Ependorf tüpü içerisinde elde edilen RNA 80 °C de saklandı.

Ribonükleik asit ve komplamenter deoksiribonükleik asit miktarının ölçülmesi

İzole edilen RNA’ların saflık ve miktar tayinleri Denovix Marka DS-11+ Model Mikro Hacimli (Nanodrop) Spektrofotometre ile yapıldı. Elde edilen RNA’lar RT-Premix ile cDNA’ya dönüştürülerek DNA gibi Amlifikasyon kontrolü sağlandı (Şekil 14). GZ-PZR cihazında cDNA’ları çoğaltılması ve miktar tayini yapabilmek için; GreenStar qPZR Master Mix’ler (Kat No: K-6210) kullanıldı. cDNA sentezi gerçekleştirildi. Uzun dönemli saklama -80 0C’de, daha kısa dönemli saklama -20 0C’de tutuldu.

Şekil 14. Elde edilen DNA’ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonların yeterliliği.

Oligo Sentezi

Tüm gruplarda; AQP7 ve GLUT5-18S genlerine hedef gen ifadelerini tespit etmek amacıyla Bioneer Marka Primer setleri (S-1001) kullanıldı. Elde edilen RNA’lar RT-Premix

ile cDNA’ya dönüştürülerek DNA gibi Amplifikasyon kontrolü sağlandı, GZ-PZR cihazında cDNA’ları çoğaltılması ve miktar tayini yapabilmek için; GreenStar Kantitatif-PZR (qPZR) Master Mix’ler (Kat No: K-6210) kullanıldı.

Primer veya problar, kullanılan Q-PZR cihazının özelliklerine uygun olarak dizayn edildi (Tablo 8). Primer setlerinin, % 20-80 oranında Guanin (G) – Sitozin (C) içermesine, özellikle G ile benzer çalışan nükleotitlerden ve probun 5’ ucuna G bazı gelmemesine, seçilen dizide G’den çok C bazı olmasına, melting temperature (Tm) sıcaklığının 65-85 oC arasında

olmasına dikkat edildi (Şekil 15).

Tablo 8. Gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılacak akuaporin 7 ve glukoz taşıyıcı 5 primerleri

AQP7 gen ifadesi için:

(Primer Forward) 5’ ATC CTT GTT TGC GTT CTT GG 3’ (Primer Reverse) 5’ GCG TGA ATT AAG CCC AGG TA 3’

GLUT5-18S gen ifadesi için: (Slc2a5; real time PCR):

(Primer Forward) 5’ TCG AGG CCC TGT AAT TGG AA 3’ (Primer Reverse) 5’ CCC TCC AAT GGA TCC TCG TT 3’

Şekil 15. Primer ve Dimer kontrolü için yapılan çalışmanın melting curve plotları.

Kantitatif-PZR deneylerinde GreenStar qPZR Master Miks ve primer setleri kullanıldı. Primerin gen bölgelerinin arttığını veya azaldığını saptamak için SYBR Green I boyası ile

DNA üzerinde oluşan sinyalin, FAM filtresi kullanılarak floresan miktarı ölçüldü (Şekil 16) ve aynı diziye sahip olmayan gen bölgelerinde farklı amplifikasyon eğrileri elde edildi (Şekil 17).

Şekil 16. SYBR Green I boyasının çift zincirli DNA’ya bağlanmasıyla ışıma artışı.

Şekil 17. Amplifikasyon eğrisi ve eşik değeri.

Master Miksler ve Kantitatif-Polimeraz Zincir Rekasiyon Koşulları

GreenStar qPZR Master Mix protokolünün kullanılmasında, 20 µl’lik reaksiyon hacmi hazırlamak için 1-100 ng arasında cDNA eklenmesini önermekteydi. Ekstraksiyon cihazından elde edilen RNA miktarları 200 ng’ın üzerinde olduğu için bu çalışmada kullanımı uygundu. Çalışmada Bioneer Marka AccuPower GreenStar qPZR PreMix (Kat No: K-6210) kullanıldı. Absolute Quantification çalışmasından (Kantitatif Analizlerde) sonra yapılan gen ifadesi test

deneylerinde, primerlerin ve örnek cDNA (veya Negatif Kontrol için PCR Grade suyun) hazır reaksiyon tüplerine eklendi, PZR Grade su ile son örnek hacmi 20 µl’ye tamamlanarak çalışıldı. Tüpler Q-PZR chazına yüklenmeden önce, homojenliğin sağlanması için hem vortex hem de spin işlemine tabi tutuldu.

Gerçek Zamanlı-Polimeraz Zincir Reaksiyon Protokolü

Hazırlanan karışımlar, optik şeffaf filme kaplı 0,2ml’lik PZR tüpleri içerisinde vortekslenerek homojenliği sağlandıktan sonra Q-PZR cihazına yerleştirildi. Deneylerin amplifikasyon koşulları, (SyberGreen Master Mix için gerekli sıcaklık, süre ve döngü sayıları) titizlikle optimize edildi (Tablo 9, 10 ve 11).

Tablo 9. Gerekli karışımlar

Tablo 10. Reaksiyon karışım miktarları

Standart Eğri ve Polimeraz Zincir Reaksiyon Verimliliği

Gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu analizinde önemli bir aşama olan bağıl kantitasyon ölçümünde, örneklerin karşılaştırmalı gen ifadelenme düzeyinin hesaplanması için PZR verimliliği hesaplandı. AQP7, GLUT5 ve gliseraldehit 3P dehidogenaz (GAPDH) primerlerinin PZR verimini hesaplarken, cDNA’lardan karışım yaparak tek bir örneğin 5 farklı dilüsyonu yapıldı ve buradan standart doğru oluşturuldu (Şekil 18).

Şekil 18. ‘Standart doğru’ oluşturup örneklerin kopya sayılarını bulabilmek için kullanılan seri dilüsyon standartları.

PZR verim katsayısı (PCR efficiency) 10(-1/slope) formülü kullanılarak elde edildi. Sonuç olarak standart curve oluşturuldu ve bu tabloya göre sonuçlar yorumlandı (Şekil 19).

Şekil 19. Polimeraz zincir reaksiyon verimi (R2_{) hesaplanarak oluşturulan standart}

eğrisi.

SYBR Green yöntemiyle yapılan Q-PCR’ın başlangıcında ortamda tek zincirli cDNA molekülü, primerler ve reaksiyon tampon çözeltisi içinde SYBR Green I boyası bulunmaktaydı. Bağlı olmayan serbest cDNA molekülü tek zincirli olduğu için çok az bir floresan ışıma yapmaktaydı. Primerler bağlanıp uzama başladığında ise SYBR Green I, çift zincirli cDNA’nın arasına girerek floresan yayılımı başlattı. Başlangıçtaki döngülerde zayıf olan floresan sinyal; oluşan gen ifadesine bağlı olarak belirli sayıda çoğaltım sonrasında ilerleyen döngülerde hızla artmaya başladı (Şekil 15). Bu artış miktarı Q-PZR cihazının 2D- CCD kamerasının algılayabildiği miktara ulaştığında Ct (Threshold cycle=Eşik döngü değeri) olarak algılandı ve analiz yazılımı bu değerleri kullanarak sonuç verdi.

Eşik Döngü Değeri

Eşik döngü değeri GZ-PZR yönteminde önemli bir değişkendir. Ct değeri, amplifikasyon sırasında saptanan floresan ışınımın eşik değerinin aşıldığı döngü sayısıdır. Başka bir deyişle üründeki ilk anlamlı artışın olduğu noktayı gösterir (Şekil 20).

Şekil 20. Amplifikasyon eğrisi ve eşik değeri.

Florimetrik PZR tekniğiyle yapılan kantitatif çalışmalarda, kalıp DNA miktarı bilinen standart örneklere ait Ct değerleri ile incelenen örneğin Ct değeri karşılaştırılarak yapılmaktadır. Bu nedenle, kantitatif PZR analizlerinde standart olarak tanımlanan kontrol örneklerine ihtiyaç duyulur (104).

Standartlar, her bir kopya için Ct değerleri ile ‘Satandart Doğru’ oluşturabilmek için kullanıldı. Yazılım, miktarları yani kopya sayıları arasındaki farkı bilinen standartlar kullanarak bir doğru çizdi, örneklerin Ct değerlerini bu doğruya göre kıyaslayarak örneklerin başlangıçtaki kopya sayılarını hesapladı. Hedef miktarı ile kopya sayısı oranı doğru orantılı olduğu için, örnekler ve kontroller arasındaki amplifikasyon oranı veya kıyası hesaplandı (Şekil 21 ve 22).

Şekil 21. Standart doğru ve Ct değerleri ile konsantrasyonlar arasındaki ilişki.

Şekil 22. Örneklerin standart doğruya oranları ile kopya sayılarının bulunması.

Hesaplanan indüksiyon katsayı değerlerine göre deney grubundaki gen ifadesi seviyelerinin kontrol grubuna göre gen ifadesi seviyesindeki kat şeklindeki artış/azalış (fold change) olarak ifade edilmiştir. Gen ifadesi verilerinin karşılaştırılması rölatif kantifikasyon ile karşılaştırma yaklaşımıdır. Rölatif kantitasyon yöntemi tüm gen ifadesi analizleri için veya

rölatif gen seviyelerinin belirlenmesi için uygundur. Bu yöntemde hedef genin konsantrasyonu, aynı örnekteki hedef-referans gene oranı şeklinde ifade edilir. Rölatif kantitasyon yöntemleri başlangıç örnek miktarındaki varyasyonlar, cDNA sentezi verimliliği ya da örnek yükleme/pipetleme hataları gibi nicelik ve nitelikteki farklılıkları düzeltir. Hedef ve referans gen miktarı PCR verimliliğinin ve örnek CP (=Ct) değerinin bir fonksiyonu olduğu için, herhangi bir standart eğri gerekmez. Referans gen olarak, GAPDH, β-aktin gibi tüm hücrelerde eksprese edilen, hücre canlılığı için gerekli ve deneysel uygulamalarda dahi ekspresyon düzeyleri sabit kabul edilen “Housekeeping Gen”ler kullanılır. Elde edilen Ct değerleri referans genin (GAPDH) Ct değeri ile Pfaffl metodu (105) uygulanarak aşağıdaki formüle göre normalize edilerek oran hesaplandı.

E= PZR verimi (EAQP7 ve EGLUT5=1,4817, EGAPDH=1,7183 olarak hesaplandı).

CP=Ct (Crossing point=threshold cycle).

ΔCP referans gen=Referans genin kontrole ait CP değeri-referans genin örneğe ait CP değeri ΔCP hedef gen=Hedef genin kontrole ait CP değeri-hedef genin örneğe ait CP değeri

Housekeeping Genlerin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyon Çalışmalarındaki Önemi

Çeşitli koşullarda ifade düzeyi değişmediği bilinen ve en az etkilenen bir referans gene, GZ-PZR yönteminde normalizasyon amacı için ihtiyaç vardır. Özellikle farklı deneklerden ya da aynı denekten farklı dönemlerde alınan örneklerle yapılan araştırmalarda, ilgilenilen genin ifade düzeyinin incelenebilmesi için dokularda ifadesi değişmediği varsayılan bir başka gen ürünü mRNA ile normalizasyon yapılması gerekmektedir. İlgilenilen genin ifade düzeyi, referans gen olarak kullanılan housekeeping genin ifade düzeyine oranlanır. Bu oranlamayla amaçlanan; izole edilen RNA miktarı ve sentezlenen cDNA miktarının getirdiği örnekler arası başlangıç farklılıklarını, deneysel hataları normalize etmektir (106).