T.C.
GAZĐOSMA PAŞA Ü ĐVERSĐTESĐ FE BĐLĐMLERĐ E STĐTÜSÜ
TÜRKĐYE DOĞAL FLORASI DA YETĐŞE Papaver CĐ SĐ Oxytona SEKSĐYO U A AĐT
GE HAVUZU U SRAP TEK ĐĞĐ ĐLE GE ETĐK KARAKTERĐZASYO U
Elif KAYMAK Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı
Yrd. Doç. Dr. Đskender PARMAKSIZ 2010
T.C.
GAZĐOSMA PAŞA Ü ĐVERSĐTESĐ FE BĐLĐMLERĐ E STĐTÜSÜ
BĐYOLOJĐ A ABĐLĐM DALI
YÜKSEK LĐSA S TEZĐ
TÜRKĐYE DOĞAL FLORASI DA YETĐŞE
Papaver CĐ SĐ Oxytona SEKSĐYO U A AĐT GE HAVUZU U
SRAP TEK ĐĞĐ ĐLE GE ETĐK KARAKTERĐZASYO U
Elif KAYMAK
TOKAT 2010
TEZ BEYA#I
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i ÖZET Yüksek Lisans Tezi
TÜRKĐYE DOĞAL FLORASIDA YETĐŞE Papaver CĐSĐ Oxytona SEKSĐYOUA AĐT
GE HAVUZUU SRAP TEKĐĞĐ ĐLE GEETĐK KARAKTERĐZASYOU
Elif KAYMAK
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Đskender Parmaksız
Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan Papaver bracteatum (2n=14), P. pseudo-orientale
(2n=42) ve P. orientale (2n=28) türleri ülkemiz doğal florasında bulunmaktadır.
Papaveracea familyasında yer alan Papaver cinsi morfin, kodein, tebain, oripavin gibi zengin
alkaloit içeriklerine sahiptir. Alkoloit içeriklerinin, ilaç sanayinin hammadde sorununa katkı
olması ve uyuşturucu madde olarak kullanılması sebebiyle önemi yüksek bir familyadır. Her ne kadar bu üç türün morfolojik ve biyokimyasal özellikleri belirlense de bu özellikler
intersipesifik hibridizasyon ve çevresel faktörlerden etkilendiğinden dolayı birbirlerinden ayrılması oldukça güçtür ve karışıklıklar yaşanmaktadır. Bu karışıklığın giderilmesinde moleküler metotlardan yararlanılmaktadır. Genetik varyasyonun araştırılmasında moleküler markörlerden yaygın olarak kullanılan SRAP tekniği kullanılmıştır. Farklı bölgelerden toplanan 40 bitki örneği 10 adet SRAP primeri kullanılarak analiz edilmiştir. Shanon indeksi 0,55, Nei indeksi 0,38, polimofizm oranı 89,66 ‘dır. 29 okunan banttan ise 26’sının polimorfik olduğu bulunmuştur. 3 nolu SRAP primeri en fazla sayılabilir bant veren primer olmuştur. Ortalama genetik mesafe 0,46 olarak bulunmuştur. En yakın mesafe 0,109 olarak 1 nolu ve 2 nolu populasyonlar arasında bulunmuştur. En uzak genetik mesafe ise 1,00 olarak 14 nolu ve 18 nolu populasyonlar arasında bulunmuştur.
2010, 31 sayfa
Anahtar Sözcükler: SRAP, moleküler markörler , Papaver, Oxytona, P. bracteatum,
ii ABSTRACT
Ms Thesis
GEETIC CHARACTERIZATIO OF GEE POOL OF Papaver GEUS Oxytona SECTIO GROW in WILD FLORA OF TURKEY BY SRAP TECHIC
Elif KAYMAK Gaziosmanpaşa University
Graduate School of atural and Applied Sciences Deparment of Biology
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Đskender Parmaksız
P. bracteatum (2n=14), P. pseudo-orientale (2n=42) and P. orientale (2n=28) species
of Oxytona section in Papaver genus are found widely in native flora of Turkey. Genus
Papaver from Papaveracea family has rich alkoloids such as morphine, codeine, tebaine,
oripavine. Papaveracea family is highly important due to its contribution to pharmaceutical industry and usage for narcotic analgesic. Although the morphologic and biochemical traits of 3 species have been determined, because these traits are effected from interspesific hybridizations and environmental conditions, the identification of the plant populations of Oxytona section is very difficult and causes confusion. Molecular methods are used to eliminate this confusion.In our study, SRAP technic that is widely used in the investigation of molecular markers was employed to research genetic variation. Forty plant species collected from different regions were investigated using 10 SRAP primers. Shannon index was found to be 0,55, Nei index 0,38, rate of polymorphism is 89,66. 26 bands were polymorphic from 29 scorable amplification bands. The highest number of scorable bands were generated by SRAP 3 primer. Average genetic distance was found to be 0,46 The nearest genetic distance between population 1 and population 2 was 0,109. The farthest genetic distance between population 14 and population 18 was 1,00.
2010, 31 pages
Key words : SRAP, molecular markers , Papaver, Oxytona, P. bracteatum, P. orientale, P.
iii TEŞEKKÜR
Yapmış olduğum bilimsel çalışmalarda bilgi ve deneyimlerini bana aktararak akademisyen olma yolunda rehberliğimi yapmakla kalmayıp, yaşama dair yönlendirmelerine sık sık ihtiyaç duyduğum danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Đskender PARMAKSIZ ‘a çok teşekkür ederim. Bölüm başkanımız Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER’ e teşekkür ederim. Laboratuar çalışmalarımız esnasında birbirimize destek olmaktan hiç çekinmediğimiz ekip arkadaşlarım Gülşen BOZTEPE, Tuğba GÜRKÖK, Eda DAŞTAN, Yahya KILINÇ , Đsmail BENLĐ ‘ye, çabalarımın boşa çıkmayacağı konusunda beni yüreklendiren ve emeğini benim için harcamaktan çekinmeyen hocam Yrd. Doç. Dr. Đbrahim TÜRKEKUL’ a teşekkürü bir borç bilirim. Anne ve babama öncelikle beni dünyaya getirdikleri, sonrasında bana her türlü katlandıkları için minnettarım. Ayrıca hayatımda yer alan ve varlıklarıyla hayatıma bir anlam katan herkese ve her şeye de sonsuz teşekkürler.
Elif KAYMAK Ağustos 2010
iv ĐÇĐDEKĐLER DĐZĐĐ Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ÖSÖZ iii ĐÇĐDEKĐLER DĐZĐĐ iv SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐĐ vi ŞEKĐLLER DĐZĐĐ viii ÇĐZELGELER DĐZĐĐ ix 1. GĐRĐŞ 1 2. KAYAK ÖZETLERĐ 3
2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri 3
2.2. Oxytona seksiyonun Genel Özellikleri 3
2.3. Morfolojik Markörler 5
2.4. Biyokimyasal Markörler (Enzim veya Protein Markörleri) 6
2.5. DNA Markörleri 7
2.5.1. Hibridizasyona Dayalı DNA Markörleri (RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphism = Kesilmiş Parçaların Uzunluk
Polimorfizmi ) 8
2.5.2. RAPD (Randomly Amplified Polymorfic DNA = Rastgele Artırılmış Polimofik DNA)
8 2.5.3. SCAR Markörleri (Sequence Characterized Amplified Region Markers=Belirlenmiş Ve Çoğaltılmış Polimorfik Diziler)
9 2.5.4. SSR (Simple Sequence Repeats= Basit Dizi Tekrarları) 9 2.5.5. ISSR (Inter Simple Sequence Repeats =Basit Đç Dizi Tekrarları)
10 2.5.6. AFLP(Aplified Fragment Length Polymorphism = Çoğaltılmış Parça
v
2.5.7. SRAP Markörler (Sequence-related amplified polymorphism= Sekans
Đlişkili Polimorfizm) 10
3. MATERYAL VE YÖTEM 18
3.1. Materyal 18
3.2.Yöntem 18
3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuar Çalışmaları Đçin Hazırlanması 18
3.2.2. DNA Đzolasyonu 18
3.2.3. PCR Uygulaması 19
3.2.4. Çalışmada Kullanılan SRAP Primerleri 21
3.2.5. Elektroforez Đşlemi 21
3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi 21
3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi 22
4. BULGULAR 23
5. TARTIŞMA VE SOUÇ 25
5.1. Sonuç 27
KAYAKLAR 28
vi
SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐĐ Simgeler Açıklama
bp Base pair (baz çifti =bç)
cM Sentimorgan
kb kilo base
mM milimolar
ng nanogram
rpm revolutions per minute (dakikadaki devir)
µg mikrogram
µl mikrolitre
µM mikromolar
UV Ultraviole
Kısaltmalar Açıklama
AFLP Amplified Fragment LengthPolymorphism(Çoğaltılmış Fragmentlerin Uzunluk Polimorfizmi)
cDNA Komplementer deoksiribonukleik asid dNTP deoksiribonükleosidtrifosfat
DNA deoksiribonükleik asid EDTA Ethilendiamintetraasetik asid
ISSR Inter Simple Sequence Repeats(Basit Đç Dizi Tekrarları) MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Moleküler Evrim
Genetik Analizi)
MAS Marker Assisted Selection (Marker Yardımlı Seçim) ORF Open Reading Frame (Açık Okuma Çerçevesi)
PCR Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PAGE Polyacrilamide Gel Electrophoresis (Poliakrilamid Jel
Elektroforezi)
POPGENE Population Genetic Analysis (Populasyon Genetik Analizi ) RAPD Randomly Amplified Polymorfic DNA (Rastgele Çoğaltılmış
vii
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Kesilmiş Parçaların Uzunluk Polimorfizmi)
RNA Ribonukleik Asid
SCAR
Sequence Characterized Amplified Region Marker( Belirlenmiş ve Çogaltılmış Polimorfik Diziler)
SRAP Sequence Related Amplified Polymorphism (Sekans Đlişkili Polimorfizm)
SSR Simple Sequence Repeat (Basit Dizi Tekrarı)
UPGMA Unweighted-Pair Group Method Arithmetic Average(Aritmetik Ortalamaları Kullanılan Ağırlıklı Olmayan Çift Grup Yöntemi) Taq Thermus aquaticus
TBE Tris/borat/EDTA (Buffer=Tampon) TE Tris/EDTA (Buffer=Tampon) Tris Tris(hidroksimetil) aminometan
viii
ŞEKĐLLER DĐZĐĐ
Şekil Sayfa
Şekil 4.1. SRAP 1 Nolu Primerin %1’lik Agaroz Jel Görüntüsü 23 Şekil 4.2. SRAP 3 Nolu Primerin %1’lik Agaroz Jel Görüntüsü 23 Şekil 4.3. SRAP primerlerinin oluşturduğu, bitkiler arasında filogenetik
ix
ÇĐZELGELER DĐZĐĐ
Çizelge Sayfa
Çizelge 3.1. PCR mix bileşenlerinin konsantrasyonları ve miktarları 20
Çizelge 3.2. PCR protokolü 20
Çizelge 3.3. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri 21 Çizelge 4.1. Kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleri
1.GĐRĐŞ
Günümüzde bitki türlerinin tanımlanmasında ve genetik varyasyonun araştırılmasında
moleküler markörler yaygın olarak kullanılmaktadır. Gelişen moleküler markör teknolojisi ile gen kaynaklarının karakterize edilmesi, çeşitlerin birbirleri arasındaki genetik farklılığın belirlenmesi, kromozom haritalamaları ve evrimsel gelişim analizlerinde yeni yöntemler ortaya çıkmıştır. Morfolojik ve biyokimyasal markörlerin uygulamadaki yetersizlikleri moleküler markörlerin uygulanmasıyla ortadan kalkmıştır. Moleküler teknikler, diğer tekniklere göre daha fazla avantajlara sahip olup, çevre faktörlerinden etkilenmezler ve polimorfizm oranları yüksektir.
PCR ile spesifik DNA parçacıkları çoğaltılarak DNA polimorfızmi belirlenebilmektedir. Protein veya DNA markörlerine dayanan haritalar "moleküler haritalar" olarak bilinmektedir. Günümüzde birçok bitkide genetik uzaklık, moleküler, kimyasal ve morfolojik özellikler kullanılarak belirlenebilmektedir. Canlılar arasındaki genetik çeşitliliğin daha iyi anlaşılabilmesi için, bu yöntemlerin tamamına ihtiyaç duyulmaktadır. DNA dizinindeki polimorfizmin belirlenebilmesi için yaygın olarak kullanılan; RFLP, AFLP, SSR, ISSR, SRAP ve RAPD gibi moleküler markör teknikleri geliştirilmiştir.
SRAP, bitkilerde genetik farklılık çalışmaları için son dönemlerde geliştirilmiş bir moleküler markör sistemidir ( Li ve Quiros, 2001). Đki primer amplifikasyonunu temel alan ve açık okuma çerçevelerini çoğaltmayı amaçlayan bir markör tekniğidir. Taksonomik analizlerde, genetik varyasyonun araştırılmasında, moleküler harita yapımında ve filogenetik akrabalık analizlerinde ayrım gücü yüksek olan SRAP tekniği sıklıkla tercih edilen bir teknik olmuştur. Marul, pirinç, çin lahanası, elma, limon, sap kerevizi, kavun, patlıcan, kenevir SRAP primerleri kullanılarak analiz edilen bitki türlerinden bazılarıdır.
2
Bu tez çalışmasının amacı ülkemiz doğal florasındaki değişik bölgelere ait Papaver cinsi
Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan 3 türe ait toplam 40 adet bitki üzerinde SRAP
(Sequence Related Amplified Polymorphism) yöntemiyle genetik karakterizasyon araştırması yapmaktır. Çalışmamızın sonunda elde edilecek verilerin; Oxytona seksiyonu ile ilgili yapılacak olan moleküler alanda ve diğer alanlardaki çalışmalara yardımcı olacağına inanmaktayız.
2. KAYAK ÖZETLERĐ
2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri
Papaveraceae familyasına ait türler genellikle Kuzey Yarımkürenin ılıman ve subtropik bölgelerinde yayılış göstermektedir. Bu familyada 28 cins ve yaklaşık 250 tür vardır. Ülkemizde bu familyaya ait 5 cins bulunmaktadır (Seçmen ve ark., 1995).
2.2. Oxytona Seksiyonun Genel Özellikleri (Syn: Macrantha)
Oxytona Bernh., Linnaea 8:843. 1833. Macrantha Elk. Tant. Monog, Papaver 13.1839.
Oxytona seksiyonu Papaver cinsine ait olup, çok yıllık türleri içermektedir. Yayılım
olarak Orta ve Doğu Türkiye, Kuzey ve Kuzey batı Đran, Kafkas ve Trans Kafkas bölgelerinde bulunmaktadır. Bu familyaya ait monograflar Fedde (1909) ve Medwedev (1918) ile başlamış en son Goldblatt (1974) tarafından yapılmıştır.
Papaver bracteatum Lindl., Coll. Bot., t. 23 (1821)
Syn : P. lasiothrix Fedde.
P. bracteatum 1818’de Avrupa’ya Fischer tarafından Kraliyet Botanik Bahçesi
(Imperial Botanical Garden)’ne muhtemelen Kafkaslardan tohum kolleksiyonu ile götürülüp, Batı Avrupa’ya dağıtılmış ve Lindley tarafından 1821’de tanıtılmıştır.
Oxytona seksiyonunun en büyük bitkisidir. Bir metreye kadar boylanabilir. 15 kadar
çiçek açan gövdesi vardır. Yapraklar 45 cm kadar uzayabilir. Somatik kromozom sayısı 2n = 14’dür (Goldblatt, 1974).
1700-2500 m arasında açık, yarı kuru yamaçlarda, nadiren gölgeli derelerde, sel yatakları ya da sulama bendlerinin çevresinde çok yoğun Astragalus, Thymus, dikenli bitkiler ve Ferula türleri ile beraber bulunurlar (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
4
Erzurum Kop dağı. Bayburt Aşkale arası 2050-2100 m. Kars, Kayseri Erciyes dağı, Sivas, Ulaş, Erzincan Karadağ 1960 m. Van, Çatak, Ağrı, Büyük Ağrı dağı, Niğde, Pertek 2000 m alanlarında yayılış gösterirler (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Papaver orientale L., Sp. Pl. 508 (2753). Ic. Bot. Mag., 2: t. 57 (1794).
Syn: P. paucifoliatum (Trautv) Fedde; P. orientale var. paucifoliatum Trautv.; P.
orientale. var. parviflora Busch.
P. orientale 1800 m’nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazen altında da
Türkiye ve Đran’da bulunabilmektedir. P. bracteatum’a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneşi az alan kuytularda bulunmaktadır. Somatik kromozom sayısı 2n = 28’dir (Golldblatt, 1974).
Türkiye’ de 1800 m’nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazan altında da bulunabilmektedir. P. bracteatum’a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneşi az alan kuytularda bulunmaktadır (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Orta ve Doğu Anadolu, Ağrı, Erzurum, Erzincan, Kars, Kayseri, Sivas, Tunceli ve Van çevresinde yayılış gösterirler (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).
Papaver pseudo-orientale (Fedde) Medw.
Syn: P. intermedium DC.; P. bracteatum var. pseudo-orinale Fedde.
Genel olarak Đran ve Türkiye’nin nemli yerlerinde bulunmaktadır. Literatürde yaygın olduğu bildirilmektedir. Bu tür arazide kendini belirgin bir şekilde göstermektedir. Bitkide diğer iki türe kıyasla değişiklik vardır. Bunlar; dik tomurcuk, ince narin yayılmış kaliks tüyleri, koyu kiremit kırmızısı petaller, koyu siyahımsı lekeler ve brakteli çiçeklerdir. 1600–2200 m arasında nemli yerlerde bulunmaktadır. Genel olarak akarsu kenarlarında, tabandan su çeken ıslak zeminlerde ya da bol miktarda yeşil olan
5
bölgelerde bulunmaktadır. Kuzey Batı Đran ve Batı Türkiye de bol miktarda bulunmaktadır. Somatik kromozom numarası 2n=42’dir (Golldblatt, 1974).
1600–2200 m yükseklikte nemli yerlerde, nemli kayalar arasında ya da küçük akarsu kenarlarında rastgele dağılmış ve P. orientale ve P. bracteatum gibi kalabalık şeklinde olmayan populasyonlardır (Golldblatt, 1974).
Çoruh, Erzincan, Erzurum, Muş, Ağrı, Van, Niğde, Hakkâri çevresinde dağılım göstermektedir (Golldblatt, 1974).
2.3. Morfolojik Markörler
Akar (2002), morfolojik karakterlerin günümüzde de kullanılan çok yararlı bir yöntem olduğunu belirtmiştir. Ancak, incelenen özelliklerin çevre koşullarından etkilenmeleri, her tür için morfolojik varyasyonun yeterli düzeyde olmayışı, çalışılan karakterlerin bir lokusla sınırlayıcı oluşu ve bazı karakterlerin ortaya çıkması için generatif döneme kadar beklenmesi bu yöntemi genetik varyasyonu ortaya koymada çoğu kez başarısız kıldığını belirtmektedir.
Morfolojik markörlerin yararları:
• Genellikle dominanttırlar. Dominant bir geni resesif genden ayırmada kullanılır. • Sayı bakımından çok azdırlar. Herbir çaprazlamada birkaç tane bulunur.
• Herbir lokusta 2 allel bulunur. • Analizleri çok kolaydır.
• Haritalama populasyonunda yapılacak bir gözlemle kolayca belirlenirler.
Morfolojik markörlerin sakıncaları: • Heterozigotları belirleyemezler • Mutasyonlarla oluşmuş olabilir • Çevresel faktörlerden etkilenirler
6
2.4. Biyokimyasal Markörler (Enzim veya Protein Markörleri)
Morfolojik karakterlerin çevreden etkilenmelerini ortadan kaldırmak için geliştirilen protein markörleri, doğrudan gen ürünleri oldukları için çok önemli üstünlüklere sahiptirler. Eşbaskın (ko-dominant) markör oluşları ve birim başına maliyetlerinin düşük olması kullanım alanlarını artırmıştır. Ancak üzerinde çalışılacak lokus sayısının azlığı ve varyasyon oranının düşük oluşu bu tekniğin kullanımını sınırlamaktadır (Parmaksız, 2004).
Tanksley (1983)’ e göre enzim markörleri gen ürünü oldukları için DNA markörlerine göre sayıca azdır, dokulara ve gelişme dönemlerine göre değişkenlik gösterirler ve çevre faktörlerinden etkilenmelerinden dolayı kullanımları sınırlıdır.
Bachmann (1993)’ a göre enzimler ile DNA markörleri arasındaki farklardan birisi DNA markörlerinin sayıca çok fazla olmasıdır. Teorik olarak DNA markörleri genomun tümünü kaplamaktadır. Bir başka deyişle, genom üzerinde kodlama yapan, kodlama yapmayan, tek kopya veya DNA dizi tekrarlarının da bulunduğu bölgelerin hepsinde DNA polimorfizmi meydana gelebilir. Oysa enzimi kodlayan lokuslar genom boyunca rastgele dağılım göstermemektedirler. Diğer bir ifadeyle, alloenzim markörleri genel olarak genlerin kodlama yapan dizilerindeki farklılıklarla ve fonksiyonel enzim gruplarıyla sınırlıdır. Bu nedenle de tüm genomu kaplamazlar.
Biyokimyasal Markörlerinin Avantajları: •Kodominant markörlerdir.
•Analizleri çabuk, ucuz ve güvenilirdir. •Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmezler.
Biyokimyasal Markörlerinin Dezavantajları: •Sayıları çok azdır.
•Bazı izoenzimlerin ancak özel dokularda ve belli bir gelişme peryodunda gözlemlenebilmesidir. Örneğin esteraz ve peroksidazlarda olduğu gibi.
7
•Çok azda olsa bazen epistatik etki gösterirler.
2.5. DA Markörleri
Günümüzde bitki türlerinin tanımlanmasında ve genetik varyasyonun araştırılmasında moleküler markörler yaygın olarak kullanılmaktadır. Son 20 yıl içerisinde hızla gelişen moleküler markör teknolojisi, çeşitlerin birbirleri arasındaki genetik farklılığın belirlenmesi, kromozom haritalamaları, gen kaynaklarının karakterize edilmesi, evrimsel gelişim analizi ve transformasyonda başarı düzeyinin belirlenmesinde yeni yöntemler ortaya koymuştur. Bu yöntemler klasik yöntemlere göre büyük avantajlar sağlamaktadır. Morfolojik ve biyokimyasal markörlerin uygulamadaki yetersizlikleri moleküler markörlerin uygulanmasıyla ortadan kalkmıştır. Moleküler teknikler, diğer tekniklere göre daha fazla avantajlara sahip olup, çevre faktörlerinden etkilenmezler ve polimorfizm oranları yüksektir. Aynı zamanda pleotropik (bir genin birden fazla fenotipik karakter üzerindeki etkisi) ve epistatik (bir karakterin ortaya çıkmasından sorumlu olan farklı genler arasında baskılayıcı etkilerin olması durumu) etki göstermeyip son derece stabildirler (Beckmann ve Soller, 1986; Tanksley, 1983; Avise, 1994; Bretting ve Widrlechner, 1995).
Moleküler belirteç, DNA’nın bir parçası diğer bir deyişle belirli bir genle beraber kalıtılan bir DNA parçasıdır. Aslında tanımlanan bir gendir ama genomun belirli bir parçasını ifade ettiği için belirteç denmiştir. Canlıların yapısını belirleyen şifre de DNA zincirlerinde oldugundan moleküler belirteçler, canlı populasyonundaki çesitlilik veya o populasyon içindeki canlı genotipleri arasındaki iliskilerin tespitinde %100’e yakın güvenilirlikle değerlendirilirler (Gülsen ve Mutlu 2005).
Moleküler belirteçlerin avantajları; 1. Çevre faktörlerinden etkilenmezler.
2. Genetik degisiklikleri daha fazla yansıttıkları için daha az pleiotrofiktir. 3. Her bir ebeveynden gelen farklı karakterler tespit edilebildigi için bitkilerin genetik orjini tespit edilebilir.
8
4. Sonsuz sayıda moleküler belirteç elde edilebilir (Kabaoğlu, 2007).
2.5.1. Hibridizasyona Dayalı DA (RFLP) Markörleri
Bu markörler çeşitli şekillerde etiketlenmiş bir DNA parçasının (prob DNA) araştırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı dizilişteki DNA’ya melezlenebilmesini baz almaktadır. Bu teknik RFLP analizi ile çok yaygın bir kullanım alanı bulmuştur.
RFLP analizi dokulardan izole edilen genomik DNA’nın nükleik asit dizilişlerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak kesilmesi ve prob DNA nın melezlendiği DNA etrafındaki farklı kesim yapılarının saptanması esasına dayanır. Genomik DNA nın kesimi tipik olarak 4–6 nükleotid tanıyan enzinmlerce yapılır. Kesim sonrasında DNA bir jel destek sistemi içinde elektroforeze tabi tutulduğunda taşıdığı negatif yüklerden dolayı pozitif yöne doğru hareket edecektir. DNA nın bu hareketi kütlesinin logaritması ile ters orantılıdır. Kesilen parçalar elektroforez sonucunda jel içinde büyüklüklerine göre sıralanırlar. Bu sıralama sonrası DNA jel ortamdan daha kullanışlı olan naylon filtrelere tek iplik halinde southern transfer metoduyla transfer edilir (Yıldırım ve Kandemir, 2001).
2.5.2. RAPD (Rastgele Artırılmış Polimofik DA)
RAPD (Rastgele Arttırılmış Polimorfik DNA, Randomly Amplified Polimorphic DNAs) ilk defa 1990’ da rastgele seçilmiş primerlerin kullanıldığı ve Polimeraz Zincir Reksiyonu’ nu (PCR) temel alan bir teknik olarak ortaya çıkmıştır (Williams ve ark., 1990).
RAPD yönteminin temel prensibi ilgili olan türe ait genomik DNA üzerinde rastgele seçilmiş, tek bir 9–10 bp oligonükleotidin, düşük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak bağlanarak PCR ile çoğaltma yapmasıdır. Tekniğin devamında elde edilen çoğaltma ürünü radyoaktif olmayan standart jel elektroforezinde yürütülür ve çoğaltma ürünleri bantlar halinde gözlemlenerek incelenir. Bantların varlığı veya yokluğuyla sonuçlar değerlendirilmektedir (Williams ve ark., 1990; Welsh ve McClelland, 1990).
9
2.5.3.SCAR Markörleri (Sequence characterized amplified region markörs)
Bireysel RAPD parçalarından köken alan PCR tabanlı markörlerdir ancak uzun, özel primerlerin kullanımıyla tanımlanırlar. Spesifik SCAR markörlerini elde etmek için RAPD veya ISSR parçaları (fragments) jelden kesilir, klonlanır ve dizi analizi yapılır. Dizi analizinden sonra genellikle 20–25 baz uzunluğundaki parçaların terminal bölgeleri için SCAR primerleri seçilir. Bu markörler marul (Keselsi ve ark. 1993), domates (Deng ve ark. 1997) ve buğday (Laroche ve ark.2000) da çeşitli hastalıklara karşı direnç genlerinin tanımlanması ve haritalanmasında başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Gostimsky ve ark. 2005).
2.5.4.SSR (Simple Sequence Repeat)
SSR markörleri 1–4 arasında tekrarlanan nükleotid motifleri içerir (Braaten ve ark., 1988, Vergnoud 1989). Bu bölgeler "mikrosatellit" olarak adlandırılır (Litt ve Luty 1989) ve PCR (Saiki ve ark., 1988) da bireysel olarak amplifiye olurlar. (GT)
n veya
(CT)
n gibi birbiri arkasına tekrar eden 2 den 10 a kadar tekrarlı olabilen dizinlerdir.
Bitki nükleer DNA’sında tekrarlanan basit dizi motiflerinin (örneğin CACACA...) varlığı Delseny ve ark. (1983) tarafından kanıtlanmıştır. Mikrosatelit olarak da adlandırılan basit dizi tekrarlarının, sonradan bitki genomu ve organel genomu içeren çoğu organizmalarda bolca bulunduğu görülmüştür (Lagercrantz ve ark. 1993, Wang ve ark. 1994). Bu diziler, bitki genetiğinin araştırılması için uygun olan genetik varyasyonun büyük bir kaynağını oluşturmaktadır (Tautz ve ark. 1986).
SSR metodu, tekrarlanan dizilerin iki yanına bağlanan primerlerin bu bölgeleri PCR’la çoğaltması ve agaroz jel, poliakrilamid jel aracılığı ile büyüklüklerine göre ayrılması üzerine kuruludur.
10
2.5.5. ISSR (Basit Đç Dizi Tekrarları)
Teknik 5’ ve 3’ sonda güçlendirilen kısa, tekrarlanan DNA zincirlerinin primer olarak kullanılmasını, PCR ürünlerinin elektroforez ile büyüklüklerine göre ayrılmasını ve jel üzerinde DNA’ların tespitini içerir. Primer olarak 2-4 farklı veya aynı nükleotidlerle sabitlestirilen, basit olarak tekrarlanan DNA zincirleri kullanılır. Bir reaksiyonda tekrarlanan zincir aynı kalmak kaydıyla, sabitlestirici DNA’ların farklı kombinasyonları primer olarak aynı reaksiyonda kullanılarak bir tek PCR reaksiyonunda güçlendirilen hedef DNA dizilerinin sayıları arttırılır. Böylece bir jel üzerinde yürütülecek bant veya belirteç sayısı arttırılmıs olur. Bu diger DNA belirteçlerinin üretebildigi sayılarla karsılastırıldıgında önemli bir avantaj saglar (Gülsen ve Mutlu, 2005).
2.5.6.AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi)
Restriksiyon enzimleri ile kesilmiş DNA fragmentlarının seçici amplifikasyonu temeline dayanır. Çoklu bantlar, tesadüfî bölgelerde DNA markörleri içeren amplifikasyon reaksiyonunda oluşturulur. DNA analizleri, her örnekten 50 ile 100 bant elde edilecek şekilde sonuçlanır. AFLP analizleri ile heterozigot ve homozigot bireyler arasındaki farklılık tespit edilebilmektedir (Parmaksız, 2004).
2.5.7.SRAP Markörler (Sequence-related amplified polymorphism)
SRAP; patates, pirinç, marul, kıvırcık, çim, kereviz, limon, buğday, elma, salatalık, çin lahanası, mısır gibi pek çok üründe başarıyla kullanılmış yeni, basit ve güvenilir PCR-tabanlı markör sistemidir ( Li ve Quiros,2004). Pek çok yayın SRAP markör sisteminin genetik çeşitlilik analizlerinde, kültürlerin tanımlanmasında ve filogenetik çalışmalarda çok etkili bir araç olduğunu göstermiştir (Ferriol ve ark., 2003). Feriol ve ark. (2003) SRAP markörler tarafından verilen bilginin morfolojik çeşitlilik ve morfotiplerin filogenetik geçmişi ile AFLP markörlerinden daha uygun olduğunu bildirmiştir.
SRAP, bitkilerde genetik farklılık çalışmaları için son dönemlerde geliştirilmiş bir moleküler markör sistemidir (Li ve Quiros, 2001). ISSR’dan farklı olarak SRAP tekniği
11
primer dizilerinin kendine has dizaynını kullanarak genomdaki kodlanmış dizileri hedefler ve bir kısım ko-dominant markörlerin tanımlanması ile sonuçlanır. SRAP primerleri, 17 veya 18 nükleotid uzunluğundadır. 13 veya 14 bazlık bir öz dizi ve bunun içinde 5’ ucunda spesifik olmayan 10 veya 11 nükleotidden oluşur, bu diziyi forward primerde CCGG ve reverse primerde AATT izler. Đç sekans 3’ucunda üç selektif nükleotit tarafından izlenir. Forward ve reverse primerlerin filler sekansları birbirinden farklı olmalıdır (Li ve Quiros, 2001). SRAP markörleri genetik farklılığı belirlemek (Ferriol ve ark., 2003) ve aynı zamanda gen işaretleme ve genom haritalanması (Li ve Quiros, 2001) için kullanışlı bir yöntem olarak tanımlanmıştır.
Li ve Quiros (2001), Açık okuma çerçevelerini (ORF’leri=Open Reading Frame) çoğaltmayı amaçlayan basit bir markör tekniği geliştirmişlerdir. Đki primer amplifikasyonunu temel almaktadır. Đlk beş siklusun annealing sıcaklığı 35 C° ‘dir. Devamındaki 35 siklus 50 C° ‘de çalışır. Çoğaltılan DNA fragmentleri akrilamid jellerle ayrılır ve otoradyografi ile belirlenebilir. Brassica ‘nın varolan rekombinant serileri ve doubled-haploid soylarını bu markör tekniği ile test etmişlerdir. Sekanslamadan sonra bantların % 45 ‘ i Genbank veritabanındaki bilinen genlerle eşleşmiştir. SRAP markörlarının %25’i co-dominanttır ki bunları sekanslamayla gösterilmiştir. Bir linkaj (bağlantı) haritasının yapılması SRAP markörlerinin tam bir dağılımını 9 büyük linkaj grubunda açığa çıkarmıştır ve bu AFLP markörları ile farklı değildir. Çin lahanasının farklı dokularından elde edilen cDNA ‘ları da çoğaltmışlar ve bu sekansların parmakizini (fingerprinting) belirlemişlerdir.
Feng ve ark. (2009), Çinde bulunan16 Celosia argentea L. ve 6 Celosia cristata L. populasyonunun genetik çeşitliliğini SRAP tekniğini kullanarak araştırmışlardır. Kullanılan 10 primer kombinasyonu 50 ila 2000 baz çifti arasında değişen 507 sayılabilir amplifikasyon bandı vermiştir, bunlardan 274 ü polimorfiktir ve primer başına ortalama olarak 54 polimorfik bant düşmektedir. UPGMA küme analizi kullanılarak populasyonlar arasındaki genetik uzaklığı belirlemek için filogenetik ağaç oluşturulmuştur ve bu veriler de coğrafi köken bilgileri ile uyuşmaktadır. 22 populasyon iki büyük genetik gruba ayrılmıştır. C. argentea ‘da M1E6 olarak adlandırılan tipik bir fragment C.argentea’ nın C. cristata’ dan ayırımında alternatif bir yaklaşım
12
sağlamıştır. Aynı zamanda, önemli coğrafik farklarla C.argentea populasyonlarında var olan büyük genetik çeşitlilik populasyon genetiği parametrelerinin yüksek bir seviyesi ile doğrulanmıştır. Bu bilginin gelecekte C.argentea populasyonları için ıslah materyali seçimi ve korunması yönetiminde faydalı olabileceğini ileri sürmüşlerdir.
Ding ve ark. (2008), Orchidaceae familyasına ait, klasik tıpta kullanılan, Çinde endemik olan ve kritik şekilde tehlike altında olan Dendrobium officinale ‘de genetik çeşitliliğin belirlenmesi ve bitkinin korunmasına yönelik olarak SRAP tekniğini kullanmışlardır. Bu türün genetik yapısının araştırılması ve korunma stratejileri üzerine bazı tavsiyeler sunmak için 9 yabani D. officinale populasyonundan 84 bireyi analiz etmişlerdir. Tür bazında yüksek bir genetik çeşitlilik belirlenmiştir (% 88,07). Ancak, diğer benzer yaşam özelliklerine sahip türlerle karşılaştırıldığında populasyon seviyesindeki genetik çeşitliliğin daha düşük olduğu gözlenmiştir (% 51,68). Bu çalışmada 4 farklı forward ve reverse SRAP primer kombinasyonu kullanılmıştır. Sonuç olarak 2 ana grup belirlenmiştir. Toplamda elde edilen 109 banttan 96’sı polimorfiktir.
Genetik çeşitliliğin belirlenmesi tehlikedeki türlerin korunması açısından çok önemli olduğunu ve genelde, nesli tehlikede olan bitkilerde düşük bir genetik çeşitliliğin varlığını ortaya koymuşlardır. Fakat Goodyera procera, Changnienia amoena,
Gastrodia elata gibi bazı tehlikede olan orkide türlerinde, yapılan RAPD ve ISSR
çalışmalarında yüksek seviyede genetik çeşitlilik belirlenmiştir. Dendrobium officinale’ nin genetik yapısının belirlenmesi için yapılan bu çalışmada populasyon seviyesinde düşük genetik çeşitlilik belirlenmişken, tür seviyesinde yüksek genetik çeşitlilik saptanmıştır. Buna sebep olarak muhtemelen populasyon dağılımı ve habitat parçalanması ile habitat kaybından kaynaklanan sınırlı gen akışını gösterilmiştir.
Wang ve ark. (2008), Cucumis melo L. (kavun) bitkisinin moleküler haritasını SRAP tekniğini kullanarak ortaya koymuşlardır. Bu çalışmada 4G21 (C. melo var. chinensis) ve 3A832( C. melo var. saccherinus) çaprazlanmasından elde edilen F2 bireylerinden oluşan 114 birey ile çalışılmışlardır. 29 primer çifti kullanılmış ve 187 polimorfik lokus üretilmiştir. Haritanın 152 genetik markörı kapsayan 12 bağlantı grubu içerdiğini ve ortalama 13,67 cM genetik uzaklık ile 2077,1 cM’ lik alan kapladığını belirtmişlerdir.
13
Rastgele 15 forward primeri seçmişler ve 64 reverse primeri ile eşleştirmişlerdir. Toplamda 960 adet primer çifti elde etmişlerdir. Bunlardan 29 primer çifti daha iyi polimorfizm göstermiş ve net bantlar vermiştir. Bir primer çiftinin 1 ila 15 arası polimorfik bant üretebildiğini ifade etmişlerdir.
Mutlu ve ark. (2008), patlıcan bitkisinde solma direnci genini SRAP, SRAP-RGA, RAPD ve SCAR markörleri ile araştırmışlardır. Fusarium wilt; patlıcan bitkisinde “pembe kar küfü” olarakta adlandırılan Fusarium nivale adlı fungusun neden olduğu vasküler bir hastalıktır. Bu çalışmada fusarium wilt direncinin monogenik kalıtımının doğrulanması ve bu dirençle ilişkili moleküler markörlerin teşhis edilmesi amaçlanmıştır. SRAP analizi 13 forward ve 16 reverse primerinden oluşan 208 primer kombinasyonu ile yapılmıştır. Toplamda 598 bant ve primer başına ortalama olarak 2,9 bant elde edilmiştir. SRAP primerlerinin kodominant olduğu ifade edilmiştir.
Gao ve ark. (2008), SRAP markörlerini kullanarak, Çin Hedychium ‘unun 22 türünün populasyon haritasını anlamak için interspesifik filogenetik ilişkisini analiz etmişlerdir. Aynı tekniği kullanarak, morfolojik karakterlere göre seçilen iki türün haritalarını yapmışlardır. Filogenetik analizler 22 türün 3 gruba ayrıldığını göstermiştir. Haritalanan ebeveynlerin 0,31’lik benzerlik katsayısıyla aynı küme içerisinde olduğunu bulmuşlardır ki bu 22 türün ortalama değerinden daha düşüktür. Orta yoğunluklu iki harita yapmışlardır. Maternal (anasal) ebeveynler 139 lokus içermekte ve 917,1 cM’ lik alan kaplamaktadır. Bu lokuslar 18 linkaj grubu içinde dağılmıştır. Paternal (babasal) ebeveynler 203 lokus içermektedir ve 1386,8 cM’ lik alan kaplamaktadır ve 23 linkaj grubuna dağılmıştır. 3:1 ayırma oranıyla lokusların sayısının iki haritayı birleştirmek için etkili olmadığını belirtmişlerdir. Ebeveyn seçimi ile ilgili, karakterlerin yanı sıra filogenetik ilişkilerin de göz önüne alınması gerektiğini önermektedirler. Çalışmada, ortalama seviye civarında veya daha yüksek benzerliği olan iki tür Hedychium populasyonunun iyi haritalanma eğilimi gösterdiği sonucuna varılmıştır.
Li-jun ve ark. (2008), Toplamda 35 genotip, 33’ü melez ve Çin ile Brezilyadan kökenlenen iki yabani tip keneviri SRAP tekniği ile çalışılmışlardır. Sonuçta; 81 primer kombinasyonundan 33’ünün polimorfik olduğu anlaşılmış ve 332 bant elde edilmiştir,
14
bunlardan 284’ü (%85,54) polimorfiktir. Primerler Brassica ve diğer genusların çeşitlilik analizinde kullanılan 9 forward ve 9 reverse primer kombinasyonundan seçilmiştir. UPGMA analizi ile genetik ilişki belirlenmiştir ve Jaccard benzerlik katsayısı hesaplanmıştır. Sonuç olarak SRAP’in etkili bir yaklaşım olduğunu ve kenevir hatlarının taksonomik analizine uygun olduğunu ortaya koymuşlardır.
SRAP’in tercihen ORF’leri (açık okuma çerçevelerini) çoğalttığı, iki birey arasındaki ve türler arasındaki gözlenen polimorfizmin temel olarak intronların, promotorların ve spacerların uzunluğundaki çeşitlenmeden kaynaklandığını ortaya koymuşlardır. SRAP markörlerinin geniş ölçüde genetik linkaj (bağlantı) harita yapımında, genetik çeşitliliğin analizinde kullanıldığını belirtmişlerdir. Çalışmada ISSR primerleri de kullanılmışlardır ve polimorfik bantların SRAP’ ten daha düşük olduğu sonucunu elde etmişlerdir. SRAP’in dominant bir markör olduğu sonucuna varmışlardır.
SRAP primerlerin tercihen C ve G ‘ce zengin eksonik bölgeleri ve A ve T ‘ce zengin promotor bölgeleri içeren intronik bölgeleri iki primerin kombinasyonunu kullanarak çoğalttığını bellirtmişlerdir. SRAP markörleri populasyonların genetik çeşitliliğinin çalışılmasında klasik methodlardan daha doğru bir bilgi sağlamaktadır. SRAP gibi PCR tabanlı moleküler markörlerin Markör Yardımlı Seçim (MAS=markör assisted selection) için de ve genetik kaynak korunması çalışmalarında kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Bu süreçteki daha ileri çalışmalar genotip ile fenotip arasındaki genetik ilişkiyi anlamak amacıyla çoğaltılan DNA’ların sekanslanması olacaktır.
Gulsen ve ark. (2007), SRAP ve fenotipik markörları 23 Abelmoschus esculentus (L) Moench (bamya) genotipi arasındaki ilişkiyi ve çeşitliliği belirlemek için çalışılmışlardır. 39 forward ve reverse primer kombinasyonu kullanmışlardır. 23 genotipin 21 ‘i Türk ve 2’si dış grup olarak rastgele seçilmiş Amerikan genotipidir. Ve 97 sayılabilir bant elde edilmiştir, %50 si tüm 23 genom için polimorfiktir. 23 genotipten 17’si (%74) bir diğerinden ortalama olarak 0,93 ‘lük benzerlikle ayırt edilmiştir. Fenotipik markörlerden ise, 33 kalıtsal özellik arazide değerlendirilmiş, onlardan 28 ‘inin (%85) polimorfik olduğu bulunmuştur. UPGMA dendogramı tüm genotiplerde ayırt edilebilen 33 fenotipik marköre dayanmaktadır, fakat bamya
15
genotiplerinin coğrafik birliklerinin belirlenmesinde başarısız olunmuştur. Sonuç olarak, SRAP markörlerinin bamya gametleri arasındaki çeşitliliğin ve akrabalığın çalışılmasında kullanışlı olduğu ve markör tabanlı seçim, linkaj haritalama ve filogenetik çalışmalar için bir potansiyele sahip olduğu ortaya konmuştur.
Budak ve ark. (2004), Amerikada Great Plains bölgesinde çim olarak geniş ölçüde kullanılan tek doğal çim olan Buffalograss ile çalışmışlardır. Buffalograss’ ın kuraklığa olan direnci ve düşük bakım gereksinimi ile dikkatleri çeken bir çim türü olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmada tohumluk biyotipler ve vejetatif biyotipler arasındaki genetik ilişki üzerine genel bir bakış elde etmeyi amaçlamışlardır. Çalşmada ISSR, RAPD, SRAP, SSR markörlarını kullanılmışlardır. Tüm çim kültürlerinin 4 markör sistemiyle parmakizlerini (fingerprinting) elde etmişlerdir. Polimorfik SRAP’ler yakın akraba türler arasındaki genetik çeşitliliği göstermiştir. 34 SRAP primer kombinasyonundan 30’u çalışılmıştır. Toplamda gözlenen 263 banttan 249’unun (%95) polimorfik olduğu belirtilmiştir. Kullanılan SRAP markörleri genotipler arasında nisbeten yüksek seviyede bir genetik uzaklık açığa çıkarmıştır. Ortalama 5 olan allellerin sayısı 1 ila 9 arasında değişmiştir. Markör tiplerinin ortalama ayrım gücünün SRAP>SSR>ISSR>RAPD şeklinde olduğunu belirtmişlerdir.
Bu çalışmada SRAP markörlerinin, çalışılan diğer markör sistemleriyle karşılaştırıldığında yüksek polimorfizme ve ayırt edici fragmentlere sahip olduğu ortaya konmuştur.
Parmaksız (2004), Oxyona seksiyonuna ait bitkilerde RAPD tekniğini kullanmışlardır. 53 populasyonda 15 primer kullanılmış ve oluşan 96 banttan 90 tanesinin polimorfik ve polimorfizm oranının % 84,3 olduğu belirtilmiştir. Yine Parmaksız ve ark. (2009) tarafından TÜBĐTAK projesi kapsamında gerçekleştirilen bir çalışmada; RAPD tekniğinin 183 populasyonda uygulanması sonuçlarına göre kullanılan 22 primerden 21 tanesinin polimorfik olduğu ve bu primerlerin toplam 87 bant oluşturduğu belirlenmiştir. Polimorfizm oranı ise %92,55 olarak bulunmuştur. Ortalama genetik mesafe 0,38 olarak bulunmuştur. SSR tekniğinin 183 populasyonda uygulanması sonucu elde edilen veriler RAPD tekniği ile yapılan çalışmanın sonuçları ile benzerlik göstermektedir.
16
Gürkök (2009), Oxyona seksiyonuna ait farklı bölgelerden toplanmış 180 bitki örneğinde ISSR tekniği ile moleküler karakterizasyon yapılmıştır. 20 ISSR primeri kullanılmıştır. Çalışma sonucunda 180 bitkide polimorfizm oranı %96,97 olup toplam 82 bant oluşturmuş 80 polimorfik bant vermiştir. Ortalama genetik mesafe 0,35 olarak, Shannon indeksi 0,50 olarak bulunmuştur.
Benli (2009), Oxyona seksiyonuna ait bitkilerin 12 SSR primeri kullanılarak genetik karakterizasyonu yapılmıştır. 60 bant üretilmiş olup, primer başına ortalama 5 bant belirlenmiştir. Matris sonucuna göre 183 populasyon arasındaki ortalama genetik uzaklık 0,41 olarak ve Shannon indeksi 0,53 olarak bulunmuştur.
17
Çizelge 4.1. Kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleri (Parmaksız ve ark. (2009) TÜBĐTAK projesinden alınmıştır.)
Pop. o. Bitki Sırası Kromozo m Sayısı Toplanan Bölge Tomurcuk Görünümü
Brakte Kaolin Petal Petal rengi Petal leke durumu
Tebain miktarı (%)
1 25-C 28 TUNCELĐ Dik 5 Kiremit Kırmızı Ortada 2,504
2 29-C 28 TUNCELĐ Dik 6 6 Koyu kırmızı Tabana
kadar
1,27
3 70-E 42 TUNCELĐ Dik 1 4 Kiremit Kırmızı Ortada 0,395
4 34-C 28 TUNCELĐ Dik 4 Kiremit Kırmızı Ortada -
5 44-C 28 TUNCELĐ Eğik 3 2 6 Koyu kırmızı Tabana
kadar
0,217
6 69-E 42 TUNCELĐ Dik 4 Kiremit Kırmızı Yok
-
7 36-C 28 TUNCELĐ Eğik 13 Kiremit Kırmızı Ortada 0,057
8 40-C 28 TUNCELĐ Eğik 4 Kiremit Kırmızı Tabana
kadar -
9 47-C 28 TUNCELĐ -
10 67-E 28 TUNCELĐ Dik 4 Kiremit Kırmızı Ortada 1,196
11 30-C 42 TUNCELĐ Dik 5 6 Koyu kırmızı Ortada -
12 1-F 42 SĐVAS YILDIZ
Dik 4 1 6 Koyu kırmızı Ortada 13 2-F 42 SĐVAS YILDIZ 14 5-F 42 SĐVAS YILDIZ 15 10-F 42 SĐVAS TECER
Dik 4 2 6 Koyu kırmızı Tabana kadar
1,982
16 7-F 28 SĐVAS TECER
Dik 4 1 6 Koyu kırmızı Tabana kadar
2,074
17 8-F 42 SĐVAS
TECER
Dik 5 6 Koyu kırmızı Tabana kadar
-
18 11-F 42 ERZĐNCAN Dik 5 1 6 Kiremit Kırmızı Tabana
kadar
2,006
19 16-F 28 ERZĐNCAN -
20 15-F 42 ERZĐNCAN Eğik 4 1 6 Koyu kırmızı Tabana
kadar
1,534
21 14-F 28 ERZĐNCAN Dik 3 2 5 Koyu kırmızı Tabana
kadar
-
22 18-F 42 ERZĐNCAN Dik 4 2 6 Koyu kırmızı Ortada -
23 99-D 14 A.Ü.Z.F. Dik 5 1 6 Koyu kırmızı Ortada 1,06
24 149-A 14 A.Ü.Z.F.
25 23-C 14 A.Ü.Z.F. Dik 4 1 5 Koyu kırmızı Ortada 2,597
26 118-D 42 NĐĞDE Dik 2 2 6 Kiremit Kırmızı Ortada 0,081
27 125-A 28 NĐĞDE Dik 7 Kiremit Kırmızı -
28 195-B 42 NĐĞDE Dik 4 Kiremit Kırmızı Ortada
29 162-B 42 NĐĞDE Dik 2 6 Kiremit Kırmızı Ortada
-
30 71-F 28 NĐĞDE Dik 6 Kiremit Kırmızı Ortada -
31 169-B 42 NĐĞDE Yarı Dik 6 Kiremit Kırmızı Ortada -
32 187-A NĐĞDE
33 201-B 28 NĐĞDE Yarı Dik 5 Kiremit Kırmızı Ortada çok
az
3,047
34 128-A 42 NĐĞDE Dik 3 4 Kiremit Kırmızı Ortada 0,086
35 231-D 42 NĐĞDE Yarı Dik 5 Kiremit Kırmızı Ortada
-
36 104-D 14 NĐĞDE Dik 4 2 6 Koyu kırmızı Ortada
37 222-B 42 NĐĞDE Eğik 4 Kiremit Kırmızı Ortada -
38 123-D 28 NĐĞDE Yarı Dik 1 3 6 Kiremit Kırmızı Ortada 0,089
39 189-B NĐĞDE
3. MATERYAL VE YÖ TEM
3.1. Materyal
Materyal olarak kullanılan örnekler; Türkiye’nin çeşitli yerlerinden toplanmış, Oxytona seksiyonu içerisindeki Papaver cinsine ait bitkilerdir. Bu bitkiler TOVAG–105 O 501 Nolu TÜBĐTAK projesi kapsamında Gaziosmanpaşa Üniversitesi deneme tarlasında yetiştirilmiştir. Her bir bitkiden üç sırada beşer bitki olacak şekilde 15 adet bitki deneme tarlasında yetiştirilmiştir. Çalışılan bitkiler 183 Papaver cinsi içerisinden Çizelge 4.1.’de verilen tebain oranları göz önüne alınarak seçilmiştir (Çizelge 4.1.). Araştırma materyali olarak kullanılan 40 adet bitkiden DNA izolasyonu amacıyla genç taze yapraklar alınmıştır. Papaver bracteatum (2n=14), P. pseudo-orientale (2n=42) ve P.
orientale (2n=28) çalışmada kullanılan türlerdir.
3.2. Yöntem
Araştırmamızda kullanılan SRAP tekniği DNA izolasyonu, PCR uygulaması ve PCR ürünlerinin Agaroz Jel ortamında yürütülerek jel görüntüleme sisteminde görüntülenmesi işlemlerini içermektedir.
3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuvar Çalışmaları Đçin Hazırlanması
Moleküler analizlerde kullanılacak DNA materyalini izole etmek amacıyla bitkilerin genç yaprakları ilkbahar döneminde toplanmıştır. Bitkilerden toplanan yapraklar kuru buz içerisinde laboratuara getirilerek -80 oC ye konulmuştur. Birkaç gün bekletildikten sonra sıvı azot ile beraber havanda dövülerek ekstrakt haline getirilmiştir. Ekstrakt haline gelen bitki örnekleri DNA izolasyonu yapılana kadar -80 oC de bekletilmiştir.
3.2.2. D A Đzolasyonu
DNA izolasyonu için Fermentas marka Genomic DNA Purification DNA izolasyon kiti kullanılmıştır. DNA izolasyon işlemi şu basamaklardan oluşmaktadır.
19
• 50–100 mg bitki ekstraktı üzerine 400 µl lizis solüsyonu eklenmiştir. • 5 dakika 65 oC de inkübe edilmiştir.
• Üzerine 600 ml kloroform eklenmiş ve 3-5 kez alt üst edilmiştir. • 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiştir.
• Üst tarafta kalan kısım yeni bir tüpe alınmıştır.
• 800 ml dilue edilmiş precipitation solusyonu eklenmiştir. • 1–2 dakika karıştırılmıştır.
• 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiştir. • Üst tarafta kalan kısım atılmıştır.
• Tüpün dibinde kalan DNA pelleti 100 ml NaCI solüsyonu ile çözülmüştür. • 300 ml soğuk etanol eklenmiştir.
• 10 dakika -20 oC de inkübe edilmiştir.
• 4 dakika santrifüj edilmiş ve üstte kalan kısım atılmıştır. % 70’lik soğuk etanol ile DNA peleti yıkanmıştır.
DNA peleti 100 ml TE (Tris –EDTA Buffer) içinde çözdürülmüştür.
3.2.3. PCR Uygulaması
PCR işlemi için Apollo Instrumentation ATC401 cihazı kullanılmıştır. PCR mix içerisine Çizelge 3.1’de belirtilen hacimlerde ve konsatrasyonlarda PCR bileşenleri katılmıştır (Çizelge 3.1).
Hazırlanan PCR mix için Çizelge 3.2’de gösterilen PCR protokolü uygulanmıştır (Çizelge 3.2).
20
Çizelge 3.1. PCR mix bileşenlerinin konsantrasyonları ve miktarları
PCR öğeleri Final Konsantrasyon Kullanılan Miktar (µl)
Su 15
10x Buffer Mg free (BIOBASIC) 1X 2,5
20 mM MgSO4 (BIOBASIC) 2,8 mM 3,5
10 mM d TP (Vivantis) 0,3 mM 1,5
Forward primer 0,4µM 1,25
Reverse primer 0,4 µM 1,25
Taq D A polimeraz (PROMEGA) 0,1U 0,4
D A 30 ng 3
Toplam 28,4
Çizelge 3.2. PCR protokolü
Sıcaklık (oC) Süre (sn) Döngü Sayısı
Ön denatürasyon 94 300 1 Denatürasyon 94 60 5 Bağlanma 35(Tm) 60 Uzatma 72 120 2.Denatürasyon 94 60 30 2. Bağlanma 50 60 2. Uzatma 72 120 Son uzatma 72 300 1
21
3.2.4. Çalışmada Kullanılan SRAP Primerleri
Çalışmada baz dizileri aşağıda belirtilen 10 adet SRAP primeri kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Primerler daha önce yapılan çalışmalarda kullanılan ve iyi sonuç veren primerler arasından seçilmiştir.
Çizelge 3.3. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri
3.2.5. Elektroforez Đşlemi
PCR ürünlerini elektroforez etmek için % 1’lik agaroz jel hazırlanmıştır. DNA’nın boyanması için etidium bromür kullanılmıştır. 28,4µl PCR ürünü üzerine 3µl yükleme solüsyonu eklenerek, elektroforez tankına yerleştirilen jel üzerine yüklenmiş ve 100 voltta ortalama 2,5 saat yürütülmüştür.
3.2.6. D A Bantlarının Görüntülenmesi
Elektroforez uygulaması bittikten sonra KODAK Gel Logic 200 jel görüntüleme cihazı kullanılarak U.V. ışık altında resimler alınarak değerlendirilme yapılmıştır.
FORWARD PRĐMER REVERSE PRĐMER Primerin
Yapışma
Sıcaklığı oC)
F1 TGA GTC CAA ACC GGA TA R1 GAC TGC GTA CGA ATT AAT 49,5 F2 TGA GTC CAA ACC GGA GC R2 GAC TGC GTA CGA ATT TGC 54 F3TGA GTC CAA ACC GGA AT R3 GAC TGC GTA CGA ATT GAC 52 F4 TGA GTC CAA ACC GGA CC R4 GAC TGC GTA CGA ATT TGA 53 F5 TGA GTC CAA ACC GGA AG R5 GAC TGC GTA CGA ATT AAC 52 F6 TGA GTC CAA ACC GGA CA R6 GAC TGC GTA CGA ATT GCA 54 F7 TGA GTC CAA ACC GGA CG R7 GAC TGC GTA CGA ATT CAA 53 F8 TGA GTC CAA ACC GGA CT R8 GAC TGC GTA CGA ATT CAC 52 F9 TGA GTC CAA ACC GGA GG R9 GAC TGC GTA CGA ATT CAG 55 F10 TGA GTC CAA ACC GGA AA R10 GAC TGC GTA CGA ATT CAT 50
22
3.2.7. D A Bantlarının Değerlendirilmesi
SRAP bandları 1 ve 0 olarak kayıt edilmiş olup, ‘1’ bandın varlığını ‘0’ ise bandın yokluğunu göstermektedir. Materyaller arasındaki genetik mesafe POPGENE32 versiyon 1.32 (Population Genetic Analysis) ve MEGA 4.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) programları ile analiz edilmiştir.
4. BULGULAR
Çalışmada 10 adet SRAP primeri kullanılmış olup primerler çoğunlukla polimorfik, bazıları ise monomorfiktir. Kullanılan primerler toplam 29 adet SRAP bandı oluşturmuştur. Polimorfik lokus sayısı 26 olarak bulunmuştur. Verilere göre en yakın genetik mesafe 0, en uzak genetik mesafe 1 dir. Bitkiler arasındaki genetik uzaklık veya yakınlık değeri 0 ise bitkiler %100 aynıdır, şayet bu değer 1 ise bitkiler %100 farklıdır.10 bitkide genetik mesafenin minimal değeri 0,1092 olarak bulunmuştur. 4 bitkide ise 1 olarak bulunan değer, 10 bitkide de 0.96 olarak bulunmuştur. Ortalama genetik mesafe ise 0,46’dır. Shannon indeksi 0,55 (standart sapma: 0,21) olarak, Nei indeksi 0,38 ( standart sapma: 0,15) olarak bulunmuştur. Ayrıca çalışmanın sonucunda % 89,66 ‘lık polimorfizm oranı saptanmıştır.
Şekil 4.1. SRAP 1 Nolu Primerin %1’lik Agaroz Jel Görüntüsü
24 25 C 29 C 8 F 18 F 187 A 231 D 104 D 123 D 231 D 70 E 34 C 201 B 67 E 149 A 47 C 222 B 44 C 36 C 69 E 40 C 30 C 2 F 5 F 10 F 1 F 7 F 169 B 118 D 162 B 195 B 71 F 189 B 11 F 23 C 16 F 14 F 15 F 99 D 128 A 125 A 5.460 5.460 12.701 14.588 12.701 9.462 9.462 7.421 7.421 1.755 1.755 8.442 5.460 5.460 13.428 16.197 7.421 7.421 5.460 5.460 9.462 9.462 9.462 9.462 15.030 7.421 7.421 9.462 9.462 10.526 10.881 23.796 11.590 11.590 5.460 5.460 8.442 11.590 11.590 22.091 7.241 8.332 3.239 1.887 1.065 8.232 5.380 6.669 6.687 2.840 5.821 2.147 2.769 1.468 4.288 6.249 5.956 3.884 2.201 2.201 3.367 6.519 1.293 11.298 1.064 7.839 4.122 0.955 1.365 6.747 2.982 5.491 2.342 4.405 3.753 3.071 2.540 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Şekil 4.3. SRAP primerlerinin oluşturduğu, bitkiler arasında filogenetik ilişkiyi gösteren dendogram (Mor renk : 14 Kromozomlu, yeşil: 28 Kromozomlu, kırmızı: 48 Kromozomlu bitkileri ,sarı renk ise kromozom sayısı bilinmeyen bitkileri simgelemektedir.)
5. TARTIŞMA ve SOUÇ
Tür içi ve türler arası genetik çeşitliliğin belirlenmesinde ayrım gücü yüksek olan markör sistemlerinden biri olan SRAP markör sistemi etkili ve basit kullanımı sayesinde yaygınlaşmıştır. Çalışılan örnek sayısının artışı SRAP’in spesifitesini olumsuz etkilememektedir. Budak ve ark. (2004), ayrım gücü bakımından markör sistemlerini karşılaştırmışlar ve SRAP > SSR > ISSR > RAPD şeklinde bir sıralama elde etmişlerdir.
Çalışmada kullandığımız bitkiler Oxytona seksiyonuna ait çok yıllık bitkilerdir. Sivas, Erzincan, Tunceli, Niğde ve A.Ü.Z.F. (Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi) bitkilerin toplandığı bölgelerdir. Toplamda 40 bitkinin 16’sı Niğde, 11’i Tunceli, 6’sı Sivas, 5’i Erzincan ve 3’ü de A.Ü.Z.F. bölgesinden toplanmıştır. Kullanılan SRAP primerleri daha önce yapılmış olan çalışmalarda kullanılan ve iyi sonuç veren primerler arasından seçilmiş olup, en fazla bant veren 3 nolu primer olarak tespit edilmiştir (Çizelge 3.3). Feng ve ark.(2009), Çin de bir süs bitkisi olan Celosia argentea L. ve Celosia cristata L. populasyonlarının genetik çeşitliliğini araştırmışlardır. Me2/Em2 olarak adlandırdıkları primer, kulandıkları 10 primerden biridir. Bu primer kombinasyonu bizim çalışmamızdaki 3 nolu primerdir. 16
Celosia populasyonundan 11’i diğerlerine göre daha yüksek bir genetik çeşitlilik göstermiştir.
Bunun daha büyük bir populasyonun varlığı ve daha az insan etkisi ile açıklanabileceğini belirtmişlerdir. Ayrıca çalışmadaki kültür bitkilerinin polimorfizm oranı ve genetik çeşitliliğin daha düşük olduğu bulunmuştur. Yabani populasyonlar arasındaki çaprazlamalar genetik çeşitliliği artırmıştır. Bizim çalışmamızda da bitkilerin Türkiye doğal florasında yetişen yabani türler olması polimorfizm oranının yüksek seviyede gözlenmesine neden olmuştur.
Feng ve ark.(2009) Celosia ile yaptıkları genetik çeşitliliğin tespiti çalışmasında, benzer şekilde 10 primer çifti kullanmışlardır. Primerlerin seçimi ve sayısı konusunda herhangi bir sınırlama olmadığından dolayı farklı çalışmalarda farklı sayıda primer kombinasyonu kullanılabilmektedir. Ding ve ark.(2008), Çin de endemik ve nesli tehlike altında olan Orchidaceae familyasından Dendrobium officinale ‘ nin genetik çeşitliliğinin belirlenmesi ve bitkinin korunmasına yönelik olarak yaptıkları çalışmada SRAP tekniğini yalnızca 4 primer çifti kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Li-jun ve ark.(2008) ise 35 kenevir genotipini 33 SRAP primer çifti kullanarak analiz etmişlerdir. Oxyona seksiyonuna ait bitkilerde RAPD tekniği ile yapılan bir çalışmada (Parmaksız, 2004), benzer bölgelerden toplanan 53 populasyonda 15 primer kullanılmış ve oluşan 96 banttan 90 tanesinin polimorfik ve polimorfizm oranının
26
% 84,3 olduğu belirtilmiştir. Bizim çalışmamızda ise polimofizm oranı % 89,66 olarak bulunmuştur. RAPD ve SRAP tekniği verileri bu bakımdan birbirini destekler niteliktedir. Yine Parmaksız ve ark. (2009) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada; RAPD tekniğinin 183 populasyonda uygulanması sonuçlarına göre kullanılan 22 primerden 21 tanesinin polimorfik olduğu ve bu primerlerin toplam 87 bant oluşturduğu belirlenmiştir. Polimorfizm oranı ise %92,55 olarak bulunmuştur. Ayrıca aynı bitki gruplarında ISSR tekniği ile yapılan diğer bir çalışmanın verilerine göre (Gürkök, 2009) çalışılan 20 primerin oluşturduğu toplam 82 banttan 80 tanesinin polimorfik ve polimorfizm oranının %96,97 olduğu bildirilmiştir. Bitkilerin toplandıkları bölgelerin aynı olmasının yanı sıra, ISSR tekniği kullanılarak yapılan çalışmada 180 farklı bitkinin çalışıldığı göz önüne alınırsa daha yüksek bir polimorfizm oranı şaşırtıcı olmamıştır. Çünkü farklı genotipler genetik çeşitliliği artırmış ve buna bağlı olarak polimorfizm oranı bizim çalışmamıza oranla yaklaşık %7’lik bir farklılık göstermiştir.
Elde edilen dendogram incelendiğinde, bitkilerin 2 ana gruba ayrıldığı görülmektedir (Şekil 4.3.) Alt gruplar incelendiğinde ise bitkilerin 9 alt gruba ayrıldığı görülmektedir. Sivas ve Niğde bölgesine ait olan P. pseudo-orientale (2n=42) türü dendogram üzerinde aynı grupta yer almıştır. Erzincan ve Tunceli bölgesine ait P. orientale (2n=28) türlerine ait bitkiler ayrı
noktalarda gruplanmıştır. Papaver bracteatum (2n=14) türü ise net bir gruplanma
göstermemiştir.
Çalışmamızda en yakın genetik mesafe değeri 0,109 olarak bulunmuştur. 25-C kodlu 1 nolu populasyon ile 29-C kodlu 2 nolu populasyon arasında 0,109’luk bir genetik mesafe saptanmıştır. Sıfıra çok yakın olan bu değer iki bitkinin birbirine genetik olarak oldukça yakın olduğunu göstermektedir. Bu iki bitkinin de 28 kromozomlu ve Tunceli bölgesine ait oluşu bu sonucu desteklemektedir. Matris verileri ile coğrafi köken bilgileri uyuşmaktadır. 5-F kodlu 14 nolu populasyon ile 11-F kodlu 18 nolu populsayon arasında ise 1,00’lik genetik mesafe saptanmıştır. Bu da 40 bitki içerisinde bu bitkilerin genetik olarak birbirine en uzak iki bitki olduğunu göstermektedir. Bu bitkilerin her ikisi de 42 kromozomlu olup, 14 nolu populasyon Sivas bölgesine, 18 nolu populasyon ise Erzincan bölgesine ait bitkilerdir.
27
5.1. Sonuç
Bu tez çalışması ile ülkemiz doğal bitki örtüsünde var olan Oxytona seksiyonu bireylerinde gen potansiyelinin genetik düzeyde tanımlanması açısından SRAP tekniği ile ilk uygulama olarak gerçekleştirilmiş ve daha sonraki çalışmalar için optimize edilmiştir. Bunun yanında bundan sonra yapılacak olan çalışmalar için uygun DNA izolasyon yöntemi ve PCR koşulları belirlenmiştir. SRAP tekniğinin genetik olarak farklı olan populasyonların tespit edilmesinde güvenle kullanılabileceği bulunmuştur. Dolayısıyla bu çalışma, bundan sonra Oxtona seksiyonu içersinde bulunan belki de Papaver cinsine ait türlerde yapılacak olan gen kaynaklarının karakterize edilmesi ve markörler yardımıyla seleksiyon çalışmalarına alt yapı hazırlamıştır.
KAYAKLAR
Akar, T., 2002. Türkiye’de yetiştirilen yerel makarnalık Buğday çeşitlerinde Genetik farklılığın polimorfik DNA Analizi ile belirlenmesi. Tarla Bitkileri Anabilim Dalı.Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. Ankara.
Avise, J.C. (1994) Molecular Markers, atural History and Evolution, Chapman and Hall, New York, NY. 511 pp.
Bachmann, K., 1993. Molecular markers in plant ecology, Tansley Review, No: 63; 403-414.
Beckmann, J.S., Soller, M., 1986. Restriction fragment length polymorphisms and genetic improvement of agricultural species. Euphytica 35:111–121.
Benli, Đ., 2009. Türkiye Doğal Florasında Yetişen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna Ait Gen Havuzunun SSR Tekniği Đle Genetik Karakterizasyonu. (Yüksek Lisans Tezi), Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Tokat.
Bretting, P.K., Widrlechner, M.P., 1995. Genetic markers and plant genetic resource management. Plant Breed Rev 31:11–86.
Budak, H. Shearman, R. C., Parmaksiz, I. and Dweikat, I. 2004. Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs, SSRs, RAPDs, and SRAPs. Theoretical and Applied Genetics.109 (2): 280–288.
Cullen, J., 1965. Papaver L., Ref.: Davis, P.H.(ed.):Flora of Turkey and East Aegean Islands, 1; 219-236, University Press, Edinburg.
Delseny M., Laroche M., Penon P. (1983) Detection of sequences with Z-DNA forming potential in higher plants, Biochem Bioph. Res. Commun., 116:113-20.
Deng, Z., Huang, S., Xiao, S.Y., and Gmitter, F.G., Jr., 1997. Development and Characterization of SCAR Markers Linked to the Citrus Tristeza Virus Resistance Gene from Poncirus trifoliate, Genome, vol. 40 697–704.
Ding, G. Zhang, D. Ding, X. Zhou, Q. Zhang, W. and Li, X.,2008. Genetic variation and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium
officinale based on SRAP analysis. Plant Syst. Evol. 276, 149-156.
Fedde, F., 1909. Papaver L. Ref.: Engler, A.: Das Pflanzenreich 40 (IV,104); 288-344, Weinheim.
Feng, N. Xue, Q. Guo, Q. Zhao, R. Guo, M.,2009. Genetic diversity and population structure of Celosia argentea and related spacies revealed by SRAP. Biochem. Genet. 10.1007, 10528-10532.
Ferriol, M., Pico, B., Nuez, F., 2003. Genetic diversity of a germplasm collection of cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theor. Appl. Genet., 107, 271– 282.
Gao, L. Liu, N. Huang, B. Hu, X., 2008. Phylogenetic analysis and genetic mapping of Chinese Hedychium using SRAP markers. Scientia Horticulturae. 117 (2008), 369-377.
Goldblatt, P., 1974. Biosystematic studies in papaver section oxytona. Annals of The Missouri Botanical Garden, 61 (2): 264-296.
Gostimsky, S.A., Kokaeva, Z.G., and Konovalov, F.A. 2005. Studying Plant Genome Variation Using Molecular Markers. Russian Journal of Genetics, Vol. 41, No. 4, 2005, 378–388.
29
Gülsen, O. and Mutlu, M., 2005. Bitki biliminde kullanılan genetik markerlar ve kullanım alanları. Alatarım 4(2); 27-37.
Gülsen, O. Karagül, S. and Abak, K., 2007. Diversity and relationships among Turkish okra germplas by SRAP and phenotypic marker polymorphism. Biologia, Bratislava, Section Cellular and Molecular Biology. 62(1), 41-45.
Gürkök, T., 2009. Türkiye Doğal Florasında Yetişen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna Ait Gen Havuzunun ISSR Tekniği Đle Genetik Karakterizasyonu. (Yüksek Lisans Tezi), Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Tokat.
Kabaoğlu, A. , 2007. Türkiye’de Bulunan Hypogymnia (Nyl.) Nyl. Türlerinde rDNA ITS Bölgesi Dizi Analizi ile Çesitliligin Tanımlanması. A.Ü. Fen Bilimleri Enst. Yüksek Lisans Tezi, Ankara.
Kesseli, R.V., Paran, J., and Michelmore, R.W., 1993. Efficient Mapping of Specifically Targeted Genomic Regions and the Tagging of These Regions with Reliable PCR-Based Genetic Markers, in Application of RAPD Technology to Plant Breeding: Joint Plant Breeding Symposia Series, Minneapolis, Minn., 31–36. Lagercrantz, U., Ellegren, H., and Andersson, L. 1993, The abundance of various
polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates,
ucleic Acids Res., 21, 1111-1115.
Laroche, A., Demeke, T., Gaudet, D.A., et al., 2000. Development of a PCR Marker for Rapid Identification of the Bt-10 Gene for Common Bunt Resistance in Wheat, Genome, 43 217–223.
Li, G., Quiros, C.F., 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet., 107 (1), 168–180.
Li-jun, L. Ding-xiang, P. and Bo, W., 2008. Genetic relation analysis on Ramie [
Boehmeria nivea (L.) Gaud.] inbred lines by SRAP markers. Agricultural
Sciences in China. 7(8), 944-949.
Medvedew, J.S. and Kavkazsk,Sv.Mus. 1918: Ann. Caucas. Dusb, ll; 204–207.
Mutlu, N. Boyacı, F.H. Göçmen, M. Abak, K., 2008. Development of SRAP, SRAP-RGA,RAPD and SCAR markers linked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant. Theor Appl Genet. 117, 1303-1312.
Parmaksız, Đ., 2004. Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonunun Türkiye’de Yetişen Türlerinde Genetik Çeşitliliğin RAPD Markörleri Đle Analizi. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Anabilim Dalı, Ankara .
Parmaksız, Đ., Önen, H., Yıldırım, A., Gümüşcü, A., Đpek, A., Arslan, N., 2009. Türkiye Doğal Florasında Yetişen Papaver Cinsi Oxytona Seksiyonuna Ait Gen Havuzunun RAPD ve SSR Teknikleriyle Genetik Karakterizasyonu, Morfolojik ve Alkaloit Kompozisyonlarının Kromozom Sayılarıyla Đlişkilendirilmesi. Ankara.TÜBĐTAK 105 O 501 nolu proje sonuç raporu.
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullıs, K. B. and Erlıch, H. A., 1988. Primer-directed enzymatic amplificatication of DNA with a termostable DNA polymerase. Science, 239: 937-945.
Seçmen, Ö., Gemici, Y., Görk, G., Bekat, L.ve Leblebici, E., 1995. Tohumlu Bitkiler Sistematiği (Ders Kitabı). 4. baskı . Ege Ünv. Fen Fak. Ders Kitapları Serisi No: 116. Đzmir.
30
Şahin, S., 2008. Türkiye Doğal Florasında Yetişen Oxytona Seksiyonuna Ait Papaver Türlerinin Morfolojik ve Palinolojik Yönden Đncelenmesi. (Yüksek Lisans Tezi), Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Bölümü, Tokat. Tanksley, S.D. and Orton, T.J., 1983. Isozymes in Plant Genetics and Breeding, Part B,
Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, p; 147-163.
Tautz D. and Renz M.,1986. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. ucleic Acids Res. 12, 4127–4138.
Wang, J. Yao, J. and Lı, W., 2008. Construction of a molecular map for melon (
Cucumis melo L.) based on SRAP. Front Agric China, 2 (4), 451-455.
Welsh, J., McClelland, M., 1990. "Fingerprinting Genomes Using PCR With Arbitrary Primers", ucleic Acids Research,Vol 18, 7213-7218.
Welsh, J., Petersen, C., 1991. And "Polimorphisms Genereted By Arbitrarily Primed PCR Đn The Mouse: Application To Strain Đdentification And Genetic Mapping", ucleic Acids Research, Vol 19, 303-306.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V., 1990. "DNA Polimorphism Amplified By Arbitrary Primers Are Useful As Genetic Markers",
ucleic Acids Research, Vol 18, 6531-6535.
Yıldırım, A. ve Kandemir, N. 2001. Genetik Markörler ve Analiz Metodları. Bölüm 23. In : Özcan, S. Gürel, E., Babaoğlu, M. Bitki Biyoteknolojisi II. Genetik Mühendislığı ve Uygulamaları. (ed.). Selçuk Üniv. Vakıf Yayınları, Sayfa 112– 159. ISBN 975-6652-05-5. Konya.
