup

GİRİŞ VE AMAÇ

Günümüzde, tüketilen yiyecek ve içeceklerin kalbin enerji metabolizması üzerine olan etkileri ile ilgili çalışmaların artmakta olduğunu görmekteyiz. Bunun yanı sıra egzersiz gibi kalbin iş yükünü artıran durumlarda, kalbin enerji ihtiyacının nasıl karşılandığı da araştırmacıların ilgi alanı olmuştur. Dinlenim halinde kardiyomiyositler, enerjiyi serbest yağ asitleri ve glukoz kullanımıyla elde ederler (1). Egzersiz sırasında ise kalp, serbest yağ asitleri ve glukoza ek olarak fruktoz, gliserol ve laktat gibi substratları da kullanmaktadır (2-4).

Sporcularda ya da fiziksel aktif kişilerde egzersiz performansını artırmak için hangi tür besinlerin kullanılması gerektiği üzerinde önemle durulmaktadır. Sıkça kullanılan sporcu içecekleri frukoz içermektedir. Yapılan bazı çalışmalarda bu içeceklerin yalnız glukoz kullanımına göre sporculara fazladan bir enerji desteği sağladığı, aerobik performansı artırdığı, güç artışı oluşturduğu ve yorgunluğu azalttığı gösterilmiştir (5-7). Sporcu içecekleri gibi besinlerin fazla miktarda alınması fruktozdan zengin beslenmeye sebep olabilmektedir.

Bağırsaklardan emilen fruktoz portal sisteme geçer ve büyük kısmı karaciğerde metabolize edilir. Plazma fruktozu arttığında ise kalp gibi non-hepatik dokularda fruktoz metabolizması belirgin hale gelebilir (2, 8). Fruktoz ince bağırsak, eritrositler, testis ve böbreklerde sodyumdan bağımsız ve enerji harcanmaksızın, glukoz taşıyıcı protein (GLUT) ailesinde yer alan fruktoz taşıyıcısı GLUT5 ile hücre içine alınmaktadır (8-10). Testis ve eritrositler fruktozu esas olarak enerji amaçlı kullanırlar (8). Kalp dokusunda fruktoz ve metaboliti olan fruktoz-1,6-bisfosfat’ın kardiyomiyositler tarafından alındığı, pirüvat ve laktat üretiminde kullanıldığı ve kardiyomiyosit uyarılma-kasılma kenedi üzerine etkisi olduğu rapor edilmiştir (2, 11). Kardiyomiyositlere fruktoz girişinde GLUT5’in olası bir rolünün

olabileceği düşünülse de, fruktoz girişinin kesin olarak GLUT5 aracılığıyla olup olmadığı tam olarak açıklanmamıştır (2, 12).

Akuaporinler (AQP) hücre zarlarından suyun hızlı ve yoğun geçişini sağlayan özel kanallardır. AQP’lerin alt grubu olan akuagliseroporinler ise sudan başka gliserole de geçirgenliği belirlenmiş kanallar olup, AQP 3-7-9-10 şeklinde 4 türü tanımlanmıştır (13). Son yıllardaki çalışmalarda, kardiyak dokuda AQP7 gen ifadesi olduğu gösterilmiş olup, AQP7’nin kalpte enerji substratı olarak kullanılan gliserol için kanal görevi yaptığı bilinmektedir (3, 14). Kalpte diğer bir enerji substratı olan fruktozun ise AQP7 ile ilişkisi henüz bilinmemektedir. Bu çalışmada, egzersize bağlı kardiyak AQP7 düzeyinde artış olabileceği ve özellikle egzersiz sırasında kalp metabolizmasında önemli rolü olduğu bilinen fruktozun diyetle fazla miktarda alınmasının kardiyak AQP7 düzeyini etkileyen bir faktör olabileceği hipotezlerinin test edilmesi amaçlanmıştır.

Sonuç olarak, son yıllarda günlük beslenmede fruktoz içeren gıdaların alımı giderek artmaktadır. Fruktozdan zengin beslenme sporcular tarafından da tercih edilmektedir. Egzersiz sırasında fruktozun kalbin enerji metabolizmasını etkilediği bilinmesine rağmen, bu işlevin kalpte hangi kanallar veya taşıyıcılar aracılığı ile sağlandığı ise henüz tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca yüksek fruktozlu beslenmenin ve egzersizin kalpte AQP7 gen ifadesine etkisi henüz araştırılmamıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, yüksek fruktozlu diyetin ve egzersizin kardiyak AQP7 ve GLUT5 gen ifadesine etkisini araştırmaktır.

GENEL BİLGİLER

KALBİN ENERJİ METABOLİZMASI

Kalp kası hücreleri enerji kaynağı olarak yağ asidi, glukoz, fruktoz, gliserol, laktat ve keton cisimlerini kullanır (Şekil 1). İyi perfüze olan bir kalpte, enerjinin %60-90’ı yağlardan, %10-40’ı karbonhidratlardan elde edilir (15). Plazma glukozunun azaldığı açlık gibi durumlarda ve plazma yağ asitlerinin arttığı veya insülinin azaldığı durumlarda ise kalbin başlıca enerji substratı keton cisimleri olmaya başlar. Kreatin fosfat kalpte diğer bir yüksek enerjili fosfattır ve adenozin trifosfatın (ATP)'nin başka bir kaynağı olarak iş görür (Kreatin fosfat+ADP+H+ Kreatin+ATP) (16, 17).

Miyokardda enerjinin yaklaşık %25’i kalp dokusunun bazal metabolizması için gerekliyken, %75'i kasılma-gevşeme ile ilgili olaylarda gereklidir. Bu kasılma-gevşeme sürecinde ATP’nin yaklaşık %70’i miyofibriler aktin/miyozin çapraz köprü döngü sürecinde kullanılırken, geri kalan %25’i sarkoplazmik retikuluma kalsiyumun geri alınmasında, %5’i ise sarkolemmal Ca++-ATPaz ve Na+/K+-ATPaz pompası tarafından sağlanan iyon gradyentinin düzenlenmesinde kullanılır (17, 18).

Enerji hammaddelerinin enerji veren moleküllere çevrilmesi, glikoliz ve/veya Krebs siklusu yoluyla olur. Kalpte enerji ihtiyacının hemen tamamı aerobik metabolizmadan sağlanır. Karbonhidratlar hücre zarını geçtikten sonra ya glikoliz yoluna girer veya glikojen olarak depo edilir. Serbest yağ asitleri de hücre zarını geçtikten sonra, sitoplazmada asetil koenzim A’ye dönüşür. Daha sonra oluşan asetil koenzim A mitokondri zarlarını geçerek ya Krebs siklusuna girer ya da β-oksidasyon ile indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid ve flavin adenin dinükleotide dönüşerek direkt elektron taşıma zinciri yoluna girer. Sonuçta aerobik glikoliz ve sitrik asit siklusu ile 36 ATP elde edilirken, anaerobik glikolizde ise sitrik

asit siklusu gerçekleşmediği için sadece 2 ATP elde edilir. Dinlenim durumunda kalp kası hücreleri enerji kaynağı olarak serbest yağ asitlerini ve glukozu kullanırken, egzersiz gibi süreçler sırasında kalbin enerji kaynağı olarak kullandığı substratlar, dinlenim durumundan daha farklıdır. Egzersiz sırasında kalp, serbest yağ asitleri ve glukoza ek olarak fruktoz, gliserol ve laktat gibi substratları da kullanmaktadır (2-4, 15). Ayrıca keton cisimleri de ihtiyaç halinde ATP elde etmek için kardiyomiyositte metabolize edilir (Şekil 1).

Şekil 1. Kalbin enerji kaynakları ve ATP üretimi (13, 16 ve 17 no'lu kaynaklardan uyarlanmıştır).

EGZERSİZ VE KALP

Fizik aktivite ve egzersiz, tarih boyunca, yaşamın bütün dönemlerinde büyük bir öneme sahip olmuştur. Milattan önce ve sonraki dönemlerde egzersiz ve sağlık arasında birçok ilişki kurulmuş, Çin’de Tai-Chi Chuan, Hindistan’da Yoga felsefesi gibi fiziksel uygunluğu geliştirmeye yönelik öğretiler milattan önceki dönemlerde başlamıştır. Dini inanç sistemleri ve eski Yunan mitolojisinde de sportif aktivitelere teşvik ve övgü vardır. Bunun yanı sıra egzersiz ve tıp arasındaki ilişkinin Hipokrat ve Galen dönemlerine kadar uzandığı bilinmektedir (19, 20).

MAT: Monokarboksilik asit taşıyıcı PDH: Piruvat dehidrogenaz CK: Kreatin kinaz Cr: Kreatin PCr:: Fosfokreatin SR: Sarkoplazmik retikulum

NADH: indirgenmiş Nikotinamid adenin dinükleotid FADH2: indirgenmiş Flavin adenin dinükleotid

Kardiyomiyosit

MAT

Gliserol

Tanım olarak fiziksel aktivite ve egzersiz birbirlerine benzer olarak düşünülse de esas olarak fiziksel aktivite; iskelet kasları tarafından gerçekleştirilen ve enerji harcanmasına yol açan vücut hareketleridir. Egzersiz ise fiziksel aktivitenin alt sınıfı olarak kabul edilen planlı, istemli ve belli bir amacı olan sürekli aktivitelerdir (21).

Egzersiz, kardiyovasküler sistemi etkileyen fizyolojik bir stres olduğundan, kalbin performansını ve fonksiyonlarını değerlendirmede de kullanılır. Egzersiz esnasında istirahate göre kalp debisi ve metabolizma hızı artar. Bu artış egzersizin tipi, yaş, kilo, cinsiyet, vücut kitle indeksi gibi faktörlerin yanı sıra, kalp, solunum ve dolaşım sistemi hastalıkları veya metabolik hastalıkların varlığına bağlı olarak değişir (22).

Egzersiz Tipleri

Egzersiz; statik (izometrik) egzersiz, dinamik (izotonik) egzersiz ve direnç (izotonik ve izometrik) egzersizler olarak sınıflandırılabilir (23). Bundan başka aerobik/anaerobik veya dayanıklılık/güç isteyen egzersizler şeklinde de sınıflandırmalar mevcuttur.

Statik (izometrik) egzersiz: Bu tip egzersiz, kasılan kasın boyu değişmeden,

geriminin artması ile yapılan egzersizdir. Ele alınan bir alışveriş poşetini dirsek ekleminde herhangi bir hareket yapmadan taşıma, bir duvarın karşısına geçip gövde sabit olacak şekilde duvarı ittirmeye çalışmak statik egzersizlere örnektir (24).

Dinamik (izotonik) egzersiz: Bu tip egzersizde ise egzersiz sırasında kas liflerinde

kısalma vardır. Yürüme, koşma, yüzme gibi fiziksel aktiviteler dinamik egzersize örnektir. Ayrıca stres testlerinden en sık kullanılan kardiyopulmoner egzersiz testindeki yürüme egzersizleri dinamik egzersizdir. Bu tür egzersiz protokolleri en sık kardiyovasküler rezervi değerlendirmek için kullanılır ve klinik testler için uygun olan düşük yoğunluklu bir ısınma aşamasını kapsar (23).

Dinamik egzersiz sırasında sempatik sistem aktive olurken parasempatik sistem baskılanır ve böylelikle kalp hızında artış olur. Kalp hızı, uygulanan iş yükü (egzersizin şiddeti) ile doğru orantılı olarak artar (25). Diğer taraftan egzersizde, kullanılan kaslarda belirgin vazodilatasyondan dolayı total periferik direnç azalır ve arteryel kan basıncında görülen orta derecede artış yalnız kan akımını artırmakla kalmaz, arteriyollerin çeperini gererek damar direncini daha da azaltır. Bu nedenle, kan akımı iki kat çoğalır. Bu artış, metabolik vazodilatasyonla meydana gelmiş olan artışa eklenerek en az iki kat daha fazla artışa neden olur. Böylece diyastolde ventriküle gelen kanın artmasıyla ventrikül daha fazla gerilip, daha kuvvetli kontraksiyona başlar ve atım hacmi artar (26).

Egzersize olan hemodinamik yanıt, egzersizin şiddeti ve katılan kas miktarına bağlıdır. Egzersizin erken fazında kardiyak debi artışı Frank-Starling mekanizmasının kullanılmasıyla artırılan atım hacmi ve kalp hızındaki artışla sağlanırken, daha sonraki fazlarda ise sempatik sistem aracılı kalp hızındaki artışla sağlanır (23). Ağır bir dinamik egzersiz sırasında kardiyak debi istirahattekine göre 4-6 kata kadar artabilir. Pulmoner yatak bu 4- 6 kat artışa pulmoner basınçta anlamlı artış olmadan uyum sağlayabilir. Egzersize olan kalp hızı cevabı yaş, postür, kan hacmi ve çevresel faktörler gibi birçok faktörden etkilenir. Yaşlılarda maksimum kalp hızı ve kardiyak debi beta adrenerjik yanıtın azalmasından dolayı daha düşüktür (27, 28).

Direnç (izotonik ve izometrik) egzersiz: Bu tür egzersizde kardiyovasküler yanıt,

izotonik ve izometrik bileşenlerin derecesine göre belirlenir.

Egzersizlerin çoğu yoğunluğu ve süresine göre hem dinamik hem de statik özellik taşırken, aerobik ve anaerobik kapasitelerin baskınlığı da değişmektedir (Tablo 1). Örneğin; uzun mesafe koşusu düşük statik, yüksek dinamik ve aerobik kapasite, kürek çekme ise hem yüksek statik hem de yüksek dinamik ve anaerobik kapasite gerektirir (29). Diğer bir sınıflandırma çeşidi olan dayanıklılık veya güç isteyen sporlarda da aerobik ya da anaerobik kapasitenin baskınlığı değişmektedir. Uzun mesafeli koşu, bisiklet sürme, hız pateni gibi dayanıklılık isteyen sporlarda aerobik kapasite baskınken, halter, disk atma, 100 metre hız koşusu gibi güç isteyen sporlarda ise anaerobik kapasite baskındır (30).

Tablo 1. Dinamik egzersiz tiplerinde aerobik ve anaerobik kapasitenin baskınlığı

Dinamik egzersizler

Düşük Orta Yüksek Metabolik ihtiyaç

Kızak yarışı, Kaya tırmanışı, Yelkencilik,

Gülle atma

Vücut geliştirme, Kar kayağı, Jimnastik,

Güreş

Boks, Kürek çekme, Kısa mesafeli koşu Anaerobik ATP-PCr Glikoliz Okçuluk, Otomobil yarışı, Dalış Artistik patinaj, Futbol, Ragbi

Basketbol, Futbol, Yüzme, Buz hokeyi Aerobik ve anaerobik Bilardo, Bowling, Körling, Golf Beysbol, Softbol, Tenis-eşli, Voleybol

Uzun mesafeli koşu, Bisiklet sürme, Tenis-tekli

Aerobik, Krebs Döngüsü, ETZ

Egzersizin Kardiyak İşleve Etkisi

Gerek dinamik, gerekse statik egzersizler değişik derecelerde olmakla birlikte sporcu kalbine yeni bir biçim verir. Fizyolojik değişikliklerin derecesi sporun tipine göre değişebilir. Dinamik egzersizler, kalpte sol ventrikül kitlesi ve kavite çapında artma ile karakterize eksantrik hipertrofi yaparken, statik egzersizlerde ise sol ventrikül kitlesinde artmanın oluştuğu fakat kavite çapı değişmediği konsantrik hipertrofi meydana gelir (Şekil 2). Yüksek

yoğunlukta dinamik ve statik egzersizlerin birlikte yapıldığı sporlara (kürek çekme vb.) katılan sporcularda ise eksantrik ve konsantrik hipertrofi birlikte oluşabilir (29, 31).

Şekil 2. Kalpte egzersiz tiplerine bağlı olarak oluşan hipertrofi çeşitleri.

Yapılan araştırmalar, dinamik egzersiz sırasında en çok kalp hızında, statik egzersizde ise en çok kan basıncında artış olduğunu göstermiştir. Dinamik egzersiz sol ventrikülde hacim yüklenmesine, statik egzersiz ise basınç yüklenmesine neden olur. Dinamik egzersiz kas kitlesinin oksijen tüketiminde, kardiyak debide, atım hacminde, kalp hızında ve sistolik kan basıncında belirgin artışa, ortalama arteryel basınçta orta derecede artışa ve diyastolik kan basıncında azalmaya neden olur, ayrıca total periferik direnç belirgin olarak azalır. Statik egzersiz ise kas kitlesinin oksijen tüketiminde, kalp debisinde ve kalp hızında çok hafif artışa, sistolik, diyastolik ve ortalama arteryel basınçta belirgin artışa neden olur, atım hacmi ve total periferik direnç ise değişmez (25, 29).

Egzersizden dolayı iş yükü artan kalpte enerji kaynakları da dinlenim durumuna göre farklılık gösterir. Kalp, egzersiz sırasında, başlıca enerji kaynağı olan yağ asitleri ve glukoza ek olarak fruktoz, gliserol ve laktat gibi substratları da kullanmaktadır (2-4, 15). Bu substratların kardiyomiyositlere alınmasında birtakım kanallar veya taşıyıcılar rol almaktadır. Fakat bu kanallar üzerine egzersizin etkisinin olup olmadığı ise henüz tam olarak bilinmemektedir.

AKUAPORİNLER

Hücreler çift katlı lipit tabakadan oluşan hücre zarı ile dış ortamdan ayrılır. Hücre zarı, genetik materyali, yapısal proteinleri ve yaşam için gerekli molekülleri koruyarak hücrenin yapısal bütünlüğünü sağlar ve hücreyle dış ortam arasındaki madde alışverişini kontrol eder. Tüm canlılarda en fazla bulunan, oksijenli solunumun son ürünü olan ve canlılık için vazgeçilmez bir molekül olan suyun hücre zarından geçişi, hücre hacminin ve sitoplazma osmolaritesinin düzenlenmesini sağlar. Moleküler düzeyde ise su birçok önemli molekülün konfigürasyonunda ve metabolik süreçlerde yer alır. Suyun zar boyunca hareketi uzun yıllardır araştırmacıların ilgi odağı olmuştur. Su gibi küçük ve nötral moleküller, hücre zarını pasif difüzyon ile geçebilir. Ancak suyun hızlı ve yoğun geçişi, bu iş için özelleşmiş kanallar yardımıyla olmaktadır (32, 33). Bu kanallara akuaporin adı verilmektedir.

Akuaporinlerin Keşfi

1920’lerde plazma zarının keşfinden beri suyun bu zardaki hareketi tartışma konusu olmuştur. Başlangıçta suyun geçişinin sadece pasif difüzyonla olduğuna inanılırdı. Ancak pek çok çalışmada hücre zarının sadece difüzyon ile açıklanamayan daha yüksek bir geçirgenliğe sahip olduğu saptandı (34). Hücre zarında su ve iyonların zar boyunca hareketini açıklayabilecek olan hidrofilik deliklerin olduğu 1950’li yıllardan beri bilinmektedir (35). 1957’de eritrosit zarlarında içi su dolu kanalların varlığı tespit edilmiştir (36). 1960’lı yıllarda, eritrositler gibi su geçirgenliği yüksek olan hücrelerde suyun lipid zardan difüzyon haricinde başka bir yolla da geçmesi gerektiği öne sürülmüştür. İlk olarak Benga ve ark. 1985’de insan eritrositlerinin zarında su kanal proteinlerini keşfetmişler ve bunu 1986’da yayımlamışlardır (37, 38). 1991 yılında Smith ve Agre eritrosit zarında Rh antijeniyle birlikte ‘Channel-forming Integral Protein 28’ adlı su kanalını tanımlamışlardır (39). Preston ve Agre’nin de içinde bulunduğu grup, 1992 yılında Xenopus oositleri üzerinde ‘Channel-forming Integral Protein 28’in su kanalı olabileceğini göstermişlerdir (40). 1993 yılında Fushimi ve ark. (41) renal toplayıcı tübülde su kanalının bir başka formunu tanımlamışlardır. Aynı yıl Agre ve ark. (42) ‘Channel-forming Integral Protein 28’in adını AQP1 olarak değiştirmişlerdir. AQP1 kanalından bir saniyede yaklaşık 3x109 _{su molekülü çok hızlı bir şekilde geçmektedir (34).}

Çeşitli çalışmalarıyla zarlardan su geçişinin moleküler temelini aydınlatması nedeniyle Peter Agre 2003 yılında Nobel Kimya ödülünü almaya hak kazanmıştır (43).

Akuaporinlerin Yapısal Özellikleri ve İşlevi

Akuaporin monomerleri yaklaşık olarak 28kDa ağırlığında ve genellikle zara sarılan altı sarmal ile zara sarılmayan iki kısa sarmal bölümler içerir (Şekil 3A). Akuaporinler genellikle, zarda tetramer formu ile stabil haldedir. Ancak her bir monomer ayrı su porları içerir. Yüksek çözünürlüklü teknolojiyle elde edilen veriler, zar boyunca yayılan sarmal alanların sitoplazmik ve hücre dışı dar bir sulu por ile bağlanan girişi çevrelediğini göstermektedir. Yapısal veriler ve moleküler dinamik simülasyonlar su moleküllerinin bu dar sulu gözenekte hareketli olduğunu göstermektedir. Yapısal ve elektrostatik faktörler akuaprinlerin su selektivitesinden sorumlu faktörler olarak kabul edilir. Bu porlar akuagliseroporinlerde sadece suya özgül olan akuaporinlerden daha dardır (sırasıyla 2.8 Å, 3.4 Å) ve hidrofobik artıklar ile kaplıdır. Şekil 3B’de gösterilen kum saati modeline göre su kanalları asparajin-prolin-alanin bölgeleri içermekte ve zarı altı kez geçmektedir. Kanal proteininin hem amino hem karboksi ucu sitozolik yüzdedir ve A, C ve E bölgelerinin dış yüzde, B ve D bölgelerinin ise sitoplazmik yüzeyde dönüş yaptığı görülmüştür. Asparajin-prolin-alanin bölgelerindeki B ve E dönüşleri bitişik konuma getirilerek kum saatinin merkezinde sınırlandırılmış bir alan oluşturulmakta ve Asparajin-prolin-alanin tekrar bölgesinin yanındaki su akışı tek sıra halinde gerçekleşmektedir (44, 45).

Şekil 3. Lipid zarda yer alan akuaporin kanal yapısı. A-Zara sarılan altı sarmal ile zara sarılmayan iki kısa sarmal bölümler, B-Kum saati modeli.

Akuaporinlerde su gibi küçük moleküllerin geçişine izin veren, bir boğaz bölgesi mevcuttur. Dar segmentli bu kanalda, daralma bölgesi ve elektrostatik çekimle kontrol edilen giriş bölgesi 2,8 A˚ çapında olup tek bir su molekülündeki Van der Waals çapıyla benzerlik göstermektedir. 20 A˚ çapındaki kanalı çevreleyen aminoasitler (fenilalanin, histidin, sistein ve arginin) hidrofobiktir. Kanalın etrafında yer alan fenilalanin tarafından oluşturulan alfa

heliks yapıda ikinci bir transmembran zincir vardır. Arjinin (R195) kanal içindeki pozitif yük sabitliğini sağlar ve histidin (H180) de nötr pH’da kısmen pozitif yüklüdür. Bu nedenle R195 ve H180 sudan daha büyük moleküller için geçemeyecekleri kadar dar bir alan oluştururken, pozitif yüklü protonlar ve diğer katyonlar için ise elektriksel açıdan geçilmez bir alan oluşturmaktadır (Şekil 4) (34, 38, 46). Eğer bunların geçişi mümkün olsaydı, zarın her iki yanındaki kimyasal derişim ve elektrik potansiyel farklılık bozulurdu. Hem sadece suya geçiren hem de suyun hızlı geçişini mümkün kılan bu kanallarda bu özgül geçirgenliğin sebebi, akuaporinlerde dört monomerin bulunması ve tek başına su moleküllerinin geçişine izin veren her bir monomerin 2-3 A° çapında transmembran poruna sahip olmasıdır (33).

Şekil 4. Akuaporinlerde yer alan aminoasitler ve su geçişinin fonksiyonel şeması (34 no’lu kaynaktan uyarlanmıştır).

Akuaporinlerin Lokalizasyonları

Akuaporinler esas olarak zarlardan su geçişini sağlar. Ancak bazı türleri sadece suya değil, aynı zamanda non-iyonik ve küçük nötral moleküllere, nitrat, klor ve amonyak gibi iyonlara da geçirgendirler (Tablo 2). Memelilerin tüm hücre tiplerinde 13 AQP türünden (AQP0-12) bahsedilmekle birlikte 14 AQP olduğunu söyleyen yayınlar da mevcuttur (44) ve

bunlar hemen hemen vücudun her dokusunda bulunurlar (Tablo 3). Akuaporinler, özellikle suya geçirgen olan (AQP0-1-2-4-5) ve suya ek olarak gliserol gibi solütlere de geçirgen olan akuagliseroporinler (AQP3-7-9-10) olmak üzere 2 ana gruba ayrılırlar. Çoğu akuaporinler herhangi bir iyon geçirgenliğine sahip değilken, AQP6 ve AQP8’in ise özellikle iyon geçirgenliği çok yüksektir (47). Son zamanlarda tanımlanan AQP11 ve AQP12 ise süperakuaporin olarak adlandırılmakta olup henüz hangi moleküllere karşı geçirgen oldukları bilinmemektedir (48).

Tablo 2. Akuaporinleri kodlayan kromozom bölgeleri ve geçirgenlikleri (49)

Akuaporin Kromozom Geçirgenlik

AQP0 12q13 Su, nitrat, klor

AQP1 7p14 Su, nitrat, klor

AQP2 12q13 Su

AQP3 9p13 Su, gliserol

AQP4 18q22 Su

AQP5 12q13 Su

AQP6 12q13 Klor, nitrat

AQP7 9p13 Su, gliserol, arsenik, üre

AQP8 16p12 Su, amonyak

AQP9 15p22 Su, gliserol, üre, purin, pirimidin, arsenik, monokarboksilatlar

AQP10 1q21 Su, gliserol

AQP11 11q13 Bilinmiyor

Tablo 3. Memelilerde akuaporinlerin lokalizasyonları AQP 0 AQP 1 AQP 2 AQP 3 AQP 4 AQP 5 AQP 6 AQP 7 AQP 8 AQP 9 AQP 10 AQP 11 AQP 12 Kaynak-lar Kalp - + - + + + - + - + + + - (14) Beyin - + - - + - - - - + - - - (47) Göz + + - + + + - - - (50) Gözyaşı bezi - - - - + + - - - (51) Tükrük bezi - + - + + + - - + - - - - (51) Kulak - + + + + + + + + + - - - (52) Akciğer - + - + + + - - - + - - - (53) Karaciğer - + - - + - - - + + - - - (54, 55) Pankreas - + - - - + - + + - - - + (51, 56) Böbrek - + + + + - + + - - - + - (57) Safra kesesi - + - - + + - - + - - - - (58) Dalak - + - - - + - - - (55, 59) Mide - + - + + + - + + - + + - (60) Barsaklar - + - + + - - + + + + + - (60) Kadın Üreme Sistemi - + + + + + + + + + - - - (61) Erkek Üreme Sistemi + + + + - + - + + + + + - (61) Mesane - + + + - - - (62) Deri - - - + - - - - + - - (63, 64) İskelet kası - + - + + + - + - + - - - (65, 66) Düzkas - + - - - (67) Yağ dokusu - - - + - - - + - + + - - (68)

Akuaporin 7 ve Kardiyak İşlevdeki Rolü

AQP7 geni ilk olarak sıçan testisinden klonlanmış ve 28.9 kDa'luk tahmini bir moleküler kütleye sahip 269 amino asitli bir proteini kodlar. İnsan AQP7 amino asit sekansı sıçan AQP7 amino asit sekansı ile %68 oranında benzerken, fare AQP7 amino asit sekansı ile %67 oranında benzerdir (69). AQP7 insanlarda ilk olarak yağ dokusunda saptanmıştır ve “adipoz akuaporini” adı verilmiştir (70). Bu dokudaki rolü glukoneogenez için gerekli olan gliserolü sağlamaktır (71). Aynı zamanda AQP7 aracılığı ile böbrekte ve testiste gliserol geri emilimi de sağlanır (72, 73). AQP7 gen ifadesinin yağ dokusu başta olmak üzere kalp, kulak, pankreas, böbrek, mide, bağırsak, erkek ve kadın üreme sistemi ve iskelet kasında da olduğu gösterilmiştir (Tablo 3).

Kalp kası hücreleri enerji kaynağı olarak serbest yağ asitlerini ve glukozu kullanır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kalbin gliserolü de enerji kaynağı olarak kullandığı saptanmıştır (3, 13). AQP7 ile kardiyomiyositlere alınan gliserol daha sonra sitoplazmada yer alan gliserol kinaz enzimiyle gliserol 3-P’a dönüşür. Oluşan gliserol 3-P mitokondride

oksidadtif fosforilasyona uğrar ve sonuçta ATP oluşur (Şekil 5). Kalbin diğer bir enerji kaynağı olan fruktoz da hepatositlere alındıktan sonra gliserol 3-P’a dönüşüp, elektron transport zinciri yoluyla ATP elde edilir (74). Benzer bir şekilde fruktoz ve metaboliti olan fruktoz-1,6-bisfosfatın kardiyomiyositler tarafından alındığı, pirüvat üretimi olduğu ve kardiyomiyosit uyarılma-kasılma kenedi üzerine etkisi olduğu rapor edilmiştir (2, 11). Bütün bu bulgular ışığında, kalbin enerji temininde kullandığı gliserol için kanal görevi yapan AQP7 ile fruktozun ilişkisi ise henüz bilinmemektedir.

Şekil 5. Kalp kası hücresinde AQP7’nin gliserol alımındaki rolü ve gliserolün kardiyomiyositteki metabolizması (13 no’lu kaynaktan uyarlanmıştır).

FRUKTOZ VE METABOLİZMASI Fruktozun Kimyasal Özellikleri

Fruktoz, altı karbonlu bir monosakkarit olup birçok meyve ve sebzede bulunur. Beyaz ve katı bir görünümü olan fruktoz, suda kolayca çözünür. Glukoz ile aynı formüle (C6H12O6)

sahip olmasına karşın kimyasal yapıları farklıdır. Fruktoz beşli glukoz ise altılı halka yapısına sahiptir. Sükroz içinde fruktoz ve glukoz birbirlerine 1,4 glikozit bağı ile bağlıdırlar (Şekil 6).

Şekil 6. Fruktoz, glukoz ve sükrozun kimyasal formülleri. Fruktoz Kaynakları ve Kullanım Şekli

Batı diyetinde yer alan kalorinin yaklaşık %10’u (yaklaşık 55 gr/gün) fruktozdan sağlanmaktadır (75). Fruktoz; doğal halinde bal, dutsu meyvelerde, kavun ve karpuzun yer aldığı familyadaki meyvelerde, ağaç meyvelerinde, bazı kök sebzelerinde monosakkarit ve/veya sukrozun bir bileşeni olarak bulunur (76). Fruktozun diyetteki endüstriyel kaynakları ise; mısır şurubu kullanılarak üretilen tatlandırılmış ve asitli hazır içecekler, sporcu içecekleri, çikolata, kek, şekerlemeler, marmelatlar gibi hazır gıdalardır (8). Fruktoz, bu besinlerde monosakkarit halde bulunabildiği gibi sukroz adlı disakkaritin içinde de bulunabilir.

Fruktozun ticari amaçlı olarak içecek ve yiyeceklerde kullanılmasının başlıca sebepleri; diğer karbonhidratlara göre daha tatlı olması, renk ve tat geliştirmesi, donma noktasının düşük olması, nem tutma oranının hızlı ve bırakma oranının yavaş olması, pek çok ürün ile kolayca karışabilmesi, glukoz ile aynı enerji yüküne sahip olması, glukozdan daha az tokluk hissi oluşturması, raf ömrünün uzun ve maliyetinin düşük olmasıdır (77, 78).

Fruktoz Metabolizması

Fruktoz metabolizması diğer şekerlerden oldukça farklıdır. Besinlerle alınan fruktoz, çeşitli dokulara değişik tipteki glukoz taşıyıcı proteinler ile alınırlar (Tablo 4). Fruktoz, enterositin apikal kısmında yer alan, özgül bir fruktoz taşıyıcısı olan GLUT5 ile enterosite alınır. Glukozun aksine bu işlem Na+ bağımsızdır ve enerji gerektirmez. Enterosite alınan fruktoz daha sonra enterositin basolateralindeki GLUT5 ve GLUT2 ile kana verilir (Şekil 7).

Tablo 4. Memelilerde glukoz taşıyıcı protein ailesinin lokalizasyonu ve geçirgenlikleri (2, 8, 9, 12, 79-81)

Lokalizasyon Geçirgenlik GLUT 1 Hemen hemen tüm dokularda Glukoz

GLUT 2 Karaciğer, ince barsak, böbrek, pankreas, beyin Glukoz>fruktoz>galaktoz

GLUT 3 Kalp, beyin, lökosit Glukoz> galaktoz

GLUT 4 Kalp, iskelet kası, adipoz doku, pankreas,

karaciğer, nöronlar

Glukoz

GLUT 5 İnce bağırsak, iskelet kası, karaciğer, yağ dokusu,

beyin, eritrositler, testis, böbrek ve kalp

Fruktoz>glukoz

GLUT 6 Testis, beyin yağ dokusu, karaciğer, dalak Glukoz, fruktoz

GLUT 7 İnce barsak Glukoz, fruktoz

GLUT 8 Hemen hemen tüm dokularda Glukoz>fruktoz, galaktoz

GLUT 9 Böbrek, karaciğer, plasenta, ince barsak, lökosit,

kondrosit

Glukoz=fruktoz, ürik asit

GLUT 10 Kalp, akciğer, beyin, karaciğer, iskelet kası,

pankreas, plasenta, böbrek

Glukoz>galaktoz (fruktoza geçirgen değil)

GLUT 11 Kalp, iskelet kası, yağ dokusu, böbrek, pankreas:

insanlarda (fare ya da sıçanlarda yok)

Glukoz, fruktoz (galaktoza geçirgen değil)

GLUT 12 Kalp, iskelet kası, ince barsak, yağ dokusu, prostat Glukoz>galaktoz>fruktoz

GLUT 13 Beyin Bilinmiyor

Şekil 7. Fruktozun ince bağırsak lümeninden hücreye ve oradan kana geçişleri.

Kana geçen fruktozun metabolize olduğu en önemli yer karaciğerdir. GLUT2 veya GLUT5 ile karaciğere alınan fruktoz fruktokinaz enzimiyle fosforile edilerek fruktoz-1-P’a dönüştürülür. Fruktoz-1-P’dan aldolaz B enzimi ile triozlar olan dihidroksiaseton P ve gliseraldehit 3-P oluşur. Bu triozlar daha sonra, ihtiyaç durumuna göre glikolizin temel düzenleyici basamağı olan fosfofruktokinaz basamağını atlar ve glikoliz yoluyla pirüvata dönüşür. Daha sonra Krebs siklusu ve elektron taşıma zinciri yoluyla ATP elde edilebilir. Bundan başka fruktozdan oluşan trioz-fosfatın çok büyük bir kısmı glukoneogenez ile glukoza veya glikojene dönüştürülürken, küçük bir kısmı piruvata dönüştürülerek CO2 ve

suya okside olur. Diğer küçük bir kısmı ise laktata dönüştürülerek dolaşıma salınır. Fruktozdan geriye kalan karbon yapı çok düşük dansiteli lipoprotein ve trigliseridlere dönüştürülmektedir (Şekil 8) (8, 74, 82).

Şekil 8. Fruktozun hepatositlere alınması, metabolizması ve ürünlerin kana geçmesi (74 ve 82 no’lu kaynaklardan uyarlanmıştır).

Glukoz ise karaciğerde öncelikle glukokinaz ile glukoz-6-fosfata fosforile olur. Ardından fruktoz-6-fosfat ve sonrasında fruktoz 1,6-bifosfata dönüştürülür. Bu dönüşümün hızı, glikolizin temel hız kısıtlayıcı enzimi olan fosfofruktokinaz tarafından düzenlenir. Fruktoz 1,6-bifosfat, Krebs döngüsüne girmeden önce piruvata dönüştürülür. Karaciğerdeki glukozun piruvata dönüşümü insüline bağımlı iken, fruktozun trioz-fosfata dönüşümü insülinden bağımsız ve hızlı bir süreçtir. Fruktoz glikolizin temel düzenleyici basamağı olan fosfofruktokinaz basamağını atlar ve glikolitik yolda devam eder. Bu hız, fruktoz için fruktokinazın Km değerinin düşük olmasından ve ATP veya sitrat gibi moleküllerin negatif geri bildiriminden etkilenmemesinden kaynaklanmaktadır (75).

Triozfosfat izomeraz

Gliserol 3-P dehidrogenaz

ETZ: Elektron taşıma zinciri TG: Trigliserid

Fruktozdan Zengin Beslenme ve Kardiyak İşleve Etkisi

Sporcularda ya da fiziksel olarak aktif kişilerde egzersiz performansını artırmak için kullanılan içeceklerin türü üzerinde önemle durulmaktadır. Sıkça kullanılan sporcu içecekleri frukoz içermekte ve yapılan bazı çalışmalarda bu içeceklerin yalnız glukoz kullanımına göre sporculara fazladan bir enerji desteği sağladığı, aerobik performansı artırdığı, güç artışı yaptığı ve yorgunluğu azalttığı gösterilmiştir (5-7). İnsanlarda açlık kan fruktozu yaklaşık 1 mg/dL düzeylerindedir. Sporcu içecekleri gibi fruktozdan zengin besinlerin çok miktarda alınması plazma fruktoz seviyesinde yükselmeye sebep olur (83). Bağırsaklardan emilen ve portal sisteme geçen fruktozun büyük kısmı karaciğerde metabolize edilir. Plazma fruktozu arttığında ise kalp gibi non-hepatik dokularda da fruktoz metabolizması belirgin hale gelebilir (2, 8). Yapılan çalışmalarda yüksek fruktozlu diyetin kardiyak işlevde birçok etkilerinin olduğu gösterilmiştir (Tablo 5).

Tablo 5. Yüksek fruktozlu diyetin kardiyak etkileri (12)

Parametreler Etki

Kan basıncı Artar veya değişmez

Kardiyak kütle Artar, azalır veya değişmez

Kalp hızı Artar veya değişmez

Sol ventrikül sistolik fonksiyon Azalır veya değişmez Sol ventrikül anjiotensin II tip 1 reseptör Artar

Kardiyak anjiotensin II Artar

Sol ventrikül reaktif oksijen ürünleri Artar

Lipid peroksidasyon Artar veya değişmez

Kardiyak antioksidanlar Azalır

Yüksek fruktozlu diyet miyokard üzerinde yapısal ve metabolik etkilere sahiptir. Miyokardda hücresel değişiklikler üzerinde yüksek fruktoz alımının doğrudan ya da dolaylı etkisi ise henüz net olarak bilinmemektedir. Kobayashi ve ark. (84) yapmış oldukları çalışmada, fruktozdan zengin beslenmenin sol ventrikül hipertrofisine yol açtığı ve bunun renin-anjiyotensin yolağı üzerinden, dolayısıyla sempatik sinir sistemi aktivasyonundan kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. Yapılan başka çalışmalarda fruktozdan zengin beslenen sıçanlarda kardiyak α ve β-adrenerjik reseptör düzeylerinde bir artış olduğu ve yüksek fruktozlu diyetten sonra kalp morfolojisi ve performansındaki değişikliğin kısmen adrenerjik

yolaktaki artmış aktivasyon sonucu, kalbin önyük artışı ile sol ventrikül basıncının artmasıyla ilişkili olabileceği ileri sürülmüştür (85, 86). Yüksek fruktozlu diyetin kardiyak hipertrofi oluşturucu etkisi ile ilgili yapılan çalışmalara bakıldığında, kardiyak hipertrofinin beslenme süresi ile belirgin şekilde ilişkili olduğu görülmektedir (87-93).

Fruktoz ince bağırsak, iskelet kası, karaciğer, yağ dokusu, beyin, eritrositler, testis ve böbreklere GLUT5 ile alınmaktadır. Testis ve eritrositler fruktozu esas olarak enerji amaçlı kullanırlar (8). Fruktoz ve metaboliti olan fruktoz-1,6-bisfosfatın kardiyomiyositler tarafından da alındığı, pirüvat ve laktat üretiminde kullanıldığı ve kardiyomiyosit uyarılma-kasılma kenedi üzerine etkisi olduğu rapor edilmiştir (2, 11). Glukoza düşük, fruktoza yüksek afinitesi olan GLUT5 kardiyomiyositlerde polimeraz zincir reaksiyonu ve immunohistokimyasal boyama (İHK) yöntemiyle gösterilmiştir (2, 94). Ancak bu bulgular, fruktozun kardiyomiyositlerin içine girişinde GLUT 5’in olası bir rolünün olabileceğini düşündürse de, fruktoz girişinin kesin olarak GLUT 5 aracılığıyla olup olmadığı açıklanmış değildir (2, 12).

GEN İFADESİ VE ÇALIŞMA YÖNTEMLERİ

Deoksiribonükleikasitte (DNA) saklanan genetik bilgilerin bir ribonükleikasit (RNA) molekülü sentezi suretiyle kopyalanması veya yazılmasına transkripsiyon adı verilir. Transkripsiyonla RNA’ya kopyalanan, bir protein molekülüne ait genetik bilgilerin okunması veya bir protein molekülü haline çevrilmesine translasyon adı verilir. Transkripsiyon ile başlayıp translasyona giden olaylar dizisi gen ifadesi (gen ekspresyonu) olarak tanımlanır. Diğer bir deyişle gen ifadesi, DNA dizisi olan genlerin, işlevsel protein yapılarına dönüşmesi süreci için kullanılan bir terimdir. Basitçe, bu durum genlerin açık (aktif) olup olmadıkları olarak da tanımlanabilir.

Dokularda gen ifadesinin belirlenmesinde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR), Northern blots, makroarrayler, mikroarrayler, diferansiyel görüntüleme GZ -PZR, gen ifadesinin seri analizi, karşılaştırmalı sentezlenmiş dizi etiketi analizi, büyük ölçekte paralel sekanslama signatürü gibi çok çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. GZ-PZR’ın diğer yöntemlere göre daha çok tercih edilme sebepleri; teknik olarak kolay, analiz maliyeti ucuz, biyoinformatik ihtiyaçları az, floresan sinyalin gücü doğrudan çoğaltılan ürün miktarı ile orantılı olması, reaksiyon boyunca veri toplanarak aynı anda analiz yapma imkânı olması, konvansiyonel ölçümlerden 1000 kat daha az RNA ile çalışılabilmesi, PZR sonrası elektroforez gerektirmemesi, iki kat artmış değişimi belirleyebilme hassasiyetine sahip olması, duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği yüksek olması ve çok sayıda örnek çalışılabilmesidir (95, 96).

Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Saiki, Mullis ve arkadaşları tarafından 1985 yılında PZR’ın bulunmasıyla moleküler biyoloji ve moleküler tıp önemli bir aşama kaydetmiştir (97). Hem bilimsel araştırmalar hem de klinik laboratuar tanısındaki uygulama alanlarıyla büyük öneme sahip olan PZR’ın geliştirilmesindeki çalışmaları nedeniyle Kary Mullis, 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü’nü almaya hak kazanmıştır (98). PZR çeşitli örneklerden elde edilen haberci ribonükleikasit (mRNA) gen ifadesini analiz etmek için tercih edilen bir tekniktir.

PZR, 30-40 kez tekrarlanan 3 aşamadan oluşan bir yöntemdir. Bu aşamalar şunlardır: 1. Çoğaltılmak istenen DNA’nın yüksek sıcaklıkta denatüre edilerek tek zincirli hale

getirilmesi “denatürasyon” (90-95 ºC).

2. Özgül hibridizasyonun gerçekleşmesini sağlayacak sıcaklıkta (Tm değerinin 3–5 ºC altındaki sıcaklık), primerlerin hedef bölgeye bağlanması “annealing” (37-65 ºC). 3. Mg+2 iyonlarının varlığında, katalizör olan Taq DNA polimeraz enziminin en

yüksek aktivite gösterdiği 72 ºC’de zincirin primerlerden itibaren uzama “elongasyon” (70-75 ºC) basamaklarından oluşur (Şekil 9).

Şekil 9. Bir PZR siklusunu oluşturan üç aşama (99).

Polimeraz Zincir Reaksiyonunda Gerekli Olan Bileşenler

1. Amplifiye edilecek hedef DNA dizisini içeren kalıp DNA,

2. Kalıp DNA çift iplikleri ile eşleşebilen 2 tür oligonükleotid primeri (15-30 bazlık ve tek iplikli)

3. Serbest Deoksiribonükleotit trifosfatlar

4. Zincirin uzama reaksiyonunu gerçekleştiren DNA polimerazın ısıya dayanıklı bir şekli olan Taq DNA polimeraz enzimine ihtiyaç duyulmaktadır.

5. Enzimin çalışacağı uygun koşulları sağlayan tampon sistemine ihtiyaç vardır.

Genellikle kısa zincirli olan oligonükleotidler, birbirlerinden dizin olarak farklıdır. Primerlerin sekansı, çoğaltılacak hedef DNA’ya komşu olan tanımlama bölgelerine eştir. Denatürasyon, primer birleşmesi ve primer uzaması PZR metodunda bir döngüyü oluşturur. Her döngünün sonunda yeni sentezlenen DNA zincirleri, bir sonraki döngü için hedef zincir olabilir. Bu reaksiyonun ana ürünü, sonu oligonükleotid primerlerin 5’ ucu olan ve uzunluğu primerler arası uzaklıkla tanımlanan bir çift iplikli DNA parçasıdır. Başarılı bir amplifikasyonun ilk döngüsünün ürünleri, iki primerin bağlanma bölgeleri arasındaki uzaklıktan daha fazla uzunluğa sahip, farklı boyutlarda DNA moleküllerdir. İkinci döngüde, istenen uzunluktaki DNA zincirleri oluşur. Bu ürünün miktarı diğer amplifikasyon döngülerinde lineer olarak çoğalır ve reaksiyonun temel çıktısını oluşturur (Şekil 10). Amplifikasyon, başlangıçtaki ana zincirin reaksiyon sonundaki kopya sayısı biçiminde aşağıdaki formülle açıklanır:

(2n-2n)x

Burada n döngü sayısı, 2n ilk ve ikinci döngüden sonra elde edilen uzunluğu bilinmeyen ürünler, x ana zincirin kopya sayısıdır. Potansiyel olarak 20 döngüden sonra her döngüde %100 başarı ile 220 _{kez amplifikasyon olacaktır. PZR’ın başarısı, uygulanan}

Şekil 10. DNA’nın PZR ile üstel çoğaltılması (99).

Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Gen İfadesi Ölçümü

Bir gen ifadesi ölçümü için alınan doku örneğinden RNA izolasyonu yapılır. Ardından RNA ters transkripsiyon ile komplamenter DNA (cDNA)’ya kopyalanır. Ters transkripsiyon basamağı, hassas ve doğru bir miktar tayini için çok önemlidir. Çünkü üretilen cDNA miktarı doğru mRNA'ların giriş miktarını yansıtmaktadır. Oluşan DNA molekülü, PZR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan işaretli prob ve boyaların kullanıldığı, floresanın oluşan DNA ile doğru orantılı olarak arttığı bir çoğaltma yöntemi olan GZ-PZR ile çoğaltılır. Ardından elde edilen verilerin analizi yapılır (Şekil 11).

Şekil 11. Biyolojik numunelerden RNA ve DNA analizi (98, 101). PROTEİN İFADESİ VE ÇALIŞMA YÖNTEMLERİ

Dokularda gen ifadesi oluştuktan sonra ürün olarak protein oluşur. Herhangi bir protein ya da proteinden oluşmuş yapının vücutta incelenmesinde, protein ifadesine bakmak da gen ifadesi sonucunu destekleyicidir. Protein ifadesi, DNA dizisi olan genlerden, işlevsel proteinin sentezlenmesi için kullanılan bir terimdir. Western blot, ELISA ve İHK gibi protein analiz yöntemleri, dokudaki spesifik bir proteini analiz etmeyi sağlayan moleküler biyoloji teknikleridir. Bu teknikler sayesinde dokuda bulunan bir proteinin varlığı, lokalizasyonu, büyüklüğü, konsantrasyonu, konsantrasyon değişimleri, farklı gruplar arasındaki konsantrasyonlarının karşılaştırılması vb. araştırılabilir. İHK yöntemiyle sentezlenen proteinin dokulardaki lokalizasyonu gösterilebilmektedir.

İmmunohistokimyasal Boyama Yöntemi

İmmünohistokimya; belli bir dokuda bulunan antijenlerin gösterilmesi için işaretlenmiş antikorların kullanılmasıdır. Belirli antijenler içeren doku kesiti, bu antijenlere karşı işaretlenmiş antikorlar içeren bir solüsyonda inkübe edildiği zaman, antikorlar spesifik olarak antijenlere bağlanır. Böylece antijen-antikor komplekslerinin yerleşimleri ya ışık (immünohistokimya) ya da elektron mikroskopla (ultrastrüktürel immunositokimya) gözlenebilir.

İmmunohistokimyasal boyama yöntemleri uygulanışlarına göre ikiye ayrılır. Direkt yöntemde; antijene karşı oluşturulan antikor işaretlenerek (bu bir enzim, fluoresan bir madde, radyoaktif madde veya bir metal olabilir) antijen-antikor kompleksi esasına göre sonuç alınır.

İndirekt yöntemde; herhangi bir antijene karşı antikor çeşitli hayvanlarda üretilir. Örn; tavşan immunoglobulinleri, keçi ve koyun gibi bir başka hayvanda, bir antikor cevabının başlatılmasından sorumlu olup, böylelikle bir antiantikor oluşur. Antijen içeren bir doku kesiti işaretlenmemiş tavşan antiantikorlan ile inkübe edilir. Yıkamadan sonra, işaretlenmiş tavşan antiantikorlan eklenir ve antijenin yeri işaretlemeye uygun olan mikroskopla görülebilir. Her bir antiantijen antikoru, işaretlenmiş antiantikorun bazı moleküllerini bağladığı için indirekt yöntem direkt yöntemden daha duyarlıdır (102).

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Bu çalışma; Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu onayı alındıktan sonra (Ek 1) Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Birimi, Fizyoloji Anabilim Dalı İzole Kalp Laboratuvarı, Biyofizik Anabilim Dalı Laboratuvarı ve Patoloji Anabilim Dalı’nda gerçekleştirildi. Ayrıca bu çalışma Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir.

DENEKLER

Bu çalışmada, yaklaşık 300-400 gr ağırlığında, 48 adet erkek Sprague-Dawley sıçan kullanıldı. Deneyde kullanılan sıçanlar, Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Birimi’nden temin edildi ve daha sonraki tüm deneysel aşamalar boyunca yine aynı birimde, standart koşullar (23±2 o

C oda sıcaklığı, % 60 nem oranı, 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık ritim) altında barındırıldı.

Bu çalışmada her grupta 12’şer hayvan olmak üzere toplam 4 grup oluşturuldu.

Kontrol grubu (K grubu): standart normal yemle beslenen, Egzersiz grubu (E grubu):

standart normal yemle beslenen ve egzersiz yaptırılan, Yüksek fruktoz grubu (YF grubu): Yüksek fruktozlu yemle beslenen, Yüksek fruktoz ve egzersiz grubu (YFE grubu): Yüksek fruktozlu yemle beslenen ve egzersiz yaptırılan gruplar olarak tanımlandı (Tablo 6). Deneyde yer alan tüm sıçanlar önceden belirlediğimiz numaralandırma yöntemiyle numaralandırılarak kafeslere dağıtıldı. Tüm gruplara 28 gün boyunca uygun diyet ve su sınırsız olarak verildi. Standart normla yem içeriğinde % 24 protein, % 5,5 yağ, % 11 karbonhidrat ayrıca sellüloz, vitamin ve mineral karışımı bulunmaktaydı. MBD Yem Ticareti®’nden toz halinde olan temin edilen ve daha sonra pelet haline getirilen yüksek fruktozlu yem içeriğinde daha önce

yapılan çalışmalara benzer şekilde % 60,4 fruktoz, % 18,3 protein, % 5,2 yağ, ayrıca sellüloz, vitamin ve mineral karışımı bulunmaktaydı (103).

Tablo 6. Çalışmada yer alan gruplar ve beslenmeleri Grup Diyet

K Standart normal yemle beslendi.

E Standart normal yemle beslendi.

YF Yüksek fruktozla beslendi. YFE Yüksek fruktozla beslendi.

DENEY DÜZENİ

Bu çalışmada, deney prosedürüne dâhil edilen sıçanların deney başlangıcında ağırlık ölçümleri yapıldı ve veriler kaydedildi. Hayvanların kuyrukları uygun şekilde numaralandırıldı. Çalışmada sıçanların barınmasını ve beslenmesini sağlayacak özelliklere sahip kafesler kullanıldı. Kafeslerin üzerine sıçanların beslenebilmeleri için yem ve su konulabilecek özellikteki metal yemlikler yerleştirildi. Bu yemlikteki su ve yem miktarı her gün kontrol edilerek yenilendi. E ve YFE gruplarına sakrifiye edilmeden önceki 23-28. günlerde orta düzeyde yürüyüş / koşu şeklinde egzersiz yaptırıldı. Tüm sıçanların 28. günde ağırlıkları tekrar ölçüldü. 28. günde sakrifikasyon öncesi intraperitoneal olarak tyopental (100 mg/kg) anestezisi uygulandı. Ayak sıkıştırma yöntemiyle anesteziye girdiği tespit edildikten sonra göğüs bölgesi median hattan insizyon ile açılarak kalp bir bütün olarak steril ortam alanına çıkarıldı. Kardiyak hipertrofi parametresi olan kalp ağırlığı/tibia uzunluğu oranını belirlemek için hassas terazi ile kalbin ağırlığı ölçüldü ve tibia boyu belirlendi. Ardından kalpler % 10’luk formole konuldu. Daha sonra kardiyak dokuda AQP7 ve GLUT5 gen ifadesi ölçümü ve immunohistokimyasal değerlendirme yapmak üzere parafine gömüldü (Şekil 12).

İlk gün:

ağırlık ölçülmesi ve kafeslere dağıtılması

28 gün beslenme

Normal diyet Yüksek fruktozlu diyet

K grubu E grubu YFE grubu YF grubu

Şekil 12. Deney prosedürü şeması. Egzersiz İşlemi

Egzersiz gruplarındaki hayvanlar koşu bandı içinde modifiye platformların bulunduğu bölmelere yerleştirildi (Şekil 13). Egzersiz gruplarına egzersiz programına başlamadan 3 gün öncesinden alıştırma yürüyüşleri yaptırıldı. Grup YFE’ye yüksek fruktozlu diyet ile beslenmeye başlanmasının 23. günden itibaren, grup E’ye ise normal yem ile beslenmeye başlanmasının 23. günden itibaren birbirini takip eden 4 gün boyunca her sabah 10:00-12:00

23-28. gün egzersiz

28. gün ağırlık ölçülmesi ve ardından anestezi ve sakrifikasyon

Kalplerin çıkarılıp tartılması

Kalplerin parafine gömülmesi

AQP7 ve GLUT5 gen ifadesi ölçümü ve immunohistokimyasal değerlendirme Tibia uzunluğu ölçümü Kardiyak hipertrofi belirlenmesi

saatleri arasında koşu bandında 15 dk boyunca 0,5 km/saat hızda hafif düzey egzersiz yaptırıldı. Bu günlerde yaptırılan egzersizler 5. günde yapılacak olan orta düzey egzersiz için bir hazırlık ve uyum sürecini sağladı. Deney sürecinin son günü olan 5. gün 25 dk süren 0,9 km/saat hızda egzersiz yaptırıldı (Tablo 7). Deney sonunda toplamda 3 hayvan çalışma dışı bırakıldı.

Şekil 13. Deneklerin egzersiz programına alındığı koşu bandı ve deneklerin palet üzerinde yerleşimini sağlayan bölmeli palet üstü kabin sistemi.

Tablo 7. Egzersiz grubunda yer alacak sıçanlara uygulanan egzersiz programı

Egzersiz Parametreleri Beslenmenin 24. Günü Beslenmenin 25. Günü Beslenmenin 26. Günü Beslenmenin 27. Günü Beslenmenin 28. Günü Hız (km/saat) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,9 Eğim Açısı (°) 0 0 0 0 0 Süre (dak) 15 15 15 15 25

AQP7 VE GLUT5 GEN İFADESİ ÖLÇÜMLERİ

Dokuların Alınması

Steril alana çıkarılan kalpler hızla %10’luk formol ile tespit edildi. Sonrasında parafin bloklar hazırlandı. Dokulardan GZ-PZR ile AQP7 ve GLUT5 genlerinin mRNA miktar tayini için parafin bloklardan 10 µm’lik 4’er kesit alındı ve ependorf içine konuldu.

Deparafinizasyon

1. Ependorf içindeki kalp dokularından parafini uzaklaştırmak için herbirinin üzerine

800 µl ksilen eklendi. Vorteks cihazı ile karıştırıldı.

2. Üzerine 400 µl absolute etanol eklendi ve vortekslendi. 2 dk 16.000 g’de santrifüj

edildi. Süpernatant dikkatlice atıldı.

3. 1ml absolute etanol eklendi vortekslendi. 2 dk 16.000 g’de santrifüj edildi.

Süpernatant dikkatlice atıldı.

4. Pellet içindeki etanol uzaklaşana kadar tüm ependorfler kapakları açık olarak +55

°C de 10 dk tutuldu. Peletin kuruması sağlandı. Eğer gerekli olursa kuruması için süre 20 dk veya daha fazla uzatıldı.

Ribonükleikasit izolasyonu

1. Parafinden uzaklaştırılan doku örnekleri üzerine 100µl RNA Tissue Lysis Buffer

(Doku lizis tamponu), 16 µl Sodyum dodesil sülfat ve 40 µl proteinaz K ilave edildi. Vortekslendi. Kısa bir spin yaptırıldı. İnkübasyon için +85 °C de 30 dk 600 rpm de ısı bloğunda tutuldu.

2. Blok sıcaklığı +55 °C ye indirildi. Örnekler alındı. +60-65 °C ye ulaştığında

örnekler tekrar bloğa yerleştirildi. Sıcaklık +55 °C ye ulaştığında 80µl Proteinaz K eklendi. Vortekslendi, kısa bir spin yaptırıldı. +55 °C de 600 rpm hızda 30 dk bekletildi. Eğer partikül varsa 10 dk daha inkübasyon işlemi uzatıldı.

3. Ependorfların içine 325 µl RNA Binding Buffer (bağlayıcı tampon) ve 325 µl

etanol eklendi. Vortekslendi ve lizat özel filtreli tüpe alındı. 6000 g’de 30 sn santrifüj edildi. Filtreden geçen karışım atıldı.

4. Yeni toplama tüpüne geçildi ve 2 dk 16.000 g de filtre kurutuldu.

5. 100 µl DNA working solution (çalışma solüsyonu) eklendi. 15 dk oda sıcaklığında

inkübasyon için beklendi. (DNA çalışma solüsyonu, Herbir örnek için 10 µl DNase 1 + 90 µl DNase inkübasyon tamponu hazırlanıp karıştırıldı.)

6. 500 µl Wash Buffer I (yıkama solüsyonu) eklendi. 30 sn 6000 g’de santrifüj edildi.

Filtreden geçen karışım atıldı.

7. 500 µl Wash Buffer II eklendi. 30 sn 6000 g’de santrifüj edildi. Filtreden geçen

karışım atıldı. Ardından aynı işlem 1 kez daha yapıldı.

8. Filtre 2dk 16.000 g’de filtre kuruyuncaya kadar santrifüj edildi. Filtre 1,5 ml’lik

ependorfe alındı.

9. 50 µl Elution buffer (elusyon tamponu) eklendi. Oda sıcaklığında 1 dk beklendi.

6000 g’de 1 dk santrifüj edildi.

10. Ependorf tüpü içerisinde elde edilen RNA -80 °C de saklandı.

Ribonükleik asit ve komplamenter deoksiribonükleik asit miktarının ölçülmesi

İzole edilen RNA’ların saflık ve miktar tayinleri Denovix Marka DS-11+ Model Mikro Hacimli (Nanodrop) Spektrofotometre ile yapıldı. Elde edilen RNA’lar RT-Premix ile cDNA’ya dönüştürülerek DNA gibi Amlifikasyon kontrolü sağlandı (Şekil 14). GZ-PZR cihazında cDNA’ları çoğaltılması ve miktar tayini yapabilmek için; GreenStar qPZR Master Mix’ler (Kat No: K-6210) kullanıldı. cDNA sentezi gerçekleştirildi. Uzun dönemli saklama -80 0C’de, daha kısa dönemli saklama -20 0C’de tutuldu.

Şekil 14. Elde edilen DNA’ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonların yeterliliği.

Oligo Sentezi

Tüm gruplarda; AQP7 ve GLUT5-18S genlerine hedef gen ifadelerini tespit etmek amacıyla Bioneer Marka Primer setleri (S-1001) kullanıldı. Elde edilen RNA’lar RT-Premix

ile cDNA’ya dönüştürülerek DNA gibi Amplifikasyon kontrolü sağlandı, GZ-PZR cihazında cDNA’ları çoğaltılması ve miktar tayini yapabilmek için; GreenStar Kantitatif-PZR (qPZR) Master Mix’ler (Kat No: K-6210) kullanıldı.

Primer veya problar, kullanılan Q-PZR cihazının özelliklerine uygun olarak dizayn edildi (Tablo 8). Primer setlerinin, % 20-80 oranında Guanin (G) – Sitozin (C) içermesine, özellikle G ile benzer çalışan nükleotitlerden ve probun 5’ ucuna G bazı gelmemesine, seçilen dizide G’den çok C bazı olmasına, melting temperature (Tm) sıcaklığının 65-85 oC arasında

olmasına dikkat edildi (Şekil 15).

Tablo 8. Gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılacak akuaporin 7 ve glukoz taşıyıcı 5 primerleri

AQP7 gen ifadesi için:

(Primer Forward) 5’ ATC CTT GTT TGC GTT CTT GG 3’ (Primer Reverse) 5’ GCG TGA ATT AAG CCC AGG TA 3’

GLUT5-18S gen ifadesi için: (Slc2a5; real time PCR):

(Primer Forward) 5’ TCG AGG CCC TGT AAT TGG AA 3’ (Primer Reverse) 5’ CCC TCC AAT GGA TCC TCG TT 3’

Şekil 15. Primer ve Dimer kontrolü için yapılan çalışmanın melting curve plotları.

Kantitatif-PZR deneylerinde GreenStar qPZR Master Miks ve primer setleri kullanıldı. Primerin gen bölgelerinin arttığını veya azaldığını saptamak için SYBR Green I boyası ile

DNA üzerinde oluşan sinyalin, FAM filtresi kullanılarak floresan miktarı ölçüldü (Şekil 16) ve aynı diziye sahip olmayan gen bölgelerinde farklı amplifikasyon eğrileri elde edildi (Şekil 17).

Şekil 16. SYBR Green I boyasının çift zincirli DNA’ya bağlanmasıyla ışıma artışı.

Şekil 17. Amplifikasyon eğrisi ve eşik değeri.

Master Miksler ve Kantitatif-Polimeraz Zincir Rekasiyon Koşulları

GreenStar qPZR Master Mix protokolünün kullanılmasında, 20 µl’lik reaksiyon hacmi hazırlamak için 1-100 ng arasında cDNA eklenmesini önermekteydi. Ekstraksiyon cihazından elde edilen RNA miktarları 200 ng’ın üzerinde olduğu için bu çalışmada kullanımı uygundu. Çalışmada Bioneer Marka AccuPower GreenStar qPZR PreMix (Kat No: K-6210) kullanıldı. Absolute Quantification çalışmasından (Kantitatif Analizlerde) sonra yapılan gen ifadesi test

deneylerinde, primerlerin ve örnek cDNA (veya Negatif Kontrol için PCR Grade suyun) hazır reaksiyon tüplerine eklendi, PZR Grade su ile son örnek hacmi 20 µl’ye tamamlanarak çalışıldı. Tüpler Q-PZR chazına yüklenmeden önce, homojenliğin sağlanması için hem vortex hem de spin işlemine tabi tutuldu.

Gerçek Zamanlı-Polimeraz Zincir Reaksiyon Protokolü

Hazırlanan karışımlar, optik şeffaf filme kaplı 0,2ml’lik PZR tüpleri içerisinde vortekslenerek homojenliği sağlandıktan sonra Q-PZR cihazına yerleştirildi. Deneylerin amplifikasyon koşulları, (SyberGreen Master Mix için gerekli sıcaklık, süre ve döngü sayıları) titizlikle optimize edildi (Tablo 9, 10 ve 11).

Tablo 9. Gerekli karışımlar

Tablo 10. Reaksiyon karışım miktarları

Standart Eğri ve Polimeraz Zincir Reaksiyon Verimliliği

Gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu analizinde önemli bir aşama olan bağıl kantitasyon ölçümünde, örneklerin karşılaştırmalı gen ifadelenme düzeyinin hesaplanması için PZR verimliliği hesaplandı. AQP7, GLUT5 ve gliseraldehit 3P dehidogenaz (GAPDH) primerlerinin PZR verimini hesaplarken, cDNA’lardan karışım yaparak tek bir örneğin 5 farklı dilüsyonu yapıldı ve buradan standart doğru oluşturuldu (Şekil 18).

Şekil 18. ‘Standart doğru’ oluşturup örneklerin kopya sayılarını bulabilmek için kullanılan seri dilüsyon standartları.

PZR verim katsayısı (PCR efficiency) 10(-1/slope) formülü kullanılarak elde edildi. Sonuç olarak standart curve oluşturuldu ve bu tabloya göre sonuçlar yorumlandı (Şekil 19).

Şekil 19. Polimeraz zincir reaksiyon verimi (R2_{) hesaplanarak oluşturulan standart}

eğrisi.

SYBR Green yöntemiyle yapılan Q-PCR’ın başlangıcında ortamda tek zincirli cDNA molekülü, primerler ve reaksiyon tampon çözeltisi içinde SYBR Green I boyası bulunmaktaydı. Bağlı olmayan serbest cDNA molekülü tek zincirli olduğu için çok az bir floresan ışıma yapmaktaydı. Primerler bağlanıp uzama başladığında ise SYBR Green I, çift zincirli cDNA’nın arasına girerek floresan yayılımı başlattı. Başlangıçtaki döngülerde zayıf olan floresan sinyal; oluşan gen ifadesine bağlı olarak belirli sayıda çoğaltım sonrasında ilerleyen döngülerde hızla artmaya başladı (Şekil 15). Bu artış miktarı Q-PZR cihazının 2D-CCD kamerasının algılayabildiği miktara ulaştığında Ct (Threshold cycle=Eşik döngü değeri) olarak algılandı ve analiz yazılımı bu değerleri kullanarak sonuç verdi.

Eşik Döngü Değeri

Eşik döngü değeri GZ-PZR yönteminde önemli bir değişkendir. Ct değeri, amplifikasyon sırasında saptanan floresan ışınımın eşik değerinin aşıldığı döngü sayısıdır. Başka bir deyişle üründeki ilk anlamlı artışın olduğu noktayı gösterir (Şekil 20).

Şekil 20. Amplifikasyon eğrisi ve eşik değeri.

Florimetrik PZR tekniğiyle yapılan kantitatif çalışmalarda, kalıp DNA miktarı bilinen standart örneklere ait Ct değerleri ile incelenen örneğin Ct değeri karşılaştırılarak yapılmaktadır. Bu nedenle, kantitatif PZR analizlerinde standart olarak tanımlanan kontrol örneklerine ihtiyaç duyulur (104).

Standartlar, her bir kopya için Ct değerleri ile ‘Satandart Doğru’ oluşturabilmek için kullanıldı. Yazılım, miktarları yani kopya sayıları arasındaki farkı bilinen standartlar kullanarak bir doğru çizdi, örneklerin Ct değerlerini bu doğruya göre kıyaslayarak örneklerin başlangıçtaki kopya sayılarını hesapladı. Hedef miktarı ile kopya sayısı oranı doğru orantılı olduğu için, örnekler ve kontroller arasındaki amplifikasyon oranı veya kıyası hesaplandı (Şekil 21 ve 22).

Şekil 21. Standart doğru ve Ct değerleri ile konsantrasyonlar arasındaki ilişki.

Şekil 22. Örneklerin standart doğruya oranları ile kopya sayılarının bulunması.

Hesaplanan indüksiyon katsayı değerlerine göre deney grubundaki gen ifadesi seviyelerinin kontrol grubuna göre gen ifadesi seviyesindeki kat şeklindeki artış/azalış (fold change) olarak ifade edilmiştir. Gen ifadesi verilerinin karşılaştırılması rölatif kantifikasyon ile karşılaştırma yaklaşımıdır. Rölatif kantitasyon yöntemi tüm gen ifadesi analizleri için veya

rölatif gen seviyelerinin belirlenmesi için uygundur. Bu yöntemde hedef genin konsantrasyonu, aynı örnekteki hedef-referans gene oranı şeklinde ifade edilir. Rölatif kantitasyon yöntemleri başlangıç örnek miktarındaki varyasyonlar, cDNA sentezi verimliliği ya da örnek yükleme/pipetleme hataları gibi nicelik ve nitelikteki farklılıkları düzeltir. Hedef ve referans gen miktarı PCR verimliliğinin ve örnek CP (=Ct) değerinin bir fonksiyonu olduğu için, herhangi bir standart eğri gerekmez. Referans gen olarak, GAPDH, β-aktin gibi tüm hücrelerde eksprese edilen, hücre canlılığı için gerekli ve deneysel uygulamalarda dahi ekspresyon düzeyleri sabit kabul edilen “Housekeeping Gen”ler kullanılır. Elde edilen Ct değerleri referans genin (GAPDH) Ct değeri ile Pfaffl metodu (105) uygulanarak aşağıdaki formüle göre normalize edilerek oran hesaplandı.

E= PZR verimi (EAQP7 ve EGLUT5=1,4817, EGAPDH=1,7183 olarak hesaplandı).

CP=Ct (Crossing point=threshold cycle).

ΔCP referans gen=Referans genin kontrole ait CP değeri-referans genin örneğe ait CP değeri ΔCP hedef gen=Hedef genin kontrole ait CP değeri-hedef genin örneğe ait CP değeri

Housekeeping Genlerin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyon Çalışmalarındaki Önemi

Çeşitli koşullarda ifade düzeyi değişmediği bilinen ve en az etkilenen bir referans gene, GZ-PZR yönteminde normalizasyon amacı için ihtiyaç vardır. Özellikle farklı deneklerden ya da aynı denekten farklı dönemlerde alınan örneklerle yapılan araştırmalarda, ilgilenilen genin ifade düzeyinin incelenebilmesi için dokularda ifadesi değişmediği varsayılan bir başka gen ürünü mRNA ile normalizasyon yapılması gerekmektedir. İlgilenilen genin ifade düzeyi, referans gen olarak kullanılan housekeeping genin ifade düzeyine oranlanır. Bu oranlamayla amaçlanan; izole edilen RNA miktarı ve sentezlenen cDNA miktarının getirdiği örnekler arası başlangıç farklılıklarını, deneysel hataları normalize etmektir (106).

HİSTOPATOLOJİK DEĞERLENDİRME

Çıkartılan kalp doku örnekleri oda ısısında, % 10'luk formalin solüsyonu içinde 24 saat tespit edildikten sonra tamamı uygun şekilde kasetlenerek takibe alındı. Artan oranda (% 60 - % 70 - % 80 - % 90 - % 99.9) alkol serilerinden geçirildi. Dokular, şeffaflaştırma amacıyla 2 değişim ksilene maruz tutulduktan sonra parafin içine gömüldü. Bloklarından alınan 5 mikronluk kesitlerin deparafinizasyon işleminden sonra birer tanesine öncelikle genel doku histolojik incelenmesi için hematoksilen-eozin (H&E) boyası, diğerlerine immunohistokimyasal olarak AQP7 ve GLUT5 boyaları uygulandı. Kesitlerde boyanmalar değerlendirilirken patolog grup özelliklerini bilmeden tarafsız değerlendirme yaptı. Hazırlanan preparatlar Olimpus BX-51 model ışık mikroskobu altında değerlendirildi. Kesitlerden Axioplan 2 imaging, MC80 DX programında görüntüler alınarak kaydedildi.

İMMUNOHİSTOKİMYASAL BOYAMA YÖNTEMİ

AQP7 (sc-28625) ve GLUT5 (sc-271055) için polikonal tavşan antikoru kullanılarak hazırlanmış özgül primer antikorlar Santa Cruz Biotechnology Inc® firmasından satın alınarak kullanıldı.

AQP7 İçin Boyama Ve Görüntüleme Basamakları:

1) Parafinize edilmiş bloklardan 4 µm kalınlığında mikrotom ile kesitler lam üzerine alındı.

2) 1 gece 56oC’lik etüvde bekletildi.

3) Lamlar şelalere dizilip 3 kez 56 oC’lik etüvde 10’ar dk inkübe edildi.

4) Lamlar 3 kez 10’ar dk sırasıyla % 96, 80 ve 70’lik alkol serilerinden geçirildi. 5) Distile sudan geçirildi ve ardından 5 dk disitile suda bekletildi.

6) Endojen peroksidaz aktivitesinin önlenmesi için % 3’lük H2O2 solüsyonunda 15 dk

bekletildi.

7) Distile suda 5 dk bekletildi.

8) Mikrodalga fırında en yüksek derecede % 10’luk etilendiamintetraasetikasit solüsyonunun içinde 20 dk antijen retrieval yapıldı.

9) Oda ısısında 20 dk ve ardından distile suda 5 dk bekletildi.

10) 10 dk oda ısısında % 1’lik proteaza maruz bırakıldı ve ardından yine 5 dk distile suda bekletildi.

11) Ultra V black solüsyonunda 10 dk inkübe edildi.