'Ankara UniversiteSt .
'!fIRiNER fAKülTEli
DIRGili
A.Ü. Veteriner Fakültesi tarafından üç ayda bir neşredilir
Cilt: Viii 1961
No.: 1
••• _-- o• • " ,,_ .,__ "_
BOGA SPERMASININ KATALAZ FERMENTİ İHTİvA EDEN VE
ETM~YEN SÜT, CUE (*) VE 1:1 ORANıNDA SÜT
+
CUESULANDIRICILARINDA MUHAFAZASI
Dr. M. Afif SEvİNÇ ve Dr. Harold D. HAFS (**)
i. GİRİş
Sun 'i tohumlama konusunda, amaç, ekonomi ve pratik uygulama akımlarından üzerinde en çok durulan ve durulmakta olan probleın. erin başında spermanın muhafazası gelmektedir. Bugün, temel ilkeler önünden, kısa ya da uzun süre içinde, boğa spermasını muhafaza layı tamamen çözülmüş bulunmaktadır. Boğa spermasının, yıllarcil onmus olarak saklandıktan sonra, uygun dölverimi sonuçları alınm'ak .artiyle, pratik alanda kullanılması olaganlaşmıştır.
Bilindiği gibi, bir iki gün içinde kullanılamıyacak boğa spermala-ının muhafazası için dondurma tekniğine baş'{urulmaktadır. Bundan aşka, kalıtsal yapıları üstün kimi boğ~ların spermalarına, yetiştiricile-in gösterdikleri büyük talepleri zamanında karrılamak için de, bahis onusu boğalardan, belli bir proğrama göre ve sürekli olarak alınan permalar dondurulmakta ve stok edilmektedir.
Donmuş sperma konusunun kısa bir süre içinde pratikte büyük ir uygulama alanı bulması, hatta başlıbaşına bir endüstrinin
kurul-(*) CornelJ Üniversitesi Sulandırıcısının baş harfleridir.
(**) Adresi : H. D. Hafs, Animal Reproduction Laboratory, Dept. of Dairi, M. S. U., East Lansing, Michigan, U.S.A.
'.
SEvİNç - HAFS
masını doğurabilmiş olması, bu tekniğin sağladığı' büyük faydaların ,tartışma götürmez önemli belirtileridir. 'Bununla beraber, donmuş
sperma tekniği, öbür sperma muhafaza tekniklerine' bakınca, daha çok kompleks ve uygulanmasında daha büyük bir dikk!te ihtiyaç gösteren bir muhafaza tekniğidir. Öte yandan, gene öbür muhafaza teknikleriy-le kıyaslanınca: donmuş sperma tekniğinin daha pahalıca olduğunu görmekteyiz. .
.
Sadece gündelik tohumlamalar bakımından, donmuş sperma tekni ğinin sözünü ettiğimiz kimi güçlüklerini yenecek bir çare bulunam:E mı? Bu soruya kesin bir cevap verebilmek, ancak spermanın donma. dan uzun bir süre fçin muhafaza edilebilmesiyle kabildir. Nitekim, uy-gun bir dölverimi elde etmek için, genellikle, 5°0. de muhafaza edilen boğa sperrriasının bir iki gün içinde toh~lamada kullanılması gerek-mektedir. Benzer şartlar altında, ayni tekniği uygulayarak spermanın, ortalama bir hafta süreyle muhafaza edilebilmesi halinde küçümsen-miyecek ölçüde faydalar sağlanabilir. Çünkü, donmuş sperma teknigi-nin, öbür tekniklere bakınca gerektirdiği fazla iş, kuru buz, alkol ve benzeri malzemeler tasarruf edilebileceği gibi, donmuş spermayı muha faza etmek için 'gereken bazı masraflar da yapılmamış olacaktır. Ancak sözü edilen bu avantajların, sun'i tohumlama programlarının her ba-kımdan geliştiği ve yeririe oturmuş bulunduğu kimi ülkelerde sağlana. bileceğini belirtmek lazımdır.
Bu çalışma, döllerne gücünü yitirmeksizin, boğa spermasını 5cO,
de enaz bir hafta süreyle muhafaza etmek imkanlarını araştırmak aIl}aciyle yapılmıştır. Bu amacın elde edilmesinde kullanılan çeşitli sperma sulandırıcıları kadar, özellikle katalaz fermentinin spermatoza-itleri korumada gösterebileceği etki üzerinde de durulmuştur.
Memeli hayvanların spermatozoitlerinde ya h~ç katalaz fermenti bulunmaz; ya da, bu, fermenti ihtiva edeI11eri varsa, miktarı yok dene-cek ölçüde azdır (8). Deniz Kestanesi spermasında bol miktarda ka ta laz fe.rmenti vardır (1,.4,10,11,12)' Memeli hayvanların spermasında pek az miktarda bulunduğu bildirilen katalaz fermentinin (13) spermataza-itlerden ziyade, başka bir kaynaktan spermaya karışmış olması muhte-meldir.
Spermadaki oksidasyon sonucu olarak yer alan, ve oksijenin speı' matozoitlere vaki zararı (oksijen hasarı) adı ile anılan bir durum var-dır. Boğa spermasının katalaz fermentini ihtiva etmemesi, ,biraz önce belirtilen durum bakımından, özellikle ilgili çekicidir (7,16,18). Söz" edilen bu oksijen hasarı olayı, muhtemelen, aromatik amino asitlerin
BOGA SPARMASI c:
oksidatif diaminizasyonu (amin kökü yerine oksijenin girmesi) sonu şekillenen hidrojen peroı{sid'in (HıOı) direkt etkisinden meydana gel-mektedir (14,15).
RCHı. CH. COOH
+
O2+
HıO - RCH2• C. COOH+
HıOı+
NH3.1
NHı O
Aromatik Amino Asid
Boga spermatozoitleri tarafından okside edilen aramatik amino asidin, L-Tyrosine, L-Phenylalanine ya da L-Tryptophan asidlerin-den biri olması gerekmektedir 04,15). Çünkü, bu üç aromatik amino asid, boga spermasının sulandınlmasında' kullanılan süt ve yumurta sarısının terkiplerinde bol miktarda bulunmaktadır.
i
VanDemark et aL. (17,18) biraz önce. belirtilen durumun dogur-dugu mahzuru gidermek, yani, spermatozoitlerin etkisiyle medyum'da husule gelen ve boga spermatozoit1erine zarar veren hidrojen proksid'- / in (HıOı) kötü etkisini yoketmek amaciyle sperma sulandıncısını;ı. ka-talaz fermenti katmak suretiyle yaptıklan çalışmalarda, oksidasyonun bir sonucu olarak spermatozoit hareket nispetinde vukua gelen kaybm önlendigini görmüşlerdir. Ancak bu araştırıcılar, çalışmalarında kul-landıkları spermalarm çogunu, bogadan aldıktan 24 - 36 saat içinde to-humlamada kullanmışlardır. Spermatozoit1erin canlılıgmı korumada katalaz fermentinin gösterdigi faydalı etki, yapılan bu tohumlarnalar-da, yani, dölverimi deneylerinde müşahede edilmemiştir. Bir diger de:-yimle, katalaz fermentinin sPermatozoit canlılıgmı korumada göster digi faydalı etkiyi, spermatozoitlerin döllerne gücünü artırmada gös-termemiştir.
Donmuş' spermanın geniş bir uygulama alanı buldugu son 1ıllar-daki sperma sulandırıcılariyle ilgili çalışIl1alar, daha çok spermatozoit-lerin dölleme güçspermatozoit-lerini yitirmeksizin, spermanın iki ya da üç günden öteye bir süre için ve 5°C. de muha:fazasmı saglayacak metod ve tek-nikleri geliştirmek ya da bulmak yönünde olmuştur. Bu konuda Foote et aL. (6) ve McLean (9) tarafmdan yapılmış çalışmalar dikkate şayan. dır. Bu araştırıcılann bildirdiklerine göre, spermayı 5°C. de ve bir hafta süreyle muhafaza etmek için kullandıkları sperma sulandırıcıla-rmdan memnuniyet verici ~onuçlar almışlardır. Yani, bu araştırıcıla-rın kullandıkları sulandırıcılar, boga spermasmı bir hafta süreyle ve 5e'C. de muhafaza etmekte, üstelik bu süre içinde ve sonunda tohumla
malarda kullanılmış bulunan bu spermalardan memnuniyet verici bir dölverimi de alınmış bulunmaktadır.
Böyle bir sonuç inı;anı şu mantıki düşünceye götürüyor : Madem-ki belli bir sulandıncıda, dölverimi düşmeksizin, spermayı bir hafta
SEvİNÇ - HAFS
gibi bir süre için muhafaza etmek imkanı mevcuttur; o halde, bu çe-şitten, ama daha etkili bir sperma sulandınclSl içinde bd~a spermas 5°C. de ve daha uzun bir süre için muhafaza etmek mümkün olabilir. •Böyle bir tekni~in başarılı olması halinde, donmuş spermanın dalı
pahalıca .oldu~ bir çok hallerde bu tekniğin donmuş sperma tekniği yerine uygulanması çok faydalar sağlayabilir.
Spermatozoitlerin 5°C. de uzun bir süre için muhafaza edilmeler' halinde, VanDemark et aL. nin (17) bir ya da iki gün muhafaza edilen spermalarla ilgili çalışmalarında tespit edilenden daha çok miktard hidrojen peroksid'in (HıOı) meydana gelmesi beklenebilir. Bu hipote gerçeğe uyuyorsa, spermayı muhafaza için kullanılacak sulandıncıy yeter miktarda katalaz fermenti ilave etmekle spermanın, muhafaz süresinin artmasiyle geniş farklar gösteren, daha iyi bir hareket ve döl verimi nispetleri vermesi icap eder.
II. MATERYAL VE METOD
'Bu çalışma, A.B.D., Mişigan Devlet. Üniversitesinin (Michiga State University) hayvan dölerme laboratuvarında yapılmıştır. A;aş tırmada kullanılan sperm~lar, sun'İ tohumlama metodunu uygulaya Mişigan Hayvan Yetiştiricileri Kooperatifinin (Michigan Artfida Breeders Cooperative) (MABC) çeşitli ırk boğalarından, sun'i vaje kullanılarak alınmıştır. Bu çalışmada kullanılan katalaz fermenti bığır karaciğerinden ve iki defa liyofilize edilerek elde edilmiştir. B-ferment, Amerika'da NBC ilaç firması taırafından imal edilmektedir.
Süt, Cornell Üniversitesi sulandıncısı (CUE) ve 1 :1 oranınd süt
+
CUE sulandırıcı kombinasyonu olmak üzere, çalışmamızda ü sperhıa sulandırıcısı kullanılmıştır (3,6>. Süt, Mişigan Devlet Üniver sitesinin sütçülük departmaı;pndan sağlanmış; 90°C. de, 10 dakika ısı tıldıktan sonra kullanılmıştır. CUE nin terkibine giren yumurta sami ise, ayni üniversitenin tavukçuluk, departmanın gündelik yumurtaların. dan sağlanmıştır. Sperma sulandırıcıları taze olarak hazırlanmış v kullanılmıştır.Sulandırıcılar, katalaz fermenti ihtiva eden ve etmeyen olma üzere iki gurup içinde hazırlanmış; ve böylece araştırmada altı ade tertip yer almıştır. Bundan başka kullanılan sulandırıcıların beher Sm; ne 500 LU. penisilin ve 500 Mcgr. streptomisin ekl~nmiştir.
Spermalar MABC in merkezinde, boğalardan alındıktan sonra he sperma nümunesi üç eşit kısma bölünerek, bir az önce belirtilen ü sperma sulandıncısından biriyle, 35°C. de sulandınımıştır. Bunda sonra özel bir termos içine konan spermalar lobartuvara getirilmiş,
v-BOGA SPARMASI
rada her nümune, ikisi katalaz fermentini ihtiva eden, 5 Smı hacmin-de dört tüpe, eşit miktarda konmuştur. Her tüpteki sulandırılmış sper-ma miktarı, 2 Sm3• idi.
Bu araştırmada, materyalolarak, 20 boğa sperma ejakülatı kulla-ılmıştır. Herbir sperma nÜInunesi ve herbir sulaiıdırıcıya düşen dört üpten ikisindeki katalaz fermentinin
.
seviyesi ya da miktarı,. sulandırıl.ış spermanın sm3• Ü başına bir gamma (0.000,001) idi. Bu miktar, VanDemark et aL. (17,18) nin kullandıkları katalaz fermenti miktarın-dan oldukça fazla idi. Bununla beraber, çalışmamızda sperma sulandı-rıcısına katılan katalaz fermentinin miktarı rastgele seçilmiştir. Ancak, bu miktar seçilirken düşünülen nokta, üç hafta süreyle, 5°C. de mu. hafaza edilecek sperma ortamında meydana gelmesi muhakkak olan idrojen peroksid (HıOı) miktarının bütününü tadile yetecek miktar.
da katalaz fermentinin medyumda bulundurulması idi. ~
Katalaz fermentinin solüsyonu şöyle hazırlanmıştır : Önce, sm3•
de 100 gamma miktarında katalaz fermenti bulunan bir ana solüsyon hazırlandı: Bundan sonra, katalaz fermentini ihtiva edecek sulandırı-cının her 100 sm3• ne, hazırlanan ana solüsyondan 1 sm3• katılarak med.
umda istenilen seviyede katalaz fermentinin bulunması sağlandı. Tüplerdeki sulandırılmış spermaların ısı dereceleri oda ısı derece-sine kadar düştükten sonra, 5°C. deki soğuk hava odasına götürülere!\: orada muhafaza edildi.
Spermatozoitlerin canlılık ya da hareket yüzdeleri, spermalan. oğalardan alındığı gün ve müteakiben 7 nci, 14 ncü ve 21 nci günler(e muayene edilerek tespit edildi. Kontras mikroskop altında okunarak tespit edilen spermatozoit hareket nispetleri, her tüpten iki preparatm
uayene edilmesi suretiyle yapılmıştır. Mikroskopta hareket nispet'et rini okuyan zat, muayene ettiği preparatın hangi ejakülat ve hangi ulandırıcıya ait olduğunu bilmiyordu. Bu usul, herhangi subjektif bir etkinin araştırmadan alınacak sonuçları etkiiememesİ bakımından uy. gulanmıştır.
III. SONuçLAR VE TARTIŞMA
Bu çalışmada elde edilen sonuçlar (Çizelge i) de gösterilmiştir. aryasyon kaynaklarına ait istatistik analizleri de (Çizelge V) te verp.
istir. Cizelge 1. den görüleceği gibi, ortalama spermatozoit hareket ispetleri' bakımından. 5°C. de ve 21 gilnlük muhafaza süresi içinde, en ..stün sonucu, % 50 hareket nispetiyle, katalaz fermenti ihtiva eden. CUE
+
Süt, ve en düşük sonucu veren de,. % 33 hareket nispetiy12,SEvİNÇ - HAFS
eVE sulandırıcıları olmuştur. İkinci derecede iyi sonuç veren şulandı-rlcı, % 48 hareket nispetiyle, eVE
+
Süt sulandırıcı kombinasyonıı olmuştur.Ote yandan, katalaz fermentini ihtiva eden ve etmeyen eVE
+
Süt sulandırıcısında tespit edilen % 49 toptan ortalama spermatozoit ha reket nispeti, süt'te tespit edilen % 37, ve eVE deki % 35 toplu ortala-ma hareket nispetlerinden (Çizelge II) öQ.emli ölçüde yüksek bulun-muştur ( P< .
001). Gene, ayni çizelgeden görüleceği gibi, sulandırı. cılara katalaz fernientinin katılması, önemli ölçüde faydalı bir etki yapmakla sonuçlanmıştır (p<.
001ı.Nitekim, bu fermenti ihtiva eden sulandırlcılarda elde edilen toptan ortalama spermatozoit hareket nispeti % 42 iken, katalaz fermentini ihtiva etmeyen sulandırıcılarda bu nispet, % 38 olmuştur. Bundan başka, sperma sulandırıcılariyle katalaz fermenti arasındaki karşılıklı etkinin (interaction) (De) ista-tistik yönünden önemli bulunmayışı (Çizelge II ve Çizel ge V), katalaz fermenti etkisinin 'sulandırıcının çeşidine göre .değişmediğini göster-mektedir.Sperma sulandırıcıİariyle muhafaza zamanları arasındaki karşı.-lıklı etki (interaction), (DS), Çizelge V. te görüleceği gibi, istatistik yönünden önemli olmuştur (p
< .
001ı. Bu durum, Çizelge III df de açıkça görülmektedir. Gene, ayni çizelgeden görüleceği gibi, eVE -i-Süt'ten müteşekkil sperma sulandırıcısı, 'spermatozoitlerin canlılık ya da yaşama süresini, ayrı ayrı süt ve eVE sulandırıcılarına bakınca, daha fazla uzatmaktadır.Muhafaza zamanlariyle katalaz fermenti' arasındaki karşılıklı etki ( eS) (interaction), IV ncü ve V nci çizelgelerden de anlaşılabileceği gibi, istatistik bakımından önemlidir ( p
<.
001 )" Bu sonuç, bu a.raş-tırmaya baslamadan..
önce düsünüldüğü gibi, medyuma katalaz fermen--tini katmanın faydalı bir etki yaptığım göstermiştir. (Çizelge IV). Van Demark et aL. nin (18) bu konuda yaptıkları çalışmalarda, katalaz fer-mentinin spermatozoitleri muhafaza da gösterdiği faydalı etkiyi, dö!-verimi denemelerinde bulamamış olmaları, kısa bir muhafaza süresin. den sonra spermaları tohumlamada kullanmış olmalarından ileri gel. miş olduğu. anlaşılmaktadır. Nitekim, bu çalışmamızda, katalaz fer-mentinin tam ve belirli etkisi, ancak, m~hafaza süresinin 14 ncü günü ne doğru görülebilmiştir. Bu durum, VanDemark ve arkadaşlarının, dölverimiyle ilgili bahis konusu çalışmalarında neden iyi bir sonuç al. mamış olduklarını açıklamaktadır.
Sperma sulandırıcıları, katalaz fermenti ve muhafaza zamanları arasındaki karşılıklı üçüzlü etkinin (DeS) (interaction) istatistik bakı-mından önemli olmayışı, bu üç faktörün' etkilerini bağımsız olarak: gösterdiklerini, ve muhafaza süresi ne olursa olsun, herhangi özel bir
BOGA SPARMASI .
sperma sulandırıcısı - kaatlaz ferme!lti kimbinasyonunda benzeri nisbI etkinin beklenmesi gerekeceginigöstermektedir ..
Ejakülatlar arasında, muhafaza zamanları arasında ~e tecrüce tüpleri arasındaki karşılıklı etkilerle (interaction), diger müteaddit karşılıklı etkiler (interactio'n) istatistik bakımından önemli farklar göstermişlerdir. Ancak bu çalışmada 9unların taşıdıgı deger, varyas- i
yon kaynaklarının kontrolü bakımından önem taşır.
21 günlük muhafaza süresi sonunda spermatozoit hareket nispet-18"i~0.e !neydana gelen düşüş Çizelge i de gösterilmişti~. ea~!~ ~perma. tozoit nispetlerinde v1.1~uagelen düşüş nispeti bakımından enliyi
S8-nucu, katalaz fe!>nentini ihtiva eden eUE
+
Süt sperma sulandıncısı, (% 48) ha.reket nispetiyle vermişti;. En kötü sonucu da, (% 61) nispe-tinde bir düşüşle eUE sperma sulandırıcısı ve:r!!!işti~. Öte yandan, katalaz fermentini ihtiva e~cn ve etmeyen sptrma sulandırıcılarında, 21 g1..i::içinde yer alancanlı spermatozoit nispetlerindeki düsüsün top-tan ortalamaları, katalaz fermentini. tutan sulandıfıcılarda<'Di;
52)ve
bu fermenti taşımıyan sulandırıcılarda ise (% 59) olmuştur. Böylece, katalaz fermenti lehinde (% 7) gibi önerrili bir fark gerçekleşmiş ol-maktadır. Bundan çıkaracagımız sonuç, herhangi bir sperma sulan-dırıcısına, bu çalışmada katılan miktar kadar katalaz fermenti eklenir ve bununla sulandırılan boga sperması uzun bir süre için muhafaza edilirse, canlı spermatozit nispetinde vukua gelecek spermatozoit öli;imlerinden (% 7) si kurtarılmış olacaktır.V. ÖZE T
1. eUE + Süt sperma sulandırıcı kombinasy~nu (% 48), Süt (% 35) ve eU.E (% 33) ortalama spermatozoit hareket nispetleri vermiş-lerdir. Böylece, kombinasyon, onu teşkil eden sulandırıcılardan çok üstün bir sonuç vermiştir.
2. Katalaz fermenti ihtiva eden ayni sperma sulandırıcıları sıra. siyle, CUE
+
Süt (% 50), Süt (D/O 39) ve eUE (% 37) ortalama canlı spermatozoit nispetleri vermislerdir. Burada da, kombinasyon üstünbir sonuç vermiştir. . . .
3. Spermaya katıldığı ilk günde katalaz fermenti canlı sper-matozoit nispetini etkilememiştir. Ama, katalaz fermentini ihtiva et-meyen sperma sulandırıcılarına bakınca, 7, 14 ve 21 günlük muhafaza sürelerinde spermatozoit hareket nispetlerini önemli ölçüde yüksek tutmuştur.
4. Katalaz fermentinin etkisi bağımsız olmuş, diger bir deyimle, kullanılan sperma sulandırıcılarının etkilerine eklenti şeklinde belir-miştir.
SEVINÇ - HAFS
5. 5°e. de ve 21 günlük muhafaza süresinde spermatozoitler, süt (% 60 düşüş) ve eUE (% 61 düşüş) sulandırıcılanndan .daha iyi bir şekilde eUE + Süt sulandırıcı kombinasyonunda (% 55), canlılıkla-rını muhafaza etmişlerdir. Katalaz fermentini ihtiva eden sperma su-landıneılarında, 21 gün' süreyle meydana gelen spermatozoit hareket
,
nispetlerindeki düşüşün toptan' ortalaması (% 52); katalaz fermentini ihtiva etmeyen ayni sulandırıcılardaki spermatozoit hareketindeki dü. şüşlerin 'toptan ortalaması da (% 59) olmuştur Böylece, medywna katılaifkatalaz fermenti, 21 gün süreyle muhafaza edilen spermalarda vukua gelen spermatozoit zayiatının, ortalama (% 7) sini önlemiş bu.
lunmaktadır. - •
Çizel3"ei.5°e. de ve 21 gün süreyle muhafaza edilen boğa spermalarında tespit edilen ortalama canlı spermatozoit yüzdeleri
Kullanılan i Muhafaza süresi (gün) eanlı 'spermatozo:t
sulandırıcılar -0"--7--14 --2'1 - Orta. nispetindeki düşüş
eUE 68 4L 17 7 33 61 Süt 70 41 17 10 35 60 eUE+Süt 76 59 35 21. 48 55 eUE + Katalaz 68 42 24 12 37 56 Süt + Katalaz 69 46 21: 16 39 53 eUE
-+
Süt + Katalaz 73 60 41 25 50 48._--
--
_.-Ortalama 71 48 26 15 40 56 = 59 = 52Çizclge II. Katalaz fermentini tutan ve tutmayan sulandıncılardaki canlı spermatozoit yüzdelerinin toptan ortalamalan
Kullanılan sulandırıcılar ~
.
Katalaz Fermenti eUE Süt
_.
eUE+Süt Orta.Bulunmayan 33 34 48 38 Sm3• de 1 gamma bulunan 37 39 50 42 . Ortalama 35 37 , 49 40 33 35 48 7 10 21 o 17 17 35 41 41 59 O 68 70 76
Çizelge
nı.
eUE, Süt ve eUE+Süt sulandıncılarında 5°e de ve 21 gün muhafaza süresinde tespit edilen canJı spennatozoithareket yüzdesi ortalamalan
...._- ._-_.
-
.-Muhafaza süreleri (gün) 7 14 21 Orta. Sulandırıcılar eUE Süt eUE+SütBOGA SPARMASI
Çizelge LV. 5°C. de ve 21 günlük muhafaza süresinde katalaz fermenti ihtiva eden ve etmeyen sulandırıcılarda tespit edilen
ortalamacanlı spermatozoit yüzdeleri MUhafaza süreleri (gün)
Katalaz fermenti O 7 14 21 Orta.
Bulunmayan 71 47 23 13 38
Sm3, de 1 gamma
bulunan 70 50 30 18 42
Çizelge V. Varyasyon kaynaklarının veryans unsurları ve hesaplanan
, (F) njspetleri ---_._"--
._,-Varyasyon Serbestlik 'Hesaplanan F nispetlerinin Varyans
kaynaklan dereceieri F nispetleri çizelge değerleri unsurlarının
(*) %10 %5 %1 genişliği D 2 68.39** 2.45 3.24 5.23 55.9 C 1 27.52** 2.99 4.39 8.22 5.3 DC 2 0.80 2.45 3.24 5.23 -0.2 S 3 572.27** 2.18 2.76 4.13 604.6 DS 6 12.21** 1.82 2.18 2.96 10.5 CS 3 9.83** 2.18 2.76 4.13 5.0 DCS 6 0.64 1.82 2.18 2.96 -0.4 E 19 10.26** 1.49 1.68 2.06 28.8 DE 38 1.78* 1.38 1.51 1.78 7.3 CE 19 0.65 1.49 1.68 2.06 -2.2 SE 57 3.74** 1.32 1.43 1.66 15.5 DCE .38 1.14 1.38 1.51 1.78 2.6 DSE 114 1.10 1.26 1.35 1.53 1.7 CSE 57 1.01 1.32 1.43 1.66 01 DCSE 114 0.73 1.26 1.35 1.53 -9.2 T:DCE 120 4.77** 1.17 1.22 1.32 29.5 ST:DCE 360 2.18** 1.17 1.22 1.32 36,6 R:S'IDCE 960 62.6
( .) Kod: D = Sulandırıcılar, C = Katalaz ft~rmenti, S = Muhafaza süreleri, E = Ejakülatlar, T = Tecrübe tüpleri, R = Preparat1arın okunuşları.
9
.•.
,
,
SEvİNÇ - HA"'S
THE PRESERVATION OF BU~L SPERM IN MILK, CUE (.) AND 1:1 CUE+MILK EXTENDERS WITH AND WITHOUT CATALASE
by
M. Alif SEvİNÇ and Harold D. HAFS INTRODUCTION
This experiment is designed, particularly, to test the effects of . catalase enzyme on the percent of motile sperm extended either İn whole rnEk, ellE and in a mixture of equal parts of whole' mBk and CUE.
Mammalian sperm ceIls are rat~e~ ~'1ique in that they contain Httle if they have any catala:;e (8), Contrary to the case !0r sea - urchin semen, which contains abundant quantities of catalase (1,4,10,~!,12). The smallı:.mount of mitalase that has been reported in mammaHan semen (13) is probably from some contaminant rather than from the
sperm.
The', absence of catalase in buIl sperm is of particular interest because of the so-caIled oxgen damage to sperm which occurs as a result of oxygenation of semen (7,16,18). This oxygen damage is pro-bably, and directly due to hydrogen peroxide (HıOı) formation through oxidative deamination of aromatic amino acids (14,15);
RCHı.CH. COOH +Oi+HıO _RCHı C. COOH+Hı02+NH3
i
NH2 O
aromatic amin o acid
The aromatic amino acid oxidized by buIl sperm may be one of the three naturaIly occuring amino acids: L--tyrosine, L--phenyla-lanine and L--tryptophan (14,15). These acids are abundant in the egg yolk and milk used in extenders for diluting, buIl semen.
With the thought that catalase might protect buIl sperm from the hydrogen peroxide which could be formed by the sperm, VanDemark et aL.(17,18') added catalase to buIl semen and found that this enzym~ protected the speı:m from loss of motility as a resuIt of exygenaUon; but no such beneficial effeet was observed on the fertility of buIl semen. The majority of this semen was used for breeding from 24 to 36 p,ours after eoIlection.
.
(*) İnitials of the Comell University extender.
r---
-BULL SEMEN PRESERV A TION
In more recent years, particularly since the introduction of frozen semen to practical field, extender research has been directed more toward developing techniques for prolonging the fertile . life of sperm dur,ing storage at 5°C., beyond one or two days. For example, McLean (9) and Foote et. aL. (6) have reported extenders which show consi-derable promise for maintaining satisfactory fertility during storage at 5°C. for as long as one week. Because this type of extender offers greater _efficiency of utilization of sperm, and because its use is rela-tively inexpensive when compared to frozen semen, the extender fo~' prolonged storage at 5°C. 'may offer more advantages then -does froze semen under many circumstances .
.
The prolonged storage of sperm at 5°C. may result in an accumu-lation of hydrogen peroxide (H202) larger than could be detected in
the fertility experiment carried out by VanDemark et aL. ( 17), in which the sperm were stored for onlyone or two days. if this is true, inclusion of sufficient amount ofcatalase enzyme in the extender should result in better motility and fertility of sperm, with larger dif. ferences appearing as the storage interval increases.
MATERIALS AND METHODS
This expeİ'iment was carried out at The Animal Reproduction La. boratory of Dairy Dept., Michigan State University (M.S.U.L The semen samples were obtained from the different bulls of Michigan Artificial Breeders Cooperative (MABC). The milk and egg yol k used in pre-paring extenders were provided from the Dairy and Poultry depart,-ments of M.S.U. The catalase enzyın. used in this experiment is twic-2 1yophilized and was purchasect from NBC drug firm.
Each of 20semen samples were split among six treatments using mainly three diluters: 1) heated homogenized who1e milk (3); 2) CUE (6); and 3) a mixture of equal parts of milk and CUE, each with and without catalase. The cata1ase enzyme was added to the extender at a concentration' of one gamma (0.000,001 gm) per mL.; a concentration considerably higher than that used by VanDemark et aL. (17,18L This level of concentration was chosen somewhat arbitrarily, but it was in. tended that there should be enough catalase to reduce all of the hydro.
i
gen peroxide fol'med during three weeks of storage at 5°C.
In order to use the catalase enzyme, a stock sol~tion of 100 gamma per mL. of bedistilled water was prepared and one part of this stock solution of catalaze enzyme was added to 100 parts of exten:;er.
SEvİNÇ - HAFS
Table
ı.
Average percentages of motile sperm for the six treatments ~ll1ring storage at 5°C. for 21 days---Days of stofage .Declin3 from
--
--Extenders O 7 14 21 Av.
ata
21daY.3CUE 68 41 17 7 33 61
MBk 70 41 17 LO 35 60 59
CUE+Milk 76 59 35 21 48 55
CUE + Catalase 68 42 24 12 37 56
Milk + Cati:llase 69 46 24 16 39 53 52
CUE + Milk + Catalase 73 60 • .41 25 50 48
Average 71 48 26 15 40 55.5
Table 2. Overall average percentages of motile sperm in the three extenders with and without eatalase
Extenders
..-
---
'--Catalase CUE Milk CUE+Milk Av.
---None 33 34 48 38
1 gamma/ml. 37 39 50 42
._----
--0-Average 35 37 49 40
Table 3. Average pereentages of on0tile spemı in the CVE,Milk, and CVE + Milk extenders during storage at 5°C. for 21 days
+._---Days of storage
---
--Extenders O 7 14 21 Av. CUE 68 41 17 7 33 Milk 70 41 17 10 35 CUE+Milk 76 59 35 21 48 Average 71 47 23 13 39For each extender within each ejaculate, two 5 mL. test tubes were prepared; each tube filled with two mL. of extended semen. Duplicate motility estimates were made from each test tube on the day of collaction and again at 7, 14, and 21 days af ter collectian of the semen
BULL SEMEN PRESERVATION
samples. Motility readings were made by a person who was unaware of the identities of extenders and semen samples being examined.
RESULTS !ND DISCUSSION
The resul s obtained in this studyare shown in table 1, and a sum. mary of the statistical analysis is presented in table 5.
As it may be seen from the body of table 1, the highest ave"agc motility of sperm was obtained from catalase included eUE+Milk extender (50 %), and the lowest from eUE extender (33 %) for 21
days of storage at 5°e. eUE+Milk combination gaye a 48 % average motility at 5°e. during the same period of storage.
The overall average motility of 49 % for the eUE+Milk extender (shown in table 2) was significantly greateıt ( P
<.
001) than the 37 % for Milk and ,the 35 % for eUE. Presenee of eatalase in the extenders resulted in a significantly beneficial effect ( p< .
001); an average sperm motility of 38 % being obtained where no eatalase was present as compared to 42 % with catalase (table 2). But the interaction between ca talase and extenders (De) (see tables 2 and 5) did not approaeh signifieance. This indicates that the effect of catalase. is the same regardless of which extender is used.The interaction between extenders and storage times (DS) was signifieant ( P
<.
001), and the eUE+Milk extender promoted better livability (i. e., mo.re. longevity) during storage than either the eUE or the Milk extender (see tables 3 and 5). The interaction between eatalase and storage times, (eS) whieh may be seen from the body of table 4, and shown in table 5, was also signifieant (p< .
001). The presenee of eatalase in the extender exerted a benefieial effeet (see table 4) as hypothesized prior to running this experiment. The faet that the fıiıı effeet of the eatalase enzyme was not realize d until 14 days of storage explains why VanDemark et aL. (18) did not find ~ similar effeet on fertility af ter short term of storage.Table 4. Average percentages of moti1e sperm in cxtenders with and without catalase during storage at 5°C. for 21 days
eatalase None 1 gamma/ml. Days of storage
---O 7 14 21 Av. ---71 47 23 13 38 70 50 30 18 42
SEvİNÇ - HAFS
'Table 5. F ratios and variance components for the measured sources of variation
Source Değrees Compute'" Magnitude
of of F Tabular F ratios of variance
variation freedom ratio 10% 5% 1% component
( *) ~ D 2 ,68.39*.,. 2.45 3.24 5.23 55.B C 1 27.52** 2.99 4.39 8.22 5.:3 DC 2 0.80 2.45 3.24 5.23 -0.2 S 3 572.27"'* 2.18 2.76 4.13 604.6 DS 6 12.21** 1.82 2.18 2.96 10.5 CS 3 9.83** 2.18 2.76 4.13 5.0 DCS 6
,P:64
1.82 2.18 2.96 -0.4 E 19 10.26** 1.4!:J 1.ti8 2.06 28,8 .DE 38 1.78* 1.38 1.51 1.78 7.3 CE 19 0.65 1.49 1.68 2.06 -22 SE 57 3.74 1.32 1.43 1.66 15.5 DCE 38 1.14 1.38 1.51 1.78 2.6 DSE 114 1.10 1.26 1.35 1.53 1.7 CSE 57 1.01 1.32 1.43 1.66 0,1 DCSE 114 0.73 1.26 1.35 1.53 -9.2 T:DCE 120 4.77*" 1.17 1:22 1.32 2B.5 ST:DCE 360 2.18**. 1.17 1.22 1.32 313.6 R:STDCE 960 62.6The three way interaction (shown in tab1es 1 and 5) among exten ders, catalase enzyme, and storage times (DCS) was not SignifiCan~ This indicates that these three factors exert thei~ effects indepen dently and that a particular. extender - cata1ase' combination should b i expected to have the same relative effect regardless of the storage tim:
' .
Differences among storage' times, among ejaculates, between tes tubes,. anq differences in the other several interactions were significant; but the se are of little interest in this experiment except to point t, their values 'as means of controling variation.
From standpoint of decline . in spermatozoal motility dUrin
J
storage, the catalase included CVE+Milk extender (48 %) was bes~ and CVE (61 %) was the worst. The overall average deeline in spe:
(*) Coded : D
=
diluters, C=
Catalase. S=
Storage times, E=
ejaculates T=
test tubes, R=
r~adings.BULL SEMEN PRESERVATION
••
motility during storage at 5aC. for 21 days was signifieantly better (52
% ) with diluters including eatalase than those without catalase (59 %lo
SUMMARY
ı.
The CUE +Milk extender resulted in the highest average mo-tility (49 %); and the average sperm motility for Milk and CUE exten-ders were 37 and 35 %, respeetively.2. The average sperm motilities in eatalase i~cluded CUE+Milk, Milk, and CUE extenders were 50, 39 and 37 %, respeetively.
3. Catalase enzyme apparentıy had no effeet on motility of the sperm on the day of collectian semen; but after 7, 14, and 21 days of starage eatalase maintained higher motilities of 3, 7, and 5 %, respev-tively, than none eatalase extenders.
4. The effeet of eatalase enzyme was independent of, and additive to, the effect of the diluter used.
5. The sperm retained their livability during storage at 5°C. for 21 days better in the' CUE + Milk extender (55 % decline) than in the Milk (60 % deeline ) or in the CUE extender (61 % deelinelo The overaH average decline in sperm motility during .storage for 21 days was signifieantly better (52 %) with diluters including eatalase than those without eatalase (59 %).
ACI{NOWLEDGMENT
The authors appreeiate the assistanee extended by R. C. Knise!y and the supply of semen samples by the pe ap le of MABC.
REFERENCES
.1. Barron, E. S. G., B. Gasvoda, and V. F1ood. 1949. Studies on the meehanisms of aetion of ionizing radiation. IV. Effeet of X - ray irradiation on the respiration of sea lifehin sperm. Bio1. Bull. Woods Hale, 97 :44.
2. Barron, E. S. G., V. Flood, and' Gasvoda. 1949. Studies on the meehanisms of aetion of ionizing radiation. V. The ıeffeet of hydrogen peroxide and X-ray irradiated sea' water on the respiration
or
sea urehin sperm and eggs. Bio1. BulL' Woods Hole, 97 :51./
3. Dombroski, F. 1957. Preparation and use of glyeerinated mill< as a sperm diluent. Personal 'eommunieation.
SEvİNç - HAFS
...
. 4. Evans, T.C. 1947.. Effects of hydrogen peroxide in the mediuın by radiation on spermatozoa of Arbacia Punctulata. BioI. BulI. Wood: Hole, 92 :99.
5. Evans, R.J. 1958. Egg yolk .proteins. Protein seminar, Michigan State University.
6. Foote, R. H., D. C. Young, and H. O. Dunn. 1958. Fertility of bull semen stored for one and two days at 5°C. in 20 % yolk - eitrate . glycine - glueose extenders. J. Dairy SeL, 41 :732. (Abs.)
7. MaeLeod, J'. 1943. The role of oxygen in the metapolism ana motility of human spermatozoa. Amer. J. PhysioI., 138 :512.
8. Mann, T. 1954. The bioehemistry of semen. Methuen and Co., Ltd., London.
9. MeLean, J. M. 1956. Results on the use of bovine semen stored 6 to 10 days in homogenized whole milk with the addition of 10 % glyeerine. N.A.A.B. News, 4: 13.
10. Rothsehild, Lord. 1948. The physiology of sea - urehin sper matozoa, Laek of movement in semen. J. Exp. BioI., 25 :344.
11. Rothsehild, Lord. 1950. The physiology of sea ur ch in sperma. tozoa. Catalase. J. E;xp. Bio!., 26 :396.
12. Rybak, B., and T. Gustafson. 1952. Ark. ZooI., ser. 2, 3 :189. 13. Sergin, N. P. 1940. Trudy Lab. iskusst. Osemen. Zhivotn. (Moscow), 7 :220. (A.B.A., 13 :6).
14. Tosie, J. 1947. Meenanisms of hydrogen peroxide formation by spermatozoa and the role of amino aeids in sperm motility. Nature, London, 159 :544.
15. Tosic, J. 1951. Symp. Bioehem. Soe., 7 :22.
16. Tosic, J., and A. Walton. 1946. Effeet of egg-yolk and its constituents on the respiration and fertilizing eapacity of spermatozoa. J. Agrie. SeL, 37 :'69.
17.. VanDemark, N. L., Q. W. Salisbury, and Bratton. ı94~ Oxygen damage to bull spermatozoa and its prevention by eatalase. J. Dairy SeL, 32 :353. '\.
18. VanDemark, N. L., R. W. Br.atton, and R. H. Foote. Thf. fer. tility of bovine semen in eitrate-yolk extenders eontaining added' eata.
