Kanserli olgularda mikronukleus sıklığının belirlenmesi ve mikronukleusların orijininin MN+FISH yöntemi ile değerlendirilmesi

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS PROGRAMI

Yrd.Doç.Dr. Funda S. PALA  

KANSERLİ OLGULARDA MİKRONUKLEUS

SIKLIĞININ BELİRLENMESİ VE

MİKRONUKLEUSLARIN ORİJİNİNİN

MN+FISH YÖNTEMİ İLE DEĞERLENDİRİLMESİ

(Yüksek Lisans Tezi)

Bio. Mehtap TAŞ

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS PROGRAMI

Yrd.Doç.Dr. Funda S. PALA  

KANSERLİ OLGULARDA MİKRONUKLEUS

SIKLIĞININ BELİRLENMESİ VE

MİKRONUKLEUSLARIN ORİJİNİNİN

MN+FISH YÖNTEMİ İLE DEĞERLENDİRİLMESİ

(Yüksek Lisans Tezi)

Bio. Mehtap TAŞ

Tez No:....

TEŞEKKÜR

Çalışmamın her aşamasında bana verdikleri destekten ve gösterdikleri sabırdan dolayı değerli hocalarım; T.Ü.Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji A.D Başkanı Prof.Dr. Çetin ALGÜNEŞ, danışman hocam Yrd.Doç.Dr. Funda S. PALA, Hematoloji A.D Başkanı Prof.Dr. Muzaffer DEMİR, Üroloji A.D’da Doç.Dr. Mustafa KAPLAN’a Tıbbi Biyoloji A.D Araş.Gör. Kıymet TABAKÇIOĞLU’na ve değerli arkadaşlarım Bio. Cüneyt ÇİMEN ve Bio. Tuğba GÜRSOY ve Bio. Sefa ÇETİNKAYA’ya en içten teşekkürlerimi sunarım.

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

KANSER ... 3

HÜCRE DÖNGÜSÜ ... 4

HÜCRE DÖNGÜSÜ KONTROL NOKTALARI ... 6

KANSER ETİYOLOJİSİ ... 9

GENOMİK KARARSIZLIK ... 11

MİKRONUKLEUS ... 16

KANSERLERİN ORİJİNİNE GÖRE SINIFLANDIRILMASI ... 18

LÖSEMİLER ... 18 AKUT LÖSEMİLER ... 20 KRONİK LÖSEMİLER ... 23 LÖSEMİ ETİYOLOJİSİ ... 25 MESANE KANSERİ ... 26 PROSTAT KANSERİ ... 28

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

TARTIŞMA

SONUÇLAR

ÖZET

SUMMARY

KAYNAKLAR

ŞEKİLLER VE TABLOLAR LİSTESİ

ÖZGEÇMİŞ

EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR

AIDS : Acquired Immunodeficiency Syndrome (Edinilmiş Bağışıklık Yetmezliği Sendromu)

BN : Binukleat

BFB : Kırık-füzyon-kırık

Cyt-B : Sitokalazin B

DAPI : 4,6-diamidino-2-phenylindole

DMSO : Dimetil sülfoksit

DNA : Deoksiribo Nükleik Asit EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetik Asit FCS : Fetal Calf Serum

FISH : Floresan In Situ Hibridizasyon HTLV-I : İnsan T hücresi Lösemi Virüsü tip 1 HTLV-II : İnsan T hücresi Lösemi Virüsü tip 2

HIV : Human Immunodeficiency Virusu (İnsan İmmun Yetmezlik Virüsü)

KCL : Potasyum Klorür

KKD : Kardeş Kromatid Değişimi (SCE: Sister Chromatid Exchange)

MN : Mikronukleus

MNC- : Sentromerik fragman içermeyen MN MNC+ : Sentromerik fragman içeren MN

NER : Nucleotide Excision Repair (Nükleotid Eksizyon Onarımı) PBS : Phosphate Buffered Saline

PHA : Fitohemaglutinin

Ph Kromozomu : Philadelphia Kromozomu RNA : Ribonükleik asit

RNAz : Ribonükleaz

rpm : Revolutions per minute SSC : Standard Saline Citrate

GİRİŞ VE AMAÇ

Kanser günümüzün üzerinde en çok araştırma yapılan hastalığıdır. Birden fazla tanımı olmakla birlikte en genel tanımı, hücre döngüsünü düzenleyen mekanizmalardaki bozukluklar sonucu ortaya çıkan, hücrenin kontrolsüz bir şekilde çoğalmasıdır (1).

Karmaşık bir mekanizmaya sahip olan kanserin etiyolojisinde pek çok farklı etmen gözlenmektedir. Kanser tek bir hücredeki değişimle başlar. Gelişiminde ise çeşitli genetik ve biyokimyasal faktörler rol oynar. Farklı dokulara ait kanserler, değişik özellikler göstermekle birlikte pek çok kanserin başlangıcı DNA mutasyonu veya kromozomal aberasyonlarla ilişkilendirilir (2). Bu nedenle DNA veya kromozom boyutunda biyoindikatörler kullanan çeşitli kanser tanı yöntemleri geliştirilmiştir.

Bir biyoindikatörün kanserin erken tanısında kullanılabilmesi için 3 anahtar aşamayı geçmesi gerekir (3,4) Bunlar;

1) Örnek alma, saklama vb. konularda standartlaşmış bir protokolünün olması, 2) Normal popülasyondaki backgroundunun belirlenmiş olması,

3) Vaka kontrol ve prospektif çalışmalarla kanser riskini belirlemedeki duyarlılığının test edilmesidir.

DNA hasarını belirlemede; DNA zincir kırıkları, kromozom aberasyonları, mikronukleuslar (MN), kardeş kromatid değişimi (KKD), p53 mutasyonu gibi çeşitli biyoindikatörler kullanılabilir (2).

Kanserin erken tanısıyla ilgili araştırmalarda bu biyoindikatörler arasında kromozomal aberasyonlar öne çıkmaktadır. Bonassi ve ark.(5) İtalyan ve Norveç popülasyonlarında yaptıkları çalışmalarda metafaz kromozom aberasyonlarının kanser riskini

2.3-2.6 oranında arttırdığını ortaya koymuşlardır (5). Metafazda gözlemlenen disentrik ve asentriklerin MN oluşumuna da neden olduğu bilinen bir gerçektir (6). Yüksek MN sıklıklarının kanser riskini arttırdığını ileri süren retrospektif çalışmalar giderek artmaktadır (7,8,9).

Mikronukleuslar hücrede mitozun metafaz-anafaz geçişi esnasında oluşan, hücre sitoplazması içinde, ana nukleusun dışında fakat nukleus ile şekil, yapı ve boyanma özellikleri bakımından aynı olan küçük küresel yapılardır (4,6,10). Fiziksel veya kimyasal mutajene maruz kalan lenfosit hücrelerinde, hasar gören tüm kromozomlar ve onların asentrik parçaları veya mitotik iğdeki hatalar nedeniyle kutuplara çekilemeyen kromozomların sitoplazmada yoğunlaşması sonucu oluşurlar. Bu nedenle MN kromozomal fragment veya tüm bir kromozom içerebilir (2,11,12).

Klasik Giemsa boyama yöntemiyle MN sıklığını belirlemek mümkünken 90'lı yılların ortalarından sonra geliştirilmeye başlayan ve günümüzde son halini alan MN+FISH yöntemiyle de mikronukleusların orijinini belirlemek mümkündür.

Yapılan araştırmalar hematolojik kanserlerin etiyolojisinde radyasyon vb. fiziksel ajanların etkili olduğunu ileri sürerken, solid tümörlerin ise iğ ipliği mekanizmasında bozukluğa neden olan kimyasal ajanlardan kaynaklandığını görüşünü savunmaktadır (11,13,14,15). Bu durumda hematolojik kanserlerde gözlemlenen MN’ların asentrik fragmentlerden köken alması buna karşılık, solid tümörlerde MN’ların tüm kromozom içermesi beklenir.

Biz bu çalışmada, hematolojik kanserler, prostat kanseri ve mesane kanserli olgularda MN görülme sıklıklarını ve MN orijinlerini belirledik. Böylece yüksek MN sıklığının ve orijinin belirlenmesinin farklı kanser tipleri için erken tanıda kullanılabilirliğini ve kanser mekanizmasındaki rolünün anlaşılmasını amaçladık.

GENEL BİLGİLER

KANSER

Normal yaşam sürecinde hücreler çeşitli mekanizmaların kontrolü altında, ihtiyaca göre bölünerek çoğalırlar ve farklılaşırlar. Buna karşılık kontrol dışında çoğalma veya farklılaşmaya yönelen hücreler, programlı hücre ölümü (apoptozis) ile yok edilirler. Kanserli dokularda, hücrelerin çoğalması ile apoptozis arasındaki denge bozulmuştur. Hücrelerin aşırı çoğalması, apoptozisin baskılanması ya da bu ikisinin birlikte görülmesiyle atipik hücreler aşırı artar ve kanser dokusu çevre dokularla etkileşmeye başlayıp normal fizyolojik akışı bozar (16).

Kanser gelişimi karmaşık bir mekanizmaya sahip olmakla birlikte, kanser hücreleri monoklonaldir, yani vücutta bulunan herhangi bir, anormal, tek hücreden köken alırlar (16,17,18,19). Karsinogenez gelişim aşamaları Şekil 1’de verilmiştir.

Kanser gelişimi (karsinogenez), fiziksel, kimyasal ve biyolojik ajanların neden olduğu DNA hasarları sonucunda ortaya çıkan genetik ve/veya epigenetik değişimlerden kaynaklanan çok aşamalı bir süreçtir. Meydana gelen mutasyonların hücrenin pozitif ve/veya negatif kontrolünde değişikliğe yol açması anormal yapıdaki hücrenin kontrolsüz çoğalması ile sonuçlanabilir. Hücre döngüsünün kontrolündeki değişiklikler ise kanserin spesifik belirleyicisidir. Kanser hücrelerinin mutasyonlar sonucu malign özellik kazanması, çevrelerindeki dokunun ve devamında organizmanın yaşamını tehdit eder hale gelmektedir (21,22,23).

Şekil 1. Karsinogenez gelişimi (20)

Karsinogenezde etiyolojik faktörlerin DNA üzerinde yarattığı hasar kadar hücrenin moleküler bileşenlerinin bu hasara verdikleri cevap da önemlidir. Genetik materyal hasarlandığı zaman hücrenin buna vereceği ilk yanıt hasarı tamir etmektir. Eğer hasar tamir edilemeyecek boyutta ise hücrenin yanıtı kendini kontrollü bir şekilde öldürmek olacaktır. Bütün bu süreçleri kontrol eden hücre döngüsünde yer alan protoonkogenler, onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerdir. Bu gen grupları mutasyona uğradıkları zaman kanser gelişiminden sorumlu tutulmaktadırlar. Bu nedenle hücre döngüsünden kısaca bahsetmek kanserin gelişim mekanizmasını daha iyi anlamamızı sağlayacaktır (17,18,24,25).

HÜCRE DÖNGÜSÜ

Hücre döngüsü; hücrenin genetik materyalinin iki katına çıkması ve ardından ikiye bölünmesini içeren, biyokimyasal aktiviteler sonucu, genetik olarak eş iki yavru hücre oluşturmasıyla tamamlanan bir süreçtir (26,27).

Ökaryotlarda hücre döngüsü G1, S, G2, M olmak üzere 4 ardışık evrede gerçekleşir.

G1, S, G2 birlikte interfaz evresini oluşturmaktadır. M ise mitoz bölünmeyi ifade eder. Hücre

Şekil 2. Hücre döngüsünün evreleri (28) G1 Evresi (İlk Aralık)

Hücrenin bölünmeye karar verdiği evredir. DNA sentezi için bu evrede hazırlık yapılır. Hücre fonksiyonları için özgül proteinler ve RNA sentezlenir. G1 evresindeki

hücreler, S evresine geçmeye hazır değillerse, G0 dinlenme evresine geçerler. G0, G1’in

gelişim göstermeyen evresidir. Kanser hücreleri, bu evreye girmekten kaçınırlar ve evreyi çok hızlı bir şekilde terk ederler (22,29,30). Eğer bu evreye girerlerse G0’daki hücreler,

kemoterapiye direnç kazanmış olup en tehlikeli hücre grubunu oluştururlar (31).

S Evresi (DNA Sentezi Evresi)

Sentez evresinde DNA miktarı iki katına çıkar. RNA sentezi devam eder, protein sentezi en yüksek seviyeye ulaşır. Sentrozom (sentrioller) kendini eşlemeye başlar.

G2 Evresi (İkinci Aralık)

Bu evrede DNA sentezi ve sentrozomun kendini eşlemesi tamamlanır. RNA ve protein sentezi devam eder.

M Evresi (Mitoz)

Hücre büyümeye devam eder, protein ve RNA sentezinin hızı birden yavaşlar, genetik materyal oluşan iki yeni hücreye eşit şekilde dağılır (25,29).

Mitoz evresi ise kromozomların, kısalıp kalınlaşması, kutuplara çekilmesi ve iki eşit yavru hücreye dönüşmesi aşamalarını içeren Profaz, Metafaz, Anafaz ve Telofaz bölümlerinden oluşmaktadır (22,29).

Hücre döngüsünün sağlıklı işleyişi, üzerinde bulunan kontrol noktaları sayesinde gerçekleşmektedir (32). Hücre döngüsünde bir evrenin doğru bir şekilde tamamlanmadan diğer evreye geçişini engelleyen 3 ayrı kontrol noktası bulunmaktadır. Bunlar; G1 kontrol

noktası, G2 Kontrol noktası ve M kontrol noktasıdır (18). Hücre döngüsü kontrol noktaları

Şekil 3’de gösterilmiştir.

Şekil 3. Hücre döngüsü kontrol noktaları (18) G1 Kontrol Noktası

Hücrenin uygun boyuta ulaşması, DNA’nın doğru bir şekilde kendisini eşleyebilmesi için RNA, protein ve enzimlerin yeterince üretilip üretilmediğini kontrol eder. Hücre uygun boyuta ulaşmamış ve DNA bütünlüğü korunmamış ise bu kontrol noktası S evresine girişi engeller (18,33). Hücrenin kendini onarabilmesi için ona zaman tanır. Hata onarılamıyorsa hücreler apoptozise giderler (25,34). G1 kontrol noktasının pek çok kanserde hatalı olduğunu

gösteren bulgular mevcuttur (18,32).

G2 Kontrol Noktası

Doğru eşleşme gerçekleştirmemiş veya hasar görmüş DNA’ya duyarlıdır. Böyle bir durumda hücre döngüsü inhibitörleri, DNA replikasyonu doğru bir şekilde tamamlanana kadar döngüyü durduracak sinyal oluşturur (24,26,34).

M Kontrol Noktası

Bu kontrol noktasında G2’den M evresine geçişi sağlayan ana düzenleyici mitoz

ilerleten faktör (MPF) kompleksi görev alır. MPF, kromatinlerin yoğunlaşmasını, iğ iplikçiklerinin oluşmasını ve bu iplikçiklerin kinetokorlar ile uygun bir şekilde bağlanmasını kontrol etmektedir (18,34).

Kromozomun kinetokor bölgesinde bir hasar oluşursa, M kontrol noktası mitozu metafaz evresinde durdurur. Hasar onarımı tamamlandıktan sonra ancak bir sonraki evreye geçiş yapılabilir (25,27,30,34).

Hücre döngüsünün kontrol noktaları, protoonkogen-onkogen ve tümör baskılayıcı genlerin karşılıklı etkileşimleri ile düzenlenmektedir (32).

Protoonkogenler-Onkogenler: Hücrelerin normal büyüme sistemi içinde yer alan çeşitli proteinleri kodlayan bir gen ailesidir. Protoonkogen ürünleri, normal hücrelerde büyüme, çoğalma ve farklılaşma ile ilgili yolakları kontrol ederler. Bu yolaklar üzerinde büyüme faktörleri, hücre bölünmesini uyaran sinyal iletim molekülleri, transkripsiyon faktörleri ya da hücre döngüsü düzenleyicileri gibi moleküller bulunmaktadır (18,35,36).

Protoonkogenler herhangi bir nedenle mutasyona uğrarlarsa ya da hatalı olarak normalden fazla ifade edilirlerse onkogenlere dönüşürler. Onkogenler hücre çoğalmasını uyarıcı etkiye sahiptirler. Tümör dokusunda aşırı miktarda ya da farklılaşmış biçimde ifade edilerek kontrolsüz hücre çoğalmasına yani maligniteye neden olurlar (16,18).

Onkogenler otozomal dominant biçimde etkisini gösterirler. Yani ekspresyonları arttığında, tek bir mutant allel normal bir hücreyi malign fenotipe dönüştürebilir (16,18,36).

Tümör baskılayıcı genler: Negatif kontrolden sorumludurlar. Bu genlerin ürünü, tümör baskılayıcı proteinler, hücre döngüsü kontrol noktalarını düzenleyen, tümör gelişimini baskılayan ve DNA’daki hasarlı hücreleri replikasyondan önce apoptozise yönlendirilen genlerdir (18,24). Bu genlerde meydana gelen mutasyon veya mutasyonlar genin ekspresyonunu kısmen ya da tamamen ortadan kaldırarak, düşük işlevli ya da işlevsiz protein sentezletip sonuçta tümör gelişimine neden olabilirler (16,36,37).

Tümör baskılayıcı genlerin etkisiyle oluşan hastalıklar resesif etki mekanizmasıyla kendini gösterir. Yani tümör baskılayıcı genin işlevini yerine getirememesi için her iki allelinin de mutasyona uğraması gerekmektedir (16,17,25,37).

proto (18,2 bazıl Tabl Gen H-r (Pro c-m (Pro RA (Pro CD (Pro p53 (Tü RB (Tü Bcl2 (Tü BR (Tü Prot vücu • • • • Kanser oonkogen v 25,30). Kar ları ve bu ge lo 1. Protoo lar ve nler N Fo ras otoo.) Si myc otoo.) H fa AR otoo.) Tr fa K2,4 otoo.) H ev 3 üm.b.) H ko ap 1 üm.b.) H ko 2 üm.b.) A dü CA2 üm.b.) D too: Protoon Kısaca ö udu istila ed Genomik Apoptoz Kendi bü Büyüme türlerinin ve tümör ba rsinogenezle enlerde göz onkogen ve karsinogen Normal onksiyonla inyal iletim Hücre döngü arklılaşma, a ranskripsiyo aktörü, farkl Hücre döngü vrelerini düz Hücre döngü ontrol nokta poptozisi dü Hücre döngü ontrol nokta Apoptozis üzenlenmes DNA tamiri nkogen; Tü özetlemek en kanser h k kararsızlığ zisten kaçab üyüme siny e inhibitörü pek çoğun skılayıcı pr e ilişkilendi lemlenen m e tümör bas nezle ilişkis arı mi üsünü, apoptozis on lılaşma üsü zenler üsü aları, üzenler üsü aları si üm.b.: Tümö gerekirse; h hücrelerinin

ğa sahip olm bilme, allerini oluş uyarılarına nda hücre roteinlere ai irilen proto mutasyonlar skılayıcı ge si (18) Kanserdek Değişiklik Nokta muta Nokta muta translokasy amplifikasy Kromozom translokasy ürünü Aşırı ifade, mutasyonla Mutasyonla delesyonlar Mutasyon v delesyonlar Aşırı ifade, apoptozisin durdurulma Nokta muta ör baskılayı her türlü k genel özell ma, şturabilme, karşı duyar döngüsü k it gen bölge oonkogenler Tablo 1'de enlerden ba ki Biçimi asyonları asyonları, yon, yon mal yon, füzyon , ar ar, r ve r , n ası asyonları ıcı gen. kontrol mek likleri: rsız olma, kontrol nok elerinde mu r ve tümör verilmiştir. azılarında g İlgili Old Kolorekt çok kans Lösemi, l pek çok k n Akut pro Mesane, kanser tip Tüm kan fazlasınd (meme,ak Retinobla osteosark kanser tip Lösemi, l Prostat, m kanseri kanizmasınd ktalarında g utasyonlar s baskılayıcı görülen mu duğu Kanse tal, mesane v er tipi lenfoma, ak kanser tipi omiyelositik meme ve pe pi nserlerin %5 da mutant kciğer, beyi astoma, koma ve bir pi lenfoma meme ve yu dan kaçıp görev alan saptanmıştır ı genlerden utasyon erler ve pek kciğer ve k lösemi ek çok 50’sinden in) r çok umurtalık çoğalan ve n r n e

• Sınırsız çoğalma kapasitesine sahip olma,

• Tümör anjiogenezisi ile tümörde yeni kan damarlarının oluşumunu sağlama, • Doku invazyonu ve metastaz yapabilme yeteneğidir (24,38).

KANSER ETİYOLOJİSİ

Kanser etiyolojisi tam olarak bilinmemekle birlikte hem kalıtsal hem de edinsel faktörlerin etiyolojide önemli rol oynadığı düşünülmektedir.

Kalıtsal Faktörler

Kanser gelişiminde aile öyküsünün önemli bir risk faktörü olduğu uzun yıllardır bilinmektedir. Kanser olgularının %5’inden daha azının genetik geçiş gösterdiği belirlenmiştir (16). Örneğin meme kanserinin yüksek oranda gözlendiği ailelerde otozomal dominant geçiş gösteren BRCA1 mutasyonunu taşıyan çocukların % 50’sinde yaşamının ileri dönemlerinde kanser gelişimi gözlenmiştir. Özellikle mutasyon taşıyan kadınlarda hayat boyu meme kanseri gelişme riski % 87 gibi yüksek oranlara çıkmaktadır (39).

Kolon kanserinin kalıtsal formu olan ailevi adenomatöz polipler, APC geninin mutant tek kopyasını taşıyan bireylerde görülmektedir. Ailevi tür ile sporadik tür gözlenme sıklığı ve başlangıç yaşı açısından karşılaştırıldığında ailevi türün diğerine göre daha erken yaşlarda ortaya çıktığı ve daha sık gözlendiği görülmektedir (40).

Retinoblastoma ise RB geninin mutasyonlu tek kopyasını taşıyan çocuklarda ortaya çıkmaktadır. Bu ailesel formu içeren bireyler %85 oranında retinoblastoma’ya yakalanma olasılığı içerirler. Kalıtımsal vakalarda tümör genellikle çift taraflı, tek odaklı olarak, bazen de çoklu tümörler şeklinde gözlenmektedir. Sporadik retinoblastoma ise çoğunlukla tek gözde tek tümör olarak gözlenmektedir (18,41).

Kansere genetik yatkınlığı olan kişiler ile yapılan çalışmalar göstermiştir ki kalıtılan kanserlerde;

• Bir sonraki kuşakta kanser daha erken yaşlarda ortaya çıkar.

• İkinci kuşakta daha sık gözlenir.

• İlk kuşağa oranla daha şiddetli bir klinik tablo gözlenir (41).

Edinsel Faktörler

Edinsel faktörler arasında kanser gelişimine, fiziksel (radyasyon, ultraviyole ışınlar vs.), kimyasal (sigara, alkilleyici ajanlar vs.) ve biyolojik (virüsler, GDO’lu besinler vs.)

ajanların neden olabileceği ileri sürülmüştür. Tüm kanserlerin en az %50’sinin edinsel faktörlerle uyarıldığı bilinmektedir (42,43,44).

Fiziksel ajanlar: İyonlaştırıcı radyasyon DNA’ya doğrudan ya da dolaylı olarak 2 farklı şekilde hasar verebilir. Doğrudan etkide yüksek enerjili elektronlar DNA’nın fosfodiester bağlarını koparırlar. Dolaylı etkide ise, hücre içindeki moleküllerle iyonlaştırıcı radyasyon etkileşerek serbest oksijen radikalleri (.O2 ve .OH) oluşur. Bu durumda serbest

radikallerin DNA bileşenleri ile etkileşimi, zincirde kırılmalara yol açar (45,46).

İyonlaştırıcı radyasyon enerjisinin hücredeki ilk hedefinin DNA molekülü olduğu uzun yıllardan beri bilinmektedir (45). Genetik materyalde DNA ve kromozom boyutunda meydana gelen hasarlar; tek nokta mutasyonları, delesyon, translokasyon, kromatid kırıkları gibi çeşitli mutasyonlar olarak karşımıza çıkmaktadır (18,46). Bu mutasyonların zaman içerisinde artması ve birikmesi kanser başta olmak üzere çeşitli hastalıklara yol açabilmektedir.

Hiroşima ve Nagazaki’ye atom bombası atıldıktan sonra sağ kalan Japonlarda yapılan çalışmalar, iyonlaştırıcı radyasyonun lösemi gelişimini 5-8 yılda en yüksek orana ulaştırırken, diğer bazı tümörlerde yaklaşık 40 yıl gibi uzun bir latent dönemi olduğunu göstermiştir (9,44,45,47). Yüksek doz radyasyonun lösemi vb. hematolojik kanserlere; prostat kanseri, mesane kanseri vb. solid tümör artışına neden olduğu ileri sürülmüştür (23).

Kimyasal ajanlar: İnsanlar gün içerisinde çok sayıda kimyasal karsinojen ve mutajene maruz kalabilmektedir. Bu maruziyet sonucunda hücre DNA’sında hasar meydana gelebilmektedir. Kimyasal ajanlardan bazıları yanlış baz eşleşmelerine, bazıları baz artışı ve eksilmesine neden olurken, bazıları da baz-şeker bağlarının ve bazlar arasında yer alan hidrojen bağlarının kopmasıyla mutasyonlara yol açmaktadır (18,46).

Toplumun genelinin sıklıkla karşılaştığı kimyasal maddeler arasında sigara dumanı ve alkilleyici ajanlar başta gelir.

Sigara dumanı: Sigara içimi kanserin önlenebilir tek nedenidir. Sigara dumanı yapısında bulunan 4000’den fazla kimyasal madde nedeniyle önemli bir karsinojen kaynağı olarak tanımlanmaktadır. Bu kimyasallar arasında polisiklik aromatik hidrokarbonlar, N-nitrozaminler, aromatik aminler, aldehitler, benzen ve butadien en yüksek potansiyelli karsinojenlerdir. Sigara içeriğindeki maddeler DNA’da doğrudan ya da enzimler aracılığı ile aktif metabolitlere dönüştürülerek etki göstermektedir (7,48).

Alkilleyici ajanlar: Bu ajanlar direkt etkili karsinojen olup elektrofilik özelliktedir. Hücrede elektrondan zengin olan DNA, RNA ve protein bölgelerine kovalent bağlarla bağlanmaktadır. Alkilleyici ajanlar, nükleotidlerdeki amino ve keto gruplarına karbon içeren (CH3─ veya CH3 ─CH2─) alkil grupları eklerler. Alkil grupları, bazlarda tautomerik kaymaya ve bunun sonucunda transisyon mutasyonlarına neden olmaktadır (46).

Biyolojik faktörler: RNA virüslerinden; İnsan T hücresi lösemi virüsü tip 1 (HTLV-I), insan T hücresi lösemi virüsü tip 2 (HTLV-II) ve insan bağışıklık yetmezlik virüsü (HIV, AIDS virüsü), DNA virüslerinden; Papilloma virüs, Hepatit B virüsü, Epstein-Barr virüsünün insan kanserlerinin etiyolojisinde rol aldığı düşünülmektedir (17,36,49).

Buraya kadar saydığımız etiyolojik faktörler, genomda yol açtıkları değişiklikler sonucu, genomun hem yapısını hem de işlevsel davranışlarını değiştirebilmektedir. Normalden farklı davranışlar sergileyen genomun bu hali, genomik kararsızlık olarak adlandırılır.

Canlının yaşamını sağlıklı bir şekilde devam ettirebilmesi ve sonraki kuşaklara genomunu hatasız aktarabilmesi için genom kararlılığı şarttır. Gün içerisinde DNA’da pek çok etkene bağlı olarak hasarlar meydana gelmektedir. Ancak DNA onarım mekanizması çok organize bir şekilde çalıştığından bu hataların 1/1000’den daha azı kalıcı olabilmektedir (17).

Herhangi bir zamanda genlerin yer aldığı DNA bölgelerinin hasar oluşturacak ajanlarla etkileşmesi sonucunda, kontrol noktalarındaki bozukluklar, kromozomal aberasyonlar, telomerlerde fonksiyon bozukluğu meydana gelmesi genomik yapıda kararsızlık oluşmaktadır. Genomik kararsızlık, hücrelerin kendilerini malign yapıya dönüştürecek mutasyonlara uğrama olasılığını artırır. Genomik kararsızlık, hem solid tümör hem de lösemi gelişiminde erken gözlenen neoplastik değişimlerden biridir (38,50). Genomik kararsızlığın gelişmesi için üç farklı yolak tipi tanımlanmıştır;

1. NER Bağımlı Kararsızlık

Nükleotid eksizyon onarımı (NER)’de görevli genlerden birinde önce bir allelde, sonra ikinci allelde mutasyon meydana gelmesi ve sonuçta bu mutant alleller yüzünden inaktif hale gelen genin fonksiyon görememesine ek olarak tümör gelişimi için UV gibi çevresel bir ajana maruz kalmak da gereklidir (51).

2. Mikrosatellit Kararsızlığı

Yanlış eşleşme tamir (mismatch repair) genlerinde meydana gelen ilk mutasyonun ardından 2. allelde de mutasyonun meydana gelmesi tümör oluşumunun başlaması için yeterlidir (51).

3. Kromozom Kararsızlığı

Mitotik iği kontrol noktalarında yer alan genlerden birinin tek bir allelinde mutasyon meydana gelmesi tümör gelişimini başlatır (51).

Kanser ve Biyoindikatör Olarak Kullanılabilen DNA Hasarları

Kanserin erken tanısıyla ilgili araştırmalarda çeşitli biyoindikatörler kullanılabilmektedir. Bunlar Tablo 2’de verilmiştir.

Tablo 2. Biyoindikatör olarak kullanılabilen DNA hasarları (2) Biyoindikatörler

• DNA zincir kırıkları • Kromozom aberasyonları

• Kardeş kromatid değişimi (KKD) • Mikronükleuslar (MN) • Telomer kısalığı • Apurinik bölgeler • DNA adduct • DNA oksidasyonu • DNA metilasyonu • p53 mutasyonu

• Mitokondriyal DNA mutasyonu • Eşey hücrelerindeki DNA hasarları

Kromozomal Aberasyonlar’ın Kanserle İlişkisi

İyonlaştırıcı radyasyon, kimyasal ajanların in vivo ve in vitro ortamlarda kromozomal aberasyonlara neden olduğu bilinmektedir. Yapılan prospektif ve retrospektif çalışmalar kanser görülme sıklığının, yüksek oranda kromozomal aberasyon taşıyan bireylerde, düşük oranda kromozomal aberasyon taşıyanlara göre artmış olduğunu göstermektedir (19,52,53,54).

Çeşitli kanserlerle ilişkilendirilen kromozomal aberasyonlar sayısal ve yapısal olmak üzere 2’ye ayrılır. Hangi mekanizmayla meydana gelirse gelsin, DNA’nın kromozom boyutundaki tüm bozuklukları sonuçta kanser etiyolojisi ve prognozunda önemli görünmektedir.

Sayısal kromozom aberasyonları: İnsan kromozom aberasyonları arasında en sık gözlenen ve klinik olarak en önemli tipi anöploidi’dir.

Anöploidi: Anöploid hücrelerde fazladan kromozom bulunur ya da kromozom kaybı vardır. Anöploidiler oluşurken kaybedilen ya da kazanılan kromozomlar klinikte genelde sendromlar olarak karşımıza çıkmaktadır. Örneğin;

Down Sendromlu erkek için karyotip 47, XY+ 21 Turner Sendromlu dişi için karyotip 45,X0.

Anöploidi, organizmada başlıca iki yolla meydana gelen bir kromozomal aberasyondur. Bunlar:

1. Non-disjunction: Mitoz ya da mayoz bölünmede kromozom çiftlerinin ayrılmasında meydana gelen aksamalardır. Bunun sonucunda yavru hücrelerden birine fazla bir kromozom gider, diğeri de bir kromozomunu kaybeder.

2. Kromozom kaybı: Hücre bölünmesi sırasında anafaz gecikmesi sonucu meydana gelir. İğ iplikçiklerinin kromozomlara doğru bağlanmaması ve metafaz plağının gerisinde kalıp bölünmeyi kaçırması buna örnek verilebilir (55).

Ayrıca kardeş kromatidlerin yapışmaması, defektli sentromer bölünmesi ve kromozomların ekstra replikasyonu gibi mekanizmalarla da anöploidi meydana gelebilir.

İlk kez 1914’te Boveri sayısal kromozomal aberasyonlarla kanser ilişkisine dikkat çekmiştir (56).

Kirsch-Volders ve ark. (55) çalışmalarında, germ hücrelerindeki anöploidilerin canlılarda pek çok büyüme ve gelişim defektine yol açtığını göstermiştir. Embriyonun oluşumu sırasında ortaya çıkan anöploidi ve poliploidi defektleri embriyoların çok büyük bir kısmının kaybedilmesine neden olur. Doğan çocukların ancak 3/1000’ü kromozomal anomalili olarak doğabilir. Daha önce de ifade edildiği gibi çoğunlukla sendromik olan bu bireylerde, sayısal aberasyon anöploidiye bağlı olarak artmış bir kansere yatkınlık durumu söz konusudur.

Panigrahi ve ark.’nın (57) çalışmalarında Down Sendromu, Klinefelter ve Turner sendromunda lösemi, meme kanseri, glondoblastoma ve nöral tüp defekti için riskin artmış olduğu bildirilmektedir. Trisomi 13 ve 18 için de artmış bir teratom, nöroblastom ve Wilms’ tümörü riskinden bahsedilmektedir.

Somatik hücrelerdeki anöploidiler de çeşitli kanserlerin gelişimi ile ilişkilendirilmiştir. Araştırıcılar, anöploidi ve kanserin indüklenme mekanizması ile ilgili farklı görüşler öne sürmüştür (Tablo 3).

Tablo 3. Anöploidi ve kanserin indüklenme mekanizması ile ilgili görüşler Kirsch-Volders ve

ark. (55)

• Tümör baskılayıcı genlerden birinin anöploidi ile kopyalarını kaybetmesi,

• Karsinogenezde rol oynayan resesif genlerin (Örneğin; mismatch tamir genleri) kromozom kaybı ile aktive olması, • Protoonkogenlerin tüm kromozom değişiklikleri ile onkogene

dönüşmesi, Panigrahi ve ark.

(57)

• Anöploidinin derecesi ile malignensinin derecesi arasında uyum olduğu,

• Anöploidinin tek başına kansere yol açamayacağını ama DNA tamir yolaklarının anöploidi ile bağlantılı bozukluklarında mutasyonların birikmesine yol açabileceği,

Duesberg ve ark. (58)

• Anöploidinin prekanseröz veya kanser hücrelerinde genomik kararsızlığın birincil sebebi olduğu,

• Kromozomların oluşmasını, ayrılmasını ve tamirini

gerçekleştiren proteinlerin dengesini bozarak yine anöploidiye yol açtığı,

• Bir karsinojen tarafından uyarılan ya da kendiliğinden ortaya çıkan rastlantısal bir anöploidi ile başladığı ve anöploidinin yapısında varolan kararsızlığın bir zincir reaksiyonu başlatarak anöploid yapıların otonom gelişimini sağladığı,

Bannon JH ve ark. (59)

• Memeli sentrozomlarında içlerinde hücre döngüsü proteinleri ve tümör baskılayıcı genlerin proteinleri bulunmaktadır. Genomun gardiyanı olarak tanımlanan bu bölgede meydana gelen herhangi bir bozukluk sitokinez gecikmesi, mitotik kayma, hücre füzyonu, DNA tamirinde bozukluk gibi pek çok tabloya yol açmaktadır. Bu sonuçlar pek çok kanser türünün erken evrelerinde gözlenen bulgulardır.

Yapısal kromozom aberasyonları: Kromozom tipi aberasyonlar ve kromatid tipi aberasyonlar olmak üzere 2 gruptur.

Kromozom tipi aberasyonlar: İnterfazın erken evresinde, G1 lenfositlerinin DNA

replikasyonundan önce kromozom hasarı yapan ajanlara maruz kalması öncül nükleotidlerin yapısında değişiklikler oluşturmaktadır. Bu da kromozomlarda kırılmalara ve sonuçta translokasyon, delesyon, insersiyon, ring kromozom, disentrik kromozom ve sayısal anomalilere yol açmaktadır (1,45).

Günümüzde pek çok kanserin teşhis ve tedavisinde yapısal ve sayısal kromozom aberasyonlarının önemli olduğu bilinmektedir (1,2,60). Kromozom tipi aberasyonlar Şekil 4’de gösterilmiştir.

Karşılıklı değişim Kollar arası değişim

Kol içi değişim Kırık ve kopmalar

Disentrik Asentrik

Sentrik halka Ara delesyon

Asentrik Resiprokal translokasyon Perisentrik inversiyon Parasentrik inversiyon Şekil 4. Kromozom tipi aberasyonlar (61)

Kromatid tipi aberasyonlar: DNA sentezinden sonraki interfaz evresinde fosfodiester bağlarının kırılması ile kromatidde meydana gelir. Bunların, radyasyon dışında çeşitli mutajenlerle hasar görmüş DNA’nın yanlış replikasyonu veya yanlış tamirinden kaynaklandığı ve ilk DNA sentez fazı içinde oluşturulduğu düşünülmektedir. Kromatid tipi aberasyonlar Şekil 5’de gösterilmiştir.

Karşılıklı değişim

İç kollar arası değişim

Kollar arası değişim Kırık kopukluk Disentrik Sentrik halka Disentrik Asentrik halka İzokromozom delesyon Kırılma ve İç kollar arası değişim Resiprokal translokasyon Perisentrik inversiyon Duplikasyon/ delesyon Parasentrik inversiyon Duplikasyon/ delesyon Şekil 5. Kromatid tipi aberasyonlar (61)

Kromatid tipi aberasyonlar arasında özellikle sık incelenen bir aberasyondur. Kardeş kromatid değişimi (KKD) analizi, Fanconi Anemisi, Bloom Sendromu, Ataxia Telangiectasia gibi bazı genetik hastalıklara tanı konmasında yardımcıdır. Kardeş kromatid değişiminin artması mutajen etkinin varlığını gösterebilmektedir. Bloom sendromlu olguların yaklaşık % 25’inde 30’lu yaşlarda hem karsinoma hem de lösemi gelişebilir (62). Kromatid kırıklarının yıllar içinde birikmesiyle kanser görülme sıklığı (insidansı) artışı belirlenmektedir (1,45). Kardeş kromatid değişimi Şekil 6’da gösterilmiştir.

Şekil 6. Kardeş kromatid değişimi (KKD)

Yapısal ve/veya sayısal kromozomlardan kaynaklanan ve kanserlerle ilişkili olabileceği düşünülen bir diğer oluşum ise Mikronukleuslardır.

MİKRONUKLEUS

Mikronukleus (MN) hücrede mitozun metafaz-anafaz geçişi esnasında oluşan, hücre sitoplazması içinde, ana nukleusun dışında fakat nukleus ile şekil, yapı ve boyanma özellikleri bakımından aynı olan küçük küresel yapılardır (4,6,10). Fiziksel veya kimyasal mutajene maruz kalan hücrelerde, hasar gören tüm kromozomlar ve onların asentrik parçaları veya mitotik iğdeki hatalar nedeniyle kutuplara çekilemeyen kromozomların sitoplazmada yoğunlaşması sonucu oluşurlar. Bu nedenle MN kromozomal fragment veya tüm bir kromozom içerebilir (2,10,11,12). MN oluşum mekanizmaları Tablo 4’de verilmiştir.

Tablo 4. Mikronukleus oluşum mekanizmaları (63)

• DNA kırıkları sonucu oluşan asentrik kromozom/ kromatid fragmanları,

• Tüm kromozomun/kromatidin kinetokorları üzerindeki tubulin fiberlerinin tutunmasındaki hatalar sonucu nükleus dışında kalması,

• Sentromerik DNA’da oluşan hatalar sonucu kromozom/kromatidlerin nükleus dışında kalması,

• Kinetokor proteinlerinde hataların oluşması sonucu kromozom/kromatidlerin nükleus dışında kalması,

• Nükleoplazmik köprü oluşumu ve kırılması, • Histon modifikasyonları ve geç replikasyon,

• BFB (bridge-fusion-break) (kırık-füzyon-kırık) sonucu oluşan gen amplifikasyonu nedeniyle nüklear tomurcuklanma olarak tanımlanmıştır.

Mikronükleuslar mitozdan sonra farklı yollar izleyebilir; 1. Apoptozis ile hücreden uzaklaştırılabilir,

2. Hücreden dışarı atılabilir,

3. Ana nükleus içine tekrar girebilir,

4. Nükleus dışı bir yapı olarak, hücre sitoplazması içinde kalabilir (64).

Mikronukleus yöntemi, hem fiziksel hem de kimyasal genotoksik ajanların etkilerinin belirlenmesine olanak sağlayan bir yöntem olup uzun yıllardan beri kullanılmaktadır (6,65,66). Mikronukleusların dolaşan kan lenfositlerindeki doğal sıklığı bireyler arasında yaş ve cinsiyete bağlı olarak farklılık gösterir (11). Beklenilenin üzerinde görülen mikronukleus sıklıklarının kanser riskini arttırdığını ileri süren retrospektif çalışmalar giderek artmaktadır (7,8,9). 2006 yılında 10 ülkeden 20 laboratuvarın 1980-2002 yılları arasında yaptığı mikronukleus analizlerinin değerlendirilmesi ile yapılan çalışmada, mikronukleus sıklığı yüksek olan kişilerde, kanser gelişimi riskinin de yüksek olduğu, kanserden bağımsız olarak, bu kişilerin yaşam sürelerinin de diğer popülasyondan anlamlı düzeyde düşük olduğunu ortaya koymuşlardır (8).

Mikronukleus analizinin kullanım alanları: • Karsinojenlerin sitogenetik etkilerinin, • Farmasötik ajanların sitogenetik etkilerinin,

• Radyolojik kazalarda genetik materyaldeki hasarların, • İn vivo/in vitro genotoksik hasarların,

• Kanser riskinin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (2,10).

Kanserler, kanserin köken aldığı doku ve hücrenin embriyonik orijinine göre sınıflandırılırlar. Barsak mukozası, bronşlar ve meme duktusları gibi epitel hücrelerinden köken alan kanserler karsinom, bağ dokusu, kemik ya da kas hücrelerinden köken alanlar sarkom, bu iki ana grubun dışındaki bir diğer grup ise kemik iliği, lenfatik sistem ve periferik kan hücrelerinden köken alanlar ise lösemi ve lenfomalardır. İnsan kanserlerinin yaklaşık %90’ını karsinomlar oluşturmaktadır. Sarkomlar ise solid tümörlerin gelişmesine neden olmaktadır (1,16,17,24).

Bu çalışmada araştırılan kanser türleri lösemiler, mesane ve prostat kanserleri olduğundan bu kanser türleri tanımlanmıştır.

LÖSEMİLER

Lösemiler, kemik iliğindeki hematopoietik hücrelerin habisleşmesi ve kontrol dışı çoğalmaları sonucu gelişen bir hastalık grubudur. Dolaşımdaki lökositlerin sayısının artışı ile belirlenmektedir (42,43,60).

Lösemiler, periferik doku ya da kemik iliğindeki anormal bir tek kök hücreden köken alır. Bu hücreler tek bir doku ya da organa ait bütün hücre türlerini verdiği için ‘pluripotent kök hücresi’ olarak isimlendirilir. Bu hücrelerin bir kısmı ‘miyeloid’ hücre serisini oluştururken, bir kısmı ‘lenfoid’ serisine farklılaşmaktadır. Miyeloid hücreler kemik iliğinde gelişimini tamamlayarak eritrositler, monositler, granülositler ve megakaryositlere farklılaşırlar. Lenfoid hücreler ise gelişiminin erken evresinde kemik iliğinden lenf düğümleri, dalak ve timusa göç eder ve lenfositlere dönüşürler. Lösemi, kök hücreden spesifik kan hücreleri oluşana dek herhangi bir farklılaşma aşamasında meydana gelebilir (42,67). Kan hücrelerinin olgunlaşma evreleri Şekil 7’de verilmiştir.

Şekil 7. Kan hücrelerinin olgunlaşma evreleri (68) Lösemilerin Sınıflandırılması

Kan hücreleri, köken aldıkları hücre tiplerine göre; • Miyeloid

• Lenfoid

Hastalığın ortaya çıkış hızlarına göre; • Akut

• Kronik olarak 2 ana grupta yer almaktadır (42,44).

Akut ve kronik terimleri hastalığın doğal seyrindeki göreceli süreyi yansıtır. Akut lösemiler; birden ortaya çıkan, hızlı ilerleyen ve prognoz olarak daha dramatik seyirli hastalıklardır. Kronik lösemiler ise; daha az agresif olup, daha yavaş gelişim göstermektedir. Akut lösemiler her yaşta gelişebilir, kronik lösemiler yetişkinlerde görülür. Akut lösemiler genellikle olgunlaşmamış hücrelerde gelişirken, kronik lösemiler olgun hücrelerde gelişim göstermektedir (69,70).

AKUT LÖSEMİLER

Olgunlaşmamış (blastik) miyeloid ya da lenfoid dizi hücrelerinin kontrolsüz çoğalması sonucu kemik iliği, periferik kan ve diğer dokuları istila ederek birikmesi ile oluşan malign hastalıklardır (42,44,45).

Akut lösemi hücrelerinin karakteristik özelliği farklılaşma yeteneğini kaybetmiş olmalarıdır. Bu hücrelerin olgunlaşması akut miyeloid lösemi (AML)'de miyeloblast ya da promiyelosit, akut lenfositik lösemilerde (ALL) ise lenfoblast düzeyinde kalmıştır. Bu olgunlaşmayan ve kontrolsüz çoğalan hücrelerin kendi serilerini oluşturarak kemik iliğini istila etmesiyle normal hematopoietik hücrelerin (eritrosit, granülosit ve lenfosit) çoğalması engellenir. Böylece lösemi hücreleri periferik kana ve diğer dokulara geçerek tüm vücuda yayılırlar (metastaz) (44).

Akut lösemiler, insanlarda tüm kanserlerin % 10’unu; tüm lösemilerin ise yaklaşık % 50’sini oluştururlar. Erkeklerde kadınlara göre, beyaz ırkta zencilere göre daha sık görülür (42,45,71).

Laboratuvar bulguları: Kan sayımı sonucuna göre ileri derecede anemi, trombosit sayısının az olması, periferik kan ve kemik iliği yayma preparatlarında blast hücrelerinin bulunması ile tanı konulmaktadır (42,44).

Akut Lösemilerin Sınıflandırılması

Akut lösemiler, kan hücrelerinin morfolojik, histokimyasal ve immünolojik özelliklerine göre;

1. Akut lenfositik lösemi (ALL)

2. Akut nonlenfoblastik veya miyeloid lösemi (AML)

olarak sınıflandırılmış ve çeşitli alt grupları oluşturulmuştur (44,45).

Akut lösemi tiplerinden ALL ve AML görülme sıklığı tüm toplum ele alındığında yaklaşık olarak eşittir. Ancak doğal seyir, prognoz ve görülme sıklığı bakımından farklılıklar gösterir. ALL çocukluk döneminde, AML ise erişkinlerde sık görülmektedir (43,44). Çocuklardaki akut lösemilerin %85’i ALL, %15’i AML, erişkinlerdeki akut lösemilerin yaklaşık %70-%80’i AML, %15-20’si ALL tipindedir (42,72,73).

Akut Miyeloid Lösemi (AML)

Akut miyeloid lösemi, kemik iliğindeki miyeloid tek bir kök hücreden köken alan olgunlaşmamış lösemik blast hücrelerin hep aynı evrede kalıp birikmesi ve normal kan

hücrelerinin üretiminin azalmasıyla karakterize, klonal bir hastalıktır. AML’li hastaların yaklaşık %80’inde somatik mutasyon, kromozomal translokasyon sonucu ortaya çıkar (42,73, 43,71).

Akut miyeloid lösemi, erkeklerde bayanlara göre daha sık görülmekte ve görülme sıklığı yaşla artmaktadır. Çocuklarda AML görülme sıklığı 1,2/100.000, 50 yaşındaki kişilerde 3,5/100.000, 70 yaşındaki kişilerde 15/100.000 olarak belirtilmiştir.

Akut lösemi değerlendirilmesinde hücrelerin morfolojisi ve sitokimyasal boyanma özellikleri dikkate alınarak ‘French-American-British Cooperative Group’ (FAB) tarafından oluşturulan sınıflandırma sistemine göre AML sekiz alt gruba ayrılır. AML alt tipleri ve görülme sıklıkları Tablo 5'de verilmiştir.

Tablo 5. FAB sınıflandırmasına göre AML alt tipleri ve görülme sıklıkları (44,70,71) AML’nin Morfolojik Alt Tipleri Görülme Sıklıkları

(%) AML-M0 Minimal farklılaşmış akut myeloblastik lösemi % 3-5 AML-M1 Olgunlaşma göstermeyen akut myeloblastik lösemi % 15-20 AML-M2 Olgun akut myeloblastik lösemi % 25-30 AML-M3 Akut promyelositik lösemi % 5-20 AML-M4 Akut myelomonositik lösemi % 20-30 AML-M5 Akut monositik lösemi % 2-9 AML-M6 Akut eritrolösemi % 3-5 AML-M7 Akut megakaryositik lösemi % 3-12

Akut miyeloid löseminin alt tiplerinde gözlemlenen kromozom aberasyonları farklılıklar göstermektedir.

Bu alt tiplerinde görülen kromozomal aberasyonları ve füzyon genler Tablo 6'da verilmiştir.

Tablo 6. AML’de görülen kromozom aberasyonların bazıları (44,71)

FAB Alt Tipi Sitogenetik Değişim Moleküler Değişim

M0 t(10;11) CALM;AF10 M1 trizomi 11, t(9;22) MLL duplikasyonu, BCR;ABL

M2 t(8;21), t(9,22) AML1; ETO, BCR;ABL

M3 t(15;17),t(11;17), t(5;17) PML;RARα, PLZF;RARα, NPM;RARα

M4 t(8;16), inv(16) MOZ;CBP, CBFβ;MYH11

M5 t(11q23) MLL füzyonu

M6 t(3;5) NPM;MLF1

M1, M2 ve M4 t(6;9) DEK;CAN, SET;CAN

Birkaç FAB alt grubu

t(16;21) TLS/FUS;ERG

Akut miyeloid lösemi’de t(8;21), t(15;17), inv(16) ve normal karyotip varlığı iyi prognoza işaret ederken; t(9;22) translokasyonu ve 11q23 delesyonu varlığı kötü prognozu göstermektedir. Bu kromozomal aberasyonlar hastalığın tanısında olduğu kadar prognozunda da önem taşır (74). Bunların dışında AML’de sık görülen diğer kromozomal aberasyonlar trizomi 8, del(5q), del(7q)dur (42).

Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL)

Akut lenfoblastik lösemi (ALL), lenfoid kökenli hücrelerin birikmesi ile karakterize klonal bir hastalıktır. ALL, esasen çocuk hastalığı olup, erişkinlerde daha az görülür. En sık olarak beş yaşın altındaki çocuklarda görülür. Erkeklerde görülme oranı kadınlara göre daha fazladır. Erişkinlerde akut lösemilerin % 20’sini ALL oluşturmaktadır. İlerleyen yaşlarda görülme sıklığı giderek azalır. Otuz beş yaşından sonra hafif bir artış gösterir ve 80-85 yaş grubunda ikinci kere küçük bir artış gösterir (42,43,73).

FAB sınıflamasına göre ALL olguları L1, L2 ve L3 olmak üzere 3 alt gruba ayrılır. Tablo 7’de ALL alt tipleri verilmiştir.

Tablo 7. FAB sınıflandırmasına göre ALL alt tipleri (43,44,71) FAB

Sınıflaması

Tanımlama Morfolojik Alt Tipleri

L1 Çocukluk tipi ALL Küçük hücreli, sitoplazması dardır.

L2 Erişkin tipi ALL Büyük hücreli- heterojen, daha geniş sitoplazmalıdır. L3 Burkitt tipi ALL Büyük hücreli-homojen, sitoplazmaları koyu ve

Akut lenfoid lösemi’de gözlemlenen kromozom aberasyonların bazıları Tablo 8'de verilmiştir.

Tablo 8. ALL’de görülen kromozom aberasyonların bazıları (44,71)

Anomali Tipi Gen Bölgesi

t(1;19) (q23;p13) PBX1;E2A t(4;11) (q21;q23) AF4;MLL t(5;14) (q31;q32) IL3;IgH t(8;14) (q24;q32) MYC;IgH t(8;22) (q24;q11) MYC;Ig1 t(9;22) (q34;q11.2) BCR;ABL t(10;14) (q24;q11) HOX11;TCRad t(11;var) (q23;var) MLL;var t(12;21) (p13;q22) TEL;AML1

Akut lenfoid lösemi’de farklı kromozom aberasyonları prognozu etkiler. Erişkin ALL olgularında en sık rastlanan genetik anomali Philadelphia (Ph) kromozomu t(9;22)’nin varlığıdır. Ph kromozomu olması durumunda hastalık hızla ilerlemekte ve daha kötü prognoz göstermektedir. ALL olgularında t(1;19), t(4;11), t(8;14) ve trizomi 8 de kötü prognozu göstermektedir (43,44,71,75).

Kronik lösemiler, görünüşte olgun ancak normal olgun kan hücrelerinin işlevlerini yerine getiremeyen, malign kan hücrelerinin aşırı üretimi ile karakterizedir. Kronik lösemi daha yavaş ilerler ve sonuçları daha az dramatiktir. Temel olarak iki alt grubu vardır:

Kronik Miyeloid Lösemi (KML)

Kronik miyeloid lösemi (KML), çoğalma düzeninin bozulduğu ama farklılaşma ve olgunlaşmanın genellikle korunduğu klonal hematopoietik kök hücre bozukluklarıdır. Kemik iliğinde aşırı miyeloid hücre artışı, periferik kanda olgun miyeloid hücrelerden oluşan yüksek lökosit sayısı ile karakterizedir (42,71,76).

Kronik miyeloid lösemi’nin yıllık görülme sıklığı 1/100.000 olup tüm hematolojik malignitelerin %15-20’sini oluşturmaktadır. 50-60 yaş arasında daha sık görülür. Erkeklerde kadınlara göre daha sık görülmektedir (1,4/1) (42,71,77).

Laboratuvar bulguları: KML tanısı, periferik kan yayması, kemik iliği incelenmesi ve karyotip analizinde Ph kromozomunun varlığı ile konulabilir. Periferik kan yayma

preparatlarında dev trombositler, megakaryosit parçacıkları gözlenmektedir. Bazofil ve eozinofil sayısı belirgin bir şekilde artmıştır (42,71).

Kronik Miyeloid Lösemi’de Görülen Kromozom Anomalileri

Kronik miyeloid lösemi’ye özgü kromozom anomalisi t(9;22) Philadelphia (Ph) kromozomudur. KML olgularında lösemik hücrelerin %90-95’inde Ph kromozomu bulunur. KML ve ALL’de bcr üzerindeki kırılma noktaları birbirinden farklı olduğu için bu hastalıkta gen ifadeleri de farklıdır. ALL’deki Ph koromozunun etkilediği gen bölgesi (q34,q11.2) iken, KML’de (q34,q11) dir. Ph kromozomun varlığı KML hastalarında iyi prognoza işaret ederken ALL’de kötü prognoz göstergesidir (71,75,77,78).

Philadelphia kromozomu 9. ve 22. kromozomun uzun kolları arasında resiprokal

translokasyon sonucu oluşur. İnsanda sitogenetik anormalliğin bir neoplazma ile ilişkisinin gösterildiği ilk translokasyondur (79). Bu translokasyon ile 9 numaralı kromozom üzerinde yer alan abl protoonkogeni, 22 numaralı kromozom üzerindeki bcr geninin yanına giderek kimerik bcr/abl füzyon genini t(9:22)(q34;q11) oluşturmaktadır. KML’nin patogenezinde füzyon gen, p210 bcr/abl proteinini şifreler. Bu protein, artmış tirozin kinaz aktivitesi göstererek hücre içi sinyal yolaklarını etkiler ve kontrolsüz hücre çoğalmasına neden olur. Bu protein mitoz aktivasyonu, apoptoz inhibisyonu, hücrenin adezyon özelliklerinin değişimi ile malign fenotipin ortaya çıkmasına neden olmaktadır (16,18,43,67).

Kronik Lenfoid Lösemi (KLL)

Kronik lenfoid lösemi (KLL) küçük, olgun görünümlü, yavaş prolifere olan uzun ömürlü monoklonal lenfositlerin kan, kemik iliği ve lenfoid dokularda birikimi ile karakterize bir hastalıktır. Bu birikim KLL’de proliferasyon oranlarında artma olmaksızın lösemik lenfositlerin uzamış yaşam sürelerinin bir sonucudur. KLL’de lenfositler apoptozis’in inhibe edilmesi nedeniyle artar. KLL’deki lösemik hücrelerin çoğu hücre siklusunun G0 evresinde

kalmıştır (42,71).

Kronik lenfoid lösemi ileri yaş hastalığıdır ve tanıda ortalama yaş 55’tir. 60 yaş üzerinde toplumda görülme sıklığı 10/100.000’den fazladır. Erkeklerde kadınlara göre görülme oranı yaklaşık 1,7/1 dir. Radyasyonla ilişkisi gösterilememiş tek lösemi tipidir. Sitotoksik ilaçlar ve kimyasal ajanların da hastalığa neden olan bir etkisi bulunmamıştır (23,42,71).

Laboratuvar bulguları: Lökosit hücrelerinin %70-95’ini sitoplazması az, yoğun kromatinli çekirdeğe sahip, küçük ve olgun gibi görünen lenfositler oluşturur. Trombosit sayısı normal değerde ya da artmış bulunur ve trombositlerde fonksiyon bozuklukları sıklıkla belirlenir. Periferik yayma esnasında ezilmiş lenfosit çekirdeklerine sık rastlanır. KLL’de kemik iliğinde lenfositler en az tüm çekirdekli hücrelerin % 30’u civarında bulunur (42,71). KLL’de görülen kromozom aberasyonların bazıları Tablo 9’da verilmiştir.

Tablo 9. KLL’de görülen kromozom aberasyonların bazıları (80)

Anomali tipi Gen bölgesi

13q14 RB1 17p13 p53 11q23 myc

Kronik lenfoid lösemi olgularında en sık gözlenen genomik aberasyon tipi delesyonlardır. Olguların yaklaşık % 55’inde 13q14 delesyonu (80), yaklaşık %20’sinde 11q23 delesyonu (81), yaklaşık %15-20’sinde trizomi 12, yaklaşık %7’sinde 17p delesyonu (80) saptanmıştır. 13q14 delesyonu iyi prognoz gösterirken 11q23 ve 17p13 delesyonu kötü prognoz göstergesi kabul edilmektedir (80,82).

LÖSEMİ ETİYOLOJİSİ

Tek yumurta ikizlerinde bir kardeşte lösemi varsa diğerinde de lösemi görülme olasılığının yüksek olması hastalığın kalıtsal karakterinin bir göstergesidir (42,43,83).

Atom bombasından sonra sağ kalanlarda yapılan çalışmalarda löseminin yüksek frekanslarda gözlenmesi birçok araştırıcı tarafından iyonlaştırıcı radyasyonun lösemi ile ilişkili olduğu şeklinde yorumlanmaktadır (23,44,45,47,84).

İyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmanın akut lösemi ve kronik myeloid lösemi (KML) riskini arttırdığı fakat kronik lenfosit lösemi (KLL) görülme sıklığında artışa neden olmadığı kabul edilmektedir (45,85).

Alkilleyici ajanlardan benzen ve petrol ürünlerine mesleki olarak maruz kalan kişilerde akut miyeloid lösemi (AML) ve akut lenfoid lösemi (ALL) riskinin arttığını gösteren çalışmalar mevcuttur (42,43,86).

Alkilleyici ajanlar başta olmak üzere kanser tedavisinde kullanılan bazı sitotoksik ilaçların ise lökomojenik olduğu saptanmıştır (71,85). Bu ajanların uzun süre kullanımının, ikincil lösemi gelişimine neden olduğu gösterilmiştir (18,23,71).

Mesane böbreklerden gelen idrarın biriktirildiği bir organdır. Karın boşluğunun alt kısmında yer alır. Mesane duvarının yapısında değişici epitel hücreleri, kas hücreleri, yağ dokusu ve bağ dokusu bulunur (87). Mesane duvarının katmanları Şekil 8’de verilmiştir.

Şekil 8. Mesane duvarının katmanları (88)

Sağlık Bakanlığı verilerine göre Türkiye’de mesane kanseri görülme sıklığı prostat kanseri’nden daha fazla olup ürolojik kanserler arasında ilk sırada yer almaktadır (89).

Mesane kanseri mesane duvarını oluşturan hücrelerin kontrolsüz bir şekilde çoğalmasıyla oluşur. Mesane kanserlerinin % 98’i epiteliyal kökenlidir. Bunlardan yaklaşık %90’ı değişici epitel karsinom, %5-7’si skuamöz hücreli karsinom ve %1-2’si de adenokarsinomdan oluşmaktadır (89,90,91).

Mesane kanseri görülme sıklığı, yaşla birlikte artış göstermektedir. Ortalama görülme yaşı 65’tir. 65-69 yaş erkeklerde 142/100.000, kadınlarda 33/100.000, 85 yaş üzerindeki erkeklerde 296/100.000, kadınlarda 75/100.000 olarak bildirilmiştir. Son 50 yılda mesane kanseri insidansı yaklaşık olarak %50 artmıştır (92,93).

Mesane kanseri görülme sıklığı, çeşitli ülkelerde ve farklı coğrafi bölgeler arasında yaklaşık 10 kat farklılık göstermektedir. Bu farklı dağılımın kalıtım, çevresel faktörlere maruz kalma ve metabolik farklılıkların kombinasyonlarından kaynaklandığı düşünülmektedir (89,92,93).

Mesane Kanseri Tanısı

Mesane kanseri’nde en sık rastlanan belirti, idrarda kan (hematüri) bulunması olup hastaların yaklaşık %85’inde görülür (87,92,94).

Mesane kanserinin tanısı, idrar analizi, idrar sitolojisi ve çeşitli radyolojik yöntemler; ultrason incelemesi, sistoskopi (mesaneye ışıklı kamera sistemi ile bakma işlemi) ile konulmaktadır (44,92). Kanser kitlesinin tanımlanması için ayrıca intravenöz pyelogafi (IVP)’de kullanılmaktadır. Bu yöntemde mesane içerisine doğru uzanan papillamatoz oluşum dolma defekti şeklinde kendini göstermektedir. Anormal bir görüntüye rastlanırsa mutlaka biyopsi alınmalıdır. Mesane kanseri Şekil 9’da gösterilmiştir.

Şekil 9. Mesane kanseri (95)

Mesane kanseri’ne genetik yaklaşım: Mesane kanseri gelişiminde p53, Rb, p16, p21 gibi tümör baskılayıcı genler, kromozom 9 delesyonları ve H-ras, c-myc, erbB-1, erbB-2 gibi bazı onkogenler de etkilidir (91,96).

Mesane kanseri ile en sık ilişkilendirilen genler p53 (17p13) ve retinoblastoma (13q14) genleri’dir. Mesane kanserli olguların yaklaşık % 60’ında p53 mutasyonu, yaklaşık %25-30’unda retinoblastoma (Rb) gen mutasyonu görülmektedir (91,97,98,99).

Kromozom 17p kaybı ve p53 mutasyonları, Rb mutasyonu daha çok ileri evre ve yüksek tümör derecelerinde görülür (89,100,101).

Mesane kanserli olgulara spesifik olan 9. kromozomun uzun kolunda ortaya çıkan delesyonlar ise olguların %50’sinden fazlasında saptanmıştır (89,96,97,98).

H-ras (11p15) gen mutasyonları da mesane kanserinin progresyonu ile ilişkilidir. Kromozom 11 delesyon mesane tümörlü olguların yaklaşık %30-40’ında kötü prognoz tespitinde bağımsız değişken olarak bildirilmiştir (89,91,96,97,102). Farklı pek çok mutasyon saptanmışsa da sıklıkla kodon 12’deki tek nokta mutasyon (G→A), H-ras geninin aktivasyonuna neden olmaktadır (103). Bu genler çeşitli şekillerde mutasyona uğradığında, gen ekspresyon artışı, gen ürününde kayıplar veya işlev kaybı gibi sonuçlara yol açmaktadır.

Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR) sıklıkla malign üroepitelyumda, normal epitelyumdan daha yüksek seviyelerde salgılanır. Özellikle yüksek dereceli ve ileri evreli tümörlerde belirgindir ve kötü prognozu gösterir (91,96,104). İzokromozom 5p ve trizomi 15 de kötü prognoz göstergesidir (104).

Mesane kanseri etiyolojisi ve risk faktörleri: Mesane kanserlerinin büyük bir kısmına çevresel faktörlerin neden olduğu düşünülmektedir. Mesane kanseri gelişimine ve ilerlemesine neden olan faktörler; sigara içimi, fazla analjezik kullanımı, enfeksiyonlar, uzun süreli böbrek ve mesane taşları, mesleki karsinojenler, genotoksik kemoterapötik ajanlar olarak bildirilmiştir (89,91,92,93).

Bilinen en önemli çevresel risk faktörü sigaradır. Kadınlarda mesane kanserlerinin yaklaşık %31-34’ü, erkeklerde yaklaşık %50’si sigaradan kaynaklanmaktadır (91,105). Sigara içenlerde, içmeyenlere göre mesane kanseri görülme sıklığı yaklaşık 4 kat fazladır (36, 89,104,105).

Mesane kanserli olguların yaklaşık %20’si mesleki maruziyet kaynaklıdır (96). Petrokimya tesislerinde çalışanlar, kaynakçılar, oto sanayi işçileri, deri işçileri, kağıt sanayi çalışanları, tornacılar, kamyon şoförleri, doktor, giyim sanayi çalışanları, boyacılar, lağım işçileri’nde artmış mesane kanseri riski olduğu bilinmektedir (36,89,101,106). Son yıllarda özellikle asbestozisin mesane kanserinde rolünü ortaya koyan çalışmaların sayısı giderek artmaktadır (105).

Mesane kanseri olgularının çoğunda kalıtım için güçlü epidemiyolojik bulgular bulunmuş ve mesane kanseri aile grupları da bildirilmiştir (91,97,107).

Prostat, erkeklerde idrar torbasının (mesane) hemen çıkışında, rektumun (makat) önünde yer alan bir salgı bezidir. Bu bezin asıl görevi, salgısı ile spermleri taşıyan meninin sıvı kısmını oluşturmaktır. Ayrıca meninin miktarını çoğaltarak spermin döllenme

kapasitesini de arttırır. Yapısında yer alan epitelyum, stroma denilen bir doku ile kaplı olup her ki tabakada da kas lifleri bulunmaktadır (108).

Prostat kanserinin yaklaşık %95’ten fazlası epitel hücrelerinden köken alan adenokarsinomlardır (92,109). Nadiren değişici epitel hücreli, küçük hücreli, epidermoid kanserler ve sarkomlar da gözlenir. İyi farklılaşma olan tümörlerde histopatolojik tanı güç olabilir. Tümörü oluşturan hücrelerdeki farklılaşmanın azlığı ya da tümörün evresi önemli prognostik işarettir. Prostat kanseri Şekil 10’da gösterilmiştir.

Şekil 10. Normal prostat ve kanserli prostat (110)

Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen kanser tiplerinden biridir. İnsidans yaşın ilerlemesiyle birlikte düzenli artış göstermektedir. Yeni tanı konmuş erkeklerin %75’i 65 yaş üstündedir. 50-59 yaş arası erkeklerde insidans 1970’lerden bugüne belirgin bir şekilde artmıştır. İnsidans 1973’de 35/100.000 iken, 1989’da 70/100.000’e yükselmiştir (106,111).

Prostat kanseri insidansı ve mortalitesi; ırk, yaşam tarzı, coğrafya ve ülkeden ülkeye hatta aynı ülkenin farklı yerleşim bölgelerindeki populasyonlar arasında değişiklik gösterir. Bu insidans değişikliğinin temel nedenini çevresel faktörler oluşturmaktadır (112).

Prostat Kanseri Tanısı

Hastalar genellikle sık idrara çıkma, idrar yapmada zorlanma, mesaneyi tam olarak boşaltamama hissi ve metastatik hastalık bulguları ile kliniklere başvururlar (44).

Prostat kanseri ileri evreye gelmedikçe nadiren semptom verir. (44,104). Parmakla rektal muayenede anormal bir durumun saptanması, prostat spesifik antijen (PSA) serum

değerinde yükseklik, görüntüleme yöntemlerinden; transrektal ultrasonografi (TRUS), bilgisayarlı tomografi birlikte değerlendirilerek tanı konulmaktadır (92,104,108,113).

Ancak bazı durumlarda kesin tanının konulabilmesi için, şüpheli görülen prostat bölgelerinden doku alınması gerekmektedir. Doku alınması, ultrason eşliğinde iğne biyopsisi ile gerçekleştirilmektedir. Biyopsi rektumdan prostat bezi içine uzatılan özel iğne aracılığı ile alınır. Biyopsi, prostat kanserinin kesin tanısını koymada tek yoldur (44,108,113,114).

Prostat kanseri’ne genetik yaklaşım: Ailesel prostat kanseri ile ilişkilendirilmiş bazı genler; 1q24-25 RNASEL, 17p11 ELAC2/HPC2 ve 8p22 MRS1’dir. Bu gen bölgeleri sıklıkla delesyona uğramaktadır. (112,115,116).

Kromozom 10’nun uzun kolu (10q23) heterozigot kaybı prostat kanserinde en sık delesyona uğrayan kromozom bölgelerinden biridir ve ileri evre prostat kanseri ile ilişkilendirilmiştir (112,115).

Prostat kanserinin son derece önemli bir diğer kromozomal bölgesi 8.kromozomun kısa kolu (8p) olup prostat kanserlerinin %85’inde delesyon gözlenir (106,109,112,114).

Tedavi edilmemiş prostat kanseri olgularında p53 mutasyonu %10-35 sıklıkta, tedaviye dirençli hastalarda ise %40-50 sıklıkta bulunmuştur (115,116).

Prostat kanserinde 5q, 6q, 16p, 16q, 17p, 17q, ve Y kromozom delesyonları da gözlenmektedir (112,114).

Prostat kanseri etiyolojisi ve risk faktörler: Prostat kanseri gelişiminde yaş bilinen en önemli risk faktörüdür. Prostat kanseri uzun süre alan, kronik ve kompleks karsinogenez olayları sonucu oluşmaktadır. Risk oluşturan diğer faktörler; genetik yatkınlık, D vitamini, sigara içimi, alkol, prostat hipertrofisi, kadmiyuma maruz kalmak şeklinde sıralanabilir (112,115).

Prostat kanseri, genetik ve çevresel faktörlerin etiyolojisinde rol oynadığı, çok yönlü bir malignitedir. Prostat kanserlerinin %10’unun kalıtsal olduğu kabul edilmektedir (112,114,115). Kanserin gelişmesi için en büyük risk faktörü ailede prostat kanseri öyküsünün olmasıdır (112,117). Birinci derece akrabalarında prostat kanseri olanlarda normal poplasyona oranla 2,1-2,8 kat fazla kanser riski saptanmıştır (104,114).

Tarım ilaçlarına maruz kalan çiftçilerde ve petrol endüstrisinde çalışan kişilerde prostat kanserinin artmış riski bildirilmiştir (112,118).

GEREÇ VE YÖNTEMLER

ÖRNEKLEM GRUBUNUN OLUŞTURULMASI

Bu çalışmada Mart 2009-Nisan 2010 tarihleri arasında Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji ve Üroloji Kliniklerine başvuran yeni tanı almış, ilaç veya radyasyon tedavisi görmemiş olgular seçildi. Hematolojik kanserli olgular; 23 kadın ve 27 erkek toplam 50 bireyden oluşurken, ürolojik kanserli olgular; 3 kadın ve 22 erkek olmak üzere toplam 25 bireyden oluştu. Ürolojik kanserler içerisinde mesane ve prostat kanserli olgular yer aldı.

Kontrol grubu olarak, herhangi bir radyasyon ve genotoksik maddeye maruz kalmamış 50 sağlıklı birey seçildi. Kontrol bireyleri seçilirken, hasta yaş aralığı ve cinsiyet dağılımı dikkate alındı. Çalışmada ayrıca kontrol bireyleri için aşağıdaki dışlama ölçütleri kullanıldı.

1. Diabet, Lupus vb. otoimmün bir hastalığı olmak,

2. Allerjik bir hastalığı olmak, 3. Neoplastik bir hastalığı olmak,

4. Akut veya kronik bir enfeksiyonu olmak, 5. Herhangi bir kalıtsal hastalığı olmak.

GEREÇLER

Bilgilendirilmiş Olur Formu

Çalışmamızda olgu ve kontrol grubu bireylerine araştırmanın içeriğini kısaca anlatan, araştırma esnasında kendilerine uygulanacak işlemler hakkında bilgi veren, araştırmayla ilgili sahip oldukları haklar ve yüklendikleri sorumlukları kendilerine bildiren “Bilgilendirilmiş

Olur Formları” kullanıldı (Ek-1). Formlar çalışmaya katılan bireylere okutulduktan veya okunduktan sonra yazılı onayları alındı.

Sosyodemografik Bilgi Formları

Olgu ve kontrol gruplarında, kişilerin bireysel özelliklerini belirlemek için sosyo demografik bilgi formları kullanıldı (Ek-2). Formlarda hasta ve kontrol grubu bireylerinin yaş, cinsiyet, medeni durum, eğitim durumu, meslek, alkol, sigara ve madde kullanımı, aile ağacı bilgileri, genel tıbbi geçmişleri sorgulandı. Formlar hasta ve kontroller ile yüz yüze görüşme yapılarak dolduruldu.

Etik Kurul Onayı

Çalışmamız Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından, araştırmanın amacı, gerekçesi, gereç ve yöntemler ile gönüllü bilgi metni incelendikten sonra 29.12.2008 tarih ve 102-13887 sayılı belge (TÜTFEK 2008-191 nolu karar) ile onaylanmıştır (Ek-3).

YÖNTEM

Örneklerin Toplanması

Araştırmada kullanılan periferik kan veya kemik iliği örnekleri steril şartlarda, vakumlu ve lityum-heparinli kan tüplerine alınarak 1 saat bekletildi. Kültür ekimi yapılmadan önce 1 ml Ficoll-Histopaque ile 2ml kan veya kemik iliği örnekleri falkon tüpüne konulup 400xg’de 30 dakika santrifüj edilerek lökositler ayrıştırıldı. Bu lökositler steril pastör pipeti yardımı ile ayrılarak kültür tüpüne ekim yapıldı.

Hücrelerin Kültüre Alınması

Kan örnekleri Moorhead ve ark. (10) geliştirdiği mikro kültür yöntemi uygulanarak kültüre alındı. Kültür medyumu olarak L-glutaminli RPMI-1640 kullanıldı. 9 ml medyum içine kültür ortamını zenginleştirmek amacıyla %10 Fetal Calf Serum ve bakteri kontaminasyonunu önlemek amacıyla %1 Penisilin/Streptomisin ilave edildi. Medyuma en son 0,5 ml lökosit süspansiyonu ve lenfositleri bölünmeye teşvik etmek amacıyla uygun konsantrasyonda (stok 1mg/ml) 0.15 ml fitohemaglutinin (PHA) eklendi. Kültür işlemleri UV ışıkla (210-300 nm dalga boyunda) steril edilen bir doku kültür laboratuvarında, laminar air flow kabini içinde gerçekleştirildi. Hazırlanan kültür örnekleri 37°C’ de %5 CO2’li etüvde

kültüre alındı. Kültüre 44.saatte uygun konsantrasyonda (stok 6μg/ml) 0.3 ml Sitokalazin B (Cyt-B) eklendi ve 72. saatte kültür durduruldu.

Kültürde ve harvest aşamasında kullanılan cihazlar ve malzemelerin konsantrasyonları ile miktarları Ekler bölümünde topluca verilmiştir (Ek-4).

Hücre Fiksasyonu (Harvest)

Kültür materyali 72 saat sonunda 15 ml’lik falkon tüplerine aktarıldı. 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant atıldıktan sonra buz soğuğunda 0.075 M KCL çözeltisi toplam hacmi 10 ml’ye tamamlayacak şekilde vorteks üzerinde damla damla ilave edilerek hipotonik şok uygulandı. Örnekler 800 rpm’de 8 dakika santrifüj edildikten sonra 3 kez Carnoy Fiksatifi (3:1 (v/v) metanol:asetik asit) uygulanarak fiksasyon işlemi tamamlandı. 2. fiksatife sitoplazmayı koruyabilmek için % 1’lik formaldehit eklendi. Her bir fiksatiften sonra 1000 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi ve üstteki sıvı atıldı. Daha sonra hücreler, önceden dondurulmuş slaytların üzerine 45ºC’lik açı ile 30 cm yükseklikten damlatılarak yayıldı. Slaytlar oda sıcaklığında kurutuldu ve FISH uygulaması yapılana kadar -20°C’lik derin dondurucuda saklandı.

FISH PROTOKOLÜ 1.GÜN

1. Slaytlar 3:1 metanol:asetik asit içinde en az 1 saat bekletilir. %70, %90, %100’ lük etanol serisinde 2 dakika yıkanır. Havada kurutulur.

2. 65ºC’de 15 dakika hibridizasyon fırınında kurutulur. 3. Slaytlar soğuduktan sonra 10 dakika asetonda bekletilir. 4. Havada kurutulur.

5. Her bir slayta 200µl RNAz (1µg/ml) uygulanır. 1saat 37ºC’de inkübe edilir. 6. 2xSSC’de 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır.

7. PBS’de 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır.

8. 3 dakika 37ºC’de pepsin uygulaması yapılır. ( Prob hazırlanır.) 9. PBS’de 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır.

10. Etanol serilerinden 2 dakika geçirilir (%70, %90, %100). 11. Havada kurutulur.

12. Slaytlar %70 formamidde 70ºC’de 3 dakika bırakılarak denatüre edilir (denatürasyon çözeltisi 70 ml iyonize formamid+30 ml 2xSSC).

13. Hemen ardından buz soğuğunda %70’lik etanol içinde 4 dakika bırakılır. 14. Etanol serilerinden 2 dakika geçirilir (%70, %90, %100).

15. Havada kurutulur.

16. Prob uygulanır, lamelle kapatılır ve en az 16 saat 37ºC’de nemli kutuda hibridizasyon için bırakılır.

Prob Hazırlama

1. 37ºC’de 5 dakika ısıtılır ve vortekslenir.

2. Slayt başına 10µl kullanıma hazır prob bir tüpe konur.

3. Prob 10 dakika 85ºC’de denatüre edilir ve hemen buza yerleştirilir.

2.GÜN

1. 37ºC’de 2xSSC’de 5 dakika yıkanır ve lamel alınır.

2. Slaytlar %50 formamide 50 ml 2xSSC eklenerek 37ºC’de 5 dakika iki kere yıkanır. 3. Slaytlar 2xSSC’de oda sıcaklığında 5 dakika iki kere yıkanır.

4. Her slayta 10µl DAPI uygulanır ve slaytın üzerine lamel kapatılır.

Preparatların Değerlendirilmesi

Hücreler Fenech’in (4) sayım kriterlerine göre değerlendirildi.

Fenech’in (4) sayım kriterleri; 1. Hücreler binukleat (BN) olmalıdır.

2. BN’ın her bir nukleus nuklear membranla temas halinde olmalı ve aynı sitoplazmik sınır içinde yer almalıdır.

3. BN içindeki iki nukleus da yaklaşık aynı boyutta, aynı yapıda olmalı, aynı şekilde boya almış olmalıdır.

4. BN içindeki iki nukleus nukleoplazmik köprü ile bağlanabilir. Bu nukleoplazmik köprü nukleus çapının 1/4’ünden büyük olmamalıdır.

5. BN’ın iki nukleusu birbirine temas edebilir ancak üst üste binmemelidir. Üst üste binmiş binukleatlarda ancak iki nukleusun sınırları da birbirinden ayrı seçilebiliyorsa sayılmalıdır.