Cilt 1, Sayı 3, 1996
KARBONMONOKSİTE (CO) AKUT VE KRONİK MARUZİYETİN
SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNİ *
Determination of Acute and Chronic Exposure to Carbon Monoxide by
Spectrophotometric Methods
Nevin VURAL ” , Cem YÜCESOY ***, Rukiye DOĞANYİĞİT (Kahraman) ****
Vural N, Yücesoy C, D oğanyiğit KR. K arbon m on oksit'e (CO) A kut ve K ron ik M aruziyetin Spektrofotom etrik Yöntem lerle Tayi ni, Adli Tıp Bülteni. 1996; 1(3):: 112-5.
ÖZET
CO zehirlenmesi sonucu ölen kişilerin (n: 18) ve CO'e kronik maruz kalan kişilerin (sigara içenler n: 100, içmeyen ler n: 44) kanlarında karboksihemoglobin (COHb) düzeyle ri spektrofotometrik yöntemlerle ölçülmüştür. Postmortem kan örneklerinde COHb tayininde, Dubowski ve Buch- wald'in modifiye mikro spektrofotometrik yöntemlerinden yararlanılmıştır. Sigara içenlerin kan örneklerinde COHb ta yininde ise türev (derivative) UV spektrofotometresinden yararlanılmış ve yöntemlerin karşılaştırılması yapılmıştır.
Postmortem kan örneklerinde COHb düzeyi % 63 - 88 arasında (ortalama % 73.11 ( 6.90) bulunmuştur. Sigara içen lerde COHb düzeyleri ise, günde 1 - 9 tane içenlerde (n: 44) % 1.94 ( 0.11 COHb, 10-20 tane içenlerde (n: 23) % 3.25( 0.19 COHb ve > 20 tane içenlerde ise (n: 31) % 4.36 ( 0.14 COHb belirlenmiştir. COHb düzeyi sigara içen tüm gruplar da içmeyenlere göre ( % 0.86 ( 0.05) anlamlı yüksek bulun muştur.
Dubowski yöntemi, CO ile akut zehirlenmelerin kantita- tif tayininde, kullandığımız diğer spektrofotometrik yöntem lere göre ekonomik ve duyarlı bir yöntem olarak değerlen dirilmiştir. Ayrıca kısa zamanda sonuç vermesi açısından da Adli Tıp laboratuvarında uygulanabilirliği bu araştırmada gösterilmiştir.
A nahtar K elim eler: Karbonmonoksit, Karboksihemog lobin, Akut Zehirlenme, Kronik Zehirlenme, UV Spektrofo- tometre, Türev (derivative) UV Spektrofotometre.
SUMMARY
COHb levels in the blood samples of victims of suspec ted CO poisoning (n: 18) and subjects exposed to low CO (smokers n: 100, nonsmokers n: 44) were measured by spectrophotometric methods.
Derivative UV-spectrophotometric method was also used for the determination of COHb in the blood of smo kers. The sensitivity and reliability of these methods were compared.
COHb levels of postmortem blood samples were found to be between 63.00 ( 88.00 % (mean 73-11 % ( 6.90). COHb levels of 1-9 cigarettes smokers daily (n=44) were found to be 1.94 ( 0.11 % COHb; 3.25 ( 0.19 % COHb in smokers (10- 20 cigarettes daily, n=23). COHb level in all smokers (4.36 ( 0.14 %) were found significantly higher then the nonsmo kers (p<0.01, p<0.05). Dubowski's method for the quantati- ve estimation of the CO poisoning was evaluated as a sen sitive and economic method among the spectrophotometric methods.
Also it was shown that this method can be used easily in Forensic Medicine Laboratories as well as the procedure takes a short time.
Key w ords: Carbon Monoxide, Carboxyhemoglobin, Acut Poisoning, Chronic Poisoning, UV Spectrophotometry, Derivative UV Spectrophotometry.
* Bu çalışma 13-16 Mayıs 1996 tarihinde Bursa'da düzenlenen II. Adli Bilimler Kongresinde poster olarak sunulmuştur. ** Prof.Dr., Ankara Üniv. Eczacılık Fak. Farmasotik Toksikoloji Anabilim Dalı
*** Doç.Dr., Ankara Üniv. Eczacılık Fak. Analitik Kimya Anabilim Dalı **** Uzm.Kim., Ankara Üniv. Adli Tıp Enstitüsü Fen Bilimleri Anabilim Dalı
Geliş Tarihi: 1 8 .0 5 .1 9 9 6 D ü zeltm e tarihi: 2 4 .0 9 .1 9 9 6 K a b u l Tarihi: 15 .1 0 .1 9 9 6
Adli Tıp Bülteni
GİRİŞ
Karbonmonoksit (CO) ile akut ve kronik zehirlen melerin tanısında karboksihemoglobin (COHb) tayini Adli Toksikoloji açısından son derece önemlidir.
CO, karbonlu bileşiklerin tam yanmaması sonucu oluştuğu için günlük yaşantıda yakın çevrede (egzos gazı, sigara dumanı) ve endüstride işyeri havasında yaygın olarak bulunur.
Evlerde kullanılan ısınma araçları, çekimi iyi olma yan sobalar CO kaynaklarını oluşturmaktadır. Özellik le kış döneminde, baca içi ve baca ağzının tıkanma sıyla oluşmaktadır (1).
1991 (Ocak)- 1996 (Nisan) tarihlerinde Ankara böl gesi Adli Tıp kayıtlarına göre, CO zehirlenmesi sonu
cu (şofben, tüpgaz, soba) toplam
63
kişi hayatını kaybetmiştir. Ancak otopsi yapılmak amacıyla Adli Tıp Kurumuna gönderilmeden direkt defnedilen CO ze hirlenmesi sonucu ölüm olayları günlük gazetelerde özellikle kış aylarında yer almaktadır.
Ayrıca, Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkez Başkanlı ğı Zehir Danışma Merkezine 1992 yılında CO zehirlen mesi sonucu toplam 29 vakanın müracaat ettiği tespit edilmiştir.
CO zehirlenmesinde, kriter olarak kanda karboksi hemoglobin (COHb) belirlenmesi önemlidir. Bu amaçla en çok kullanılan gazometrik, kolorimetrik, infrared, spektrofotometrik ve gaz kromatografisi gibi yöntemler kullanılmaktadır.
Diğer hemoglobin (Hb) türevleri yanında
COHb'nin absorbsiyon spektıumuna dayanan miktarı nın saptanması 1900 yılından beri kullanılmaktadır. Spektrofotometrik yöntemlerin prensibi, COHb'nin so- ret bandında (410 nm'de) ve görünür alanda (538 - 540 ve 568 - 572 nm'de) maksimum absorbans göster me özelliğine dayanır. Bu amaçla, çok çeşitli spektro fotometrik yöntemler geliştirilmiştir (2,5,6).
Son yıllarda, COHb tayininde türev (derivative) UV spektrofotometresi de kullanılmaktadır. Bunun nede ni, COHb'nin verdiği türev spektrumlarının, diğer he moglobin bileşiklerinin türev spektrumlarından etki lenmeden kesin ve duyarlı olarak ölçülebilmesidir (7,8).
Bu çalışmada, akut ve kronik CO zehirlenmelerin de COHb tayini için çabuk, güvenli ve hassas yöntem araştırılması yapılmıştır. Bu amaçla Dubowski (10), Buchwald (11) ve türev (derivative) UV spektrofoto metresi yöntemleri karşılaştırılmış ve daha önceki bu konuda yaptığımız çalışmalarda değerlendirilmeye alınmıştır (2,7,9). Ayrıca kullandığımız Dubowski ve Buchwald yöntemleri karşılaştırılmış ve daha önceki bu konuda yaptığımız çalışmalarda değerlendirilmeye alınmıştır (2,7,9). Ayrıca kullandığımız Dubowski ve Buchwald yöntemleri, COHb zehirlenme şüphesi olan kan örneklerine uygulanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM
Kan örneklerinden 5'er mİ cam kapaklı ve heparin- li pyrex tüplere alınmış ve ağızları sıkıca kapatılarak analize kadar 4(C'de muhafaza edilmiştir.
Kan örneklerinde COHb tayininde, Dubowski ve Buchwald tarafından geliştirilen iki yöntem duyarlılık ve verimlilik açısından karşılaştııılmıştır.
Dubowski Yönteminin Prensibi: 0.05 mİ kan örne ğinin, % 0.4' lük amonyum hidroksit (NH40H) ile 10 ml'ye seyreltilmesinden sonra, küçük bir miktar (yak laşık 10 mg) sodyum ditiyonit (N a2S204) ilave edilmiş ve UV spektrofotometresinde 555 ve 480 nm dalga boylarındaki absorbanslarının ölçülmesinden sonra, sonuçlar kalibrasyon eğrisiyle değerlendirilmiştir (10).
Kalibrasyon Eğrisinin Çizilmesi:
a. Heparinize kan örnekleri, son zamanlarda CO'e
maruz kalmamış, sigara içmeyen kişilerden sağlanmış tır.
Şekil 1: %0 COHb ve VolOO COHb Spektrumları
b. İki adet, cam kapaklı pyrex tüpünün her birine 1 mİ kan konulmuş ve birinci tüp içerisinden 3 daki ka % 99.9 saflıkta karbonmonoksit gazı (LB, % 99.9), diğerinden ise 3 dakika % 99.9 saflıkta Oksijen gazı (LB, % 99.9 geçirilmiş ve tüplerin ağzı iyice kapatılıp parafinlenmiştir.
Şekil 2: %0 COHb ve VolOO COHb 4. türev Spektnım lan
Cilt 1, Sayı 3, 1996
c. Hazırlanan bu standartlardan NH40H çözeltisiy
le seyreltilerek çeşitli konsantrasyonlarda standartlar hazırlanmış ve örneklerin COHb yüzdeleri A555/ A480 oranından hesaplanmıştır.
Buchwald Yönteminin Prensibi: 0.02 mİ kan örne ğinin seyrettik amonyak çözeltisi ile 26 ml'ye tamam lanmasından sonra seyreltik çözeltiden karbonmonok- sit ve oksijen gazı geçirilmiş ve UV spektrofotometre- sinde 414, 421 ve 428 nm dalga boylarında ölçüm ya pılmıştır. Sonuçlar formülle hesaplanmıştır (11).
TARTIŞMA
CO ile zehirlenme sonucu meydana gelen kronik maruziyet ve ölüm olaylarının değerlendirilmesinde kanda COHb tayini önemli bir kriterdir. Bu amaçla COHb tayininde kullandığımız spektrofotometrik yön temlerin (Dubowski, Buchwald ve türev spektrofoto- metresi) karşılaştırılması tablo 1, 2 ve 3'de gösterilmiş tir. Bu yöntemler arasında anlamlı bir fark olmadığı (student-t testi ile ) gözlenmiştir (p> 0.05).
Tablo 1. CO zehirlenm esi sonucu m eydana gelen ölüm olayların d a postmortem kan örneklerinde Dubowski ve Bııchıvald yöntem le riyle belirlenen COHb düzeyleri
% COHb % COHb
No Yaş Cinsiyet________ Ölüm nedeni________D ubowski Yöntem i* Buchwald Yöntemi*
1 35 E Şofben zehirlenmesi 74 64 2 44 K 68 72 3 28 K 77 74 4 42 K 82 80 5 37 E " 88 82 6 32 K 67 72 7 38 E " 65 60 8 25 K 80 78 9 24 K 63 58 10 44 E 80 84
11 48 E Katalitik Soba zehirlenm esi 74 77
12 35 E 68 64
13 37 E 78 72
14 22 K 75 77
15 19 E 77 79
16 28 E 65 60
17 30 E Egzos gazı zehirlenmesi 71 75
18 32 K 64 66
Sınır : 63-88 Sınır : 60-84
Ara :: 19-48 Ort : 73.11±1.68 O r t : 71.8811.84
O rt: 32.2 S.D : 7.13 S.D : 7.83
(* P>0,05)
CO tayininde çabuk sonuç vermesi açısından Ad li Toksikoloji Laboıatuvarlarında spektrofotometrik prensibe dayanan Co-Oximeter gibi otomatik yöntem ler veya polarografik oksijen analizörü gibi yöntemler kullanılabilir. Ancak otomatik yöntemler pahalı cihaz ları gerektirmektedir. Bu nedenle bu çalışmada her toksikoloji laboratuvaıında bulunması gereken spekt- rofotometreyle rutin olarak uygulanabilecek yöntem lerden ikisi analitik olarak incelenmiştir. Ayrıca yön temlerin kalibrasyonunda COHb standardları için kul lanılan karbonmonoksit tüpleri (10) yerine daha ucuz ve pratik olarak karbonmonoksitin basit laboratuvar yöntemleriyle elde edilebileceği ve kullanılabilirliği daha önceki çalışmalarımızda gösterilmiştir (2).
Bu çalışmada COHb tayininde türev (derivative) spektrofometresi yöntemine de yer verilmiştir.
Tablo 2. Kronik olarak CO'e m aruz kalan kişilerin (sigara içenler) kan örneklerinde Dubowski ve Buch w ald yöntem leriyle belirlenen COHb düzeyleri
% C O H b ± S.D . (A ra lık)
İçilen S ig a ra S a yısı C in s iy e t (n) D u b o w ski Y ö n te m i B u ch w a ld Y ö n te m i 0 ,8 3 ± 0 ,0 6 a 0 ,8 6 ± 0 ,0 5 b S ig a ra içm e ye n E -15 (0 ,5 0 -1 ,4 2 ) (0 ,5 5 -1 ,2 0 ) (n : 44) 0 ,8 8 ± 0 ,0 4 a 0 ,8 6 ± 0 ,0 4 b K -29 (0 ,5 0 -1 ,2 6 ) (0 ,4 4 -1 ,2 8 ) 2 ,2 3 ± 0 , 1 9 2 ,1 0 ± 0 ,1 9 1 -9 a de t E-17 (0 ,9 8 -3 ,4 4 ) (0 ,7 4 -3 ,2 8 ) (n : 44) 1,87 ± 0,1 7 1,96 ± 0 ,1 7 K -27 (0 ,5 2 -3 ,7 2 ) (0 ,6 6 -3 ,8 8 ) 3 ,1 5 ± 0 ,1 5 3 ,1 4 ± 0 ,1 3 10-20 a de t E -15 (2 ,1 8 -3 ,8 8 ) (2 ,2 4 -3 ,9 8 ) (n : 23) 3 ,3 6 ± 0 ,2 4 3,3 9 ± 0 , 1 6 K-8 (2 ,7 4 -3 ,9 4 ) (2 ,4 4 -3 ,9 4 ) 4 ,2 4 ± 0 , 1 3 4 ,3 4 ± 0,0 8 > 2 0 a de t E-21 (3 ,3 8 -4 ,9 8 ) (3 ,7 8 -4 ,9 8 ) (n : 31) 4 ,4 9 ± 0 , 1 5 4 ,2 7 ± 0 ,0 8 K -10 (3 ,6 4 -4 ,9 4 ) (3 ,8 8 -4 ,7 8 )
a. İki cin s iy e t a ra s ın d a is ta tis tik s e l o la ra k a nla m lı b ir fa rk b u lu n m a m ıştır. (P >0,05) b. İki y ö n te m a ra sın d a ista tistikse l o la ra k a n la m lı b ir fa rk b ulu n m a m ıştır. (P >0 ,05 )
COHb'nin normal ve türev spektrofotometresinde ver diği absorbsiyon spektrumları şekil 1 ve 2'de gösteril miştir. COHb tayininde 1900 yılındanberi spektrofoto metrik yöntemler kullanılmaktadır. Bu amaçla birçok yöntemler geliştirilmiştir. Zamanımızda ise düşük kon santrasyonda COHb tayini ve COHb'nin methemoglo- bin (MetHb), siyanmethemoglobin (CNMetHb) ve sulfhemoglobin (SHb) gibi diğer Hb bileşiklerinden ayrılması ile ilgili çalışmalara zamanımızda da Taşlan maktadır (4,5,12).
Tablo 3 Sigara içenlerde UVspektrofotometresi ve türev (derivati ve) UV spektrofotometresi ile belirlenen %COHb seviyeleri
% C O H b (D u b o w ski Y ö n te m i
U V T ü re v (d e riv a tiv e ) N o S p e k tro fo to m e tre s i U V S p e ktro fo to m e tre si*
1 4 .6 5.1 2 2 .8 3.6 3 4.1 3.9 4 1 0.6 5 4 .6 5.2 6 5 .9 6.4 7 5.5 6.2 8 3 .7 4 .5 9 5 .4 6.6 10 2.9 2.3 S ın ır : 1.0-5.9 S ın ı r : 0 .6 - 6.6 O r t: 4 .0 5 ± 0 .0 8 O r t : 4 .4 4 ± 0.0 9 S.D. : 1.42 S .D . : 1.82 *(P > 0 ,0 5 )
Yukarda açıklanan yöntemlerle postmortem kan da saptanan COHb düzeyleri Tablo l'de gösterilmiştir. İncelenen 18 postmortem kan örneğinde COHb düze yi ortalama % 73-11 C 6.90 olarak saptanmıştır. Genel olarak CO zehirlenmesinin neden olduğu ölümlerde kanda COHb düzeyi % 60 ve üstüne çıkmaktadır. El de ettiğimiz bulgular bu konuda diğer araştırıcıların bulgularını desteklemektedir (9,13,14). Kanlarında COHb saptanan 18 ölüm olayında, ölüm nedeni ola
Adli Tıp Bülteni
rak şofben (tüp gazla çalışan) zehirlenmesi (n: 10), ka talitik soba zehirlenmesi (n: 6) ve eksoz gazı (n: 2) ze hirlenmesi olarak bildirilmiştir. Genel olarak karbon- monoksitle zehirlenme ve ölüm nedenleri arasında yangın dumanına (3), eksoz gazına maruz kalma (14) ve ülkemizde ise soba ve şofben zehirlenmesi nedeni ile Taşlanmaktadır (13). Diğer taraftan ülkemizde soba ve gaz dumanına maruz kalma sonucu oluşan ölüm ler normal kabul edilip Adli Tıp raporlarına geçmedi ği için CO ile zehirlenme ve ölümler hakkında istatis tikler yeterli değildir.
Postmortem kan örnekleri için kullanılan bu iki yöntemin, daha düşük konsantrasyonda kronik CO'e maruz kalan kişilerin (sigara içenler) kanlarında COHb tayini için uygulanabilirliği gösterilmiştir. Siga ra içmeyenlerde COHb düzeyi ortalama % 0.80 ( 0.05, sigara içenlerde (1 paket civarında) ortalama % 4.36 (14 tespit edilmiştir. İstatistiksel değerlendirmeler so nucu (student-t testi), COHb düzeyi sigara içmeyenle re göre sigara içenlerde daha yüksek bulunmuştur (p<0.01, p<0.05). Ancak COHb düzeyi cinsiyete göre anlamlı bir farklılık göstermemiştir (p>0.05, Tablo 2). Akut karbonmonoksit zehirlenmesinin semptomları COHb düzeyi % 10 üstüne çıktığında anlaşılabilir. De vamlı ve düçük düzeyde CO'e maruz kalma ile kanda COHb düzeyi % 7 - 8'e kadar ulaşabilir. Bu durumda akut semptomlar yerine psikometrik deneylerle göste rilebilen psikonörolojik semptomlar belirir (11). Siga ra içenlerde COHb düzeyi içilen sigara sayısına bağlı olarak % 5 ve daha üstüne çıkabilir. Bulgularımız bu araştırmaları desteklemektedir (9).
KAYNAKLAR
1. Vural N. Toksikoloji. Ankara: A.Ü.Basımevi, A.Ü.Ecz.Fak.Yayınları, No:73, 1996: 413-420.
2.Vural, N., Motacedded.: COHb tayininde kullanılan mikrodifüzyon ve değiştirilmiş Wolf yöntemlerinim karşılaştırılması,
3. Gormsen H, Jeppsen N, Lund A. The Causes of Death in Fire Victims. Forensic Sci Int 1984;24: 107-
111
4. Lewin BC. Rechani PR, GumanJL. Analysis of
Car-boxyhhemoglobin and Cyanide in Blood From Vic tims of the Dupont Plaza Hotel Fire in Puerto Rico. J Forensic Sci 1990;35(1): 151-168.
5. Panzali A, Signorini C, Albertini A. Improvement in Lower Carboxyhemoglobin Range Determination by Second-Derivate Spectroscopy. Clin Chem 1987;33 (1):2311-2312.
6. Vreman HJ, Mahoney JJ, Kessel AL, Stevenson DK. Carboxyhemoglobin as Measured by Gas Cromatog- raphy and with IL 282 and 482 Co-Oximeters. Clin Chem 1988;34 (12):2562-2566.
7. Weiser, W.E., Parduce, H.L.: Evaluation of Multi- Wavelength Derivate Spectra for Quantitative Aplica- tions in Clinical Chemistry. Clin. Chem. 1983; 29 (9): 1673-1677.
8. Park J, Worth HG. Carboxyhemoglobin Determi nation by Second-Derivate Spectroscopy. Clin Chem 1985;31(2):279-281.
9. Vural N, Kahraman R. Karbonmonoksit (CO) Ze hirlenmesi ile Ölenlerde ve Sigara İçenlerde Karbok- sihemoglobin (COHb) ve Methemoglobin (MetHb) Düzeyleri. A.Ü. Ecz Fak Derg 1994;23(12): 11-19. 10. Bauer JD. Carboxyhemoglobin, Methemoglobin and Sulfhemoglobin. Clinical Laboratory Methods and Diagnosis, Volume 1, London: Saint Louis The C.V. Mosby Company, 1970:397-405.
11. Vural N, Motacedded Z. Standardization of Car boxyhemoglobin by Microspectrophotometric Met hod and Application of the Method to Workers Oc- cupationaly Exposed to Carbon Monoxide. A.LI.Ecz Fak Mec 1978;8(l):55-68.
12. Siek OJ, Riedors F. Determination of Carboxyhe moglobin in the Presence of Other Blood Hemoglo bin Pigments by Visible Spectrophotometry. ) Foren sic Sci 1984;29(.l):39-54.
13. Vural N, Kahraman R. Factors Affecting The Post mortem Carbon Monoxide and Methemoglobin Con centrations. Forensic Chem 1994;5:93-96.
14. Reys LL, Santos JC. Importance of Information in Forensic Toxicology. Am J Forensic Med Path 1992;13(l):33-36.
Yazışma adresi:
Prof.Dr. Nevin VURAL
Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasotik Toksikoloji Anabilim Dalı 06100 Tandoğan / Ankara
