İnkübasyon sonunda farklı bir plağın ilgili kuyucuklarına 200 µl steril serum fizyolojik eklenerek bir yıkama plağı oluşturulmuştur. Yıkama plağının kapağı kaldırılarak, sonraki kısımlar için saklanmıştır. Biyofilm oluşturulmuş pegleri içeren plak kapağı, yıkama plağına alınarak 1 dakika süreyle oda sıcaklığında yıkamaya alınmıştır. Eş zamanlı olarak, başka bir plakta ilgili kuyucuklara 200 μl TSB besiyeri ilave edilmiştir. Yıkama işleminin sonunda plak kapağı kaldırılarak TSB içeren plağa kapatılmıştır. Etrafı parafilmle çevrilmiş ve 10 dakika ultrasonik banyoda oda sıcaklığında daha önce anlatıldığı biçimde sonikasyona alınmıştır.
Plak ultrasonik banyoda işlem görürken, steril plaklarda besiyeri dilüsyonları hazırlanmıştır. Her kuyucuk için ilgili bir sütuna, daha önce anlatıldığı biçimde 180 μl steril TSB besiyeri ilave edilerek 10-1 ile 10-8 arasında dilüsyonlar oluşturulmuştur. Sonikasyon işlemi tamamlandığında, biyofilmin döküldüğü plak aseptik şartlarda açılmıştır. İlgili kuyucuklardan 20 μl bakteri süspansiyonu alınarak dilüsyon plağının ilgili ilk kuyucuğuna eklenmiştir. Çok kanallı otomatik pipet kullanılarak dilüsyonlar gerçekleştirilmiştir. Her dilüsyonun sonunda, pipet ucu tıbbi atık kutusuna atılmış ve steril yeni uçlar takılmıştır. Son kuyucuklardan yani 10-8' lik dilüsyonlardan çekilen süspansiyon tıbbi atık kutusuna atılmıştır.
29
Dilüsyon işleminin gerçekleştirilmesinin ardından, sekize bölünerek 10-1
' den 10-8' e kadar numaralandırılmış TSA plaklarına, ilgili dilüsyon kuyucuklarından 10' ar μl süspansiyon inoküle edilmiştir. Her izolat için bir TSA petri kutusu kullanılmıştır ve bu iki farklı kuyucuğun dilüsyonları, suşa ait ilk kuyucuk üste, ikinci kuyucuk alta gelecek şekilde aynı plağa ekilmiştir. Spot ekim yapılmış TSA plakları, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir ve oluşan koloniler sayılmıştır. Koloni sayımında, sayılabilecek en düşük dilüsyondaki koloni sayısı değerlendirilmiştir.
Bakterilerin biyofilm oluşturma yetenekleri arasında farklılık olup olmadığının araştırılması amacıyla suşlara ait MVCC değerleri belirlenmiş ve elde edilen değerler SPSS 21 programı ile veri setinin homojenitesini test etmek amacıyla one-sample Kolmogorov-Smirnov testiyle istatistiksel olarak analiz edilmiştir.
3.4. Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri
3.4.1. Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu Belirlenmesi
Toplam 6 antibiyotiğin (amoksisilin/klavulonik asit, gentamisin, seftriakson, siprofloksasin, trimetoprim/sulfametoksazol ve nitrofurantoin), minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) değerleri belirlenmiştir. Antibiyotikler, Infectious Disease Society of America (IDSA) ve European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) önerileri göz önüne alınarak, kullanım sıklıklarına göre seçilmiştir (Gupta ve diğ. 2011). Antibiyotik seçiminde ayrıca, çoklu ilaç direnci özelliğinin belirlenebilmesi için, farklı gruplardaki antibiyotiklere yer verilmiştir. Yukarıdaki 6 farklı antibiyotik grubundan üç ve üzeri antibiyotiğe dirençli olan bir bakteri, çoklu ilaç direncine sahip olarak kabul edilmiştir (Johnson ve diğ. 2010, Er ve diğ. 2015).
Bakterilere ait MİK değerleri, sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle European Committee on Antimicriobial Susceptibility Testing (EUCAST) önerileri dahilinde steril U tabanlı ELISA plakları kullanılarak belirlenmiştir ve izolatların duyarlılıkları, EUCAST duyarlılık tablolarına göre değerlendirilmiştir (EUCAST 2019a).
Besiyeri olarak katyon ayarlı Mueller Hinton Broth (KA-MHB) kullanılmıştır. Besiyeri hazırlığı ve katyon ayarı, EUCAST önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir (EUCAST 2019c). Her satır için suşa ait bir üreme kontrol ve her satır için bir sterilite kontrol çalışılmıştır.
30
Amoksisilin trihidrat (Sigma-Aldrich, Almanya), trimetoprim (Sigma-Aldrich, Almanya) ve nitrofurantoin (Sigma-Aldrich, Almanya), ayrı ayrı 10 mg/ml olacak şekilde dimetil sülfoksit (DMSO) (Fluka, İsviçre) içerisinde çözülmüştür (Andrews 2001, Macingwana ve diğ. 2012, CLSI 2018). Sulfametoksazol (Sigma-Aldrich, Almanya) ise 50 mg/ml olacak şekilde DMSO içerisinde çözülmüştür (Macingwana ve diğ. 2012). Gentamisin sülfat (Sigma-Aldrich, Almanya) ve seftriakson sodyum (Sigma-Aldrich, Almanya), 10 mg/ml olarak steril distile suda çözülmüştür. Siprofloksasin (Sigma-Aldrich, Almanya), steril distile su içerisinde 0,1 molar sodyum hidroksit çözeltisinin damlatılmasıyla 10mg/ml olacak şekilde çözülmüştür (Olofsson ve diğ. 2006). Lityum klavulonat (Sigma-Aldrich, Almanya) ise 10 mg/ml olacak şekilde sodyum fosfat tamponu (pH=6,0) içerisinde çözülmüştür (EUCAST 2003). Antibiyotiklerin hepsi çalışma yapılacağı gün içerisinde hazırlanmıştır. Amoksisilin/klavulonik asit dilüsyonlarında, klavulonik asit konsantrasyonu, denenen her bir kuyucukta 2 mg/L olacak şekilde ayarlanmıştır. Sınır değer, amoksisilin kosantrasyonuna göre verilmiştir (EUCAST 2019a). Trimetoprim/sulfametoksazol dilüyonlarında ise, trimetoprim:sulfametoksazol oranı, 1:19 olacak şekilde dilüe edilmiştir. Sınır değer, trimetoprim konsantrasyonuna göre verilmiştir (EUCAST 2019a).
E. coli ATCC 25922 ve 4 farklı izolatın MİK aralıkları belirlenerek deney optimize edildikten sonra tüm suşlar çalışmaya alınmıştır. Her deneyde, E. coli ATCC 25922 suşu çalışmaya dahil edilmiştir. Suşlar için çalışılan MİK aralıkları, Çizelge 3. 3.' de gösterilmiştir.
TSA besiyeri üçe bölünerek tek düşürme ekim yöntemiyle pasajlanan her bir izolat, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde (Nüve, Türkiye) inkübe edilmiştir. Her izolat için MHB ile 0,5 McFarland standardı hazırlanmıştır.
İlgili plaklardaki her bir suşa ait satırların ilk kuyucukları üreme kontrol, ikinci kuyucukları ise sterilite kontrol olarak kullanılmıştır. Kuyucuklardaki son hacim 100 µl olacak şekilde ayarlanmıştır. Besiyeri-antibiyotik konsantrasyonu, %25' i geçmeyecek şekilde düzenlenmiştir (Harrison ve diğ. 2010). Amoksisilin/klavulonik asit antibiyogramı haricinde, en yüksek konsantrasyonlu antibiyotik kuyucuğu dışındaki kuyucuklara, 100 μl KA-MHB besiyeri ilave edilmiştir. Amoksisilin/klavulonik asit haricindeki antibiyotikler için çalışılacak en yüksek konsantrasyonlu kuyucuklara, ilgili antibiyotik konsantrasyonu ayarlanarak 200 µl antibiyotikli KA-MHB besiyeri dağıtılmıştır. Ardından, çok kanallı otomatik pipet yardımıyla, en yüksek antibiyotik dilüsyonu olan kuyucuklardan başlanarak
31
100 µl ile aritmetik dilüsyon yapılmıştır. En düşük antibiyotik konsantrasyonlu kuyucuklarda da dilüsyon yapıldıktan sonra artan sıvı tıbbi atığa atılmıştır.
Amoksisilin/klavulonik asit için ise öncelikle sterilite ve üreme kontrol kuyucuklarına 100 μl KA-MHB besiyeri dağıtılmıştır. En yüksek konsantrasyonlu antibiyotik kuyucuğu dışındaki kuyucuklara ise 50 μl KA-MHB besiyeri ilave edilmiştir. En yüksek konsantrasyonlu kuyucuklara, amoksisilin konsantrasyonu ayarlanarak 100 µl antibiyotikli KA-MHB besiyeri dağıtılmıştır. Ardından, çok kanallı otomatik pipet yardımıyla, en yüksek antibiyotik dilüsyonu olan kuyucuklardan başlanarak 50 µl ile aritmetik dilüsyon yapılmıştır. En düşük antibiyotik konsantrasyonlu kuyucuklarda da dilüsyon yapıldıktan sonra artan sıvı tıbbi atığa atılmıştır. Sonrasında, 4 mg/L olarak ayarlanan klavulonik asit-KA-MHB çözeltisinden amoksisilin bulunan her kuyucuğa 50 µl eklenmiştir. Böylelikle "MİK antibiyogram plakları" oluşturulmuştur.
Plak hazırlığının ardından, her bir izolat için MHB ile 0,5 McFarland standardı hazırlanmıştır. Kuyucuklara inoküle edilecek bakteri miktarı, 0,5 McFarland süspansiyonunun 1:10 dilüsyonu ile ayarlanmıştır. Çok kanallı otomatik pipet kullanılarak bu bakteri dilüsyonlarından, ilgili kuyucuklara 5 µl bakteri süspansiyonu inoküle edilmiştir. Böylelikle her bir kuyucuğa, ~5X105
KOB/ml bakteri inokülasyonu gerçekleştirilmiştir. İnokülasyon işlemi, 0,5 McFarland hazırlığının ardından 15 dakika içerisinde gerçekleştirilmiştir (CLSI 2006). Plak kapakları kapatılarak etrafları parafilmle çevrilmiş ve 35±2 °C' de 22±2 saat aerobik ortamda etüvde (Nüve, Türkiye) inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda plaklar görsel olarak değerlendirilmiş ve üremenin olmadığı en düşük antibiyotik konsantrasyonu, "MİK değeri" olarak kaydedilmiştir.
Çizelge 3.3. Çalışılan MİK aralıkları.
Antibiyotik Adı Çalışılan MİK Aralığı (mg/L)
Suş Başına Çalışılan Toplam Kuyucuk Sayısı Amoksisilin/klavulonik asit 0,25/2 - 128/2 10 Gentamisin 0,25 - 128 10 Seftriakson 0,001 - 128 18 Siprofloksasin 0,001 - 128 18 Nitrofurantoin 1 - 512 10 Trimetoprim/sulfametoksazol 0,001/0,019 - 128/2432 18
32
Gerçekleştirilen sıvı mikrodilüsyon testi sonucunda, E. coli ATCC 25922 suşunun MİK aralıklarının uygunluğu, EUCAST önerileri doğrultusunda değerlendirilmiştir (EUCAST 2019b). Deneyler, iki kez tekrar edilmiştir. Tüm suşlara ait MİK50 ve MİK90 değerleri, izolatların MİK değerlerinin sıralanarak, %50 ve %90 izolatı inhibe eden en düşük konsantrasyon olarak belirlenmiştir (Moskowitz ve diğ. 2004).
3.4.2. Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu Belirlenmesi
Öncelikle, MİK testinin optimizasyonunda kullanılan ve E. coli ATCC 25922' yi içeren 5 farklı suş, minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEK) aralıklarının belirlenebilmesi için aşağıdaki protokolle çalışılmıştır. Deney optimize edildikten sonra tüm suşlar aynı protokolle çalışmaya alınmıştır. Farklı günlerde gerçekleştirilen her deneyde, E. coli ATCC 25922 suşu çalışmaya dahil edilmiştir. Her satırdaki suş için bir üreme kontrol ve her satır için bir sterilite kontrol çalışılmıştır. Suşlar için çalışılan MBEK aralıkları, Çizelge 3. 4.' de gösterilmiştir.
Çizelge 3.4. Çalışılan MBEK aralıkları.
Antibiyotik Adı Çalışılan MBEK Aralığı (mg/L)
Suş Başına Çalışılan Toplam Kuyucuk Sayısı Amoksisilin/klavulonik asit 2/2 - 1024/2 10 Gentamisin 2 - 1024 10 Seftriakson 2 - 1024 10 Siprofloksasin 2 - 1024 10 Nitrofurantoin 2 - 1024 10 Trimetoprim/sulfametoksazol 2/38 - 512/9728 10
Antibiyotik stok solüsyonları, MİK belirleme deneyiyle aynı yöntemle ve hepsi çalışma yapılacağı gün içerisinde hazırlanmıştır. Kuyucuktaki son hacim, MİK belirleme için gerçekleştirilen sıvı mikrodilüsyondan farklı olarak 200 μl olacak şekilde ayarlanmıştır. Besiyeri-antibiyotik konsantrasyonu, %25' i geçmeyecek şekilde düzenlenmiştir (Harrison ve diğ. 2010). Amoksisilin/klavulonik asit dilüsyonlarında klavulonik asit konsantrasyonu, denenen her bir kuyucukta 2 mg/L olacak şekilde ayarlanmıştır. Sınır değer, amoksisilin kosantrasyonuna göre verilmiştir (EUCAST 2019a). Trimetoprim/sulfametoksazol dilüyonlarında ise, trimetoprim:sulfametoksazol oranı, 1:19
33
olacak şekilde dilüe edilmiştir. Sınır değer, trimetoprim konsantrasyonuna göre verilmiştir (EUCAST 2019a).
TSA besiyeri üçe bölünerek tek düşürme ekim yöntemiyle pasajlanan her bir izolat, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir. Her izolat için MHB ile 0,5 McFarland standardı hazırlanmıştır. Hazırlanan süspansiyondan 0,3 ml alınarak, 8,7 ml TSB besiyeri içeren tüpe inoküle edilmiştir. Böylelikle, 1:30 dilüsyon oluşturulmuştur. Her izolat için ilgili tüpten 150 µl çekilerek hücre kültür plaklarında ilgili kuyucuklara inokülasyon gerçekleştirilmiştir. Besiyeri kontrol amacıyla, her satırın ikinci kuyucuğuna bakteri inoküle edilmemiş 150 µl TSB besiyeri eklenmiştir. Bu plakların kapakları kaldırılmış ve daha sonraki çalışmalar için saklanmıştır. Plaklara, pegleri içeren kapaklar kapatılmıştır ve etrafları parafilmle sarılmıştır. Plaklar, 35±2 °C' de 18±2 saat aerobik ortamda ve 115 rpm' de orbital çalkalamalı etüvde inkübe edilmiştir.
İnkübasyon sonunda farklı bir plak serisinin ilgili tüm kuyucuklarına 200 µl steril serum fizyolojik eklenerek bir yıkama plağı serisi oluşturulmuştur. Yıkama plaklarının kapakları kaldırılarak, sonraki kısımlar için saklanmıştır. Biyofilm oluşturulmuş pegleri içeren plak kapakları, yıkama plaklarına alınarak 1 dakika süreyle oda sıcaklığında yıkama gerçekleştirilmiştir.
Eş zamanlı olarak, başka bir plak serisinde amoksisilin/klavulonik asit antibiyogramı haricinde, en yüksek konsantrasyonlu antibiyotik kuyucuğu dışındaki kuyucuklara 200 μl KA-MHB besiyeri ilave edilmiştir. Amoksisilin/klavulonik asit haricindeki antibiyotikler için çalışılacak en yüksek konsantrasyonlu kuyucuklara ise antibiyotik konsantrasyonu ayarlanarak 400 µl antibiyotikli KA-MHB besiyeri dağıtılmıştır. Ardından, çok kanallı otomatik pipet yardımıyla, en yüksek antibiyotik dilüsyonu olan kuyucuklardan başlanarak 200 µl ile aritmetik dilüsyon yapılmıştır. En düşük antibiyotik konsantrasyonlu kuyucuklarda da dilüsyon yapıldıktan sonra artan sıvı tıbbi atığa atılmıştır.
Amoksisilin/klavulonik asit için ise öncelikle sterilite ve üreme kontrol kuyucuklarına 200 μl KA-MHB besiyeri dağıtılmıştır. En yüksek konsantrasyonlu antibiyotik kuyucuğu dışındaki kuyucuklara ise 100 μl KA-MHB besiyeri ilave edilmiştir. En yüksek konsantrasyonlu kuyucuklara, amoksisilin konsantrasyonu ayarlanarak 200 µl antibiyotikli KA-MHB besiyeri dağıtılmıştır. Ardından, çok kanallı otomatik pipet yardımıyla, en yüksek antibiyotik dilüsyonu olan kuyucuklardan başlanarak 100 µl ile aritmetik dilüsyon yapılmıştır. En düşük antibiyotik konsantrasyonlu kuyucuklarda da dilüsyon yapıldıktan sonra artan sıvı tıbbi atığa atılmıştır. Sonrasında, 4 mg/L olarak
34
ayarlanan klavulonik asit-KA-MHB çözeltisinden amoksisilin bulunan her kuyucuğa 100 µl eklenmiştir. Böylelikle "MBEK antibiyogram plakları" oluşturulmuştur.
Yıkama işleminin sonunda, biyofilmin oluşturulduğu plak kapakları kaldırılarak MBEK antibiyogram plaklarına kapatılmıştır. Etrafları parafilmle çevrilmiş ve 35±2 °C' de 22±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir.
İnkübasyon sonunda, farklı bir plak serisinin ilgili tüm kuyucuklarına 200 µl steril serum fizyolojik eklenerek yeni bir yıkama plağı serisi oluşturulmuştur. Yıkama plaklarının kapakları kaldırılarak, sonraki kısımlar için saklanmıştır. KA-MHB içeren MBEK antibiyogram plağından alınan ve antibiyotik ile inkübe edilmiş biyofilme sahip plak kapakları, yıkama plaklarına daldırılarak 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkanmıştır. KA-MHB içeren MBEK plaklarına ise steril düz plak kapağı kapatılarak, MİK değerlererinin kıyaslanması için saklanmıştır. Bulanıklık olmayan en düşük dilüsyonlu ilk kuyucuk, "KA-MHB MBEK plağından elde edilen MİK değeri" olarak kaydedilmiştir.
Yıkama işleminin sonunda, steril TSB içeren yeni bir plak serisi oluşturulmuştur. Pegleri içeren plak kapakları kaldırılarak, steril TSB içeren plaklara alınmıştır ve plakların etrafı parafilmle kapatılmıştır. İki plak üst üste gelecek şekilde daha önce anlatıldığı biçimde 10 dakika ultrasonik banyoda oda sıcaklığında sonikasyon işlemine alınmıştır. Sonikasyonun sonunda, pegleri içeren plak kapakları tıbbi atık kutusuna atılmıştır ve yerine steril düz plak kapakları kapatılmıştır. Plakların etrafı parafilmle kapatılmıştır ve 35±2 °C' de 22±2 saat aerobik ortamda etüvde inkübe edilmiştir.
İnkübasyon sonunda kuyucuklardaki bulanıklık, ilk 5 suş için hem görsel olarak hem de 650 nm dalga boyunda optik dansitenin mikroplak okuyucu ile belirlenmesiyle değerlendirilmiştir. Arada fark olmaması ve daha önceki çalışmalarda da MBEK değerinin görsel olarak belirlenebileceğinin belirtilmesi üzerine, sonraki çalışmalarda bulanıklık görsel olarak değerlendirilmiştir (Harrison ve diğ. 2018). Üremenin olmadığı en düşük antibiyotik konsantrasyonu, "MBEK" değeri olarak belirlenmiştir. Standardize hale getirilen ve bakterinin plakta üremesi sonrası MBEK deney protokolüne ait akış şeması, Çizim 3. 7.' de gösterilmiştir. Deneyler, 2 kez tekrar edilmiştir. Tüm suşlara ait MBEK50 ve MBEK90 değerleri, izolatların MBEK değerlerinin sıralanarak, %50 ve %90 izolata ait biyofilmi inhibe eden en düşük değer olarak belirlenmiştir (Moskowitz ve diğ. 2004).
Günümüzde, MBEK verilerini duyarlı veya dirençli olarak sınıflayabilmek için kullanılan bir duyarlılık tablosu bulunmamaktadır. Daha önceki çalışmalarda MBEK ve MİK değerlerinin kıyaslanabilmesi için, CLSI gibi duyarlılık öneri tablolarının duyarlı (S) ve dirençli (R) sınır değerleri kullanılmıştır (Sepandj ve diğ. 2004). MBEK değeri, MİK
35
sınır değerine göre değerlendirilerek, bakteri duyarlı veya dirençli olarak sınıflandırılmıştır. Ülkemizin kullandığı standardın EUCAST olması nedeniyle, çalışmamızda EUCAST sınır değer önerileri kullanılmıştır (EUCAST 2019a).