T.C.
KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
ÜROPATOJEN ESCHERICHIA COLI İZOLATLARININ
BİYOFİLM OLUŞTURMA YETENEĞİNİN VE BİYOFİLMDE
ANTİBİYOTİK DUYARLILIĞININ ARAŞTIRILMASI
Doğanhan Kadir ER
Kocaeli Üniversitesi
Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yönetmeliğinin Mikrobiyoloji Programı için Öngördüğü
DOKTORA TEZİ Olarak Hazırlanmıştır.
KOCAELİ 2019
T.C.
KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
ÜROPATOJEN ESCHERICHIA COLI İZOLATLARININ
BİYOFİLM OLUŞTURMA YETENEĞİNİN VE BİYOFİLMDE
ANTİBİYOTİK DUYARLILIĞININ ARAŞTIRILMASI
Doğanhan Kadir ER
Kocaeli Üniversitesi
Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yönetmeliğinin Mikrobiyoloji Programı için Öngördüğü
DOKTORA TEZİ Olarak Hazırlanmıştır.
Danışman: Prof. Dr. Devrim DÜNDAR
Destekleyen Kurum: TÜBİTAK 217S252 Etik Kurul Onayı: KÜ GOKAEK 2017/165
KOCAELİ 2019
iii
KABUL VE ONAY
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ' NE
Tez Adı: Üropatojen Escherichia coli İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneğinin ve Biyofilmde Antibiyotik Duyarlılığının Araştırılması.
Tez Yazarı: Doğanhan Kadir ER Tez Savunma Tarihi: 18.06.2019
Tez Danışmanı: Prof. Dr. Devrim DÜNDAR
Bu çalışma, sınav kurulumuz tarafından Mikrobiyoloji Anabilim Dalında DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir.
Onay
iv ÖZET
Üropatojen Escherichia coli İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneğinin ve Biyofilmde Antibiyotik Duyarlılığının Araştırılması.
Amaç: Escherichia coli (E. coli), üriner sistem enfeksiyonlarında en sık karşılaşılan etkendir ve A, B1, B2 ve D olarak 4 temel filogenetik gruba ayrılmıştır. B2 filogenetik grubuna dahil olan ST131 klonal grubu, tedaviyi zorlaştırmakta ve rekürrense sebep olabilmektedir; buna sebep olan faktörlerden birisi, biyofilm oluşturabilme yeteneğidir. Farklı filogenetik ve klonal kökenlere sahip olan üropatojenik E. coli izolatlarının biyofilmdeki duyarlılıkları hakkında, literatürdeki veri çok kısıtlıdır. Çalışmanın amacı, üriner sistem enfeksiyonu etkeni olan, farklı filogenetik ve klonal kökenlere sahip E. coli izolatlarının biyofilm varlığında, sıklıkla kullanılan antimikrobiyallere karşı duyarlılığının belirlenmesidir.
Yöntem: Çalışmaya, A, B1, B2 ve D filogenetik gruplarından 10'ar ve ST131 klonal grubundan 39 olmak üzere, toplam 79 üropatojenik E. coli izolatı dahil edilmiştir. Bu izolatların amoksisilin/klavulonik asit, gentamisin, seftriakson, siprofloksasin, nitrofurantoin, trimetoprim/sulfametoksazole karşı minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) ve minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEK) değerleri belirlenmiş ve filogenetik grup, ST131 pozitifliği ve direnç potansiyelleri arasındaki ilişkiler araştırılmıştır.
Bulgular: MİK değerlerine göre duyarlı olarak saptanan izolatların, biyofilm varlığında dirençli olabildiği gözlenmiştir. Bazı antibiyotikler için MBEK değerleri, MİK değerlerine göre 32000 kata kadar artış göstermiştir. MBEK sonuçları sınır değer tablolarına göre değerlendirildiğinde, dirençli bakteri sayısında 1,5-24,5 kat artış olduğu belirlenmiştir. ST131 izolatlarının MBEK değerleri, seftriakson (p=0,017) ve siprofloksasin (p<0,001) için ST131 dışı izolatlardan daha yüksektir. Nitrofurantoine ait MİK değerleri, A filogenetik grubunda diğer gruplara göre daha yüksektir (p<0,001). MBEK değerleri filogenetik gruplar ile karşılaştırıldığında, gentamisin (p=0,014) ve nitrofurantoinde (p=0,011) MBEK değerlerinin D filogenetik grubunda B2 filogenetik grubuna göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir.
Sonuç: Üriner sistem enfeksiyonlarının gelişmesinde hem abiyotik yüzeylerdeki biyofilmin hem de hücre içi biyofilm benzeri bakteri topluluklarının etkisi bilinmektedir.
v
Rutin in vitro antimikrobiyal duyarlılık testleri, sadece planktonik hücrelere ait duyarlılığı belirleyebilmektedir; biyofilm varlığında antimikrobiyal duyarlılık hakkında fikir vermemektedir. Bu nedenle, MBEK testlerinin standardizasyonuna ihtiyaç duyulmaktadır. Üropatojenik E. coli üzerine nitrofurantoin, filogenetik grup ve pandemik klonal grup farketmeksizin hem biyofilm hem de planktonik bakteri üzerine en etkili antibiyotiktir.
Anahtar Sözcükler: Escherichia coli, üriner sistem enfeksiyonu, ST131, filogenetik grup, MBEK, MİK, biyofilm.
vi ABSTRACT
Investigation of the Ability to Form Biofilm and Antibiotic Susceptibility of Biofilm Forming Uropathogenic Escherichia coli.
Objective: Escherichia coli is the leading cause of urinary tract infections and has divided to 4 phylogenetic groups including A, B1, B2 and D. The clonal group B2-ST131 complicates the treatment and may cause recurrence; one of the factors causing this is biofilm-forming ability. The data about the susceptibility of uropathogenic E. coli (UPEC) with different phylogenetic and clonal origins in biofilm is limited. The aim of this study was to determine the susceptibility of E. coli isolates with different phylogenetic and clonal origins to the commonly used antimicrobial agents in the presence of biofilm.
Method: A total of 79 UPEC isolates, including 10 from each phylogenetic groups and 39 from the ST131, were included. The minimum inhibition concentration (MIC)s and the minimum biofilm eradication concentration (MBEC)s of the isolates against amoxicillin/clavulonic acid, ceftriaxone, ciprofloxacin, gentamicin, nitrofurantoin and trimethoprim/sulfamethoxazole were determined and the relationships between phylogenetic groups, ST131 status and resistance potentials were investigated.
Results: It was observed that the isolates detected as susceptible according to MICs, were resistant in the presence of biofilm. For some antibiotics, MBECs increased by 32000 times compared to MICs. When the MBECs were evaluated according to the susceptibility tables, it was determined that there was a 1.5-24.5 fold increase in the number of resistant bacteria. The MBECs of ST131 were higher for ceftriaxone (p=0.017) and ciprofloxacin (p<0.001) than non-ST131 isolates. MICs of nitrofurantoin are higher in the A phylogenetic group than in other phylogenetic groups (p<0.001). When MBECs were compared with phylogenetic groups, it was determined that MBECs in gentamicin (p=0.014) and nitrofurantoin (p=0.011) were higher in D phylogenetic group than B2.
Conclusions: The effects of both biofilms on the abiotic surfaces and biofilm-like intracellular bacterial communities are well-known in the development of urinary tract infections. The susceptibility of the biofilm-formed organisms, could not accurately identified by routine in vitro susceptibility tests. Therefore, standardization of MBEC tests is needed. Nitrofurantoin may be the drug-of-choice due to its effect on both biofilm and
vii
planctonic cells in the treatment of UPEC regardless of the phylogenetic groups or pandemic clonal group.
Keywords: Escherichia coli, urinary tract infection, ST131, phylogenetic group, MBEC, MIC, biofilm.
viii TEŞEKKÜR
Danışman hocam Sayın Prof. Dr. Devrim DÜNDAR’ a bana bu değerli çalışmada bulunma fırsatı verdiği, her basamağında anlayışla yaklaştığı ve hiçbir zaman esirgemediği desteği için minnettarım.
Tez İzleme Komitesi' nde bulunan Hocalarım Sayın Prof. Dr. Sema Aşkın KEÇELİ ve Doç. Dr. Emel ERGÜL’ e her türlü destekleri ve bu tezin oluşmasına katkı sağlayan motive edici yaklaşımlarından dolayı çok teşekkür ederim.
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Hocalarım Sayın Prof. Dr. Fetiye KOLAYLI, Prof. Dr. Aynur KARADENİZLİ, Prof. Dr. Fatma BUDAK, Prof. Dr. Zeki YUMUK, Prof. Dr. Gülden SÖNMEZ TAMER ve Dr. Öğretim Üyesi Erdener BALIKÇI’ ya desteklerinden dolayı teşekkür ederim.
Sayın Prof. Dr. Canan BAYDEMİR’ e istatistiksel analiz konusundaki desteği ve önerileri için teşekkür ederim.
Minnesota Üniversitesi US Veterans Medical Center Epidemiyoloji Direktörü Sayın Prof. Dr. James R. JOHNSON ve asistanı Dr. Brian JOHNSTON' a gönderdikleri pozitif kontrollerden dolayı teşekkür ederim.
Arş. Gör. Hüseyin UZUNER ve Agim OSMANİ başta olmak üzere, tüm laboratuvar arkadaşlarıma, anlayışları ve destekleri için teşekkür ederim.
Annem Pervin, babam Ünsel, ağabeyim Boğaç Han ve sevgili eşim Merve Sefa ER’ e sonsuz desteklerinden, anlayışlarından ve sevgilerinden dolayı teşekkür ederim.
Bu proje, Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından 217S252 proje numarasıyla desteklenmiştir.
ix
TEZİN AŞIRMA OLMADIĞI BİLDİRİSİ
Tezimde başka kaynaklardan yararlanılarak kullanılan yazı, bilgi, çizim, çizelge, ve diğer malzemeler kaynakları gösterilerek verilmiştir. Tezimin herhangi bir yayından kısmen ya da tamamen aşırma olmadığını ve bir İntihal Programı kullanılarak test edildiğini beyan ederim.
x
İÇİNDEKİLER
ÖZET ... iv
ABSTRACT ... vi
TEŞEKKÜR ... viii
TEZİN AŞIRMA OLMADIĞI BİLDİRİSİ ... ix
İÇİNDEKİLER ... x
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ... xii
ÇİZİMLER DİZİNİ ... xiv
ÇİZELGELER DİZİNİ ... xv
1. GİRİŞ ... 1
1.1.Üriner Sistem Enfeksiyonları ... 1
1.2.Ekstraintestinal Patojenik E. coli ... 2
1.2.1.Virülans ve Antimikrobiyal Duyarlılık ... 2
1.2.2.Filogenetik ve Klonal Gruplar ... 3
1.2.3.Patojenez ... 4
1. 3. Biyofilm ve Biyofilm Belirleme Yöntemleri ... 4
2. AMAÇ ... 13
3. YÖNTEM ... 15
3.1.Örnek Seçimi ve Etik Kurul Onayı ... 15
3.2.Tampon Çözeltilerin, Besiyerlerinin ve Ayraçların Hazırlanması ... 16
3.2.1.Eozin - Metilen Mavisi (EMB) Agar Besiyeri ... 16
3.2.2.Gliserollü (%15) Triptik Soy Broth (TSB) Besiyeri ... 16
3.2.3.Luria-Bertani (LB) Broth Besiyeri ... 16
3.2.4.Mueller-Hinton Broth (MHB) Besiyeri ... 16
3.2.5.Triptik Soy Agar (TSA) Besiyeri ... 17
3.2.6.Triptik Soy Broth (TSB) Besiyeri ... 17
3.2.7.Reaktif ve Tampon Çözeltilerin Hazırlanması ... 17
3.3.Biyofilm Deneyleri ... 19
3.3.1.Biyofilm Oluşturma Yönteminin Denenmesi ... 19
3.3.2.Canlı Hücre Sayısının Belirlenmesi ... 22
3.3.3.Plağın Tamamında Eşit Biyofilm Oluşumunun Araştırılması ... 25
xi
3.4.Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri ... 29
3.4.1.Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu Belirlenmesi ... 29
3.4.2.Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu Belirlenmesi ... 32
3.5.İstatistiksel Analiz ... 35
4. BULGULAR ... 37
4.1.Biyofilm Oluşturma Yöntemi Deneme Sonucu ... 37
4.2.Canlı Hücre Sayısının Belirlenmesi ... 38
4.3. Eşit Biyofilm Oluşumunun Araştırılması ... 39
4.4.İzolatların Biyofilm Oluşturma Yeteneğinin Belirlenmesi ... 40
4.5.Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu ve Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu Verilerinin Karşılaştırılması ... 46
5. TARTIŞMA ... 63
6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ... 70
KAYNAKLAR ... 72
ÖZGEÇMİŞ ... 77
xii
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
BaSO4 : Baryum Sülfat BaCl2 : Baryum Klorid CaCl2 : Kalsiyum Klorid
CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO : Dimetil Sülfoksit
E. coli : Escherichia coli
ExPEC : Ekstraintestinal patojenik E. coli EMB : Eozin Metilen Mavisi
EUCAST : European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing GSBL : Genişlemiş Spektrumlu-β-Laktamaz
H2SO4 : Sülfirik Asit
KA-MHB : Katyon Ayarlı Mueller Hinton Broth
KÜ GOKAEK : Kocaeli Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu
KOB : Koloni Oluşturan Birim
L : Litre
MgCl2 : Magnezyum Klorid
MVCC : Mean Viable Cell Count (Ortalama Canlı Hücre Sayısı)
µm : Mikrometre
µM : Mikromolar
ml : Mililitre
mM : Milimolar
MBEK : Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu MİK : Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu
M : Molar
MHA : Mueller-Hinton Agar
MHB : Mueller-Hinton Broth
nm : Nanometre
NaOH : Sodyum Hidroksit
PCR : Polymerase Chain Reaction
xiii
ST131 : Sekans tip-131
TSA : Triptik Soy Agar
TSB : Triptik Soy Broth
UPEC : Üropatojenik E. coli ÜSE : Üriner Sistem Enfeksiyonu
xiv
ÇİZİMLER DİZİNİ
Çizim 1.1. Üriner sistem enfeksiyonu patojenezi.. ... 5
Çizim 1.2. Biyofilm benzeri hücre içi toplulukların oluşum basamakları... 9
Çizim 3.1. Pegleri içeren plak kapağı ve plağın yandan görünüşü. ... 20
Çizim 3.2. İnkübasyon sonrası plağın ve kapağın görüntüsü ... 21
Çizim 3.3. Ultrasonik banyo ve plağın yerleşimi. ... 24
Çizim 3.4. Dilüsyon plağı şeması.. ... 25
Çizim 3.5. TSA spot ekim plak şeması. ... 26
Çizim 3.6. Çalkalamalı etüvdeki inkübasyon basamağı. ... 28
Çizim 3.7. Plakta üreme sonrası MBEK deney protokolüne ait akış şeması. ... 35
Çizim 4.1. Boyanmış peglerin üstten ve yandan görüntüsü. ... 37
Çizim 4.2. Biyofilm canlı hücre kantitasyon ekimi. ... 38
Çizim 4.3. Satırlara ait VCC değerleri. ... 39
xv
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 1.1. Yaygın kullanılan biyofilm belirleme sistemleri. ... 10
Çizelge 1.2. Biyofilm biyokütlesi, canlı hücre sayısı ve ekstrasellüler polimerik madde belirlenmesi için kullanılan yöntemler. ... 11
Çizelge 1.3. In vitro biyofilmin antimikrobiyal duyarlılığının belirlenmesinde sıklıkla kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması ... 12
Çizelge 3.1. Reaktif ve tampon çözeltiler... 18
Çizelge 3.2. Canlı hücre sayısı plak şeması... 22
Çizelge 3.3. Çalışılan MİK aralıkları... 31
Çizelge 3.4. Çalışılan MBEK aralıkları. ... 32
Çizelge 4.1. Satırlarda eşit biyofilm oluşumu deneyine ait tanımlayıcı veriler. ... 40
Çizelge 4.2. Suşlara ait biyofilmdeki canlı hücrelerin kantitasyon verileri... 41
Çizelge 4.3. ST131 ve ST131 dışı izolatların antibiyotiklere karşı duyarlılıkları. ... 47
Çizelge 4.4. Suşlara ait MİK değerleri ve KA-MHB MBEK plağından elde edilen MİK değerleri. ... 48
Çizelge 4.5. Suşlara ait MİK50, MİK90, MBEK50, MBEK90 ve belirlenen aralık değerleri. 53 Çizelge 4.6. Filogenetik gruplara ve ST131 klonal grubuna ait ortanca MİK ve MBEK verileri. ... 53
Çizelge 4.7. MİK ve MBEK verilerine göre dirençli izolat sayıları ve yüzdeleri. ... 54
Çizelge 4.8. Antibiyotiklere ait MBEK/MİK oranları. ... 55
1 1. GİRİŞ
1.1. Üriner Sistem Enfeksiyonları
Üriner sistem enfeksiyonları, yüksek morbidite ve mortaliteyle seyreden, toplum için önemli bir mali yüke sahip olan enfeksiyonların başında gelmektedir. Dünya geneline bakıldığında, her yıl 150 milyon kişiye üriner sistem enfeksiyonu tanısı konmaktadır. Dünya ekonomisine tahmini maliyeti 6 milyar doları geçmektedir (Gonzalez ve Schaeffer 1999, Foxman 2002). Ülkemizde, üriner sistem enfeksiyonu nedeniyle yılda yaklaşık 5 milyon reçete yazıldığı tahmin edilmektedir (Ozturk ve diğ. 2008).
Epidemiyolojik çalışmalar, dünya üzerindeki kadınların neredeyse yarısının hayatları boyunca en az bir kez üriner sistem enfeksiyonu geçirdiğini belirlemiştir. Kadınların erkeklere oranla daha sık üriner sistem enfeksiyonu geçirdiği bilinmektedir. Her üç kadından biri, yirmi dört yaşına kadar en az bir kez antibiyotik kullanımı gerektirecek bir üriner sistem enfeksiyonu geçirmektedir (Foxman 2002). Ayrıca, geçirilmiş üriner sistem enfeksiyonu öyküsü olan kişilerin rekürrense yatkın olduğu belirlenmiştir; başlangıç enfeksiyonunun ardından 6 ay içerisinde ikinci bir enfeksiyonun görülme sıklığı %20 - %50 arasındadır (Hannan ve diğ. 2010, Ikaheimo ve diğ. 1996, Foxman ve diğ. 2000).
Üriner sistem enfeksiyonlarında en sık izole edilen etken Escherichia coli (E. coli)' dir ve enfeksiyonların yaklaşık olarak %70 - %90' ında bu tür izole edilmektedir. E. coli, hastane kökenli üriner sistemi enfeksiyonlarda da sıklıkla belirlenmektedir; hastane enfeksiyonu olgularının ortalama %40' ı E. coli' ye bağlıdır (Brzuszkiwicz ve diğ. 2006).
Antimikrobiyal direnç üriner sistem enfeksiyonları için büyük bir sorun haline gelmiştir. Artan direnç, tedavi başarısızlıklarına sebep olmaktadır. Direncin üstesinden gelebilmek için farklı yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle enfeksiyon mekanizmalarının doğru bir biçimde anlaşılması, virülans faktörlerine veya biyofilm oluşumuna yönelik alternatif tedavi yöntemlerinin belirlenebilmesi için önem teşkil etmektedir.
Üriner sistem enfeksiyonlarında E. coli' nin hem kateter gibi abiyotik yüzeylerde biyofilm, hem de hücre içi biyofilm benzeri bakteri toplulukları oluşturmaya eğilimli olduğu bilinen bir durumdur (Kostakioti ve diğ. 2013, Flores-Mireles ve diğ. 2015, Price ve Chapman 2018). Günümüzde rutin laboratuvarda uygulanan antimikrobiyal duyarlılık belirleme yöntemleri, bakterilerin biyofilm oluşturmuş vaziyetteki duyarlılıklarını
2
belirlemede etkisiz kalmaktadır. In vitro antimikrobiyal duyarlılık ile in vivo duyarlılık, biyofilm varlığında çoğunlukla uyuşmamaktadır. Bu durumun sonucunda, enfeksiyon eradikasyonunda zorluklarla karşılaşılmaktadır. Bu çalışma ile, E. coli' ye bağlı üriner sistem enfeksiyonlarında eradikasyonu engelleyen temel sebeplerden birisi olan biyofilm oluşumunun, antimikrobiyal duyarlılığa etkisinin belirlenmesi planlanmıştır.
1.2. Ekstraintestinal Patojenik E. coli
1.2.1. Virülans ve Antimikrobiyal Duyarlılık
İnsan gastrointestinal sistemi, doğumun ardından ilk birkaç saat içerisinde E. coli ile kolonize olmaya başlamaktadır. Çoğunlukla bakteri ve konak yıllar boyunca karşılıklı yarar sağlayacak "kommensal" biçimde hayatlarını sürdürmektedirler. Fakat kommensal E. coli izolatları dışında patojenik formlar da kolonizasyon oluşturabilmektedirler ve enfeksiyonlara sebep olabilirler. Günümüzde bu bakış açısıyla E. coli, kommensal, diyarejenik ve ekstraintestinal olarak farklı patotiplere ayrılabilmektedir. Ekstraintestinal patojenik E. coli (ExPEC) izolatları, gastrointestinal sistem dışındaki enfeksiyonlardan sorumlu tutulan izolatları içermektedir; tarihsel olarak üropatojenik E. coli (UPEC), sepsis ile ilişkili E. coli (SEPEC) ve yenidoğan menenjiti ile ilişkili E. coli (NMEC) olarak sınıflanan farklı gruplar, toplu olarak ExPEC grubuna dahil edilmiştir (Russo ve Johnson 2000, Willes ve diğ. 2008).
ExPEC, çeşitli sayıda ve özellikte virülans faktörüne sahiptir. Bazı virülans faktörlerine sahip izolatların özellikle üriner sisteme spesifik enfeksiyonlar oluşturabilmesi nedeniyle, UPEC terimi ortaya çıkmıştır. Bu virülans faktörleri adezinler, toksinler, demir edinim mekanizmaları, protektinler, invazinler ve diğerleri olarak gruplanabilmektedir (Dale ve Woodford 2015).
Üropatojenik E. coli' nin enfeksiyonlarda virülans faktörleriyle başarılı olmasının yanında, antimikrobiyal direncinin yüksek olabilmesi sebebiyle, tedavi başarısızlıkları meydana gelebilmektedir (Can ve diğ. 2015). Buna bağlı olarak organizmanın yüksek direnç yeteneği sayesinde, ampirik tedavi seçiminde de zorluklar oluşmaktadır. Üriner sistem enfeksiyonlarının ampirik tedavisinde, Amerika Enfeksiyon Hastalıkları Derneği (Infectious Diseases Society of America) ve Avrupa Klinik Mikrobiyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları Derneği (European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases)' nin kılavuzları doğrultusunda komplike olmayan sistit tedavisinde önerilen antibiyotiklerin
3
başında nitrofurantoin, trimetoprim/sulfametoksazol, fosfomisin, florokinolonlar ve β-laktam grubu antibiyotikler gelmektedir (Gupta ve diğ. 2011). Ülkemizde, amoksisilin/klavulonik asit, trimetoprim/sulfametoksazol ve siprofloksasin gibi ilk sıralarda tercih edilen antibiyotiklere karşı direnç, %40' lara kadar ulaşmıştır (Canbaz ve diğ. 2002, Arslan ve diğ. 2005, Aypak ve diğ. 2009).
1.2.2. Filogenetik ve Klonal Gruplar
Üriner sistem kökenli E. coli izolatlarının filogenetik gruplandırması, izolata ait köken ve virülans genlerinin dağılımının belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır. E. coli, temel olarak 4 farklı filogenetik gruba ayrılmıştır. Bu gruplar, A, B1, B2 ve D olarak adlandırılmıştır. Sınıflandırma, tarihsel olarak multilokus enzim elektroforezi ve multilokus sekans tipleme ile gerçekleştirilmiştir. Günümüzde multilokus enzim elektroforezi ve multilokus sekans tipleme yöntemleri, yerini daha kolay ve ucuz olan çoklu polimeraz zincirleme tepkimesi (PZT) temelli yöntemlere bırakmıştır (Clermont ve diğ. 2015).
Çoklu PZT temelli yöntem, chuA, yjaA genleri ve TSPE4.C2 isimli DNA parçacığının varlıkları ve/veya yokluklarına göre izolatları filogenetik gruplara ayırabilmektedir. Bunun için, Clermont sınıflaması adı verilen bir dikotomöz karar ağacı kullanılmaktadır (Clermont ve diğ. 2000).
Filogenetik gruplar arasında genom büyüklükleri, virülans genlerini taşıma sıklıkları, ve antimikrobiyal duyarlılık açısından farklıklar bulunduğu bilinmektedir (Gordon ve diğ. 2008). ExPEC' e bağlı üriner sistem enfeksiyonlarında klinik izolatlar, çoğunlukla B2 ve D filogenetik gruplarına dahildir. Kommensal E. coli izolatları ise A ve B1 filogenetik gruplarına yayılmıştır (Er ve diğ. 2015).
B2 filogenetik grubunda bulunan, kısaca sekans tip-131 (ST131) olarak adlandırılan klonal grubun enfeksiyon sıklığı giderek artmaktadır. Bu klonal grup, pandemik ve hipervirülan olarak tanımlanmaktadır. Ayrıca bu klonal grup çoğunlukla genişlemiş spektrumlu-β-laktamaz aktivitesi ve çoklu ilaç direnciyle de ilişkilendirilmiştir (Rogers ve diğ. 2010, Er ve diğ. 2015). ST131' in üç karakteristik özelliği, bulunduğu serogrubu (O25b veya O16), filogenetik grubu (B2) ve multilokus sekans tiplemesi ile belirlenen sekans tipi (ST131) olarak bildirilmiştir (Rogers ve diğ. 2010). ST131 içerisinde O25b:H4 serotipi baskın olarak görülmektedir fakat O16:H5 olarak tanımlanan ve %1-%12 sıklığında görülen bir ST131 serotipi daha bulunmaktadır (Zhong ve diğ. 2015). Üriner
4
sistem enfeksiyonu oluşturma ve rekürrense sebep olabilme konularında bu klonal grubun başarısı, onu çalışılması gereken bir klonal grup haline getirmektedir.
ST131' in tanımlanmasında multilokus sekans tipleme yöntemi haricinde, çoklu PZT temelli daha kolay yöntemler de kullanılabilmektedir. B2 filogenetik grubuna dahil olduğu bilinen izolatlarda, mdh ve gyrB genlerindeki tek nükleotid polimorfizmine (SNP) ve O antijenine spesifik PZT ile ST131 tanısı koyulabilmektedir (Clermont ve diğ. 2007, Johnson ve diğ. 2009).
1.2.3. Patojenez
E. coli' ye bağlı üriner sistem enfeksiyonları, asemptomatik bakteriüriden sepsisin eşlik ettiği piyelonefrite kadar değişiklik gösteren klinik sendromları içermektedir. Enfeksiyon sadece alt üriner sistemde gerçekleşebildiği gibi hem alt hem de üst üriner sistemi kapsayabilmektedir (Sobel ve Kaye, 2009). E. coli' ye bağlı üriner sistem enfeksiyonlarının patojenezindeki basamaklar: (1) Periüretral bölgenin kontaminasyonu, (2) üretra kolonizasyonu ve mesane göçü, (3) pili ve adezinler ile mesaneye planktonik hücre kolonizasyonu ve invazyon, (4) nötrofil infiltrasyonu, (5) konak savunmasını atlatabilen hücrelerin çoğalması, (6) biyofilm oluşumu, (7) proteaz ve bakteriyel toksinlerle epitel hasarı, (8) böbreklere geçiş, (9) böbrek kolonizasyonu, (10) bakteriyel toksinlerle konak hücre hasarı ve (11) bakteriyemi olarak sınıflanabilir (Flores-Mireles ve diğ. 2015). E. coli' ye bağlı üriner sistem enfeksiyonu patogenezi, Çizim 1. 1.' de gösterilmiştir.
1. 3. Biyofilm ve Biyofilm Belirleme Yöntemleri
Ekstrasellüler DNA, ekstrasellüler polimerik maddeler olarak adlandırılan ekzopolisakkaritler, pili, flagella ve diğer adezinler ile bir çatı görevi görerek, "biyofilm" olarak adlandırılan multisellüler bakteriyel topluluklar oluşturulabilmektedir (Flores-Mireles ve diğ. 2015). Bakteriler tarafından oluşturulan bu çatı, "ekstrasellüler matriks" olarak tanımlanmıştır ve biyofilm biyokütlesinin yaklaşık %90' ını kapsayabilmektedir (Kostakioti ve diğ. 2013). Oluşturulan bu yapı, bakteriyel topluluğu -biyofilmi- immün yanıttan, antimikrobiyallerden ve diğer stres kaynaklarından korumaktadır. Biyofilm, quorum sensing regülasyon sistemleriyle düzenlenen kompleks hücre içi ve dışı sinyalizasyon ve iletişim proseslerinin sonucunda oluşabilmektedir (Flores-Mireles ve diğ. 2015).
5
Bakterilerin biyofilm oluşturması ve biyofilmin olgunlaşması, geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz çok sayıda basamağı kapsamaktadır. Bu basamakların işleyişi türler arasında farklılıklar gösterebilse de biyofilm oluşumuyla ilgili temel olarak 3 temel bölümden bahsetmek mümkündür; tutunma, olgunlaşma ve dağılma (Kostakioti ve diğ. 2013, Price ve Chapman 2018). İlk basamak bakterinin kısmen rastlantısal olarak bir
Çizim 1.1. Üriner sistem enfeksiyonu patojenezi. Flores - Mireles ve diğ (2015) 'den alınmıştır.
yüzeye ulaşmasıdır. Gerçekleşen pasif hareketler, Brownian hareketi veya yerçekimi kuvvetleri tarafından yönetilmektedir. Bu pasif hareketler haricinde bakteriler, yüzeyler
6
boyunca karşılaşılan itici elektrostatik ve hidrodinamik kuvvetlerin üstesinden gelmelerini sağlayan ve dolayısıyla yüzeylerle etkileşime girme şanslarını arttıran aktif hareket mekanizmaları da geliştirmişlerdir (Donlan 2002, Beloin ve diğ. 2008, Kostakioti ve diğ. 2013). Mikroorganizma yüzeyle temas kurduğunda, hücredeki adezinler vasıtasıyla tutunma gerçekleşir fakat bu "yapışma" mutlak değildir; dinamik ve geriye dönüşümlüdür. Bakteri, hidrodinamik kuvvetler vasıtasıyla veya bir besine ulaşım için planktonik popülasyona geri dönebilir (Dunne 2002, Wu ve Outten 2009). Geri dönüşümsüz tutunma, hidrodinamik kuvvetlerin üstesinden gelinerek sağlanabilmektedir. Özellikle UPEC izolatları için, tip I fimbria, curli olarak adlandırılan amiloid fiberler ve antijen 43' ün abiyotik yüzeylere geri dönüşümsüz tutunmayla ilişkisi bilinmektedir (Beloin ve diğ. 2008, Cegelski ve diğ. 2009, Kostakioti ve diğ. 2013). Tip I fimbria (D-mannoz spesifik adezin)' nın aktif kısmı olan FimH, UPEC izolatları için biyofilm başlangıcında en önemli proteindir. FimH proteini insan mesane epitel hücrelerinin invazyonuna ve üroplakin hücrelerine bağlanmada etkilidir (Busch ve Waksman 2012, Kostakioti ve diğ. 2013, Sihra ve diğ. 2018).
Bakterinin yüzeye kontağı, bazı genlerin ekspresyonu üzerinde değişiklikler yapmaktadır ve "biyofilm fenotipi" nin indüksiyonu gerçekleşmektedir. Böylelikle, organizmanın sesil yaşamla ilişkili özellikle ekstrasellüler matriks ürünlerinin sentezi tetiklenmektedir (Mah ve O'Toole 2001, Otto ve Silhavy 2002, Beloin ve diğ. 2008, Bhomkar ve diğ. 2010). Bazı hücreler ise lizise uğrayarak yüzeyin ekstrasellüler DNA ile kaplanmasına yardımcı olur. Lizise uğramış hücreler ayrıca ilave bakteri tutunmasını tetiklerler (Price ve Chapman 2018). Patojenik E. coli' ye ait ekstrasellüler matriks yapısı tam olarak bilinmemektedir. Bilindiği kadarıyla biyofilmin olgunlaşması, curli gibi adezinleri, sellülozu, kolanik asiti ve poli-β-1,6-N-asetil-D-glukozamini içeren koruyucu ekstrasellüler matriksin oluşmasına bağlıdır (Kostakioti ve diğ. 2013, Price ve Chapman 2018).
Olgun biyofilm içerisinde, aktif bir topluluktan bahsedilebilir. Bu topluluk biyofilm içerisindeki bakteriler için gerekli ürünleri paylaşmakta ve biyofilm mimarisinin sürdürülmesini sağlamaktadır. Biyofilm olgunlaştıkça, biyofilm içerisindeki bakterilerden bazıları persistan forma geçerek metabolik aktivitelerini sınırlayabilirler. Ayrıca bu dönemde dağılma bir seçenek haline gelebilir. Biyofilmin dağılması, kayma gerilimi gibi hidrodinamik parametreler ile meydana gelen pasif dağılma biçiminde gelişebilir (Karatan ve Watnick 2009). Ayrıca bakteriler çevresel değişiklikleri algılayarak biyofilm içinde kalmanın yararlı olmadığı durumlarda, planktonik forma geçişin sağlanabildiği yollar
7
geliştirmişlerdir. Biyofilmin dağılması; besin erişimindeki güçlük, oksijen dalgalanmaları, toksik ürünlerin artması ve diğer stres kaynakları sebebiyle gerçekleşir (Karatan ve Watnick 2009, Rowe ve diğ. 2010, Kostakioti ve diğ. 2013).
Biyofilm oluşturmuş bakteriler planktonik formlarıyla kıyaslandığında, birçok antimikrobiyal maddeye karşı yüksek oranda dirençli hale gelebilmektedir. Bu dirençlilik oranı, bazı antibiyotikler için 1000 katın üzerine çıkabilmektedir (Ceri ve diğ. 1999). Biyofilm oluşturmuş bakterinin planktonik hücrelere göre daha fazla dirençli olmalarının birçok nedeni bulunmaktadır. Bu temel nedenler; (1) ekstrasellüler matriksten dolayı antimikrobiyal maddenin difüzyonun kısıtlanması, (2) topluluk içerisinde direnç genlerinin aktarılabilmesi, (3) metal iyon konsantrasyonu ve pH değerlerine bağlı olarak eflüks pompalarının ekspresyonu ve antibiyotiklerin inaktivasyonu, (4) çevresel etkenler ve besin sınırlaması nedeniyle bakterilerin metabolik aktivite ve büyüme özellikleri gibi fizyolojik özelliklerinin değişimi, (5) biyofilm içerisinde metabolik özellikleri kısmen inaktif hale gelmiş ve bölünme eğiliminde olmayan persistan hücrelerin bulunması ve (6) biyofilm fenotipinin indüksiyonudur (Delcaru ve diğ. 2016).
UPEC suşları, üriner kateter, böbrek veya mesane taşı gibi abiyotik yüzeylere bağlanarak ya da üriner sistemde fiziksel bir tıkanıklık bulunduğunda, hücre dışı bir biyofilm oluşturabilmektedir. Bunun haricinde, "biyofilm benzeri hücre içi bakteriyel topluluk" adı verilen ve belirli konak hücreleri içerisinde oluşan biyofilm benzeri yığınlar da söz konusudur (Flores-Mireles ve diğ. 2015).
Son yıllarda yapılan araştırmalar, hücre içerisine girmeden enfeksiyon oluşturduğu düşünülen birçok patojenin, konak hücresi içerisinde biyofilm benzeri bir yapı oluşturarak ve hücre içi yaşama adaptasyon sağlayarak persistan hale gelebildiğini göstermektedir (Kostakioti ve diğ. 2013). Bu yapı, "biyofilm benzeri hücre içi bakteriyel topluluk" olarak adlandırılmaktadır ve ilk olarak UPEC izolatlarında belirlenmiştir. Biyofilm benzeri hücre içi bakteriyel topluluk, özellikle enfeksiyonun akut fazında önem teşkil etmektedir (Mulvey ve diğ. 1998, Anderson ve diğ. 2003, Hannan ve diğ. 2010). Biyofilm benzeri hücre içi bakteriyel topluluk gelişimi, çeşitli morfolojik süreçlerden oluşmaktadır; gerçekleştirilen fare inokülasyonu deneylerinde, bu durum gözlemlenebilmiştir (Justice ve diğ. 2004, Kostakioti ve diğ. 2013). Mesane inokülasyonun ardından ilk 6 saatte UPEC izolatı hızla (bölünme süresi 30-35 dakika) bölünme eğilimindedir ve mesanede gevşek bağlantılı basillerin küçük kümeleri oluşur. Bu durum erken hücre içi bakteriyel topluluk olarak adlandırılmaktadır (Justice ve diğ. 2004, Kostakioti ve diğ. 2013). UPEC izolatları, tip I fimbria ve muhtemelen diğer adezinler vasıtasıyla, şemsiye hücrelerinin yüzeyindeki
8
üroplakin reseptörlerine tutunmaktadırlar (Sihra ve diğ. 2018). Ardından, sıkı bir paket haline gelen ve ortalama 0,7 µm uzunluğunda kokoid hücrelerden oluşan kümeler meydana gelir. Altı-sekiz saat sonrasında, hücre bölünme süresi 60 dakikanın üzerine çıkarak dramatik bir şekilde yükselir. Bu aşamada bakteri sıkı bir şekilde paketlenmiştir ve hücre içinde olgunlaşmış hücre içi bakteriyel topluluğu içeren organize bir küre oluşturmuştur (Justice ve diğ. 2004, Kostakioti ve diğ. 2013). Enfekte bir mesanede hücre içi bakteri topluluklarının sayısı 3 ile 700 arasında değişebilmektedir. Her bir hücre içi bakteri topluluğu klonaldır ve 104
- 105 bakteriden oluşmaktadır (Anderson ve diğ. 2003, Schwartz ve diğ. 2011). Hücre içi bakteri toplulukları, abiyotik yüzey biyofilmindeki ekstrasellüler matrikse benzer bir yapıyı barındırmaktadır. Ekzopolisakkaritler, hücre içi biyofilm topluluğunu nötrofillerden korumak için bu ekstrasellüer matrikste bulunur (Anderson ve diğ. 2010).
Biyofilm benzeri hücre içi bakteri topluluğu genişledikçe, enfekte konak hücresinin membranını dışa doğru iterek ayak benzeri bir çıkıntı oluşmasına sebep olur (Anderson ve diğ. 2003). Bunun sonucunda hücre içi bakteri topluluğundaki UPEC, tek basiller veya filamentler halinde enfekte hücreden ayrılabilir ve naif epitel hücrelerine tekrar tutunabilir. Böylelikle, önceden enfekte olmamış bir epitel hücresin içerisine girerek biyofilm benzeri hücre içi topluluğunun oluşumunu başlatabilir. Alternatif olarak, epitelin tekrar enfeksiyonu sonucu pasif hücre içi rezervuarlar oluşturulabilir. Pasif hücre içi rezervuarlar, 4-10 bakteriden oluşurlar. Bu rezervuarların içerisindeki bakteriler bölünmeme eğilimindedirler ve aylarca hücre içerisinde kalarak rekürrense sebep olabilmektedirler. Morfoloji değişikliği ile oluşan bu filamentöz hücreler, aynı zamanda nötrofillere karşı dayanıklılık sağlarlar (Flores-Mireles ve diğ. 2015). Biyofilm benzeri hücre içi bakteri topluluğunun, böyle mekanizmalarla kronik enfeksiyon gelişiminde önemli bir role sahip olduğu bilinmektedir (Hannan ve diğ. 2010). Biyofilm benzeri hücre içi bakteri topluluğunun, abiyotik yüzeylerde oluşan biyofilm konusunda da benzer özellikler gösterdiği ve çok benzer mekanizmalarla bakterinin antibiyotik direncini arttırdığı bilinmektedir (Flores-Mireles ve diğ. 2015). Biyofilm benzeri hücre içi bakteriyel topluluğun oluşum basamakları, Çizim 1. 2.' de gösterilmiştir.
9
Çizim 1.2. Biyofilm benzeri hücre içi toplulukların oluşum basamakları. Perianal bölgenin kolonizasyonu (1), mesaneye göç (2), üroplakine tutunma ve hücre içerisine giriş (3), bakteri çoğalması ve hücre içi bakteri topluluğunun oluşumu (4), filamentöz hücrelerin salınımı, komşu hücrelerin invazyonu ile hücre içi bakteri topluluğunun enfekte edilen yeni hücrede oluşturulması veya aylarca canlı kalabilen pasif hücre içi rezervuarların oluşumu (5). Sihra ve diğ (2018)' den alınmıştır.
Biyofilmin belirlenebilmesi için çok sayıda sistem geliştirilmiştir. Besin aktarımına bağlı olarak, bu sistemler iki temel grup altında toplanmaktadır; kapalı (kesikli) ve açık (sürekli) sistemler (McBain 2009). Kapalı sistemler genel olarak daha basit ve uygulanabilirken, açık sistemler büyüme parametrelerinin ve dinamiklerinin daha iyi kontrol edilmesine olanak verebilmektedir (Lourenço ve diğ. 2014, Macia ve diğ. 2014). Kapalı sistemlere örnek olarak kuyucuk temelli mikroplaklar, peg çıkıntısı içeren kapaklar ile oluşturulan Calgary biofilm device ve biyofilm ring testi verilebilir. Açık sistemlerde ise CDC biyofilm reaktörü, akışkan-hücre çemberi, drip flow biofilm reaktörü bulunmaktadır. Yöntemlerin birbirlerine karşı avantajları ve/veya dezavantajları bulunmakta, amaca uygun yöntemin seçilmesi önemlidir (Macia ve diğ. 2014, Azeredo ve diğ. 2017). Bu yöntemlerin bazıları, biyofilmde antimikrobiyal duyarlılığın belirlenebilmesi için kullanılabilmektedir. Kapalı yöntemlerden kuyucuk temelli plaklar ve peg çıkıntısı içeren kapaklar ile açık yöntemlerden akışkan-hücre modeli ve suspended substratum reaktörü, antimikrobiyal duyarlılığın belirlenebildiği biyofilm yötemlerine örnek olarak verilebilir (Macia ve diğ. 2014). Çizelge 1. 1.' de biyofilm belirleme sistemlerinden bazıları gösterilmiştir.
10
Çizelge 1.1. Yaygın kullanılan biyofilm belirleme sistemleri. Sistem Adı Sistem Özelliği Genel Uygulama Alanı
Mikroplak Sistemi Kapalı Biyofilm oluşturma kapasitesinin araştırılması, Antimikrobiyal duyarlılık
Calgary biofilm device
Kapalı Biyofilm oluşturma kapasitesinin araştırılması, Antimikrobiyal duyarlılık
Biofilm Ring Test Açık/Kapalı Biyofilm oluşturma kapasitesinin araştırılması, Antimikrobiyal duyarlılık
Drip Flow Biofilm Reactor
Açık Lamlarda düşük kayma gerilimi varlığında biyofilm oluşumunun gözlemlenmesi ve kantifikasyonu Flow Chamber Açık Sürekli taze besiyeri varlığında düşük sayılı
biyofilmin belirlenmesi
Sistemlerde oluşturulan biyofilmin varlığının gösterilebilmesi için, farklı biyofilm belirleme yöntemleri bulunmaktadır. Bu yöntemler mikrobiyolojik, moleküler, fiziksel ve kimyasal yöntemler olarak tanımlanmıştır (Azeredo ve diğ. 2017). Özellikle antimikrobiyal duyarlılık belirlenmesinde biyofilmin canlılığını belirlemeye yönelik canlı hücre sayım yöntemleri ve metabolik aktivite belirlemeye yönelik kimyasal yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır. Biyofilm biyokütlesi, canlılığı ve ekstrasellüler polimerik madde ölçümü için kullanılan yöntemler, Çizelge 1. 2.' de gösterilmiştir.
Kuyu temelli mikroplak sistemlerinde, genel olarak metabolik aktiviteyi belirlemeye yönelik olan XTT (2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)karbonil]-2H-tetrazolyum hidroksit) ve total biyokütleyi belirlemeye yönelik kristal viyole gibi boyama yönemleri kullanılmaktadır (Sule ve diğ. 2009, Azeredo ve diğ. 2017). Peg çıkıntısı içeren plak kapağı sistemlerinde biyofilm yoğunluğu ise peg başına düşen canlı hücre sayısı vasıtasıyla belirlenmektedir (Harrison ve diğ. 2010, Azeredo ve diğ. 2017). Peg temelli yöntemler, alternatif mikroskobik ve boyama yöntemleriyle birleştirilebilmektedir (Harrison ve diğ. 2010). Çizelge 1. 3.' de in vitro biyofilmin antimikrobiyal duyarlılığının belirlenmesinde sıklıkla kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması gösterilmiştir (Macia ve diğ. 2014).
11
Çizelge 1.2. Biyofilm biyokütlesi, canlı hücre sayısı ve ekstrasellüler polimerik madde belirlenmesi için kullanılan yöntemler.
Yöntem Ölçüm Özelliği
Mikrobiyolojik Yöntemler
Koloni Oluşturan Birim Canlı hücre sayısı Moleküler Yöntemler
qPCR Biyokütle
PMA-qPCR Canlı hücre sayısı
Fiziksel Yöntemler
Ağırlık Biyokütle
Elektrokimyasal empedans spektroskopi Biyokütle Kimyasal Yöntemler
Biyokütle belirleme için mikroplak boyama Biyokütle
Metabolik aktivite belirleme için mikroplak boyama Canlı hücre sayısı EPM Ölçümü Yöntemleri
EPM ekstraksiyonu
EPM belirlenmesi KTLM+FLBA
Anti-EPM komponent antikorları
qPCR, Kantitatif Polimeraz Zincirleme Tepkimesi; PMA, propidyum monoazid; EPM, ekstrasellüler polimerik madde; KTLM, konfokal taramalı lazer mikroskobi; FLBA, floresan lektin
12
Çizelge 1.3. In vitro biyofilmin antimikrobiyal duyarlılığının belirlenmesinde sıklıkla kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması. Macia ve diğ. (2014)' den alınmıştır.
Parametreler Biyofilm Modeli
Mikroplak Yöntemi Peg Temelli Kapak Akışkan-Hücre Modeli
Suspended Substratum Reaktörü
Besin Aktarımı Kapalı Sistem Kapalı Sistem Açık Sistem Açık Sistem
Biyofilm Oluşumu Kuyulara tutunma Peg çıkıntılara tutunma Cam yüzeye (lama) tutunma
Kuponlara tutunma
Antibiyogram Kuyular antibiyotikle inkübe edilir Günlük besiyeri değişimi Peg çıkıntılar antibiyotikle inkübe edilir Günlük besiyeri değişimi Besiyeri şişesine antibiyotik eklenir ve istenilen süre akışta tutulur Sıvı faza antibiyotik eklenir ve tüm kuponlar eş zamanlı olarak inkübe edilir Biyokütle/KOB Sayımı KV (veya XTT) boyama OD belirleme Santrifüj veya sonikasyonla biyofilm aktarımı OD belirleme veya gözle değerlendirme Onar kat dilüsyon ve sayım
Boncuklarla yıkayarak biyofilm aktarımı
Onar kat dilüsyon ve sayım
Vorteks veya sonikasyonla biyofilm aktarımı
Onar kat dilüsyon vesayım
Mikroskobik Analiz SEM
Canlı/ölü hücre görüntüsü SEM KTLM Boyama ve fiksasyon ihtiyacı olabilir Floresan proteinle işaretli bakterinin görüntülenmesi SEM KTLM
Boyama ihtiyacı olabilir
Yapısal Analiz Tanımlanmamıştır Üç boyutlu
görüntüleme ve canlı-ölü hücre görüntüsü Özel yazılımla biyokütle, kalınlık, pürüzlülük analizleri Üç boyutlu görüntüleme ve canlı-ölü hücre görüntüsü Karakteristik Özellikler Uygulanabilir ve tekrarlanabilir Kontaminasyon riski düşük Biyofilm kalınlığı <50µm Uygulanabilir ve tekrarlanabilir Kontaminasyon riski çok düşük Biyofilm kalınlığı <50µm Hücre yıkımı olmaksızın gerçek zamanlı görüntüleme Biyofilm kalınlığı >50µm Biyofilmden ayrılan planktonik hücrelerin ve biyofilmdeki sessil hücrelerin eş zamanlı analizi Denenen Mikroorganizmalar Staphylococcus aureus Candida albicans Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Mycobacterium spp. Candida spp. Burkholderia spp. Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. Pseudomonas aeruginosa Candida spp. Staphylococcus spp.
KOB, koloni oluşturan birim; KV, kristal viyole; XTT, 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)karbonil]-2H-tetrazolyum hidroksit; OD, optik dansite; SEM, taramalı elektron mikroskobu; KTLM, konfokal taramalı lazer mikrosobu.
13 2. AMAÇ
Günümüzde, Escherichia coli (E. coli)' ye bağlı üriner sistem enfeksiyonlarında rekürrense çok sık rastlanmaktadır. Bu nedenle, organizmanın virülansının belirlenmesine yönelik çok sayıda çalışma mevcuttur (Antao ve diğ. 2009, Banerjee ve diğ. 2013, Er ve diğ. 2015). Organizmaya ait yüksek direnç ve dolayısıyla tedavi başarısızlıklarının önüne geçebilmek için, biyofilm oluşum basamaklarını da içeren bazı spesifik virülans faktörlerine karşı, anti-virülans yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu sebeple oluşturulmuş çeşitli protein, bileşik ve bunun gibi ürünleri kapsayan virülans ve anti-biyofilm maddeler mevcuttur (Pinkner ve diğ. 2006, Cegelski ve diğ. 2009, Roy ve diğ. 2018). Fakat bu maddelerden E. coli' ye bağlı üriner sistem enfeksiyonu tedavisinde, aktif olarak kullanılanı henüz bulunmamaktadır.
Anti-virülans yaklaşımlar umut vaat etmektedir fakat henüz klinikte kullanımının olmaması sebebiyle hastalar, mevcut antibiyotiklerle ve bunların kombinasyonlarıyla tedavi edilmeye çalışılmaktadır. Enfeksiyona sebep olan bakterinin antibiyotiklere karşı çoğunlukla dirençli olması sebebiyle, tedavi başarısızlıkları söz konusudur (Can ve diğ. 2015).
E. coli dışındaki bazı bakterilerle gerçekleştirilen ve hayvan modellerini kapsayan çalışmalar, bakterisidal aktivitesi olmayan ürünlerle biyofilmin hızlı bir biçimde yıkımının sepsis ve bakteriyemi gibi risklere sebep olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, yakın gelecekte anti-biyofilm stratejiler geliştirilse dahi bu stratejilerin içinde belirli bir süre antibiyotik kombinasyonlarının olması gerektiği düşünülmektedir (Fleming ve Rumbaugh 2018).
Tedavi başarısızlıklarının bir diğer sebebi, rutin antimikrobiyal duyarlılık testlerinin, in vivo bakteriyi inhibe edecek gerçek değerin belirlenmesinde yeterli olamama durumudur. Rutin in vitro duyarlılık testleri, sadece planktonik hücreye ait duyarlılık konsantrasyonlarını belirleyebilmektedir fakat E. coli ve diğer birçok bakteri, hücre içi biyofilm benzeri yapı ve biyofilm oluşturabilmektedir. Biyofilm oluşturmuş durumdaki bakterinin, planktonik hücreye göre çok daha fazla dirençli olduğu bilinen bir durumdur. Bu direnç, bazı antibiyotikler için 1000 katın üstüne çıkabilmektedir (Ceri ve diğ. 1999). Bu nedenle, rutin testlerle elde edilen minimum inhibisyon konsantrasyon değerlerine göre gerçekleştirilen tedaviyle bakteri eradike edilememektedir. Bu durumun üstesinden
14
gelebilmek için, rutine uyarlanabilen ve bakterinin minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunu belirlemeye yönelik testler geliştirilmesi elzemdir.
Minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu belirlemede, rutin laboratuvarda uygulaması en kolay sistemin, yüksek-verimli olarak tanımlanan Calgary biyofilm aracı olduğu düşünülmektedir. Calgary biyofilm aracı, plak kapağındaki pinlerde biyofilm üretiminin sağlandığı bir mikroplak sistemidir (Azeredo ve diğ. 2017). Her ne kadar tekniğin uygulanmasında zorluklar bulunsa da, yapılan çalışmalarla tekniğin rutine uygun bir biçimde optimize edilebilmesi muhtemeldir (Harrison ve diğ. 2010).
Çalışmamızın amacı, üriner sistem enfeksiyonu etkeni olarak tanımlanmış ve filogenetik grupları belirlenmiş E. coli izolatlarının minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonlarının belirlenmesi ve bu verilerin minimum inhibisyon konsantrasyonu değerleriyle kıyaslanmasıdır. Daha önceki bir çalışmada 4 temel filogenetik gruba (A, B1, B2 ve D) ayrılmış olan ve ayrıca bilinen en önemli pandemik dirençli klonlardan B2-ST131 olarak tanımlanmış olan E. coli izolatları çalışmaya alınmıştır. Çalışmamızda, bir plak ve peglere sahip bir plak kapağı sistemi kullanılacaktır. Böylelikle, ülkemizde sıklıkla tercih edilen ve/veya kullanımı uluslararası kılavuzlarca önerilen antibiyotiklerin, biyofilm üzerine etkisinin araştırılması hedeflenmiştir.
15 3. YÖNTEM
3.1. Örnek Seçimi ve Etik Kurul Onayı
Kocaeli Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu' na "Etik Kurul Onayı" için başvurulmuştur. KÜ GOKAEK 2017/165 proje numarasıyla ve KÜ GOKAEK 2017/8.24 karar numarasıyla, çalışmanın gerçekleştirilmesinde etik sakınca bulunmadığı kararı, 07.06.2017 tarihinde tarafımıza bildirilmiştir. Teze daha önceki bir projeden (TÜBİTAK 215S136 - Üriner Sistem Enfeksiyonu Etkeni Olan Escherichia coli İzolatlarında, ST131 Sekans Tipinin ve Alt Klonlarının Belirlenmesi) elde edilen semptomatik üriner sistem enfeksiyonu etkeni E. coli izolatları dahil edilmiştir.
Çalışmada, toplam 79 (39 ST131 ve 40 ST131 dışı E. coli izolatı) izolat kullanılmıştır. ST131 dışı E. coli izolatlarının 10 tanesi A, 10 tanesi B1, 10 tanesi B2 ve 10 tanesi D filogenetik grubuna dahildir. İzolatların filogenetik grupları ve ST131 durumu, daha önceki projede tanımlanmıştır; filogenetik gruplar, çoklu PCR kullanılarak belirlenmiştir (Clermont ve diğ. 2000, Er ve diğ. 2015). ST131 klonal grup tanımlaması ise iki farklı PCR temelli (ST131 ile ilişkili O25b ve O16 rbf varyantların saptanması için çoklu PCR ve mdh ve gyr genlerindeki tek nükleotid polimorfizmine (SNP) spesifik çoklu PCR) yöntemle gerçekleştirilmiştir (Clermont ve diğ. 2007, Johnson ve diğ. 2009, Er ve diğ. 2015).
İzolatlar, Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı' ndan 01.12.2015 - 29.05.2016 tarihleri arasında toplanmıştır. İzolatların identifikasyonu, Vitek 2 (BioMérieux, Fransa) ve Vitek MS (BioMérieux, Fransa) sistemleri ile gerçekleştirilmiştir. DNA izolasyonu, filogenetik gruplama, ST131 klonal grubunun tanımlanması, minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) ve minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonlarının (MBEK) araştırılması işlemleri, Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı' nda gerçekleştirilmiştir. Örnekler, %15 gliserol içeren Triptik Soy Buyyon (TSB) (Merck, Almanya) besiyerinde -80°C' de medikal tip dondurucuda (Sanyo, Japonya) saklanmışlardır.
16
3.2. Tampon Çözeltilerin, Besiyerlerinin ve Ayraçların Hazırlanması
3.2.1. Eozin - Metilen Mavisi (EMB) Agar Besiyeri
EMB agar (Merck, Almanya), ticari olarak satın alınmıştır ve üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyeri 121°C' de 15 dakika otoklavla (Alp, Türkiye) steril edilmiştir, 45-50°C' ye kadar soğutulmuştur ve steril petri kutularına ~4mm kalınlıkta olacak şekilde aseptik şartlarda dökülmüştür. Plaklar oda sıcaklığında düz bir zeminde katılaşmaya bırakılmıştır. Petriler kullanılıncaya kadar +4°C' de buzdolabında (Arçelik, Türkiye) saklanmıştır.
3.2.2. Gliserollü (%15) Triptik Soy Broth (TSB) Besiyeri
TSB, ticari olarak satın alınmıştır ve üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyerine eklenen su %15 eksik koyularak gliserol (Merck, Almanya) ile tamamlanmıştır. Besiyeri 121°C' de 15 dakika otoklavla steril edilmiştir. Steril hale gelmiş besiyeri, otomatik pipet (Eppendorf, Almanya) yardımıyla 1.5 ml' lik mikrosantrifüj tüplerine ~1 ml olacak şekilde aseptik şartlarda dağıtılmıştır. Tüpler kullanılıncaya kadar +4°C' de buzdolabında saklanmıştır.
3.2.3. Luria-Bertani (LB) Broth Besiyeri
LB Broth (Becton Dickinson, ABD) ticari olarak satın alınmıştır ve üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyeri 121°C' de 15 dakika otoklavla (Alp, Türkiye) steril edilmiştir. Steril hale gelmiş besiyeri, otomatik pipet yardımıyla 1.5 ml' lik mikrosantrifüj tüplerine ~1 ml olacak şekilde aseptik şartlarda dağıtılmıştır. Tüpler kullanılıncaya kadar +4°C' de buzdolabında saklanmıştır.
3.2.4. Mueller-Hinton Broth (MHB) Besiyeri
MHB (Merck, Almanya) ticari olarak satın alınmıştır ve üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyeri eritildikten sonra, otomatik pipet (Eppendorf, Almanya) yardımıyla cam tüplere 5 ml olacak şekilde dağıtılmıştır ve ağızları pamukla
17
kapatılmıştır. Besiyerlerini içeren tüpler 121 °C' de 15 dakika otoklavla steril edilmiştir. Tüpler kullanılıncaya kadar +4°C' de buzdolabında saklanmıştır.
Katyon ayarlı Mueller-Hinton Besiyeri (KA-MHB) ise Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) önerileri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyeri 121 °C' de 15 dakika otoklavla steril edilip 45-50°C' ye kadar soğutulmuştur. Önceden hazırlanan 10' ar mg/ml kalsiyum ve magnezyum çözeltileri aseptik şartlarda otomatik pipet kullanılarak besiyerine ilave edilmiştir. Besiyerinin kalsiyum son konsantrasyonu 22,5 mg/L ve magnezyum son konsantrasyonu 11,25 mg/L olacak şekilde ayarlanmıştır (CLSI 2006). KA-MHB besiyeri, MİK ve MBEK belirlemek için antimikrobiyal duyarlılık testlerinde kullanılmıştır. Besiyeri, kullanım öncesi taze olarak hazırlanmıştır.
3.2.5. Triptik Soy Agar (TSA) Besiyeri
TSA (Merck, Almanya), ticari olarak satın alınmıştır ve üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyeri 121°C' de 15 dakika otoklavla steril edilmiştir, 45-50°C' ye kadar soğutulmuştur ve steril petri kutularına ~4mm kalınlıkta olacak şekilde aseptik şartlarda dökülmüştür. Plaklar, oda sıcaklığında düz bir zeminde katılaşmaya bırakılmış ve petriler kullanılıncaya kadar +4°C' de buzdolabında saklanmıştır.
3.2.6. Triptik Soy Broth (TSB) Besiyeri
TSB (Merck, Almanya) ticari olarak satın alınmıştır ve üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda hazırlanmıştır. Besiyeri eritildikten sonra 121°C' de 15 dakika otoklavla steril edilmiştir. TSB besiyeri, bakteri biyofilm oluşturma deneyleri ve MBEK belirleme deneylerinde kullanılmıştır. Kullanım öncesi taze olarak hazırlanmıştır.
3.2.7. Reaktif ve Tampon Çözeltilerin Hazırlanması
Deneylerde kullanılan reaktif ve tampon çözeltiler, Çizelge 3. 1.' de belirtildikleri şekilde hazırlanmıştır.
18 Çizelge 3.1. Reaktif ve tampon çözeltiler. Reaktif veya Çözelti Adı Konsantrasyonu ve Miktarı Hazırlanışı 0,5 McFarland Standardı
100 ml 0,18 mol/L H2SO4 çözeltisinden 99,5 ml ve 0,048 mol/L BaCl2 çözeltisinden 0,5 ml karıştırılmıştır. Spektrofotometre (Shimadzu, Japonya) ile 625 nm' de absorbansı okunmuştur.
Amoksisilin trihidrat 10 mg/ml 1 ml steril DMSO içerisinde 10 mg amoksisilin trihidrat çözülmüştür.
Ca++ 10 mg/ml 3,68 g CaCl2.2 H2O 100 ml suda çözülmüştür ve 0,2 µm' lik filtre ile steril edilmiştir.
Gentamisin sülfat 10 mg/ml 1 ml steril distile su içerisinde 10 mg gentamisin sülfat çözülmüştür.
Mg++ 10 mg/ml 8,36 g MgCl2.6 H2O 100 ml suda çözülmüştür ve 0,2 µm' lik filtre ile steril edilmiştir.
Kristal Viyole Çözeltisi
%0,1 0,1 g kristal viyole tartılarak, 100 ml steril distile suda çözülmüştür.
Lityum klavulonat 10 mg/ml 1 ml Sodyum Fosfat (pH=6,0) içerisinde 10 mg lityum klavulonat çözülmüştür.
Nitrofurantoin 10 mg/ml 1 ml steril DMSO içerisinde 10 mg nitrofurantoin çözülmüştür.
Seftriakson sodyum 10 mg/ml 1 ml steril distile su içerisinde 10 mg seftriakson sodyum çözülmüştür.
Siprofloksasin 10 mg/ml 900 µl distile su içerisine 10 mg siprofloksasin eklenmiştir ve 0,1 M sodyum hidroksit çözeltisi damlatılarak çözülmüştür. Eksik kalan kısım steril distile su ile tamamlanmıştır. Sodyum Fosfat
Tamponu, pH 6,0
0,1 M 3,67 g Na2HPO4.7H2O ve 11,91 g
NaH2PO4.H2O tartılarak 800 ml distile suda çözülmüştür. pH ayarlanarak 1000 ml' ye distile suyla tamamlanmıştır ve 0,2 µm' lik filtre ile steril edilmiştir.
19 Çizelge 3.1. Rekatif ve tampon çözeltiler (devam). Reaktif veya
Çözelti Adı
Konsantrasyonu ve Miktarı
Hazırlanışı
Sodyum Hidroksit 0,1 M 0,2 g sodyum hidroksit tartılarak 45 ml steril distile su içerisinde çözülmüştür. Steril distile su eklenerek 50 ml' ye tamamlanmıştır.
Sulfametoksazol 50 mg/ml 1 ml steril DMSO içerisinde 50 mg sulfametoksazol çözülmüştür.
Trimetoprim 10 mg/ml 1 ml steril DMSO içerisinde 10 mg trimetoprim çözülmüştür.
3.3. Biyofilm Deneyleri
Çalışılacak örnekler, -80 °C’ den çıkartılarak EMB agara aseptik şartlar altında tek koloni düşürme yöntemi ile pasajlanmışlardır. 37±2 °C’ de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde (Nüve, Türkiye) inkübe edilmiştir. Seçici besiyerinde gerçekleştirilen deneyler, bakterilerin biyofilm oluşturma özelliklerini etkileyebilmektedir (Harrison ve diğ. 2010). Bu nedenle, EMB Agar' da üreyen suşlardan TSA besiyerine tek koloni düşürme yöntemiyle ekim yapılmıştır ve 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübasyonun sonunda bu plaklardan biyofilm deneylerine geçilmiştir.
3.3.1. Biyofilm Oluşturma Yönteminin Denenmesi
Gerçekleştirilen biyofilm oluşturma ve biyofilmde antimikrobiyal duyarlılık araştırma deneyleri, ELISA plağı temellidir. Biyofilm oluşumu, 96 kuyucuklu Nunc MicroWell hücre kültürü plağında (Thermo Fisher Scientific, ABD) ve bu plağa uygun pegleri (çıkıntıları) içeren Nunc ImmunoTSP lid (Thermo Fisher Scientific, ABD) kapaklarla sağlanmıştır. (Harrison ve diğ. 2010). Kuyucuklara alınan belirli konsantrasyondaki planktonik bakterinin, plak kapağındaki peglere tutunarak biyofilm oluşturması beklenmektedir. Çizim 3. 1.' de pegleri içeren plak kapağı ve plağın yandan görünüşü gösterilmiştir.
20
Çizim 3.1. Pegleri içeren plak kapağı ve plağın yandan görünüşü.
Biyofilm oluşumunun denenmesi için, öncelikle az sayıda fakat bütün grupları içeren örneklerle bir deney tasarlanmıştır. A grubundan 1 izolat, B1 grubundan 1 izolat, D grubundan 1 izolat, B2-ST131 dışı 1 izolat, ST131 klonal grubundan 4 izolat, kontrol için E. coli ATCC 25922 ve ST131 pozitif kontrol suşu olarak daha önceki bir çalışmada kullanılan MVAST0004 suşunu içeren toplam 10 izolat ilk çalışmaya dahil edilmiştir (Er ve diğ. 2015). Gerçekleştirilen bu ilk çalışmanın amacı, mevcut sistemle biyofilm oluşumunun sağlanabilirliğini belirlemektir.
TSA besiyerine pasajlanan 10 farklı suş, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda inkübe edilmiştir. Her bir suş için steril tüpler içerisindeki serum fizyolojik ile 0,5 McFarland standardı hazırlanmıştır. McFarland standardı, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) önerileri doğrultusunda oluşturulmuştur (CLSI 2006). Hazırlanan süspansiyonların her birinden 1 ml alınarak, her bir suş için 29 ml TSB besiyeri içeren tüplere inoküle edilmiştir ve böylelikle 1:30 dilüsyon yapılmıştır. Bu tüplerden 150 µl çekilerek 96 kuyucuklu, düz tabanlı Nunc MicroWell hücre kültürü plağında 3 farklı kuyucuğa inokülasyon gerçekleştirilmiştir. Sıvı hacmi olarak 150 µl tercih edilmesinin nedeni, sonraki basamaklarda çalkalama işleminin uygulanacak olmasıdır (Harrison ve diğ. 2010). Negatif kontrol amacıyla, bakteri inoküle edilmemiş 150 µl TSB besiyeri kullanılmıştır. Deneyde tek bir hücre kültür plağı kullanılmıştır. Bu plağın kapağı kaldırılmış ve daha sonraki çalışmalar için saklanmıştır. Plak kapağı olarak, biyofilmin oluşturulacağı pegleri içeren Nunc ImmunoTSP kapaklar kapatılmıştır ve etrafı parafilmle sarılmıştır. Plak, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda, 100 rpm' de orbital çalkalamalı etüvde (Labnet, ABD) inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası plaktaki bulanıklık, Çizim 3. 2.' de gösterilmiştir.
21
İnkübasyon sonunda ayrı bir plak olarak yıkama plağı hazırlanmıştır. Yıkama plağı için, Nunc MicroWell hücre kültürü plağı kullanılmıştır. Yıkama tamponu olarak 200 µl steril serum fizyolojik kullanılmıştır. İnokulumların denk geldiği kuyucuklara, 200 µl yıkama tamponu ilave edilmiştir. Biyofilm oluşmuş plak kapağı aseptik şartlarda kaldırılarak yıkama plağı üzerine kapatılmıştır ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Bu basamak ile peglerdeki planktonik hücrelerin uzaklaştırılarak sadece peglere tutunan bakterilerin kalması planlanmıştır (Harrison ve diğ. 2010).
Çizim 3.2. İnkübasyon sonrası plağın ve kapağın görüntüsü (görüntü plağın altından alınmıştır).
Ardından, peg üzerindeki biyofilmin boyanması için kristal viyole çözeltisi kullanılmıştır ve protokolde minör modifikasyonlar gerçekleştirilmiştir (O'Toole 2011). Bu işlemin amacı, elde edilen biyofilmin görsel olarak belirlenmesidir. On beş ml' lik steril bir falkon tüpte %0,1' lik kristal viyole çözeltisi hazırlanmıştır. Ayrı bir plak aseptik şartlarda açılarak biyofilmin oluşturulduğu ve negatif kontrolün bulunduğu ilgili kuyucuklara %0,1' lik kristal viyole çözeltisinden 200 µl eklenmiştir. Yıkama plağından aseptik şartlarda alınan plak kapağı, boya çözeltisi olan plağa kapatılmış ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletilmiştir. Bir başka plak, ilgili kuyucuklara 200 µl steril serum fizyolojik eklenerek boya yıkama plağı olarak hazırlanmıştır. Boyada bekletilen plak kapağı bu plağa kapatılmıştır. Beş dakikalık oda sıcaklığında yıkama işleminin ardından, plak kapağı görsel olarak incelenmiştir.
22 3.3.2. Canlı Hücre Sayısının Belirlenmesi
Farklı izolatların aynı oranda biyofilm oluşturduğunu belirlemek için, biyofilm içerisindeki canlı hücre sayısının araştırılması gerekmektedir (Harrison ve diğ. 2010). Ayrıca optimum bir antimikrobiyal duyarlılık testi için, antimikrobiyal madde solüsyonu - bakteri oranını sabit bir hale getirerek korumak gerekmektedir. Bu gibi nedenlerle, mevcut deney ile farklı suşlara ait canlı hücre sayımının yapılması hedeflenmiştir.
Toplam 40 izolat (39 ST131 izolatı ve E. coli ATCC 25922 suşu), mevcut deneye dahil edilmiştir. E. coli ATCC 25922 suşu baştaki ve sondaki kuyucuklarda çalışılmıştır. Standart suş çift kuyucukta çalışılarak, sapma hakkında fikir elde edilmesi planlanmıştır. Negatif kontrol olarak boş TSB besiyeri kullanılmıştır. Toplamda 42 kuyucuk ilk sıradan itibaren dizilerek çalışılmıştır. Deneye ait plak şeması, Çizelge 3. 2.' de gösterilmiştir.
Çizelge 3.2. Canlı hücre sayısı plak şeması. Her kuyucuk bir izolat numarasıyla numaralandırılmıştır. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A ATCC 52 30 54 5 10 81 92 93 94 63 101 B 120 128 130 137 141 142 69 159 160 162 166 169 C 177 179 184 186 200 202 208 211 232 234 32 58 D 249 252 275 290 ATCC NK E F G H
ATCC, E. coli ATCC 25922; NK, negatif kontrol.
TSA besiyerine pasajlanan 40 farklı suş, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir. Her bir suş için steril tüpler içerisindeki serum fizyolojik ile 0,5 McFarland standardı hazırlanmıştır. Hazırlanan süspansiyonların her birinden 0,1 ml alınarak, her bir suş için 2,9 ml TSB besiyeri içeren tüplere inoküle edilmiştir. Bu tüplerden 150 µl çekilerek hücre kültür plağına ilgili kuyucuklara inokülasyon gerçekleştirilmiştir. Negatif kontrol amacıyla, bakteri inoküle edilmemiş 150 µl TSB besiyeri inoküle edilmiştir. Bu plağın kapağı kaldırılmış ve daha sonraki çalışmalar için saklanmıştır. Plağa, pegleri içeren kapaklar kapatılmıştır ve etrafı parafilmle sarılmıştır.
23
Plak, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda ve 100 rpm' de orbital çalkalamalı etüvde inkübe edilmiştir. Deneyin gerçekleştirilen ikinci tekrarında, çalkalama hızı 115 rpm' e çıkarılmıştır. Diğer tekrarlarda da 115 rpm kullanılmıştır.
İnkübasyon sonunda farklı bir plağın ilgili kuyucuklarına 200 µl steril serum fizyolojik eklenerek bir yıkama plağı oluşturulmuştur. Yıkama plağının kapağı kaldırılarak, sonraki kısımlar için saklanmıştır. Biyofilm oluşturulmuş pegleri içeren plak kapağı, yıkama plağına alınarak 1 dakika süreyle oda sıcaklığında yıkamaya alınmıştır. Eş zamanlı olarak, başka bir plakta ilgili kuyucuklara 200 μl TSB besiyeri ilave edilmiştir. Yıkama işleminin sonunda plak kapağı kaldırılarak TSB içeren plağa kapatılmıştır. Etrafı parafilmle çevrilmiş ve 10 dakika ultrasonik banyoda (Branson, ABD) oda sıcaklığında sonikasyon işlemine alınmıştır (Ceri ve diğ. 1999, Harrison ve diğ. 2010). Sonikasyon işleminde, içerisine su girmeyen bir çelik tepsi (Branson, ABD) kullanılmıştır. Ultrasonik banyo, üreticinin önerileri doğrultusunda musluk suyu ile doldurulmuş ve çelik tepsi daldırılmıştır. Çelik tepsi içerisindeki plak, su seviyenin altında kalacak şekilde su yüksekliği ayarlanmıştır. Ultrasonik banyoda geçen 10 dakikalık süre, daha önceki çalışmalarda belirlenmiştir. Süreyi uzatmanın özellikle antimikrobiyal duyarlılık testi gerçekleştirildiği dönemde hücre hasarına sebep olabileceği düşünülmüştür (Ali ve diğ. 2006, Harrison ve diğ. 2010). Böylelikle, peglere tutunmuş biyofilmin, hücre yıkımı en aza indirilerek sıvı besiyerine aktarılması planlanmıştır (Ceri ve diğ. 1999, Harrison ve diğ. 2010). Çizim 3. 3.' de ultrasonik banyo işlemi gösterilmiştir.
24 Çizim 3.3. Ultrasonik banyo ve plağın yerleşimi.
Plak ultrasonik banyoda işlem görürken, steril plaklarda besiyeri dilüsyonları hazırlanmıştır. Her suş için bir sütuna, 180 μl steril TSB besiyeri ilave edilmiştir. Böylelikle, 10-1
ile 10-8 arasında dilüsyonlar oluşturulacaktır. Örnek dilüsyon şeması, Çizim 3. 4.' de gösterilmiştir.
Sonikasyon işleminin ardından, biyofilmin döküldüğü plak aseptik şartlarda açılmıştır. Her izolat için ilgili kuyucuktan 20 μl bakteri süspansiyonu alınarak dilüsyon plağının ilgili ilk kuyucuğuna eklenmiştir. Çok kanallı otomatik pipet kullanılarak dilüsyonlar gerçekleştirilmiştir. Her dilüsyonun sonunda, pipet ucu tıbbi atık kutusuna atılmış ve steril yeni uç takılmıştır. Buradaki amaç, dilüsyon hatasını en aza indirmektir. Son kuyucuklardan yani 10-8' lik dilüsyondan çekilen süspansiyon tıbbi atık kutusuna atılmıştır.
25
Çizim 3.4. Dilüsyon plağı şeması. Parantez içi numaralar, örnek izolat numaralarını göstermektedir.
Dilüsyon işleminin gerçekleştirilmesinin ardından, sekize bölünerek 10-1
' den 10-8' e kadar numaralandırılmış TSA plaklarına ilgili dilüsyon kuyucuklarından 10' ar μl süspansiyon inoküle edilmiştir. Yapılan işlemin şeması, Çizim 3. 5.' de gösterilmiştir. İşlem, her suş için 1 TSA petri kutusu olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Spot ekim yapılmış TSA plakları, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir ve oluşan koloniler sayılmıştır. Koloni sayımında, sayılabilecek en düşük dilüsyondaki koloni sayısı değerlendirilmiştir. Yapılan deney sonucunda, standart hesaplamalar ile peg başına düşen canlı hücre sayısı (viable cell count - VCC) hesaplanmıştır (Ceri ve diğ. 1999, Harrison ve diğ. 2010).
3.3.3. Plağın Tamamında Eşit Biyofilm Oluşumunun Araştırılması
Plağın tamamında eşit biyofilm oluşumunun araştırılması, MBEK değerlerinin standardizasyonu için gerekmektedir. Bu durumun araştırılması amacıyla, steril bir plağın ilk iki kuyucuğu haricinde tamamına E. coli ATCC 25922 suşu inoküle edilmiştir. TSA besiyerine pasajlanan E. coli ATCC 25922 suşu, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir. Serum fizyolojik ile 0,5 McFarland standardı hazırlanmıştır. Hazırlanan süspansiyondan 0,5 ml alınarak, 14,5 ml TSB besiyeri içeren tüpe inoküle edilmiştir. Bu tüpten 150 µl çekilerek hücre kültür plağına ilgili kuyucuklara
