T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
Tez YöneticisiDoç. Dr. Sevgi ESKİOCAK
KOLOREKTAL KANSERLİ OLGULARDA
OKSİDATİF STRESİN ARAŞTIRILMASI
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Sabriye KAYA
TEŞEKKÜR
Uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve tecrübeleriyle bana yol gösteren, yönlendiren, tez çalışmamda çok değerli katkıları olan Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyesi ve danışmanım sayın Doç. Dr. Sevgi ESKİOCAK başta olmak üzere Anabilim dalı başkanımız sayın Prof. Dr. Erol ÇAKIR’a, sayın Prof. Dr. Selma SÜER GÖKMEN’e, sayın. Doç. Dr. Hakan ERBAŞ’a, Fakültemiz İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Gastroenteroloji Bilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. H. Ahmet TEZEL’e, Doç. Dr. Ali Rıza SOYLU’ya, Yrd. Doç. Dr. Hasan ÜMİT’e, Özel Ekol Hastanesi Gastroenteroloji Uzmanı Dr. Sedat ÖZDEMİR’e ve Genel Cerrahi Uzmanı Dr. Zeliha TÜRKYILMAZ’a, çalışmamızı destekleyen Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri’ne ve tüm çalışma arkadaşlarıma teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
GİRİŞ VE AMAÇ ... 1
GENEL BİLGİLER ... 4
SERBEST RADİKALLER ...4
ANTİOKSİDAN SİSTEMLER ...20
KOLOREKTAL KANSER ...21
KANSER VE OKSİDATİF STRES ...
23
GEREÇ VE YÖNTEMLER ... 28
BULGULAR ... 34
TARTIŞMA ... 42
SONUÇLAR ... 50
ÖZET ... 52
SUMMARY ... 54
KAYNAKLAR ... 56
EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR
ADA : Adenozin deaminaz AP-1 : Aktivatör protein-1 BH4 : Tetrahidrobiopterin
cGMP : Siklik guanozin monofosfat COX-2 : Siklooksijenaz-2
DNA : Deoksiribonükleik asit
EDRF : Endotelden kaynaklanan gevşetici faktör ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay eNOS : Endotelyal nitrik oksit sentaz
ETZ : Elektron transfer zinciri
FAD : Flavin adenin dinükleotid
FMN : Flavin adenin mononükleotid GPx : Glutatyon peroksidaz
GR : Glutatyon redüktaz
GSH : Glutatyon
H• : Hidrojen radikali
HOCl : Hipokloröz asit
HO2• : Hidro peroksil radikali
HOX : Hipohalöz asit
HPLC : Yüksek performanslı sıvı kromatografi IL-1 : İnterlökin-1
iNOS : Uyarılabilir nitrik oksit sentaz KAT : Katalaz
L• : Lipid radikali
LO• : Lipid alkoksil radikali LOO• : Lipid peroksil radikali LOOH : Lipid hidroperoksit
MDA : Malondialdehid
M1dG : Malondialdehid deoksiguanozin
MMP : Matriks metalloproteinaz MPO : Miyeloperoksidaz
NAD : Nikotinamid adenin dinükleotid
NADH : Nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş) NADPH : Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (indirgenmiş)
NFκB : Nükleer faktör kappa B NO• : Nitrik oksit
NO2 : Nitrojen dioksit
NOS : Nitrik oksit sentaz
nNOS : Nöronal nitrik oksit sentaz NOx : Nitrojen oksit
NOX : NADPH oksidaz
NSAİ : Nonsteroid antiinflamatuar ilaç NT : Nitrotirozin
O3 : Ozon
O2•⎯ : Süperoksit anyon radikali 1O
2 : Singlet Oksijen •OH : Hidroksil radikali
ONOO- : Peroksinitrit
PMNL : Polimorfo nükleer lökosit PTEN : Fosataz ve tensin homoloğu R• : Serbest radikal
RNT : Reaktif nitrojen türevi
RO• : Alkoksil radikali
ROO• : Serbest oksijen radikali ROT : Reaktif Oksijen Türevi
SCN¯ : Tiyosiyanat
SH : Tiyol
SOD : Süperoksit dismutaz
TBA : Tiobarbitürik asit
TNF-α : Tümör nekrozis faktör-α XDH : Ksantin dehidrojenaz XOD : Ksantin oksidaz
GİRİŞ VE AMAÇ
Kolorektal kanser günümüzde en sık görülen kanserler arasında üçüncü sırada yer almaktadır. Erkeklerde yaygınlık bakımından prostat kanserinden sonra ikinci sırada; kadınlarda ise meme ve serviks kanserinden sonra üçüncü sırada yer almaktadır (1).
Ülkemizde de sindirim sistemi kanserleri arasında mide kanserinin başta geldiği ve bunu kolon kanserinin izlediği kabul edilmektedir. Ancak son yıllarda yurdumuzda kolon kanserlerinde belirgin bir artış olduğu kabul edilmektedir. Sağlık bakanlığının verilerine göre bu oran giderek artmaktadır (2).
Gastrointestinal kanal, özellikle kolonda sürekli olarak reaktif oksijen türleri (ROT) üretilmektedir. Oksidatif stres, doku veya hücrede oluşan ROT’un konsantrasyonunun antioksidan kapasiteyi aşması olarak tanımlanır. Oksidanlar belirli düzeyin üzerine çıkar veya antioksidanlar yetersiz olursa yani denge bozulursa söz konusu oksidan moleküller organizmanın yapı elemanları olan protein, lipid, karbonhidrat, nükleik asitler ve yararlı enzimleri bozarak zararlı etkilere yol açarlar. Oksidatif stres, geri dönüşümlü ya da dönüşümsüz hücre hasarına yol açar. Oksidatif stres akut ya da kronik olabilir. İskemi-reperfüzyonda, akut inflamasyonda ve hiperokside kısa süreli bir oksidatif stres varken, kronik inflamasyonda uzun süreli bir oksidatif stres vardır. Bu uzun süreli oksidatif stresin kanser gelişiminde rol oynadığı ileri sürülmektedir (3). Çoğu hastalıklarda ROT düzeyinin artışı hastalığın sebebi değildir, primer bozukluğa ikincil olarak oluşurlar ve ardından patogenezde yer alırlar (4). Kolorektal kanser gelişiminde, mukozadaki oksidatif stresin önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Kolon lümenindeki ROT direkt genotoksik etkileri yanında fekal mutajen oluşmasına yol açarlar (3).
Lipid peroksidasyonu bir tür oksidatif doku hasarı olup çoklu doymamış yağ asitlerini ve kolesterolü etkilemektedir. Hidrojen peroksit (H2O2) ve süperoksit radikallerine (O2•⎯)
maruz kalan hücrelerin membranlarında hasarlanma, hücre organellerinin kaybı ve sitozolik aldehid ve peroksit ürünlerinin oluşumu gözlenir. Malondialdehid (MDA) oluşumu lipid peroksidasyonunun iyi bir göstergesidir. Kolorektal kanserlerde malign dokuda çevre sağlam dokuya göre MDA düzeylerinde %111’lere varan artışlar bildirilmiştir (5). Skrzydlewska ve ark. (6) kolorektal kanserli hastaların çevre sağlam dokuya göre tümör dokularında katalaz (KAT) düzeyi azalırken; MDA, süperoksid dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPX) ve
glutatyon (GSH) düzeyinin arttığını, tümöral evre ilerledikçe GSH’ın azaldığını bildirmişlerdir.
Nitrik oksit (NO•) oldukça reaktif bir serbest radikaldir. Yarı ömrü sadece bir kaç saniyedir ve kolayca süperoksit gibi serbest radikallerle birleşir. Biyolojik sistemlerde hızla nitrit ve nitrata parçalanır (7,8).
Nitrik oksit çok kısa yarı ömrü ve reaktivitesi nedeniyle lokal bir haberci olarak etki eder, sinyal iletimi, apoptozis gibi birçok biyolojik olayda rol oynar. Apoptozis gibi koruyucu mekanizmaların bozulduğu karsinogeneziste NO• önemli rol oynamaktadır. Fonksiyonel p53 geni taşımayan HT-29 kolon kanseri hücrelerinde NO• konsantrasyonunun artması ile mitokondrial süperoksit anyon radikallerini toplayarak apopitozu inhibe ettiği bildirilmiştir (9). Nitrik oksit'in, süper oksit radikali (O2•⎯) ile in vivo reaksiyonu sonucu oluşan bir türev
olan peroksinitrit (ONOO⎯) proteinlerdeki tirozin kalıntılarını nitratlayarak nitrotirozin (NT) oluşturur.
Lökositlerdeki solunum patlaması ROT oluşumu için önemli kaynaklardan birini oluşturmaktadır. Aşırı lökosit aktivasyonu ROT oluşumunun artmasına ve doku hasarının oluşumuna yol açabilir. Literatürde kolon kanseri olgularında lökosit aktivasyonunun göstergesi olan miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesinin çalışıldığı çok az çalışma mevcuttur.
Literatürde lipid peroksidasyon ürünleri, NO• ile kolorektal kanserler arasındaki ilişkiyi inceleyen çalışmalar mevcuttur. NT ile kolorektal kanser arasındaki ilişkiyi inceleyen tek çalışmaya rastlanmıştır. Kolorektal kanserde ROT artışına yol açan nedenler, kolon dokusunda lipidler üzerine oluşturduğu etkiler konusunda halen yanıtlanmamış sorular bulunmaktadır.
Bu çalışmamızda önemli sağlık sorunu olan, yaşam kalitesini düşüren, iş-güç kaybına yol açan kolorektal kanserde oksidatif ve nitrozatif stresi incelemeyi, lökosit aktivasyonu ile ilişkisini ortaya koymayı amaçladık. Bunu değerlendirmek amacıyla kolorektal kanser tanısı
almış olan hastaların plazmalarında NT, NO• ve MPO, serumlarında MDA analizlerini yapmayı hedefledik.
GENEL BİLGİLER
SERBEST RADİKALLER
Atomlar, nötron ve protondan oluşan pozitif yüklü bir çekirdekle, çekirdeğin çevresinde bulunan negatif yüklü elektronlardan oluşmaktadır. Enerji düzeylerine göre belirli bir düzende yerleşen elektronlar, orbital adı verilen yörüngelerde hareket etmektedirler. Her orbitalde yerleşik iki elektron, birbirine zıt yönde kendi ekseni etrafında dönmektedir. Orbitallerden birine veya ikisine ters dönüşlü bir veya ters dönüşlü iki elektron yerleşmesi ile radikal oluşmaktadır. Serbest radikaller, atomik veya moleküler yapılarında bir veya daha fazla sayıda eşlenmemiş tek elektron içeren kararsız moleküllerdir. Bu tek elektron çiftlenme eğiliminde olduğundan, serbest radikaller ileri derecede reaktiftir (10).
Bir serbest radikalin dış yörüngesinde çiftlenmemiş bir tek elektronun varlığı geleneksel olarak üzerine bir nokta konularak (R•) gösterilir. En basit serbest radikal hidrojen
radikali (H•) yani hidrojen atomu olup bir proton ve bir adet çiftlenmemiş elektron içerir (10).
Radikaller başlıca 2 yolla oluşur;
1) Homolitik bölünme: Kovalent bağlı bir molekülün, her bir parçasındaki ortak elektronlardan birisinin homolitik bölünmesi sonucunda ortaklanmamış elektronlar taşıyan molekül veya atomlar meydana gelir. Yüksek ısı, ultraviyole ışını ve iyonize edici radyasyon kovalent bağın ayrılması için gerekli enerjiyi sağlayabilir.
X:Y X• + Y•
2) Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi: Biyolojik sistemlerde serbest radikaller en çok bu yolla meydana gelir (10).
A + e⎯ A•¯
aerobik organizmalarda bu radikaller daha çok oksijen radikalleri şeklinde kendini gösterir (10).
Radikaller diğer moleküller ile çeşitli şekillerde reaksiyona girerler. İki radikal karşılaştığında paylaşılmamış elektronlarını birleştirirler ve kovalent bir bağ oluştururlar. Bir radikal paylaşılmamış elektronunu radikal olmayan bir moleküle verebilir, diğer bir molekülden alabilir veya radikal olmayan bir moleküle bağlanabilir. Bu reaksiyonlardan hangisi olursa olsun radikal olmayan bir molekül sonuçta radikale dönüşür. Serbest radikaller aerobik hücre metabolizmasının bir ürünü olarak sürekli üretildiği gibi dış etkenlerin etkisiyle de meydana gelebilir. Oluşan radikallerin zararlı etkileri antioksidan savunma mekanizmaları ile engellenerek etkisizleştirilir. Serbest radikallerin oluşum hızı ile etkisizleştirilme hızı dengede olduğu sürece, organizma serbest radikallerden etkilenmemektedir. Ancak, savunma azalır veya serbest radikallerin oluşum hızı, sistemin savunma gücünü aşarsa denge bozulur. Serbest radikaller hücre yapı ve fonksiyonlarında önemli değişikliklere neden olurlar ve hastalıkların patogenezinde rol oynarlar.
Serbest Radikal Türleri
Serbest radikalleri, oksijen merkezli ve oksijen merkezli olmayan serbest radikaller olmak üzere iki sınıfa ayırmak mümkündür. Reaktif oksijen türleri terimi, sadece radikaller için değil, hidrojen peroksit (H2O2), hipokloröz asit (HOCl), ozon (O3) gibi radikal olmayan
oksijen türleri için de kullanılır. Reaktif türler terimi ise reaktif nitrojen, klor, brom, sülfür merkezli türler için de kullanılan geniş bir terimdir (Tablo 1).
1) Süperoksit anyon radikali (O2•⎯) : Süperoksit anyon radikalinin önemli kaynağı,
mitokondriyal elektron transport zinciri (ETZ)’dir. Süperoksit anyon radikali ayrıca inflamatuar hücrelerin yüzeylerinde bulunan NADPH oksidaz (NOX) sistemi ile de oluşturulur. Hem çevresel etkenler, hem de organizmalardaki enzimatik ve enzimatik olmayan tepkimelerle en çok ve en kolay oluşan oksijen radikali süperoksit radikalidir. Süperoksit radikali, moleküler oksijene bir elektron eklenmesi ile oluşur. Yarılanma ömrü çok kısa olup, oksidan etkisi zayıf fakat redüktan etkisi çok güçlüdür. Serbest radikal olmasına rağmen hasar oluşturucu bir tür değildir. Asıl önemi; hidrojen peroksidin kaynağı ve geçiş metal iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Ayrıca NO• ile reaksiyona girerek peroksinitriti oluşturur (Şekil 1). Süperoksit, düşük pH’da daha reaktif olan perhidroksil radikaline (HO2•) protonlanır, fakat
fizyolojik pH’da bu form çok azdır. Süperoksit radikali oksijenin neden olduğu toksisitede önemli bir rol oynar. Süperoksit, oluştuktan sonra tiyol grupları ile reaksiyon verebilir. Bu ise
ya GSH tüketilmesine sebep olarak hücreyi ileri bir oksidatif strese sokar veya enzim ve diğer hücresel proteinler üzerindeki tiyol grupları ile reaksiyon vererek onları inaktive eder.
Tablo 1. Serbest radikal ve radikal olmayan reaktif türler (10)
Serbest radikaller Radikal olmayanlar
Reaktif oksijen türleri (ROT)
Süperoksit (O2•⎯) Hidroksil (•OH) Hidroperoksil (HO2•) Karbonat (CO3•⎯) Peroksil (RO2•) Alkoksil (RO•)
Karbon dioksit (CO2•⎯)
Singlet oksijen (O2 1Σg+)
Reaktif klorin türleri (RCT)
Atomik klorin (Cl•)
Reaktif bromin türleri (RBT) Atomik bromin (Br•)
Reaktif nitrojen türleri (RNT)
Nitrik oksit (NO•) Nitrojen dioksit (NO2•)
Nitrat (NO3•)
Reaktif oksijen türleri (ROT)
Hidrojen peroksit (H2O2)
Hipokloröz asit (HOCl) Hipobromöz asit (HOBr) Ozon (O3)
Singlet oksijen (O2 1∆g)
Organik peroksit (ROOH) Peroksinitrit (ONOO⎯) Peroksinitrat (O2NOO⎯)
Peroksinitröz asit (ONOOH)
Nitrozoperoksikarbonat (ONOOCO2⎯)
Peroksomonokarbonat (HOOCO2⎯)
Reaktif klorin türleri (RCT)
Hipokloröz asit (HOOCl) Nitril klorit (NO2Cl)
Kloraminler Klor gazı (Cl2)
Klorin dioksit (ClO2)
Reaktif bromin türleri (RBT)
Hipobromöz asit (HOBr) Brom gazı (Br2)
Reaktif nitrojen türleri (RNT)
Nitröz asit (HNO2)
Nitroksil anyonu (NO⎯) Nitrozil katyonu (NO+)
Dinitrojen tetraoksit (N2O4)
Dinitrojen trioksit (N2O3)
Peroksinitrit (ONOO⎯) Peroksinitrat (O2NOO⎯)
Peroksinitröz asit (ONOOH) Nitronyum katyonu (NO2+)
Alkil peroksinitrit (ROONO) Alkil peroksinitrat (RO2ONO)
Nitril klorid (NO2Cl)
Süperoksit, aynı zamanda Haber-Weiss reaksiyonu gibi oksidatif strese neden olabilen önemli reaksiyonları da başlatabilir (11,12).
2) Hidrojen peroksit (H2O2) : Elektronlar çiftlenmiş olduğu için serbest radikal
değildir, fakat son derece güçlü bir oksitleyici ajandır. Süperoksidin dismutasyon reaksiyonu ile ya da oksijenin direkt olarak indirgenmesi sonucu oluşur. Hidrojen peroksit, geçiş metal iyonlarının varlığında hidroksil radikallerini oluşturabilmektedir (Şekil 1). Metal katalizörlerin yokluğunda ise hidrojen peroksit KAT ve GPx enzimleri ile kolaylıkla uzaklaştırılır ve zararsız hale getirilir (13,14).
Şekil 1. Süperoksit radikalleri ve hidrojen peroksidin reaksiyonları
G6PD: Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GPx: Glutatyon peroksidaz, GR: Glutatyon redüktaz, GSH: Glutatyon, GSSG: Okside glutatyon, IL-8: İnterlökin-8, KAT: Katalaz, LH: Lipid, MDA: Malondialdehid, MPO:
Miyeloperoksidaz, NFkB: Nükleer faktör kappa B, NOS: Nitrik oksit sentaz, SOD: Süperoksit dismutaz, TNF-α: Tümör nekrozis faktör-alfa.
3) Hidroksil radikali (•OH) : En reaktif oksijen radikalidir. Tüm biyolojik
substratlarla reaksiyona girebilen, hücre membranlarındaki doymamış yağ asitleri, hücre içinde ve membranındaki proteinler, karbonhidratlar, deoksiribonükleik asit (DNA) zincirleri
NADP+ NADPH+H+ O2 Diğer ürünler O2 NOS L-arginin L-sitrüllin NO˙ e¯ O2•⎯ Tirozin Nitrotirozin ONOO¯ ˙OH+OH¯ H2O2 2H2O 2OH¯ 2GSH GSSG GR GPx G6PD NADPH + H+ NADP+ KAT O2 H 2O2 Fe2+ MPO 2 XOH X¯ +H2O2 H2O2 O2 NFkB IL-8 Adezyon molekülleri SOD O2•⎯+2H+ O2 (+) LH L˙ L˙ Fe3+ Fe3+ Fe2+ ˙OH+OH LOOH LOO˙ LPO LH İzoprostan MDA Fe2+ Fe3+ + OH¯ LO˙ 2H2O 6-P-glukonolakton Glukoz-6-P TNF-α
gibi önemli komponentlerin yapı ve fonksiyonlarını bozabilen aktif yapıdadır (13,15). Hidroksil radikali, Fenton ve Haber-Weiss reaksiyonları ile üretilebilir.
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + •OH+ OH¯ (Fenton reaksiyonu)
H2O2 + O2•⎯ •OH + OH¯+ O2 (Haber-Weiss reaksiyonu) Ayrıca X-ışınları veya γ-ışınları gibi iyonize edici radyasyona maruz kalınması sonucunda hücre ana bileşenlerinden su molekülünün parçalanması ile de H• ve •OH oluşabilir (10,13,15).
4) Hidroperoksil radikali (HO2•) : Süperoksit radikalinin protonlanmasıyla oluşur ve
süperoksitten daha reaktiftir (10). O2•⎯ + H+ HO2•
5) Singlet oksijen (1O2) : Oksijen molekülünün enerji alması ile moleküler oksijenin
daha reaktif bir türü olan singlet oksijenler oluşur. Delta (O2 1∆g) ve sigma (O2 1Σg+) olmak
üzere iki tipi vardır. Delta tipinde daha fazla enerji vardır ve daha reaktiftir. Singlet oksijen bir radikal olmayıp, sıklıkla serbest oksijen radikalleri ile birlikte anılan reaktif oksijen türüdür. Serbest radikal reaksiyonlarıyla üretilebilir. Singlet oksijen’in vücutta deri ve retina gibi gün ışığına maruz kalan bölgelerinde fotosensitizasyon reaksiyonu ile sıkça oluştuğu tespit edilmiştir. Bu bölgelerde çok fazla doymamış yağ asitleri bulunduğundan singlet oksijen bu lipidlerle hızla reaksiyona girerek harabiyet oluşturabilir. Singlet oksijenler, triptofan, metiyonin, sistein veya histidin gibi aminoasitlerle reaksiyona girerek önemli biyolojik hasarlar oluşturabilir (10,15).
6) Hipokloröz asit (HOCI) : Hipokloröz asit de radikal olmadığı halde ROT arasında
değerlendirilmektedir. Hipokloröz asit, fagositik hücrelerce bakterilerin öldürülmesinde önemli rol oynar. Aktive olan polimorfo nükleer lökositler (PMNL) süperoksit üretir. Bu serbest radikal üretimi, fagositer hücrelerin bakterileri öldürmesinde çok önemlidir. Solunum patlaması sırasında oluşan süperoksit moleküllerinden, SOD etkisi ile hidrojen peroksit üretilir. Özellikle nötrofillerin içerdikleri MPO enzimi, hidrojen peroksidi klorür iyonuyla birleştirerek güçlü bir antibakteriyel oksidan olan HOCl’e dönüştürür (Şekil 2) (10).
7) Karbon merkezli radikaller: Hidroksil radikali yağ asitleri başta olmak üzere,
merkezli organik radikallerin oluşmasına neden olur. Karbon merkezli radikaller hızlı bir şekilde O2 molekülü ile reaksiyona girerek, ilgili peroksil radikallerini (ROO•) oluştururlar.
Bu peroksil radikali lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonunu başlatan radikal olup çok uzun ömürlüdür. Geçiş metal iyonlarının varlığında hidroperoksil radikalinden bir oksijen atomu çıkması sonucu alkoksil radikali (RO•) oluşur. Alkoksil radikalleri de biyomoleküllerden proton çıkararak karbon merkezli radikal oluşmasına yol açar (10,15).
Şekil 2 . Hipokloröz asit oluşumu
MPO: Miyeloperoksidaz, SOD: Süperoksit dismutaz.
8) Nitrik oksit (NO•) : Nitrik oksit, bağışıklık sisteminin düzenlenmesi, düz kasların
gevşemesi, vazodilatasyon ve nörotransmisyonu içeren çeşitli fizyolojik süreçlerde görev alan önemli bir sinyal molekülü olmakla birlikte aynı zamanda çok reaktif bir radikaldir. Nitrik oksit molekülünde eşleşmemiş elektron bulunması nedeniyle serbest radikaldir.
1980’lerde Furchgott ve Zawadski (16) izole arter preparatlarında, asetilkolinle oluşturdukları gevşemenin, endotele bağımlı olduğunu göstermişlerdir. Damar gevşemesinde yer alan bu maddeye endotelden kaynaklanan gevşetici faktör (EDRF) adı verilmiştir. Ignarro ve ark. (17) ile Palmer ve ark. (18) ayrı ayrı yaptıkları çalışmalarda damar endotelinden izole ettikleri EDRF’nin aslında NO• olduğunu tespit etmişlerdir.
Nitrik oksit, L–argininden sitrülin oluşumu sırasında, L–argininin guanidin nitrojen grubunun 5 elektron oksidasyonuyla oluşur (Şekil 3). Bu reaksiyon NOS enzimi tarafından katalize edilir. Nitrik oksit sentazların; endotelyal (eNOS), nöronal (nNOS) ve uyarılabilir (iNOS) olmak üzere genetik olarak üç izoformu tespit edilmiştir. Bunlardan eNOS ve nNOS yapısallardır ve bulundukları dokularda düşük miktarda NO• üreterek vasküler tonusun ayarlanması, sinaptik şekillenme ve sinirsel iletinin düzenlenmesinde rol alırken; fagositik
H2O HOCl H2O2 H2O 1O 2 + Clֿ (Hipokloröz asit) H2O2 O2•ˉ H+ eֿ Fe+2 Fe+3 O2.- O2 SOD MPO •OH O2
hücrelerde bulunan iNOS uyarıldıktan sonra NO• sentezini arttırarak hücre aracılı immün cevapta rol alır. Nöronal ve epitelyal NOS izoenzimleri NO• üretimi için Ca+2-kalmodulin kompleksine bağımlıdır, iNOS ise bağımsızdır. Reaksiyon için ortamda oksijen ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH), flavin adenin dinükleotid (FAD), flavin mononükleotid (FMN), tetrahidrobiopterin (BH4) ve kalmodulin bulunması gerekir (7,8).
Şekil 3. Nitrik oksit (NO•) sentezi (7)
BH4: Tetrahidrobiopterin, FAD: Flavin adenin dinükleotid, FMN: Flavin adenin mononükleotid, NADP+:
Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (yükseltgenmiş), NADPH: Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (indirgenmiş), NO:Nitrik oksit, NOS: Nitrik oksit sentaz.
Renksiz ve son derece toksik bir gaz olan NO•’in yarı ömrü çok kısadır. Düşük konsantrasyonlarda toksik değildir ve çok önemli fizyolojik işlevlerin gerçekleşmesinde rol oynar.
Organik çözücülerde çözünürlüğü yüksek olan NO• biyolojik membranlardan kolayca diffüze olabilir. Nitrik oksit bir kez sentezlendikten sonra hızla hedef dokulara yayılır, hücre içinde çözünür guanilat siklaz enzimini aktive eder ve siklik guanozin monofosfat (cGMP) miktarını arttırarak düz kas gevşemesi, vasküler tonüs, kan akımlarının düzenlenmesi, adhezyon ve agregasyonun azalmasında rol oynar. Ayrıca mikroorganizmaların mitokondrial hem proteinlerindeki demir ile reaksiyona girip ölmelerine yol açarak savunma sisteminde de rol oynar. Nitrik oksit, kardiyovasküler sistem, sinir sistemi ve immünolojik sistemde birçok fizyolojik ve patolojik mekanizmaların düzenlenmesinde çok önemli hücreiçi ve hücrelerarası sinyal taşıyan bir moleküldür. Normal fizyolojik koşullarda NO• konsantrasyonları 100-500
NADP+ 2O2 NO NADPH C NH2 NH2+ CH2 NH3+ COOֿ NH FAD FMN BH4 Hem Ca-kalmodulin CH2 CH2 CH2 CH COOֿ C NH2 NOS CH NH3+ NH CH2 CH2 O L-arginin L-sitrüllin
nM düzeylerinde iken; endotoksin, α-interferon, IL-1, TNF-α gibi ajanlarla iNOS’un tetiklenmesi sonucunda düzeyleri yaklaşık on kat artar (7,10). İnflamasyon gelişmesinde; nitrojenin reaktif metabolitlerinin artmış üretiminin patofizyolojik bir rolü vardır. İnsanlardaki inflamatuar barsak hastalıklarının patogenezinde de NO•’in rol oynadığı bildirilmiştir (8). Oksijen varlığında, kolayca bir dizi nitrojen oksitlerine (NOx) dönüşebilir. Nitrik oksit ve
tekrar NO•’e dönüşebilen nitrojen oksitler (NO2, N2O3, N2O4 vb) güçlü nitrozile edici
ajanlardır ve primer ile sekonder aminleri nitrözilleyerek, nitrozaminleri oluştururlar. Nitrozaminler; potansiyel karsinojenik maddelerdir. Çünkü bu bileşikler DNA’da nitrozilasyon, deaminasyon yapabilir ve alkil nükleofillerin oluşumuna neden olabilirler.
Serbest Oksijen Radikallerinin Kaynakları
Serbest radikaller organizmada normal olarak meydana gelen oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonları sırasında oluştuğu gibi çeşitli dış kaynaklı etkilerle de oluşabilir. Hücre organellerinin her biri farklı miktarda radikal oluşumuna sebep olurlar. Bunların yanı sıra radyasyon, stres ve ksenobiyotikler aktive olmuş fagositler de serbest radikal üretimini arttırırlar. Sitokrom P450, sitokrom b5, ksantin oksidaz, triptofan dioksijenaz, lipooksijenaz, prostaglandin sentetaz enzimlerinin reaksiyonları sırasında, hemoglobin, flavoproteinler, lipid peroksidasyonunda, oksidatif stres yapan iskemi, travma ve intoksikasyon gibi durumlarda, elektron transfer zinciri reaksiyonlarında, tiyol, hidrokinon, katekolamin, flavin ve antibiyotik gibi moleküllerin otooksidasyonu sırasında hücresel serbest radikaller oluşur (10,19). Serbest radikal oluşturan kaynaklar endojen ve ekzojen olmak üzere iki gruba ayrılabilir.
Endojen serbest radikal üretim kaynakları: Normal olarak metabolizmada, bazı
biyokimyasal olayların çeşitli basamaklarında serbest radikaller oluşmaktadır. Her ne kadar serbest radikal yapısına sahip maddelerin organizmaya zarar verme potansiyelleri varsa da, bazı metabolik olayların ilerleyebilmesi için bunların oluşması kaçınılmazdır.
1. Mitokondriyal elektron transport sistemi: Mitokondrideki enerji metabolizması sırasında oksijen kullanılırken, süperoksit üretimi olabilir. Buradaki radikal üretiminin nedeni NADH dehidrogenaz ve koenzim Q gibi elektron taşıyıcılardan oksijen molekülüne elektron kaçağının olmasıdır. Fizyolojik olarak reaktif oksijen türlerinin temel kaynağı normal oksijen metabolizmasıdır. Dolayısıyla fizyolojik koşullar altında mitokondriyal elektron transport sistemi serbest radikal üretiminin en önemli kısmını oluşturmaktadır (10,15,20).
Endoplazmik retikulum ve nükleer membrandaki serbest radikal üretimi, membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda üretilen serbest radikaller organellerin içine girebilir, sitozolik reaksiyonlara katılabilir. Endoplazmik retikulum membranına bağlı sitokrom P450 komplekslerinin ayrışması H2O2 ve
diğer peroksit ara ürünlerinin oluşmasına neden olmaktadır. Nükleer membranda oluşan serbest radikaller özellikle DNA’da hasaroluştururlar (10).
3. Redoks döngüsü: Ksenobiyotiklerden serbest radikal oluşumu sadece mikrozomal reaksiyonlarla olmamaktadır. Menadion, parakuat, dikuat, nitrofurantoin gibi bileşikler alternatif bir redoks döngüsüne girerler. Bu bileşikler, ilave bir çiftlenmemiş elektron kazanma eğilimindedirler. Bu ajanlardan oluşan radikaller, kolayca oksijenle oksitlenir ve süperoksit radikalini oluştururlar. Oluşan ksenobiyotik ve süperoksit radikalleri hücreiçi ferritin depolarından demiri serbest hale getirirler. Sitozole salınan demir, serbest radikaller arasında en reaktif olan ve dolayısıyla daha yıkıcı olan •OH gibi ikincil radikallerin oluştuğu Fenton reaksiyonunda katalitik rol oynar (10).
4) Araşidonik asit metabolizması: Plazma membranına bağlı siklooksijenaz ve lipoksijenaz enzimleri prostaglandin ve lökotrien biyosentezi için araşidonik asidin oksidasyonunu katalizledikleri sırada karbon ve oksijen merkezli serbest radikaller açığa çıkmaktadır. Oluşan serbest radikaller, enzimlerin kendileri ve diğer hücre komponentleri ile reaksiyona girme yeteneğindedir (10,13).
5) Otooksidasyon: Çözünebilir özelliği olan ve nötral sıvı ortamda oksidasyon-redüksiyon reaksiyonlarına girebilen hücre bileşenlerinden pek çoğu hücreiçi olarak serbest radikalleri açığa çıkarabilirler. Koenzimler, hemoglobin, miyoglobin, indirgenmiş sitokrom c indirgenmiş ferrodoksinler, askorbik asit, tiyoller, flavinler, hidrokinonlar, tetrahidropterinler ve katekolaminler gibi bileşiklerin otooksidasyonu ile O2
indirgenirken O2•⎯ oluşmaktadır (10).
6) Oksidan enzimlerin reaksiyonları: Aerobik organizmalarda oksijenin katıldığı birçok reaksiyonda oksijenin tek elektron indirgenmesiyle süperoksit anyonu meydana gelebilir. Glikojen oksidaz, ksantin oksidaz, NADPH oksidaz, NADH oksidaz, diamin oksidaz, ürat oksidaz gibi enzimler bunlardan bazılarıdır. Üzerinde en çok çalışılan enzim ksantin oksidaz (XOD) aslında ksantin dehidrogenaz (XDH) olarak sentezlenmekte ve bu
şekilde dokularda yaygın olarak bulunmaktadır. Bu enzim elektronlarını moleküler oksijene değil nikotinamid adenin dinükleotid (NAD)’ye verir ve süperoksit anyon radikali oluşturmaz. Fakat XDH’ın sülfidril gruplarının oksidasyonu ya da sınırlı proteolizi ile oksidaz formuna dönüşebilir. Ksantin oksidaz moleküler oksijeni kullanarak H2O2 ve
O2•⎯oluşturmaktadır (20).
7) Fagositoz: Fagositik hücreler, mikroorganizmaları öldürücü fonksiyonlarını mikroorganizmaların hücre içine alınıp sindirildiği fagositoz olayı ile gerçekleştirirler. Fagositoz, serbest radikal oluşumunun sorumlu olduğu oksidatif mekanizmalar ve çoğu fagositik hücrenin granüllerinden salınan sitokinlerin rol aldığı oksidatif olmayan mekanizmaların birlikte çalıştığı biyokimyasal bir süreçtir. Fagositik hücrelerin aktivasyonu, çeşitli hücre dışı uyaranlar aracılığıyla meydana gelir. Sonuçta fagozom membranında lokalize NADPH oksidaz aracılığıyla solunum patlaması adı verilen, oksijen tüketiminin hızla arttığı ve süperoksit radikalinin oluştuğu bir süreç gerçekleşir. Aktive olan nötrofiller, monositler, makrofajlar ve eozinofiller O2•⎯ üretirler. Solunum patlaması sırasında oluşan O2•⎯
molekülünden SOD aktivitesi ile H2O2 oluşur. Fagositik hücrelerin primer granüllerinden
degranülasyon ile fagozom içine bırakılan MPO enzimi aktivitesi ile hipokloröz asit oluşturulur (Şekil 4).
Şekil 4. Fagozom içinde gerçekleşen süperoksit radikalleri reaksiyonları (21)
Miyeloperoksidaz, polimorf nükleuslu lökositler ve monositlerin azurofilik granüllerinde lokalize olmuş lizozomal bir hemoproteindir. Total nötrofil proteinin % 2-5'ini oluşturmaktadır. MPO sentezi kemik iliğindeki myeloid farklılaşma sırasında oluşur. Bu farklılaşma granülositlerin dolaşıma katılmasından hemen önce son bulur. Enzim, nötrofil ve monositlerin primer granüllerinde bulunabilmesine rağmen makrofajlarda ya çok az bulunur
Bakteri 2O2 H2O2 HOCl 2H+ O2 2O2˙¯ H+ NADP+ + 2H+ Proton kanalı NADPH2+ 2e¯ NADPH Oksidaz kompleksi Cl־
veya hiç bulunmaz.
Miyeloperoksidaz ilk kez 1941 yılında saflaştırılmıştır. Özgül olmayan peroksidaz aktivitesi gösteren enzimin geniş bir substrat aralığı vardır. MPO herbiri 60 kilodalton ağırlığında iki ağır ve herbiri 15 kilodalton ağırlığında olan iki hafif olmak üzere 4 alt üniteden oluşmaktadır. Hem molekülü, proteindeki glutamat ve aspartat kalıntılarına kovalent olarak iki ester bağıyla bağlanmıştır (10).
Temel durumda MPO ferrik (Fe III) durumda bulunur. Fagositoz sırasında ise bileşik I, bileşik II ve bileşik III olmak üzere üç farklı formu oluşur. Hidrojen peroksit varlığında MPO’nun hem grubu okside olarak reaktif ferril radikalini oluşturur. Bu ara bileşiğe ''Bileşik 1'' denir. Miyeloperoksidazın primer katalitik formu; bileşik I'dir. Bileşik I; Cl¯, Br¯, I¯ gibi halojenürleri ve tiyosiyanat (SCN¯) gibi psödohalojenürleri kolayca indirgeyerek hipohalöz asidleri (HOX) oluşturur. Halojenürlerin ve tiyosiyonatın normal plazma düzeylerinde Cl¯ tercih edilen bir substrattır ve HOCl oluşur. Aşırı miktarda H2O2 varlığında bileşik I
halojenürleri okside etmekte inaktif olan bileşik II'ye dönüşürken H2O ve O2 açıga çıkar.
Bileşik II; O2•⎯ ve askorbat varlığında doğal MPO formuna dönüşür. Süperoksit anyonu doğal
MPO'nun bileşik III formuna dönüşmesine yol açabilir. Bileşik III stabil değildir, tekrar doğal MPO formuna dönüşür. Bu dönüşüm askorbat varlığında daha hızlıdır (Şekil 5).
Şekil 5. Miyeloperoksidaz kompleks enzim reaksiyonları (22)
MPO: Miyeloperoksidaz.
Miyeloperoksidaz aracılıklı etkiler: Nitrojen dioksit ya direkt olarak MPO tarafından ya da MPO’nun ürünü olan HOCl tarafından okside olur. Bu reaksiyonlar sonucunda oluşan reaktif nitrojen türleri proteinlerdeki tirozin kalıntılarını nitratlar. Bileşik I formundaki MPO ayrıca proteinlerdeki tirozin kalıntılarına da etki ederek ditirozin çapraz bağları oluşumuna yol açabilir. Miyeloperoksidaz aktivitesi ile oluşan HOCl biyomoleküllerde oksidasyon, klorinasyon yapar, 1O2 oluşumuna yol açar (Şekil 6) (22,23).
HOCl MPO O2•⎯ H2O2 Bileşik I Bileşik II 2H2O2 H2O+ O2 Cl- +H+ O2•⎯, askorbat Bileşik III
Şekil 6. Miyeloperoksidaz aracılıklı etkiler (22)
MPO: Miyeloperoksidaz.
Ekzojen serbest radikal üretim kaynakları: Serbest radikaller, ekzojen nedenlerle
de oluşabilir. Radyasyon, barbütiratlar, ksenobiotikler, metal iyonları en önemli ekzojen serbest radikal üretim kaynakları olarak bilinirler (19).
Serbest Radikallerin Vücuttaki Etkileri
Organizma, tüm anabolik ve katabolik reaksiyonlar esnasında ve sonrasında, sürekli bir oluşum halindeki serbest radikal reaksiyonları ile oksidanlara maruz kalırken, bir yandan da endojen antioksidanlar adı verilen moleküller tarafından etkisizleştirme süreci içindedir.
Serbest radikaller, belirli düzeylerde kaldıkları sürece, organizmanın yabancı maddelere ve infeksiyöz ajanlara karşı savunmasında rol alan önemli molekülerdir. Ancak belirli düzeyin üzerinde oluşurlar ve/veya antioksidanlar yetersiz kalırsa serbest radikaller hücresel yapıları etkileyerek hücre hasarına yol açarlar (Şekil 7) (13).
Normal metabolizma sırasında ya da patolojik yolla ortaya çıkan serbest radikaller, hücre ve dokularda birçok zarara yol açmaktadır. Bu zararlar şöyle sıralanabilir:
a) Tiyollere bağımlı enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının bozulması, hücre ortamının tiyol/disülfit oranının değişmesi.
b) Protein ve lipidlerde kovalent bağlantılar oluşturması. c) Zar proteinlerinin tahribi, taşıma sistemlerinin bozulması. d) Proteinlerin tahrip olması ve protein döngüsünün artması. e) Enzim aktivitelerinde değişiklikler.
OH Oksidasyon Klorinasyon H2O2 1O 2 Tirozil radikali O3 Ditirozin çapraz bağları MPO+H2O2 NO2ֿ Reaktif nitrojen arabileşikleri OClֿ HOCl Cl2 Clֿ Tirozin Tirozin peroksit
Şekil 7. Serbest radikallerin neden olduğu hücre hasarı (24)
DER: Degranule endoplazmik retikulum, PER: Peroksizom, DNA: Deoksiribo nükleik asit.
f) Kollajen ve elastin gibi uzun ömürlü proteinlerdeki oksido-redüksiyon olaylarının bozularak kapillerlerde aterofibrotik değişiklerin oluşması.
g) Lipid metabolizmasında değişiklikler.
h) Lipid peroksidasyonu, zar yapısı ve fonksiyonunun değişmesi. i) Steroid ve yaşlılık pigmenti denilen bazı maddelerin birikimi. j) Mukopolisakkaritlerin yıkımı.
k) Nükleotid yapılı koenzimlerin yıkımı.
l) Deoksiribonükleik asidin tahrip olması (10,19).
Lipidlere etkisi: Reaktif oksijen türleri, plazma ve organel membranlarında lipid peroksidasyonuna neden olurlar. Hidroksil radikali membran lipidleri ile çift bağ yapar, böylece lipid-radikal etkileşimi ile zincirleme reaksiyon sonucu MDA, dien konjugatları gibi pek çok lipid peroksidasyon ürünü oluşur. Membran lipidlerinin okside olması ile bu membranların fiziksel ve kimyasal özellikleri değişir, iyon geçirgenliği bozulur. Böylece organel ve hücre hasarı ortaya çıkar, eritrositlerde hemoliz görülür.
Lipid peroksidasyonu, çoklu doymamış yağ asitlerinin zincirleme bir radikal reaksiyonudur ve üç aşamadan oluşur (Şekil 8).
Başlama safhası: Reaktif oksijen moleküllerinden •OH, RO•, ROO• ve 1O2 molekülleri
lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonlarını başlatabilir. Süperoksit ve H2O2 lipid
peroksidasyonunun başlamasına yol açabilirler. Reaktif oksijen molekülü çoklu doymamış yağ asidindeki peşpeşe gelen çift bağlar arasındaki metilen grubundan bir proton kopararak karbon merkezli bir lipid radikali (L•) oluşturur (10,19).
Şekil 8. Çoklu doymamış yağ asidlerinin peroksidasyonu (10)
MDA: Malondialdehid, RH: Lipid, R˙: Lipid radikali.
İlerleme safhası: Lipid radikali kararsız bir moleküldür. Molekül içi düzenlenme ile dien konjugatı oluşturur. Dien konjugatının O2 ile reaksiyona girmesi ile lipid peroksil
radikali (LOO•) oluşur. Lipid peroksil radikali kolesterolün oksidasyonunda, membran proteinlerine atakta, singlet oksijenin oluşumunda rol alır. Lipid peroksil radikali kendinde bulunan başka bir çift bağa atak yaparak siklik peroksitlerin oluşumuna yol açabilir. Lipid peroksil radikali başka lipidlerden proton kopararak lipid hidroperokside (LOOH) dönüşürken; atak yaptığı lipid, radikal haline geldiği için yeni bir zincir reaksiyonunu başlatmış olur. Lipid hidroperoksit fizyolojik koşullarda oldukça stabil bir moleküldür, ama geçiş metal iyonlarının varlığında bozunur. Bu reaksiyon sonunda reaktif olan lipid alkoksil
Araşidonik asit
Lipid radikali (L˙)
Dien konjugatı
Lipid peroksil radikali (LOO˙) Lipid hidroperoksit (LOOH) O2 Monosiklik peroksit Bisiklik endoperoksit O2 ile reaksiyon ve indirgenme F2 izoprostan -H+ Yüksek O2 İzofuran O2 , hidroliz MDA + Diğer ürünler
Düşük O2 varlığında molekül içi proton
çıkarılması RH
radikali (LO•) ve hidroksil iyonu (OH¯) oluşur. Lipid alkoksil radikali çoklu doymamış yağ asitleri ve peroksitlerden proton koparabilir. Bu reaksiyonlar sonucunda yeni karbon merkezli radikaller oluşur ve lipid peroksidasyon zincir reaksiyonunun ilerlemesine yol açar. Lipid alkoksil radikali bazen kendi zinciri üzerine atak yapar ve epoksi radikal oluşmasına yol açar. Lipid alkoksil radikali β–parçalanma reaksiyonuyla aldehidler ile etan veya pentan radikaline parçalanır. Etan ve pentan radikalleri başka bir yağ asidine atak yaparak yeni bir lipid radikali oluştururken etan ve pentan gazlarına dönüşür. ω3 çoklu doymamış yağ asitlerinden etan, ω6 yağ asitlerinden ise pentan açığa çıkar.
Sonlanma safhası: Zincir reaksiyonu; iki lipid radikali birbiriyle etkileşene dek sürer. Sonlanma basamağında lipid çapraz bağları (LL) ve siklik endoperoksitler (LOOL) oluşur. Antioksidan moleküllerin bir kısmı da zincir reaksiyonunu sonlandırabilir. Lipid peroksidasyonu sırasında karbon bağlarının kopması ile aldehid yapısında yıkım ürünleri ortaya çıkmaktadır. Bu sitotoksik metabolitler MDA gibi alkaneller ve 4-hidroksinonenal gibi hidroksialkanellerdir. Malondialdehid lipid peroksidasyonunun son ürünüdür. Reaktif aldehidler ortaya çıktıkları bölgeden uzağa diffüze olabildikleri için uzak bölgelerde de doku hasarına sebep olabilirler.
Oksidatif hasarın in vivo göstergesi olarak en çok kullanılan belirteç MDA’dır. Malondialdehidin hücre membranlarının geçirgenliğini arttırdığı, membranların iyon alışverişine etki ederek hücreiçi iyon dengesini bozduğu, enzim aktivitelerinin bozulmasına, DNA’nın yapısında kırılmalara ve baz değişimlerine neden olduğu bildirilmektedir (10).
Malondialdehid, en çok linoleik asit, araşidonik asit, dokosahekzaenoik asit gibi ikiden fazla çift bağı olan doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonu ile oluşur, fakat bazen eikozonoidlerin enzimatik metabolizması sırasında da ortaya çıkabilir. Malondialdehid, pH değişikliğine bağlı olarak değişik izoformlarda olabilir (Şekil 9). Fizyolojik pH’da serbest formda bulunan MDA birçok amino grubuna düşük reaktivite gösteren enolat anyonu formuna dönüşür. Düşük pH’da ise reaktivite artar ve MDA proteinlere atak yapar, özellikle lizin kalıntıları olmak üzere birçok kalıntıda modifikasyonlarla sonuçlanan molekül içi ve moleküller arası çapraz bağlar oluşur:
Protein-NH Protein-NH + H C O C O H CH2 Protein-N H C H Protein-N C CH = = = H
Malondialdehid, DNA bazlarıyla da etkileşir ve mutajenik lezyonların ortaya çıkmasına neden olur.
Malondialdehid, memeli dokularında hızlıca metabolize olur. Aldehid dehidrogenezlar ile malonik semialdehide okside olur, dekarboksilazlar ile asetaldehide, ardından aldehid dehidrogenazlar ile asetata dönüşerek metabolize olur (10).
Şekil 9. Sulu çözeltilerdeki malondialdehid formları (10)
MDA: Malondialdehid.
Serbest radikallerin DNA’ya etkileri: Serbest radikallerin nükleer ve mitokondrial
DNA ile tepkimesi sonucunda baz modifikasyonları, baz delesyonları, zincir kırılmaları gerçekleşebilmektedir. DNA’nın harabiyeti genellikle mutasyonların ortaya çıkmasına neden olur. Mitokondrial DNA'da meydana gelen mutasyonlar sonucunda hücrenin enerji durumu etkilenir. Sonuçta serbest radikaller; kanser oluşumu, yaşlanma ve hücre ölümünde rol oynamaktadır.
Proteinlere etkisi: Proteinlerin içerdikleri aminoasitlerin oksidasyona duyarlılıkları farklı olmakla birlikte sistein, tirozin, triptofan, histidin, metionin ve lizin kalıntılarının hassasiyetinin yüksek olduğu kabul edilmektedir. Süperoksit radikalinin bu aminoasitlerle yavaş bir reaksiyon verdiği ancak •OH, H2O2, HOCl’lerin daha hızlı oksidan etki gösterdikleri
tespit edilmiştir. Bu nedenle, mikrosirkülasyonda oluşan ROT, proteinlerde, enzimlerde modifikasyona ve hücre fonksiyonlarında değişime neden olur. Proteinlerde serbest radikal etkisiyle protein tiyol gruplarının oksidasyonu, disülfit bağlarının indirgenmesi, ileri protein
Keto Enol Enolat anyonu
+MDA -H2O +MDA +MDA -H2O Siklik form –
oksidasyon ürünleri, protein karbonil ve nitrotirozin oluşur (25,26).
Nitrik oksit'in, O2•⎯ ile in vivo reaksiyonu sonucu oluşan sitotoksik bir türev olan
peroksinitrit proteinlerdeki tirozin kalıntılarının orto pozisyonunda nitrasyonu ile NT oluşumuna yol açar (Şekil 10).
Tirozinin geri dönüşümsüz olarak nitrasyonu, tirozinin fosforillenmiş ve fosforillenmemiş formlarının birbirine dönüşümünü engelleyerek, enzim aktivitesinin ve sinyal ileti mekanizmalarının düzenlenmesini etkiler.
Şekil 10. Nitrotirozin oluşumu (27)
Nitrotirozin’in, ONOO- oksidasyonunun kararlı son ürünü olması nedeniyle NT ölçümünün NO• bağımlı in vivo hasarın tespitinde kullanışlı bir belirteç olduğu bildirilmektedir (27).
Memeli hücrelerinde okside proteinlerin tamir mekanizmaları sınırlı olduğu için hidroliz edilerek ortamdan uzaklaştırılması gereklidir. Okside olmuş proteinlerin proteozom kompleksi tarafından parçalandığı gösterilmiştir. Okside olmuş proteinler 20S çekirdek proteozomu içinde ATP ve ubikitinden bağımsız yollarla parçalanmaktadır. Oksidatif modifiye proteinlerdeki okside aminoasitler uzaklaştırılır ya da ATP sentezinde karbon kaynağı olarak kullanılır. Oksidatif streste güçlü oksidanlara maruz kalınmasıyla hücrelerdeki proteolitik kapasite yetersiz kalabilir. Bazı durumlarda okside proteinler uygun bir şekilde yıkıma gidemez, diğer yapılarla çapraz bağlar ve geniş hidrofobik bağlar yaparlar. Hasarlı proteinlerin birikimi sonucu hücre normal fonksiyonlarını yerine getiremez ve hücre ölümü ya da nekrozu gerçekleşir (26).
ANTİOKSİDAN SİSTEMLER
Doğrudan etki ile oksidanları inaktif hale getiren maddelere "antioksidan" adı verilmektedir. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek, ROT’lerini temizleyerek veya geçiş metal iyonlarını bağlayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler.
Genel olarak enzimatik antioksidanlar hücre içinde, enzimatik olmayan antioksidanlar ise hücre dışında daha fazla etkilidir. Ancak bir tripeptid olan GSH hücre içinde güçlü antioksidandır (24).
Antioksidanların oksidan moleküllere karşı etki tipleri şunlardır:
Toplayıcı etki; Yeni radikal oluşumunu engelleme ve oluşmuş olan radikalleri daha az zararlı hale getirme,
Bastırıcı etki; Oksidanlarla etkileşip onlara bir hidrojen atomu aktararak aktivitelerini söndürme ve inaktif hale getirme,
Zincir kırıcı etki; Zincirleme olarak devam eden tepkimeleri belirli yerlerinden kırarak oksidan etkiyi durdurma,
Onarıcı etki; Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın tamiri ve temizlenmesi. Antioksidanlar çeşitli kriterlere göre sınıflandırılabilirler:
Yapılarına göre;
a) Enzimler
b) Enzim olmayan proteinler, küçük moleküller
-Geçiş metal iyonlarını bağlayan proteinler (Hb, serüloplazmin, ferritin). -Düşük molekül ağırlıklı bileşikler (bilüribin, ürik asit)
Kaynaklarına göre;
a) Endojen antioksidanlar
b) Ekzojen antioksidanlar (vitamin A, vitamin E, vitamin C) Çözünürlüklerine göre;
a) Suda çözünenler b) Lipidde çözünenler Yerleşimine göre;
a) Hücreiçi sıvısında bulunanlar b) Hücre dışı sıvılarında bulunanlar
KOLOREKTAL KANSER
Amerika Birleşik Devletleri’nde kolorektal kanser; erkeklerde prostat ve akciğer, kadınlarda meme ve akciğer kanserlerinden sonra üçüncü sıklıkta görülen kanserdir. Kolorektal kanserinden ölüm tüm kanser nedeniyle ölümlerin %10’unu oluşturmaktadır (1,28). Amerika’da 2008 yılında 148810 yeni vaka bildirilmiş ve bunların 4996’ı ölümle sonuçlanmıştır (29).
Kolorektal kanser görülme oranları dünyanın değişik coğrafi bölgelerinde farklılık göstermektedir. Gelişmiş ülkelerde sık görülmektedir. Kuzey Amerika ve Avrupa’daki birçok
ülkede görülme sıklığı Afrika ve Asya’daki gelişmekte olan ve/veya az gelişmiş bölgelerden on kat daha fazladır (1,28,30). Kuzey Amerika’da, Yeni Zellenda’da, Avustralya’da ve Batı Avrupa’da sık görülmektedir. Bu coğrafi farklılıkların; genetik yatkınlık yanında, diyetsel ve çevresel faktörlerin etkisiyle oluştuğu kabul edilmektedir. Kolorektal kanserden etkilenme açısından cinsler arasında fark görülmemekle birlikte görülme sıklığının erkeklerde %9.4, kadınlarda %10.1 olduğu bildirilmektedir (31).
Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı verilerine göre 2005 yılındaki kolon kanseri insidansı; erkeklerde %8.69, rektum kanseri insidansı %4.51’dir. Kadınlarda ise insidans; kolon kanserinde %6.31'dir (2).
Kolorektal kanser sıklığı 20-39 yaşlar arasında son derecede düşüktür, 40-50 yaş arasında önemli oranlarda artmaya başlar. Kolorektal kanserlerde tanı yaşı ortalama 62'dir. Ancak, kolorektal kanserler için risk 50-75 yaş arasında değişir. Yaş ilerledikçe risk oranı yükselir.
Kolorektal kanserde tümöral barsak bölgesinin cerrahi olarak çıkarılmasından sonra 5 yıllık yaşam oranı %40-60 arasında değişmektedir. Tümör yinelenmesinin %71'i ilk 2 yıl içinde, %91’i ise 5 yıl içinde olmaktadır (30).
Primer kolorektal kanserlerin %95’ini adenokarsinomlar oluşturur. Kolorektal kanserlerinin yaklaşık %30’u rektumda, %25’i sigmoidde, %5-10’u inen kolonda, %10-15’i transvers kolonda, %25’i de çıkan kolon-çekumda yerleşmektedir (32).
Risk Faktörleri
1) Diyet: Proteinden ve yağdan zengin beslenmek kolorektal kanser açısından risk
faktörüdür.
2) İleri yaş: Kolorektal kanser ileri yaş hastalığı olup kişinin 50 yaş ve üzerinde
olması orta derecede risk faktörüdür.
3) Aile öyküsü: Birinci derece yakın akrabalarında kolorektal kanser hikayesi olan
kişilerde kolorektal kanser gelişme riski normal bireylere göre artmıştır.
4) Alışkanlıklar: Sigara ve alkol kullanımı kolorektal kanser riskini arttırmaktadır. 5) Diğer faktörler: Diabetes Mellitus, safra kesesi ameliyatı, inflamatuar barsak
hastalıkları olan bireylerde kolorektal kanser sağlıklı bireylere göre daha sık görülmektedir. Özellikle inflamatuar barsak hastalığı olan bireylerde inflamatuar süreç karsinogenez patogenezinde rol oynamaktadır.
1) Diyet
-Yüksek lif içerikli beslenme
-Kalsiyum alımı
-Folik asit alımı
2) Fiziksel aktivite 3) İlaçlar
-Nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar -Hormon replasman tedavisi -Statinler
Klinik Bulgular
Kolorektal kanserin bulguları farklı ve özgül değildir. En sık görülen bulgular, rektal kanama, dışkılama alışkanlığında değişme ve karın ağrısıdır. Bulguların dikkat çekici olup olmaması veya tipi, tümörün yeri ve boyutu ile ilişkilidir. Kolorektal kanser yıllarca bulgu vermeyebilir.
Çekum ve sağ kolondaki kanserler genelde halsizlik, yorgunluk ve demir eksikliği anemisi ile kendilerini gösterirler. Sol taraftaki lezyonlar ise, gizli kanama, dışkılama alışkanlığının değişimi ya da sol alt kadranda kramp şeklinde ağrı gibi şikayetlere neden olurlar. Postmenopozal bir kadın ya da erişkin bir erkekte demir eksikliği anemisi oluşursa kolorektal kanserden kuşkulanılarak gerekli araştırmalar yapılmalıdır (28,30,33).
Kolorektal kanserde daha az sıklıkla görülen bulgular kilo kaybı ve ateştir. Ancak kilo kaybı hiçbir zaman kolorektal kanserin tek belirtisi değildir.
Kolorektal kanserli hastaların önemli bir kısmı barsak tıkanması ve perforasyonu nedeniyle hastaneye başvurabilir.
Hastaların yaklaşık %5’inde primer tümör sessiz kalabilir ve hastalarda kemik ağrıları, sarılık, patolojik kırıklar, nörolojik bulgular, tromboflebitler ve deri nodülleri gibi metastaz bulguları görülebilir. Sigmoid kolon ve inen kolon tümörlerinde mesaneye, transvers kolon tümörlerinde mideye, rektum tümörlerinde üretra veya vajene fistül gelişimi görülebilir (30,33,34).
KANSER VE OKSİDATİF STRES
Kanser gelişimi karmaşık ve çoklu adımlar içeren bir süreçtir. Kimyasalların kanser oluşumunu uyarmasında iki mekanizma öne sürülmektedir. Birincisi direkt olarak genomik DNA üzerine hasarlayıcı etkiler göstererek mutajenik değişikliklere yol açarlar ve hedef
hücrede neoplastik dönüşümün artmasına neden olurlar. Diğer bir mekanizma ise hücre çoğalması ve hücre ölümü arasındaki dengenin hücre çoğalması lehine bozulmasıdır. Genetik hasara yol açmayan kanserojenler hücre çoğalması ve ölümünün düzenlenmesi üzerine etki gösterirler. En önemli etkileri gen ifadesi ve hücre büyüme parametrelerinde meydana getirdikleri değişikliklerdir (35). Fizyolojik süreçte yaşlanmış, fonksiyonunu yitirmiş, fazla üretilmiş, düzensiz gelişmiş veya genetik olarak hasarlı hücreler güvenli bir şekilde ortadan kaldırılırlar. Genetik olarak kontrol edilen bu programlı hücre ölümüne apopitoz adı verilir. Apopitoz hücre döngüsü boyunca yapım-yıkım dengesinin sürdürülmesini sağlar. Hasarlı DNA da apopitoz yolu ile ortadan kaldırılır. Hücrenin DNA’sında meydana gelen mutasyonlar kanser oluşumuna neden olabilecekleri için bu hasarlı hücrelerin apopitoz yolu ile ortadan kaldırılmaları büyük önem taşımaktadır. Protoonkogenlerin aktive olması ve/veya tümör baskılayıcı genlerin inaktif olması kanser gelişiminde rol oynar. p53 tümör oluşumunu önleyen transkripsiyon faktörüdür. Hasara uğrayan hücrede bölünmenin durmasını ve apopitozun uyarılmasını sağlar. p53 genleri hasarlı ise hücreler hasarlı DNA’lar ile hücre döngüsüne girerler.
Organizmada serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların ortadan kaldırılma hızı bir denge içerisindedir ve bu durum "oksidatif denge" olarak adlandırılır. Oksidatif denge sağlandığı sürece organizma, serbest radikallerden etkilenmemektedir. Radikallerin oluşum hızında artma ya da ortadan kaldırılma hızında bir düşme, bu dengenin bozulmasına neden olur. Serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma mekanizması arasındaki ciddi dengesizlik "oksidatif stres" olarak adlandırılır. Serbest radikaller çeşitli makro moleküllerle reaksiyona girerler ve sonunda pek çok farklı ürünler oluşturarak hasara neden olurlar. Reaktif türlerin ana hedefi DNA olması nedeniyle yaşlanma ve kanserle ilişkilidir. Reaktif oksijen türleri; tek veya çift zincir DNA kırıklarına, pürin ve pirimidinlerde modifikasyonlara, deoksiriboz-fosfat iskeletinde hasara, DNA-protein ve DNA-DNA çapraz bağlantılarına neden olabilirler. DNA hasarı, transkripsiyonun uyarılması ve durması, sinyal yollarının uyarılması, replikasyon hataları ve genomik dengesizlik ile sonuçlanır. Bütün bunlar da karsinogenez ile ilişkilidir (36).
Oksidatif baz modifikasyonları mutasyon ile sonuçlanabilir. Singlet oksijen guanini kolayca oksitleyebilir. Hidroksil radikali pürin, pirimidin bazlarına ve deoksiriboz iskeletine hasar verir. Peroksinitrit ve NO•; DNA hasarı yapabilirler. Peroksinitritin guanin bazı ile reaksiyona girerek 8-nitroguanin oluşturması sonucunda G:C, T:A ile yer değiştirebilir. DNA’da bu lezyonun stabilitesi kısa sürelidir, ancak RNA’da uzundur. 8-nitroguanin ile karsinogenez süreci arasındaki bağlantı tam olarak bilinmemektedir. Reaktif klorin türleri de
DNA’da değişikliklere yol açabilmektedir. DNA hasarını tamir mekanizmaların etkinliğinde azalma, düzenleyici enzim aktivitesinde değişiklik, hücre çoğalmasının uyarılması, apoptozun baskılanması ile de karsinogenezin ilerlemesinde rol oynar (10,37).
Bunlara ek olarak mitokondrial DNA’nın oksidatif hasarı karsinogenez sürecinin de içinde bulunduğu çeşitli hastalıklarda önemli rol oynayabilir.
Reaktif Türler ve Hücre Proliferasyonu
Reaktif türlerin tipi ve düzeyi, ne kadar süreyle maruz kalındığı, bunları ortadan kaldıracak antioksidan savunma düzeyi ve oksidatif hasarı düzeltecek olan tamir mekanizmasının aktivitesine bağlı olarak hücre çoğalması etkilenir. Bunun sonucunda hücre çoğalmasında artış, hücre döngüsünde durma, yaşlılık, apoptozis ve nekroz görülebilir. Reaktif türler kanserin başlaması ve ilerlemesi aşamalarına katılır ve böylece bunların etkisiyle hücre döngüsü, gen ifadesi, doğrudan veya dolaylı DNA hasarı, apoptozis ve diğer hücre ölümü tipleri görülür (38).
p53 proteini ve reaktif türler: Tümör baskılayıcı gen ürünü olan p53 proteini hücre bölünmesini durduran transkripsiyon faktörüdür. p53 ve ROT’leri birbirleri ile ilişkilidir. Normal seviyedeki p53; MnSOD, GPx gibi antioksidan enzimleri kodlayan genlerin transkripsiyonunu attırarak antioksidan savunmada rol oynar. Reaktif oksijen türleri de p53 aktivitesini arttırarak zarar görmüş hücrenin apopitozunda rol oynar. Ayrıca yüksek seviyede p53 aktivitesi ROT üretiminin artışına yol açabilir (10,19).
Apopitozisin Reaktif Türler ile Düzenlenmesi
Reaktif türler normal hücrelerde apopitozisin ilerlemesine neden olur (10). Bazen kaspazların oksidatif inaktivasyonu gerçekleşebilir. Bazı hücrelerde artmış O2•⎯ seviyesi
sitozolik pH’ın da yükselmesine neden olur ki bu durumda kaspaz aktivitesi engellenir. Buna karşın H2O2 sadece DNA’ya saldırarak değil; mitokondri hasarı ve sitozolik pH’ı düşürerek de
apopitozisi ilerletebilir. Süperoksit radikali ve H2O2’in hücre pH’ı üzerindeki etkileri hücre
membranında bulunan Na+/H+_ATPaz aktivitesini değiştirmelerinden kaynaklanabilir (10,39).
Diğer yönden ROT’leri tümör baskılayıcı gen olan fosfataz ve tensin homoloğu (PTEN) inaktive ederek protein kinaz B sinyal molekülü (Akt) yolunun aktivasyonunu arttırırlar ve hücrenin hayatta kalmasını sağlarlar (40).
Reaktif türler invazyon ve metastazla ilişkilidir. Hücre yüzeyi morfolojisinin değişmesi, hücre içi iletişim, hücre hareketi ve damar geçirgenliğinin artması metastazın kolaylaşmasını sağlar. Ayrıca ekstraselüler matriks, tümör hücreleri ve fagositler özellikle makrofajlar tarafından salınan matriks metalloproteinazlarca (MMP) bozulur. Reaktif türler MMP’i aktifleştirir (10).
Oksidatif Stres, Hücre Sinyal İletimi ve Kanser
Hücreler birbirleriyle iletişim halindedir ve ekstraselüler uyaranlara karşı cevap verirler. Bu biyolojik mekanizmaya sinyal iletimi denir. Sinyal iletimi hücre dışarısındaki çeşitli fonksiyonel elementlerin hücre içine geçişi ile bilginin sağlanması sürecidir. ROT, hücre hasarına yol açmakla birlikte aslında hücre içindeki sinyal iletiminin ve düzenlenmesinin bazı safhalarında önemli fizyolojik rol oynarlar. ROT’nin ikincil habercilerin fonksiyonlarında önemli rolü vardır. Ayrıca sitozolik kalsiyum konsantrasyonunun düzenlenmesi, protein fosforilasyonunun düzenlenmesi ve NF-KB ve
AP-1 faktör ailesi gibi bazı transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonunda rol alır (35,41,42).
Kronik İnflamasyon ve Kanser
Biyolojik, kimyasal ve fiziksel faktörlerle uyarılan kronik inflamasyon, insanlarda değişik türlerdeki kanserlerin artışıyla ilişkilidir. Kronik inflamasyon hücresel dengede düzensizliklere, normal hücrelerde büyüme ve maligniteye ilerleyişin başlamasına, değişik türlerde DNA hasar ürünleri oluşmasına, DNA onarım mekanizmalarının yetersizliğine, proinflamatuar sitokinlerin artışına ve hasarlanmış hücrelerin apopitozis hızında azalmaya neden olmaktadır (43). İnflamasyon sürecinde fagosit membranında bulunan NOX; süperoksit oluşumunu sağlayan önemli bir kaynaktır. Tümöral farklılaşmayla bağlı olarak NOX düzeyinin arttığı düşünülmektedir. Fakat bununla ilgili bilgiler hala netleşmemiştir (10). Ayrıca birçok çalışmada MPO enziminin de kanser gelişiminde rolü olduğu görülmektedir. MPO, uyarılmış olan nötrofillerden salındıktan sonra reaktif türlerin oluşumuna yol açmasının dışında prokarsinojenlerin karsinojen formuna dönüşmesinde rol oynamaktadır. Bu yolla da kanser gelişimine katkıda bulunmaktadır.
Kolorektal Kanser ve Oksidatif Stres
Kolonda lümen mukozası sürekli reaktif oksijen türlerinin etkisine maruz kalmaktadır. Bu maruziyet okside gıda artıklarından, yüksek düzeyde demir iyonlarından, oksidanlardan, toksinlerden, bakterilerden ve safra asitlerinden kaynaklanmaktadır (44).
Lipid peroksidasyon ürünlerinden MDA’nın karsinogeneziste anahtar rol aynadığı bilinmektedir. Nayak ve ark. (45) kolorektal kanserli hastalarda yaptıkları çalışmada lipid peroksidasyonunu yansıtan MDA seviyelerini kontrol grubuna göre yüksek bulmuşlardır. Leung ve ark. (46) cerrahi şansı olmayan olguların cerrahi olarak tedavi edilebilenlere göre plazma antioksidan düzeylerinin düşük, MDA düzeyinin ise yüksek olduğunu bildirmişlerdir. İleri evre tümör olgularının cerrahi şansını kaçırması nedeniyle lipid peroksidasyonunun tümör evresiyle birlikte artmış olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Rainis ve ark. (44) kolorektal kanserli hastalarda yaptıkları çalışmada kolonik tümör dokusuyla sağlam kolonik dokuda MDA ve lipid peroksid düzeylerine bakmışlar ve tümör dokusundaki seviyelerinin sağlam dokuya göre yüksek olduğunu görmüşlerdir. Aynı çalışmada kolon dokusunda lökosit enzimleri olan MPO ve adenozin deaminaz (ADA) düzeylerine bakmışlar ve MPO düzeyinin kolon dokusunda sağlam dokuya göre iki katına çıktığını, ADA düzeylerinde de artış olduğunu göstermişlerdir.
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Bu çalışma; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurul onayı alınarak (Ek 1) Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı araştırma laboratuvarında gerçekleştirildi.
HASTALARIN BELİRLENMESİ
Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı ve Özel Ekol Hastanesi Gastroenteroloji kliniğinde izlenen kolorektal kanser tanısı alan hastalar (n=21) ile sağlıklı kişiler (n=21) kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edildi.
Tanı konmuş diyabet, başka bir kanser, kronik böbrek yetmezliği, kronik inflamatuar hastalığı (kronik inflamatuar barsak hastalığı) olan hastalar, son bir hafta içinde; vitamin (A, E ve C vitaminleri), demir bağlayıcıları (Desferroksamin), ksantin oksidaz inhibitörleri (Allopurinol), trimetazidin, N-asetil sistein içeren ilaçlar (Asist), karnitin, probukol, anjiotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri, kortizon, asetil salisilik asit, nonsteroid antiinflamatuarlar gibi oksidan stresi etkileyen ilaçları kullananlar, alkol ve sigara kullananlar ve çalışmaya dahil olmak istemeyenler çalışma dışında bırakıldı. Çalışma kapsamına alınacak her bireye ''Bilgilendirilmiş gönüllü olur formu'' (Ek 2) okunarak bilgilendirildi, çalışmaya katılan kişi tarafından imzalanan formun bir kopyası katılımcıya verildi.
KAN ÖRNEKLERİNİN ALINMASI VE SAKLANMASI
Kontrol grubundan ve kolorektal kanserli hastalardan 12 saatlik açlıktan sonra sabah alınan venöz kan örnekleri biyokimya (antikoagülansız, düz) ve heparinli tüplere konarak Biyokimya Anabilim Dalı Laboratuvarı’na getirildi. 3000 rpm’de, 10 dk santrifüj edilip
plazma ve serumları ayrılarak çalışma gününe kadar –80 ºC’de saklandı.
KULLANILAN MALZEMELER
Kimyasal Maddeler
Asetik asit (CH3COOH) (Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
Bakır sülfat (CuSO4.5H2O) (Pancreac Monplet, madrid-İspanya)
Glisin (H2NCH2COOH) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Hidroklorik asit (HCl) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya) Kadmiyum granül (Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya) MPO elisa kiti (Hycult biotechnology)
n-Butanol (CH4H10O) (Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
N-Naftiletilendiamin dihidroklorür (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya) (C10H7NHCH2CH2NH2HCl)
NT elisa kiti (Hycult biotechnology)
Piridin (C5H5N) (Sigma Aldrich GmbH, Seelze-Almanya)
Potasyum nitrat (KNO3) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Sodyum hidroksit (NaOH) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya) Sodyum tetra borat (Na2B4O7. 10 H2O) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Sülfonilamid (C6H8N2O2S) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Tiyobarbitürik asid (C4H4N2O2S) (Merck KgaA, Darmstadt-Almanya)
Diğer Alet ve Cam Malzemeler
Cam malzemeler : Deney tüpleri, balon jojeler, beherler vd.
Distile su cihazı : Nüve, Almanya
Elektronik tartı : Sartorius AG, Almanya
Etüv : Memmert 400, Almanya
Manyetik karıştırıcı : Ikamag RH-Staufen, Almanya
Otomatik pipetler : Eppendorf, Socorex, Microlit
pH metre : Inolab pH level 1 WTW, Almanya
Soğutmalı santrifüj : Hettich Universal 30RF, Almanya
Spektrofotometre : Shimadzu UV-1700A, Japonya
Vorteks : Velp Scientificia, Almanya
BİYOKİMYASAL ÖLÇÜMLER
Miyeloperoksidaz Tayini
Plazma örneklerinde MPO seviyesi tayini, hycult biotechnology marka, HK324 no'lu kit kullanılarak çift sandviç ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) yöntemi ile ölçüldü. Tüm örneklerde çalışmalar iki kez tekrarlandı. 0, 0.4, 1.0, 2.6, 6.4, 16, 40 ve 100 ng/mL standart çözeltileri ile kalibrasyon eğrisi hazırlandı (Şekil 11). Regresyon analizi ile kalibrasyon eğrisinin denklemi bulundu, bu denklem kullanılarak plazma örneklerindeki MPO düzeyleri hesaplandı.
Miyeloperoksidaz kalibrasyon eğrisinin denklemi: y = 1.03951148 + 0.01727115x Miyeloperoksidaz (ng/mL) 100 10 1 0 1 , E -5 Absorbans 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
Nitrotirozin Tayini
Plazma örneklerinde NT seviyesi tayini, hycult biotechnology marka, HK501 no'lu kit kullanılarak çift sandviç ELISA yöntemi ile ölçüldü. Tüm örneklerde çalışmalar iki kez tekrarlandı. 0.0, 2.1, 6.2, 18.5, 55.6, 166.7, 500 ve 1500 nM standart çözeltileri ile kalibrasyon eğirisi hazırlandı (Şekil 12). Regresyon analizi ile kalibrasyon eğrisinin denklemi bulundu, bu denklem kullanılarak plazma örneklerindeki NT düzeyleri hesaplandı.
Nitrotirozin kalibrasyon eğrisinin denklemi: y = 0.5016967 + 0.00012148x Nitrotirozin (nM) 10000,00 1000,00 100,00 10,00 1,00 Ab so rb an s 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
Şekil 12. Nitrotirozin standart grafiği
Nitrik Oksit Tayini
Cortas ve ark. (47) tanımladıkları metoda göre spektrofotometrik olarak yapıldı. Plazmada nitratın nitrite dönüşümü kadmiyum granülleriyle sağlandıktan sonra nitrik oksit seviyeleri Griess ayıracı kullanılarak saptandı. Tüm örneklerde çalışmalar iki kez tekrarlandı. 10 mM KNO3 stok standart 10 mM sodyum borat içinde hazırlandı. Stok standarttan 25, 50,
kez çalışılarak kalibrasyon eğrisi hazırlandı (Şekil 13). Regresyon analizi ile kalibrasyon eğrisinin denklemi bulundu, bu denklem kullanılarak plazma örneklerindeki NO düzeyleri hesaplandı.
Nitrik oksit kalibrasyon eğrisinin denklemi: y = 0.00645652 + 0.00144713x KNO3 (uM) 200 150 100 50 0 Ab sorb a ns 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05
Şekil 13. Nitrik oksit standart grafiği
Malondialdehid Ölçümü
Prensip: Deneyin prensibi çoklu doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonu ile oluşan son ürünlerden biri olan MDA’nın sıcak ortamda TBA ile oluşturduğu bileşiğin pembe-kırmızı renginin 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır (48).
Deney: 200 µl serum üzerine %20’lik asetik asid ve %0.8’lik TBA eklendi. Tüpler kaynar su banyosunda 60 dakika bekletildikten sonra soğutularak üzerlerine n-butanol/piridin karışımı eklendi. Tüpler 1700xg’de 10 dakika santrifüj edilerek, butanol/piridin fazı
ayrıldıktan sonra butanol/piridin körüne karşı 532 nm dalga boyunda spektrofotometrede ölçüldü.
Tüm örneklerde çalışma ikişer kez tekrarlandı. Malondialdehitin 532 nm'deki molar absorptivitesi kullanılarak serumdaki MDA değerleri hesaplandı, sonuçlar nmol/mL olarak ifade edildi.
İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME
Verilerin istatistiksel değerlendirilmesi için Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı Bilgi İşlem Dairesi’nde bulunan Minitab Release 13 (Lisans no:WCP 1331.00197) paket programı kullanıldı. Her bir grupta verilerin parametrik varsayımları yerine getirip getirmediğini incelemek için normal dağılıma uygunluk ve varyansların homojenliği testleri yapıldı. İki grup arasındaki farklılıklar; Mann-Whitney U testi ile değerlendirildi. İki grubun yaş ortalamalarının karşılaştırılması Student’s t testi ile değerlendirildi. İki grubun cinsiyet dağılımlarının karşılaştırılması Ki kare testi ile değerlendirildi. Korelasyon analizi için Spearman testi kullanıldı. Elde edilen değerler ortalama±standart sapma (Ort±SD) olarak ifade edildi ve p<0.05’in altındaki farklılıklar anlamlı olarak değerlendirildi.
BULGULAR
Çalışmaya alınan olguların yaş ortalaması kolorektal kanser grubunda 60.52 yıl, kontrol grubunda 60.29 yıl olup istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (Tablo 2).
Tablo 2. Çalışmaya katılan olguların yaş ortalamaları dağılımları
Gruplar Yaş (yıl) *
Ort±SD
Kontrol (n=21) 60.29±13.67
Kolorektal kanser (n=21) 60.52±13.80 *: Student-t testi ile değerlendirme.
Kolorektal kanser grubunda 18 erkek, 3 kadın; kontrol grubunda da 18 erkek 3 kadın çalışmaya katılmış olup gruplar arasında cinsiyet dağılımı açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (Tablo 3).
Tablo 3. Çalışmaya katılan olguların cinsiyet dağılımları
Gruplar Cinsiyet
χ
Erkek Kadın
Kontrol (n=21) 18 3
Kolorektal kanser (n=21) 18 3
Kolorektal kanser grubunda plazma MPO düzeyi 64.70 ng/mL iken kontrol grubunda 51.02 ng/mL olarak saptandı. Kolorektal kanser grubunun plazma MPO düzeyi kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı (p<0.01) yüksek olduğu görüldü (Tablo 4, Şekil 14).
Tablo 4. Kontrol ve kolorektal kanser gruplarının plazma miyeloperoksidaz düzeyleri (Ort±SD)
Gruplar Plazma MPO
(ng/mL)§
Kontrol (n=21) 51.02±20.93
Kolerektal kanser (n=21) 64.70±19.79**
§: Mann-Whitney U testi ile değerlendirmede;
**: p<0.01.
MPO: Miyeloperoksidaz.
Şekil 14. Plazma miyeloperoksidaz düzeyleri
**: p<0.01. 51.02 64.70 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 Miyelopero ksidaz (ng/mL)
Kontrol Kolorektal Kanser **
