i
T.C.
NECMETTİN ERBAKAN ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Tezi
DİOSMETİNİN KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDEKİ (HCT 116) ANTİKARSİNOJENİK ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Miyase YÖRÜK
Danışman
Doç. Dr. Hatice Gül DURSUN
Bu araştırma Necmettin Erbakan Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından 191318006 proje numarası ile desteklenmiştir.
Konya-2021
ii TEZ ONAY SAYFASI
Necmettin Erbakan Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Öğrencisi Miyase YÖRÜK’ün “Diosmetinin Kolorektal Kanser Hücrelerindeki (HCT 116) Antikarsinojenik Etkinliğinin Araştırılması” başlıklı tezi tarafımızca incelenmiş; amaç, kapsam ve kalite yönünden Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
KONYA- 24/ 06/ 2021
Tez Danışmanı Doç. Dr. Hatice Gül DURSUN N.E.Ü. Meram Tıp Fakültesi
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
Üye Prof. Dr. Hasibe VURAL
N.E.Ü. Meram Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
Üye Dr. Öğr. Üyesi Mehmet Enes SÖZEN
Alanya Alaaddin Kekyubat Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Yukarıdaki tez, Necmettin Erbakan Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulunun …/…/.2021 tarih ve …../……sayılı kararı ile onaylanmıştır.
Prof. Dr. Kısmet Esra NURULLAHOĞLU ATALIK Enstitü Müdürü
iii
TEZ BEYAN SAYFASI
Bu tezin tamamının kendi çalışmam olduğunu, planlanmasından yazımına kadar hiçbir aşamasında etik dışı davranışımın olmadığını, tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, tez çalışmasıyla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları kaynaklar listesine aldığımı, tez çalışması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim.
24/ 06/ 2021 Miyase YÖRÜK
iv BENZERLİK RAPORU
Tezin Tam Adı: Diosmetinin Kolorektal Kanser Hücrelerinde (HCT 116) Antikarsinojenik Etkinliğinin Araştırılması
Öğrencinin Adı Soyadı: Miyase YÖRÜK Dosyanın Toplam Sayfa Sayısı: 66 sayfa
Danışman öğretim Üyesi Adı Soyadı: Doç. Dr. Hatice Gül DURSUN
v ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR
Bilim insanı olma yolundaki ilk adımımda bana yol gösteren, bilgi ve tecrübeleriyle akademik hayatımın anlamlı olmasını sağlayan çok değerli hocam ve tez danışmanım Doç. Dr. Hatice Gül DURSUN’a,
Bilimi çok sevmemi ve içimdeki araştırmacı ruhu ortaya çıkarmamı sağlayan her konuda bilgi ve tecrübeleriyle en büyük destekçilerim saygıdeğer Anabilim dalı hocalarım Prof. Dr. Ercan KURAR, Prof. Dr. Hasibe VURAL’a ve Doç. Dr. Hatice Gül DURSUN’a,
Tez çalışmam sırasında laboratuvar araştırmalarımda bilgi ve tecrübeleriyle hiçbir desteğini esirgemeyen Asistan hocam Arş. Gör. İlknur ÇINAR AYAN’a,
Bilgi birikim ve desteklerini esirgemeyen Asistan hocalarım Arş. Gör. Ebru GÜÇLÜ’ye Arş. Gör. Dr. Canan EROĞLU GÜNEŞ’e,
Kararlarım ve isteklerim karşısında beni canı gönülden destekleyen ve “Canın ne istiyorsa yap kızım, ben arkandayım” diyen sevgili annecim Songül YÖRÜK’e,
Hep yanımda olup beni destekleyen canım kardeşlerim; Fatma YÖRÜK, Semra YÖRÜK, Murat YÖRÜK, Selma YÖRÜK ve Zehra ESER’e ve yeğenim Taha ESER’e kızı olduğum için gurur duyduğum rahmetli babam Mehmet Ali YÖRÜK’e
TEŞEKKÜR EDERİM…
Bu tezi Babam Mehmet Ali YÖRÜK’e atfediyorum.
Miyase YÖRÜK
vi
İÇİNDEKİLER
Tez Kapağı ve İç Kapak ... i
Tez Onay Sayfası ... ii
Tez Beyan Sayfası ... iii
Benzerlik Raporu ... iv
Önsöz ve Teşekkür ... v
İçindekiler ... vi
Kısaltmalar ve Simgeler Listesi ... viii
Şekiller Listesi ... ix
Tablolar Listesi ... x
ÖZET ... xi
ABSTRACT ... xii
1. GİRİŞ VE AMAÇ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 3
2.1. Kanser ... 3
2.1.1. Kanserin Nedenleri ve Tedavisi ... 5
2.2. Kolorektal Kanser ... 9
2.2.1. İnsidans ve Mortalite ... 10
2.2.2. Risk Faktörleri ... 11
2.2.3. Tedavi ... 12
2.3. Kanser ve Apoptoz ... 13
2.3.1. Apoptoz Sırasında Hücrede Meydana Gelen Değişiklikler ... 14
2.3.2. Apoptoz Yolakları ... 15
2.3.2.1. İç Yolak (İntrinsik ya da Mitokondriyal Yolak) ... 15
2.3.2.2. Dış Yolak (Ekstrinsik ya da Ölüm Reseptör Yolağı) ... 16
2.3.3. Kanser Tedavisinde Apoptozun Rolü ... 17
2.3.4. Kanser Tedavisinde ve Önlenmesinde Fitokimyasallar ... 18
2.3.5. Diosmetin ... 21
2.4. Çalışmanın Hipotezi...22
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 23
3.1. Kullanılan Cihaz ve Sarf Malzemeler ... 23
3.2. Hücre Kültürü ... 25
3.2.1. HCT 116 Hücre Hattının Dondurulması ... 26
vii
3.2.2. HCT 116 Hücre Hattının Çözdürülmesi ... 26
3.2.3. HCT 116 Hücre Hattının Pasajlanması ... 27
3.2.4. Etken Madde Dozlarının Hazırlanması ... 27
3.2.5. Hücre Sayımı ... 28
3.3. XTT Testi ... 28
3.4. Koloni Oluşum Testi ... 29
3.5. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Analizi ... 29
3.5.1. Total RNA İzolasyonu ... 30
3.5.2. RNA örneklerinin Yatay Jel Elektroforezinde Yürütülmesi ... 30
3.5.3. DNase Uygulaması ... 31
3.5.4. cDNA sentezi ... 31
3.5.5. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ... 32
3.6. DNA Fragmentasyon Testi ... 32
3.7. İstatistiksel Analiz ... 33
4. BULGULAR ... 34
4.1. Diosmetinin HCT 116 Hücreleri Üzerindeki Sitotoksik Etkisi ... 34
4.2. Diosmetinin Koloni Oluşumu Üzerindeki Etkisi ... 35
4.3. Diosmetinin, Apoptoz ve Hücre Döngüsü ile İlişkili Genlerin Ekspresyonu Üzerindeki Etkisi ... 35
4.4. DNA Fragmentasyon Analizi ... 36
5. TARTIŞMA ... 38
6. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 44
7. KAYNAKLAR ... 45
8. ÖZGEÇMİŞ ... 53
9. EKLER ... 54
Ek-1: Etik Kurul Kararı ... 54
viii
KISALTMALAR VE SİMGELER LİSTESİ
AIF : Apoptozis Inducing Factör
APAF-1 : Apoptotik Proteaz Aktive Edici Faktör
CO2 : Karbondioksit
DD : Ölüm Resöptörlerinde Bulunan Ölüm Alanı Diosmetin : 3’5,7-trihidroksi-4’metoksiflavon
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Besi yeri DMSO : Dimetil Sulfoksit
EMT : Epitel Mezenkimal Geçiş
ERK : Hücre Dışı Sinyallerle Düzenlenen Kinaz FADD : Fas Associated Death Domain
HCT 116 : İnsan Kolon Karsinoma Hücre Hattı IAP : Apoptoz Proteinleri İnhibitörleri KRK : Kolorektal Kanser
ml : Mililitre
mM : Milimolar
NF-KB : Nükleer Faktör Kappa B DNA’yı (transkripsiyon faktörü)
P53 : Tümör Protein 53
PAGE : Poliakrilamid Jel Elektroforezi
qPRZ : Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ROS : Reaktif Oksijen Türleri
TNF : Tümör Nekroz Faktör
TNFR : Tümör Nekroz Faktör Reseptörü
XTT : Sodyum 3′-[1-[(fenilamino)-karbonil]-3,4-tetrazolyum]-bis(4- metoksi-6-nitro)benzen-sülfonik asit hidra
µl : Mikrolitre
µM : Mikromolar
ix
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil No Sayfa No
Şekil 2.1. Kanserin ayırt edici özellikleri ve bu özelliklerle ilişkili proteinlerin
fonksiyon/ekspresyon değişiklikleri ... 4
Şekil 2.2. Karsinogenezin evreleri. ... 6
Şekil 2.3. Kanser gelişimini etkileyen faktörler. ... 8
Şekil 2.4. Kolorektal karsinogenez sürecinde rol oynayan moleküler yolaklar..11
Şekil 2.5. İç (İntrinsik) ve dış (ekstrinsik) apoptoz yolakları ... 17
Şekil 2.6. Fitokimyasalların sınıflandırılması ... 21
Şekil 2.7. Diosmetinin kimyasal yapısı ... 22
Şekil 3.1. HCT116 hücre hattının (ters )inverted mikroskop görüntüsü. ... 26
Şekil 3.2. RNA’nın yatay jel elektroforez görüntüsü. ... 31
Şekil 4.1. XTT proliferasyon testinin 48. saatteki renk değişimi görüntüsü ... 34
Şekil 4.2. Diosmetinin doz ve zaman bağımlı olarak HCT 116 hücre hattındaki hücre canlılığı üzerine etkisi. ... 34
Şekil 4.3. Diosmetinin farklı dozlarının koloni oluşumları üzerine etkisi. ... 35
Şekil 4.4. Diosmetin uygulamasının HCT 116 hücrelerinde DNA fragmentasyon oranlarına etkisi ... 37
x
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo No Sayfa No
Tablo 3.1. Çalışmada kullanılan makine ve teçhizat listesi. ... 23
Tablo 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasallar ve sarf malzemeler ... 24
Tablo 3.3. Çalışmada kullanılan kitler ... 25
Tablo 3.4. HCT 116 hücre hattının özellikleri ... 25
Tablo 4.1. Diosmetinin IC50 dozu ile muamele edilen HCT 116 hücre hattında, apoptoz ve hücre döngüsü ile ilişkili genler üzerindeki etkisi. ... 36
xi
ÖZET
T.C.
NECMETTİN ERBAKAN ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Diosmetinin Kolorektal Kanser Hücrelerinde (HCT 116) Antikarsinojenik Etkinliğinin Araştırılması
Miyase YÖRÜK Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi / Konya - 2021
Kolon ve rektumda ortaya çıkan tümörlerle karakterize olan kolorektal kanser (KRK), erkeklerde tüm kanserler arasında insidans ve mortalite açısından 3., kadınlarda ise insidans açısından 2. ve mortalite açısından 3. sırada yer almaktadır. KRK prognozu hastalığın evresine bağlıdır. KRK tanısı hastaların yaklaşık üçte birinde metastatik süreç başladıktan sonra konulabilmektedir. İlerlemiş KRK’da 5 yıllık sağkalım oranları da düşüktür. Erken evrede tanı alabilen ve tedavisine başlanan hastalarda da nüks oranının yüksek olması, bir süre sonra kemo-rezistans gelişmesi ve tedavide kullanılan terapötiklerin sitotoksisitelerinin yüksek olması tedavi başarısını olumsuz etkilemektedir.
Daha başarılı ve daha az yan etkili terapötik ajan adayları olarak yıllardır fitokimyasallar üzerinde çalışılmaktadır. Bu fitokimyasallardan biri de Diosmetindir.
Baklagiller ve turunçgiller gibi birçok bitkide bulunan diosmetinin anti-bakteriyel, anti- inflamatuvar, anti-mutajenik ve anti-karsinojenik etkilere sahip olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada diosmetinin KRK hücre hattı HCT 116 hücrelerindeki anti-karsinojenik etki mekanizmasının ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak; diosmetinin sitotoksisitesinin ve proliferasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için XTT testi ve koloni oluşum testi yapılmış, antikarsinojenik etkisini apoptoz üzerinden gösterip göstermediğinin anlaşılması için de apoptoz ve hücre döngüsü ile ilişkili genlerin ekspresyonları Real time-PCR yöntemi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca apoptozu doğrulamak üzere ELISA yöntemi ile DNA fragmentasyon analizi gerçekleştirilmiştir.
XTT testi sonucunda diosmetinin IC50 değeri 7,5 µM olarak bulunmuş ve çalışmanın sonraki kısımlarına IC50 değerinin bir alt ve bir üst dozu da dahil edilerek toplam üç doz (5 µM, 7,5 µM ve 10 µM) ile devam edilmiştir. Koloni oluşum testinde diosmetinin doz-bağımlı şekilde koloni oluşumunu inhibe ettiği görülmüştür (Kontrol, 5 µM, 7,5 µM ve 10 µM dozlar için koloni sayısı sırasıyla 476±15,1;
248,33±3,51; 201±30,44 ve 106,33±8,14). Gen ekspresyon analizlerinde apoptoz-ilişkili genlerden TP53, BAX, KASPAZ 3, KASPAZ 7, KASPAZ 8, KASPAZ 9, KASPAZ 10, FAS, FADD, CYCS, TNF, TNFR2’nin ekspresyon seviyelerinde anlamlı düzeyde artış (p<0.05) ve BCL-2 gen ekspresyon seviyesinde ise anlamlı düzeyde azalış (p<0,05) gözlenmiştir. Hücre döngüsü-ilişkili genlerinden RB1 gen ekspresyon seviyesinde anlamlı düzeyde bir artış (p<0,05) ve E2F4, CCND3, CDK4, CDK6 gen ekspresyon seviyelerinde ise anlamlı düzeyde azalış (p<0,05) belirlenmiştir. DNA fragmentasyon analizinde de apoptozun belirteçlerinden olan DNA fragmentasyonunun doz gruplarında kontrole göre doza-bağlı şekilde artış gösterdiği tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, diosmetin KRK hücre hattı HCT 116 hücrelerinde proliferasyonu baskılayarak ve apoptozu uyararak anti-karsinojenik etki göstermiştir. Hücre döngüsü-ilişkili genlerdeki ekspresyon değişiklikleri diosmetinin anti-proliferatif etkisini hücre döngüsünü durdurarak gerçekleştirdiğini düşündürmektedir. Hem iç (intrinsik) yolak-ilişkili genlerdeki hem de dış (ekstrinsik) yolak-ilişkili genlerdeki ekspresyon değişiklikleri, diosmetinin her iki apoptoz yolağı üzerinden de etkili olduğunu ortaya koymaktadır.
Anahtar Kelimeler: Anti-kanserojen, Apoptoz, Diosmetin, HCT 116.
xii
ABSTRACT
REPUBLIC OF TURKEY
NECMETTIN ERBAKAN UNIVERSITY HEALTH SCIENCES INSTITUTE
Investigation of Anticarcinogenic Activity of Diosmetin on Colorectal Cancer Cells (HCT 116)
Miyase YÖRÜK
Department of Medical Biology Master Thesıs / Konya - 2021
Colorectal cancer (CRC), which is characterized by tumors arising in the colon and rectum, ranks 3rd in terms of incidence and mortality among all cancers in men, 2nd in incidence and 3rd in terms of mortality in women. The prognosis of CRC depends on the stage of the disease. The diagnosis of CRC can be made after the metastatic process has started in approximately one third of the patients.
5-year survival rates are also low in advanced CRC. The high recurrence rate, development of chemo- resistance after a while, and high cytotoxicity of the therapeutics used in the treatment negatively affect the success of the treatment in patients who can be diagnosed at an early stage and whose treatment is started. Phytochemicals have been studied for years as candidates for more successful and less side- effect therapeutic agents. One of these phytochemicals is Diosmetin.
It is known that diosmetin, which is found in many plants such as legumes and citrus fruits, has anti-bacterial, anti-inflammatory, anti-mutagenic and anti-carcinogenic effects. In this study, it was aimed to reveal the anti-carcinogenic mechanism of action of diosmetin in CRC cell line HCT 116 cells.
For this purpose; XTT test and colony formation test were performed to determine the cytotoxicity of diosmetin and its effect on proliferation, and the expressions of genes related to apoptosis and cell cycle were evaluated by Real time-PCR method to understand whether it shows its anticarcinogenic effect through apoptosis. In addition, DNA fragmentation analysis was performed by ELISA method to confirm apoptosis.
As a result of the XTT test, the IC50 value of diosmetin was found to be 7,5 µM, and three doses (5 µM, 7,5 µM and 10 µM) were included in the next parts of the study, including one lower and one higher IC50 value. In the colony formation test, diosmetin was found to inhibit colony formation in a dose-dependent manner (Colony count for Control, 5 µM, 7,5 µM, and 10 µM doses, respectively 476±15.1; 248.33±3.51; 201±30.44 and 106.33±8.14). In gene expression analyzes, the expression levels of apoptosis-related genes TP53, BAX, CASPASE 3, CASPASE 7, CASPASE 8, CASPASE 9, CASPASE 10, FAS, FADD, CYCS, TNF, TNFR2 were significantly increased (p<0.05) and BCL- A significant decrease (p<0.05) was observed in 2 gene expression levels. A significant increase (p<0.05) in RB1 gene expression levels and a significant decrease (p<0.05) in E2F4, CCND3, CDK4, CDK6 gene expression levels were determined. In DNA fragmentation analysis, it was determined that DNA fragmentation, which is one of the markers of apoptosis, increased in a dose-dependent manner in the dose groups compared to the control.
In conclusion, diosmetin showed anti-carcinogenic effect by suppressing proliferation and stimulating apoptosis in CRC cell line HCT 116 cells. Expression changes in cell cycle-related genes suggest that diosmetin exerts its anti-proliferative effect by arresting the cell cycle. Expression changes in both intrinsic pathway-related genes and extrinsic pathway-related genes suggest that diosmetin acts on both apoptosis pathways.
Key Words: Anti-carcinogene, Apoptosis, Diosmetin, HCT 116.
1 1. GİRİŞ VE AMAÇ
Uluslararası Kanser Araştırma Ajansının (IARC) 2020 yılındaki GLOBOCAN verilerine göre, kolorektal kanser (KRK) insidans ve mortalite açısından kanserler içerisinde ilk üçte yer alır (Sung ve ark. 2021). KRK hastalarının yaklaşık % 20- 30’unda, ancak ileri evrede tanı konulabilmektedir. Erken evrede tanı alıp tedavi edilenlerin % 40-50’sinde ise nüks görülmektedir. İleri evrede tanı konulup tedaviye alınanlarda 5 yıllık sağkalım oranları son derece düşüktür (Rodriguez-Salas ve ark.
2017). KRK tedavisinin ana omurgasını cerrahi, neoadjuvan radyoterapi, adjuvan kemoterapi ve hedefe yönelik tedaviler oluşturmaktadır (Van der Jeught ve ark. 2018).
Daha yüksek tedavi başarısı ve daha az yan etki beklentisi ile birçok bitki-türevli ajan kanser kemoterapisi için büyüteç altına alınmıştır. Bu bitkisel türevli ajanlar bitkilerin ürettiği “sekonder metabolitler” diye adlandırılan biyoaktif bileşiklerdir. Bunların arasında alkaloidler, flavonoidler, fenoller, glikozitler, saponinler, tanenler, uçucu yağlar, zamklar ve reçineler bulunur (Matsuda ve ark. 2018). Bu bileşikler kanser oluşumunu aktive eden proteinleri, enzimleri ve sinyal iletim yolaklarını inhibe ederek ya da DNA tamir mekanizmasını ve apoptozu uyaran proteinleri aktive ederek ve/veya antioksidan işlevleri indükleyerek anti-karsinojenik fonksiyonlarını yerine getirirler (Iqbal ve ark. 2017). Bu bileşenlerden biri olan Diosmetin polifenollerin flavonoid alt sınıfına ait bir flavonoldür. Maydanoz, turunçgiller, kasımpatı, kekik, zeytin ve baklagil yapraklarında bolca bulunur (Yoshikawa ve ark. 2000; Lin ve Harnly 2010;
Abad-García ve ark. 2014).
Apoptozu hedeflemek kanser tedavisinin ana stratejilerinden birisidir. Nitekim klinik kullanımda olan kanser terapötik ilaçlarının çoğu apoptozu indüklemektedir (Liu ve ark. 2015). Birçok karmaşık sinyal iletimini içeren apoptoz, çok sıkı bir şekilde düzenlenmektedir (Majno ve Joris 1995). Başlıca iki yolak üzerinden meydana gelir:
1. “İç Yolak” (İntrinsik ya da Mitokondriyal Yolak). Bu yolak onarılamayan genetik hasar, hipoksi, büyüme faktörü eksikliği, sitoplazmik Ca+2 konsantrasyonunda artış ve şiddetli oksidatif stres gibi faktörlerin varlığında devreye girer; mitokondri ve mitokondriyal proteinler kullanılır (Oren ve Rotter 1999). Bu yolağın düzenlenmesinde BCL-2 (B-cell Lymphoma 2) ailesine ait bir grup protein rol oynar:
“Pro-apoptik BCL-2 proteinleri” ve “Anti-apoptik BCL-2 proteinleri” (Carneiro ve Deiry 2020). 2. Dış Yolak (Ekstrinsik ya da Ölüm Reseptör Yolağı). Ölüm reseptörleri adı verilen hücre yüzey reseptörlerine hücre dışı ligandların bağlanmasıyla aktive olan
2 apoptoz yolağıdır. Bu yolaktaki ölüm reseptörleri ve bu reseptörlere bağlanan ligandları: TNFR1-TNFα, FAS (CD95, APO-1)-FASL, TRAILR1 (DR4)-TRAIL ve TRAILR2 (DR5)-TRAIL’i kapsar.
Bu çalışmada diosmetinin KRK hücre hattı HCT 116 hücrelerindeki anti- karsinojenik etki mekanizmasının ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak; diosmetinin sitotoksisitesinin ve proliferasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için XTT testi ve koloni oluşum testi yapılmış, antikarsinojenik etkisini apoptoz üzerinden gösterip göstermediğinin anlaşılması için de apoptoz ve hücre döngüsü ile ilişkili genlerin ekspresyonları Real time-PCR yöntemi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca apoptozu doğrulamak üzere ELISA yöntemi ile DNA fragmentasyon analizi gerçekleştirilmiştir.
3 2. GENEL BİLGİLER
2.1. Kanser
Kanser DNA’daki ve gen ekspresyonundaki çoklu değişikliklerden kaynaklanan, kontrolsüz anormal çoğalan ve uzak bölgelere de yayılma potansiyeline sahip hücre popülasyonunun ortaya çıkmasıyla karakterize olan genetik bir hastalıktır (Forcados ve ark. 2017). Tüm dünyada insan hayatını en çok tehdit eden hastalıklardan birisi olan kanser, ölümlerin en yaygın nedenlerindendir (Zarei ve ark. 2016; Heron 2018). Dünya Sağlık Örgütünün bir alt kuruluşu olan Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) tarafından oluşturulan GLOBOCAN veritabanının verilerine göre 2020 yılı için kansere bağlı ölüm sayısının dünya genelinde 10 milyona ve yeni vaka sayısının da 19.3 milyona ulaştığı tahmin edilmektedir. Yine aynı verilere göre kadın ve erkeklerdeki en sık tanı alan ilk beş kanser sırasıyla meme, akciğer, kolorektal, prostat ve mide kanserleri iken; kanser-nedenli ölümlerin sıralamasında ilk beşte akciğer, kolorektal, karaciğer, mide ve meme kanserleri yer almaktadır (Sung ve ark. 2021).
Kanserden ölüm oranları 1991’den günümüze kadar toplamda % 29’luk bir düşüş göstermiştir. Kanser nedenli ölüm oranlarındaki bu önemli düşüşün özellikle sigara tüketiminin azalmasından ve buna bağlı olarak akciğer kanser mortalitesinin düşmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Ayrıca kanser taramaları sayesinde erken teşhis olanaklarının artması ve hedefe yönelik uygulanan tedaviler de bu düşüşte rol oynamaktadır (Siegel ve ark. 2020a). 2016 yılındaki Türkiye İstatistik Kurumu (TÜİK) verilerine göre; ülkemizde ölümlerin % 20’sini kanserler oluşturur. Kanserler içerisinde en çok ölüm erkeklerde; soluk borusu, bronş ve akciğerdeki kötü huylu tümörlere bağlı olurken; kadınlarda ise meme kanseri en sık ölüm nedenidir (Gültekı̇n ve Boztaş 2016).
Kanser hücreleri kendilerini normal hücrelerden ayıran bazı ortak karakteristik özellikler gösterirler. Bu özelliklerden 6'sı Hanahan ve Weinbers tarafından “kanserin ayırt edici özellikleri” olarak 2011 yılında tanımlanmıştır (Şekil 2.1) (Hanahan ve Weinberg 2011).
1. Sınırsız replikasyon yeteneği 2. Kendi büyüme sinyallerini üretme 3. Büyüme karşıtı sinyallere duyarsızlık 4. Apoptozdan kaçış
5. Anjiogenez
6. Doku invazyonu ve metastaz
4 Karsinogenez sürecinin ve bu süreçte etkili olan moleküler olayların daha iyi anlaşılmasıyla daha sonraları bu listeye immün sistemden kaçış, inflamasyon artışı, genomik instabilite artışı, bozulmuş metabolik yolaklar ve farklılaşmamış durumda kalma gibi özellikler de eklenmiştir (Hanahan ve Weinberg 2011; Parker ve Metallo 2015).
Şekil 2.1. Kanserin ayırt edici özellikleri ve bu özelliklerle ilişkili proteinlerin fonksiyon/ekspresyon değişiklikleri (Hanahan ve Weinberg 2011).
Karsinogenez hücrelerin giderek artan anormal proliferatif ve invazif karakter kazandığı çok basamaklı bir süreçtir. Tümör hücrelerinde biriken mutasyonlar bu sürecin yönetilmesinde ve seyrinde önemli rol oynar. Ortaya çıkan ilk mutasyonun sınırlı bir yayılıma yol açtığı; sonra edinilen her bir mutasyonun ise daha güçlü bir çoğalma potansiyeli kazandırarak klonal bir seçilim ve büyümeye neden olduğu öngörülmektedir. Karsinogenezin çok basamaklı sürecini kolorektal kanser gibi bazı kanserlerde gözlemek mümkündür: Pre-malign hücre büyümesi ile malign hücre oluşumu arasındaki süreç, “benign adenom → in situ karsinom → invazif karsinom
→ lokal/uzak metastaz” şeklindeki çoklu basamaklar halinde ayırt edilebilmektedir (Coleman ve Tsongalis 2006).
5 Deneysel ve epidemiyolojik çalışmalar karsinogenezin üç evreye ayrılabileceğini göstermiştir: 1. İnisiyasyon, 2. Promosyon ve 3. Progresyon.
İnisiyasyon evresi, normal hücrelerde meydana gelen ilk genetik değişikliklerle başlar.
Bu değişiklikler kanser gelişiminde kritik olan protoonkogenlerde, tümör baskılayıcı genlerde veya DNA tamir sistemi genlerinde meydana gelir ve hücrelerde çoğalma yeteneğinin artmasına yol açar. Değişikliklerle henüz neoplazik olmayan hücreler neoplazi yolundaki ilk adımı atmış olurlar (Ortega ve Campos 2019). Bu başlatıcı mutasyonlar depürinasyon ve deaminasyon gibi zaten hücrede meydana gelmekte olan olaylarla ya da replikasyon hatalarıyla da desteklenir (Oliveira ve ark. 2007).
Promosyon evresi, hücrelerin klonal yayılımının gerçekleştiği evredir. Klonal yayılma hücreleri onları malign karaktere dönüştürecek genetik değişikliklere yatkın hale getirir. Bu süreç hormonlar ve büyüme faktörleri de dahil olmak üzere hücre bölünmesini teşvik eden moleküller ya da dış kaynaklı bileşenler tarafından desteklenir (Ortega ve Campos 2019).
Progresyon evresi, pre-neoplastik lezyonların ve/veya benign neoplazilerin yeni genetik ve epigenetik değişikliklerle malign lezyonlara dönüştüğü son evredir.
Artan mutasyonlar ve oluşan genomik instabilite hücrelerin son derece proliferatif, metastatik ve apoptik mekanizmalardan yoksun bir karakter kazanmasına yol açar. Bu evrede sürece epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve anjiyogenez de eşlik eder (Şekil 2.2; Ortega ve Campos 2019).
2.1.1. Kanserin Nedenleri ve Tedavisi
Kansere sebep olan faktörleri “İntrinsik Faktörler” ve “Ekstrinsik Faktörler”
olarak iki başlık altında değerlendirmek mümkündür. İntrinsik faktörlerin başında mutasyonlar, inflamasyon ve oksidatif stres gelir. Ekstrinsik faktörler ise hayat tarzı, beslenme, enfeksiyonlar, çevresel kimyasal ve fiziksel ajanlardan oluşur. Kanser gelişiminde rol oynayan mutasyonlar “sürücü mutasyonlar” olarak adlandırılır.
Proliferasyona doğrudan etkisi olmayan ancak sürücü mutasyonların kazanılmasıyla ortaya çıkan mutasyonlar da “yolcu mutasyonlar”dır. Kansere yol açan mutasyonlar protoonkogenleri ve tümör baskılayıcı genleri ve bu genlerin protein ürünlerini etkiler.
Mutasyonlar protoonkogenlerin onkogenlere dönüşmesinde ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonunda etkili olurlar. Protoonkogen-onkogen dönüşümü sinyal iletim yolaklarının hiperaktivasyonuna yol açarak hücrelerin kontrolsüz çoğalmasına neden olur.
6
Şekil 2.2. Karsinogenezin evreleri.
Tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu neticesinde de sinyal iletiminin negatif regülatörleri veya hücre proliferasyonunun frenleyici elemanları etkisiz hale gelir (Reagan 2019). Onkogenler büyüme faktörlerini, büyüme faktörü reseptörlerini (EGFR, PDGFR gibi), sinyal aktarım proteinlerini (Ras, abl, ß-catenin gibi), hücre döngüsü düzenleyicilerini (siklin D, Cdk4 gibi) ve transkripsiyon faktörlerini (myc gibi) kodlayan genlerden oluşur. Tümör baskılayıcı genler ise hücre yüzey proteinlerini (TGF- ßR gibi), hücre iskeleti proteinlerini (NF2 gibi), transkripsiyon faktörlerini (RB1, p53 gibi), hücre döngüsünün düzenleyicilerini, apoptozda görev alan proteinleri (BCL-2, BCL-XL, BAX gibi) ve DNA tamir sistemi proteinlerini (XP, HNPCC, MLH1, ATM, BRCA1 ve BRCA2 gibi) kodlayan genleri içerir (Liu ve ark.
2016a). Kronik inflamasyon kanser için en büyük risk faktörlerinden birisidir, nitekim kanserlerin % 20 kadarının kronik inflamasyonla ilişkili olduğu düşünülmektedir (Reagan 2019).
7 Kanser oluşumunu etkileyen faktörler sürekli olarak araştırma konusu olmuştur. 1950’de Dünya Sağlık Örgütünün sponsorluğunda düzenlenen bir sempozyumda, dünyanın farklı bölgelerinde görülen kanser türlerindeki dramatik farklılıklar katılımcıların ilgisini çekmiştir. Başka ülkelere göç edenlerin anavatanlarında en çok görülen kanserlerden ziyade göç ettikleri ülkelerde/bölgelerde en çok görülen kanser türlerinden etkilendiklerinin ortaya konulmuş olması çoğu kanser türünün kalıtsal ve genetik faktörlerden çok, çevresel maruziyetler ile ilintili olduğunu ortaya koymuştur. Sempozyum 1965 yılında insan kanserlerinin nedenleri üzerine multidisipliner araştırmalar yürütmesi için IARC’ın kurulmasına önayak olmuştur. Böylece kanser nedenlerini araştırmak için pek çok çevresel ajan üzerinde epidemiyolojik ve deneysel kanıtlara dayalı incelemelerde bulunulmuştur. Bu çalışmalarda çeşitli mesleklerin kanser oranlarının artışı ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Boya işçilerinin mesane kanserine, petrol işçilerinin skrotal kansere, maden işçilerinin akciğer kanserine, radyologların özellikle X ışınlarının keşfedildiği yıllarda sürekli kendileri üzerinde denemeleri sonucunda cilt kanserine yakalanma oranlarının yüksek olduğu görülmüştür (Blackadar 2016). Bugün artık bazı plastik kimyasalların, polinükleer hidrokarbonların, asbest liflerinin, bazı metal bileşiklerin, katran ve ziftin, radyasyonun (X-ışını radyasyonu, toprak radonu ve ultraviyole radyasyonu), bazı ilaçların (immün yetmezliğe neden olan ilaçlar, bazı antineoplastik ajanlar ve hormonlar), bazı bakterilerin (Helicobacter pylori gibi) ve virüslerin (EBV [Epstein- Barr virüsü], HPV [İnsan papilloma virüsü], HBV [hepatit B virüsleri], HCV [Hepatit C virüsü], KSHV [Kaposi sarkomu ilişkili herpes virüsü], HIV [İnsan immün yetmezlik virüsü] kansere neden olduğu bilinmektedir (Ameri 2019; Reagan 2019).
Ayrıca tütün dumanı ve silika, alkol, batı tarzı beslenme ve obezite de önemli risk faktörlerinin arasındadır (Reagan 2019). Kanser gelişiminin tek bir nedeni yoktur.
Yukarıda bahsi geçen faktörlerin her biri tek başına kanseri başlatmak için yeterli değildir. Kanser gelişimi genetik, çevresel veya bireysel yapısal özellikleri kapsayan birçok faktörün birbiriyle etkileşmesi sonucunda gerçekleşen çok basamaklı bir süreçtir (Şekil 2.3; Ameri 2019; Reagan 2019).
8
Şekil 2.3. Kanser gelişimini etkileyen faktörler.
Kanserler tümörün tipi ve evresine göre belirlenen tedavi seçenekleri ile multimodal bir yaklaşımla tedavi edilir. Bu seçeneklerin içerisinde cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi gibi geleneksel yöntemlerin yanında hedefe yönelik kemoterapi, ablatif tedavi ve immünoterapi gibi yöntemler de bulunur (Hines 2018; Yıldızhan ve ark.
2018). Nitekim son yıllarda daha etkili kanser tedavilerinin geliştirilmesi ile kanserden sağkalım önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, bu güçlü tedavilerin kullanımı, neredeyse her organ sistemini etkileme potansiyeline sahip olan toksisiteler ve yan etkilerle ilişkilidir. Bu etkilerden bazıları geçici olmakla birlikte; bazıları da kalıcı sekellere yol açar (Hines 2018). Geleneksel kemoterapi, hızla bölünen hücreleri hedef alan ve replikasyona müdahale eden sitotoksik ilaçların kullanımını içerir. Etki mekanizmasına göre sınıflara ayrılırlar: alkilleyici ajanlar, antimetabolitler, antibiyotikler, mikrotübül inhibitörleri, topoizomeraz inhibitörleri, hormonal ajanlar ve çeşitli karışık veya karma mekanizmalı ilaçlar. Hedeflenen kemoterapi, tümör hücresi çoğalması ve göçünde yer alan spesifik süreçlere yönelik bir dizi kemoterapötik ilaç kullanımını kapsar. Bu kemoterapötik ilaçlarla büyüme faktörlerinin, reseptörlerinin veya bunlarla ilişkili tirozin kinazların bloke edilmesi amaçlanır. Hedeflenen tedaviler arasında EGF ve VEGF gibi hücre dışı reseptörler üzerinde etki yapan monoklonal antikorlar ve hücre zarlarına nüfuz eden ve hücre içi sinyal yollarını bloke eden küçük moleküller yer alır. Kanser hücrelerinin mutasyona uğrama ve hedefe yönelik tedavilere direnç geliştirme yeteneklerinin üstesinden
9 gelmek için, hedefe yönelik tedaviler genellikle geleneksel kemoterapi ile birlikte uygulanır. Radyoterapide kanser hücrelerinin DNA'larına zarar verilerek yok edilmesi için yüksek enerjili ışınlar, X ışınları, gama ışınları, elektron ışımaları ya da protonlar gibi radyasyon kullanılır. Tedavi tek başına verilebileceği gibi cerrahi ya da kemoterapi ile kombine edilebilir (Unal ve ark. 2018; Hines 2018). Kanser tedavisindeki bir başka seçenek olan ablatif tedaviler ise kanser hücrelerinin bölgesel olarak yok edilmesini içerir. Tümör hücrelerini koagüle etmek, parçalamak ya da kemoterapinin etkinliğini artırmak için fosfolipid tabakalarını bozmak gibi amaçlarla tümör dokusuna doğrudan radyofrekans, lazer, ısı, soğuk veya elektrik alanı uygulanır.
Radyofrekans ablasyonu (RFA), mikrodalga ablasyonu, lazer intertisyel termal terapi (LITT), kriyoterapi ve elektroporasyon bu amaçlarla kullanılan ablasyon teknikleridir (Hines 2018). İmmünoterapide ise immün sistemin uyarılıp güçlendirilmesi ve kanser ile olan spesifik mücadelesine yardım edilmesi amaçlanır. Farklı kanser türlerinde farklı immünoterapi yöntemleri tek başına ya da diğer tedavi seçenekleriyle kombine edilerek uygulanabilir. Kullanılan immünoterapi yöntemleri monoklonal antikorları, immün sistem kontrol nokta inhibitörlerini, kanser aşılarını, sitokinleri, immünomodülatör ilaçları, kimerik antijen reseptör yüklü T hücre tedavisini (CAR T- Cell), tümör infiltre eden lenfositleri (TIL) kapsar (Unal ve ark. 2018; Yildizhan ve ark. 2018).
2.2. Kolorektal Kanser
Kolorektal kanser (KRK), gastrointestinal sistemin kısımları olan kolon ve rektumda ortaya çıkan heterojen bir hastalıktır. KRK'nin çoğunluğu adenomatöz poliplerden veya adenomlardan yavaş ilerleyen bir süreç içerisinde gelişir (Levine ve Ahnen 2006). Bu süreç neoplastik öncü lezyonlara dönüşen ve yaklaşık 10-15 yıllık bir süre içinde KRK’ye ilerleyen anormal bir kript ile başlar (Dekker ve ark. 2019).
KRK’nin büyük çoğunluğunda orijin hücrenin bir kök hücre ya da kök hücre benzeri bir hücre olduğu varsayılmaktadır. Bu kanser kök hücreleri tümör supressör genleri inaktive ve onkogenleri aktive eden genetik ve epigenetik değişikliklerin birikiminin eseridir. Kolonik kriptlerin tabanında bulunan bu hücrelerin tümörün başlatılması ve sürdürülmesi için gerekli olduğu düşünülmektedir (Medema 2013; Nassar ve Blanpain 2016). KRK’nin % 90’ı sporadik iken, % 10 kadarı da kalıtsal özellik ya da genetik yatkınlık göstermektedir (Bogaert ve Prenen 2014). Sporadik KRK için yaklaşık 30 yıl önce tanımlanan çok aşamalı kolorektal karsinogenez modeli hala geçerliliğini
10 korumaktadır. Bu modele göre süreç APC gen mutasyonlarının kazanılmasıyla başlamakta ve ardından bunu KRAS onkogeninin aktivasyonu, TP53 tümör baskılayıcı genin inaktivasyonu, anöploidi ve heterozigosite kaybı (LOH) gibi çoklu mutasyonların birikimi izlemektedir (Fearon ve Vogelstein 1990). Son zamanlarda serrated adenomlar sayesinde alternatif KRK karsinogenez yolakları da tanımlanmıştır. Bugün için KRK karsinogenezinde rol oynayan, klinik özellikleri ve prognozu da etkileyebilen en az üç moleküler yolak olduğu kabul edilmektedir (Bogaert ve Prenen 2014; Gonzalez-Ponsve Cruz-Correa 2015) (Şekil 2.4). Birincisi sporadik KRK’lerin % 70’inden sorumlu olan kromozomal instabilite (KIN) yolağıdır.
Bu yolak tümör baskılayıcı gen lokuslarında heterozigosite kaybı ve kromozomal yeniden düzenlemeler ile karakterizedir. Ayrıca APC, KRAS, PIK3CA, BRAF, SMAD4, TP53 gibi tümör baskılayıcı genlerde ve onkogenlerde biriken mutasyonlar da sürece dahil olur. İkinci yolak hatalı eşleşme tamir sistemi (mismatch repair, MMR) genlerinin disfonksiyonunun yol açtığı mikrosatellit instabilite (MSI) yolağıdır.
KRK’nın kalıtsal formlarından biri olan HNPCC (herediter non-polipozis kolorektal kanser)’nin de ayırt edici özelliği olan bu yolak sporadik KRK’ların da % 15’inden sorumludur. Üçüncü yolak CpG adacığı metilatör fenotip (CAMF) yolağıdır. Sporadik MSI kolon tümörlerinin çoğu CAMF pozitiftir ve genellikle kolonun proksimal bölgesinde bulunur. Bu yolakta hMLH1 gibi MMR genlerinde ve tümör baskılayıcı genlerde çoklu promotör CpG adacık hipermetilasyonu söz konusudur. Bu yolağa BRAF mutasyonları da eşlik etmektedir. KRK karsinogenezinde üç ayrı moleküler yolağın varlığına rağmen, tümörler birden çok yolağın özelliklerini sergileyebilmektedir (Bogaert ve Prenen 2014).
2.2.1. İnsidans ve Mortalite
IARC tarafından yayınlanan GLOBOCON verilerine göre 2020’de dünya genelinde 1.9 milyondan fazla yeni KRK vaka sayısı ve 935.000 KRK sebepli ölüm tanımlanmıştır. Yine aynı verilere göre KRK, erkeklerde tüm kanserler arasında insidans ve mortalite açısından 3., kadınlarda ise insidans açısından 2. ve mortalite açısından 3. sırada yer almaktadır (Sung ve ark. 2021). Türkiye’de de durum farklı olmayıp KRK, hem erkeklerde hem kadınlarda 3. en sık görülen kanserdir. Sağlık Bakanlığı’nın açıkladığı Türkiye Kanser İstatistikleri verilerine göre KRK sıklığı erkeklerde 100.000 kişide % 25.3, kadınlarda % 14.2’dir (Gültekı̇n ve Boztaş 2016).
11
Şekil 2.4. Kolorektal karsinogenez sürecinde rol oynayan moleküler yolaklar. KIN: kromozomal instabilite, MSI: mikrosatellit instabilite, CAMF: CpG adacığı metilatör fenotip.
2.2.2. Risk Faktörleri
KRK gelişiminde rol oynayan çeşitli değiştirilebilir ve değiştirilemez risk faktörleri olduğu bilinmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar değiştirilemez faktörlerden olan cinsiyet ve artan yaşın hastalık insidansı ile güçlü ilişkiler gösterdiğini ortaya koymuştur. Erkeklerdeki KRK riski kadınlardaki KRK riskinin yaklaşık iki katı kadardır (Brenner ve ark. 2007; Freedman ve ark. 2009; Kolligs ve ark. 2011).
KRK’ların % 50’sinden fazlası 70 yaşından sonra teşhis edilirken, sadece % 10’u 50 yaşından önce tanı almaktadır (Kolligs 2016). Değiştirilemez risk faktörlerinden bir diğeri kalıtsal mutasyonlardır. KRK’ların yaklaşık % 10’u kalıtsaldır. Kalıtsal formları
“kalıtsal non-polipozis kolorektal kanseri” (HNPCC, hereditary non-polyposis colorectal cancer), “adenomatöz polyposis” (FAP, familial adenomatous polyposis;
MAP, MUTYH-associated polyposis) ve “hamartomatöz polipozis” (PJS, Peuts- Jeghers syndrome; JPS, juvenile polyposis syndrome; PHTS, PTEN hamartoma tumors syndrome) sendromlarını kapsamaktadır (Rawla ve Barsouk 2019). KRK
12 hastalarının yaklaşık % 30’u ailesel neoplazi öyküsüne sahiptir. Bu durum muhtemel saptanamamış germ-line mutasyonların varlığına işaret etmektedir. KRK tanısı almış birinci derece yakını bulunanlarda riskin 2-4 kat arttığı öngörülmektedir (Kosinski ve ark. 2007). Chron hastalığı ve ülseratif kolit hastalığı gibi inflamatuvar barsak hastalıklarının varlığı da KRK riskini yaklaşık iki katı artırmaktadır (Lutgens ve ark.
2013). Diğer risk faktörlerinin arasında polip öyküsü, diabetes mellitus ve insülin direnci de gösterilmektedir.
Değiştirilebilir risk faktörleri ise daha çok yaşam tarzı ile ilişkili olan faktörlerdir. Yapılan çalışmalardan elde edilen kanıtlar obezite ve hareketsiz yaşamın, sigaranın, alkol tüketiminin ve Batı tarzı beslenmenin (liften, yeşil yapraklı sebzelerden ve meyvelerden fakir; kırmızı et ve işlenmiş gıdadan zengin beslenme şekli) KRK riskini artırdığını göstermektedir (Lutgens ve ark. 2013; Aran ve ark. 2016;
Sawicki ve ark. 2021).
2.2.3. Tedavi
KRK, heterojen bir hastalıktır. Klinik özellikleri, moleküler özellikleri ve prognozu hastadan hastaya farklılık göstermektedir. Buna bağlı olarak tedaviye alınan yanıt da hastalar arasında değişmektedir. Beş yıllık sağkalım büyük oranda hastalığın evresine bağlıdır. Evre I KRK hastaları % 90’ın üzerinde bir sağkalım gösterirken, evre IV KRK hastaları için bu oran ancak % 10’a ulaşmaktadır. Bu nedenle erken teşhis KRK için öncelikli bir hedeftir (Dawood 2018). Etkin tarama protokollerinin ve erken tanı yöntemlerinin geliştirilmesine, pre-operatif ve post-operatif bakımın standardizasyonuna, cerrahi tekniklerde sağlanan ilerlemelere ve hastalığın her evresi için uygulanabilecek sistemik tedavilerin bulunmasına bağlı olarak son yıllarda KRK’ya bağlı ölüm oranlarında dereceli bir azalış söz konusudur (Siegel ve ark. 2014;
Welch ve ark. 2016). Buna rağmen, hala hastaların % 20-30’unun ileri evrede saptanıyor olması ve erken evrede tanı alan hastaların da % 40-50’sinde nüks meydana geliyor olması KRK’yı ilaç direnci, tedavi ve prognoz açısından zorlu bir hastalık yapmaktadır. KRK’da tedavi seçimi hastanın genel durumu, tümörün boyutu, yeri ve metastaz varlığı da dahil olmak üzere birçok faktör göz önünde bulundurularak yapılmaktadır. Cerrahi en yaygın tedavi seçeneğidir. Tümör tek bir polip ile sınırlıysa sadece kolonoskopi tercih edilebilmektedir (Marley ve Nan 2016). Daha ilerlemiş hastalıkta bağırsak rezeksiyonu veya bağırsağın yanında diğer komşu organların kısmen ya da tamamen çıkarılması gerekli olabilmektedir (Marley ve Nan 2016).
13 Cerrahinin bir seçenek olmadığı durumlarda ya da cerrahiyi desteklemek amacıyla radyofrekans ablasyonu, kriyocerrahi, kemoterapi, adjuvan kemoterapi, radyoterapi ya da hedefe yönelik tedaviler uygulanabilmektedir (Marley ve Nan 2016). KRK kemoterapisinde ana omurgayı floropirimidinler (pirimidin anologları), irinotecan (topoizomeraz I inhibitörü) ve oxaliplatin (alkilleyici ajan) oluşturmaktadır (Aran ve ark. 2016; Dienstmann ve ark. 2017). Kemoterapi primer tümörün uzak organlardaki nüksünü önlemek amacıyla evre II ve evre III’deki hastalara cerrahi tedavi ya da radyoterapiyi müteakip uygulanabilmektedir (adjuvan kemoterapi) (Biondi ve ark.
2013a; Biondi ve ark. 2016b). Son yıllarda özellikle metastatik KRK tedavisinde immünoterapi ve hedefe yönelik tedavilerin kullanımı yaygınlaşmıştır. Kontrol noktası inhibitörlerinin MMR ve MSI’nin söz konusu olduğu hastalarda sağkalımı uzatmada etkili olduğu kanıtlanmıştır. Hedefe yönelik tedavi seçeneklerinden anti- vasküler endotelyal büyüme faktörü (anti-VEGF) ve anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü (anti-EGFR) kemoterapi ile kombine edildiklerinde sağkalımı uzatıcı etki göstermektedir. Bu iki antikorun tercihinde biyobelirteç olarak K/N-Ras mutasyonları etkili olmaktadır. Anti-EGFR tedavisi K/N-Ras mutasyonu olmayan hastalarda anti- VEGF tedavisinden daha etkili sonuçlar ortaya koymaktadır (Van Cutsem ve ark.
2016; Rawla ve ark. 2019).
2.3. Kanser ve Apoptoz
Apoptoz, görevini tamamlamış ya da istenmeyen hasarlı hücreleri uzaklaştırarak doku homeostazisinin sürdürülmesini sağlayan programlı fizyolojik bir hücre ölüm mekanizmasıdır (Nagata 1997; Mejer ve ark. 2000). Birçok karmaşık sinyal iletimini içeren bu mekanizma çok sıkı bir şekilde düzenlenmektedir (Majno ve Joris 1995). Apoptoz, malign potansiyeli olan hücrelerin eliminasyonunda rol oynadığı için karsinogenezin anahtar oyuncularından biri olarak kabul edilmektedir.
Bu mekanizmadaki bozukluk ve yetersizlikler neoplastik hücrelerin çoğalmasına yol açabilmektedir. Apoptozdan kaçış (hücre ölümüne direnmek) kanserin ayırt edici özellikleri arasında tanımlanmaktadır (Hanahan ve Weinberg 2011). Bu özellik kanser hücrelerinin daha uzun süre hayatta kalmasına imkan tanımakta ve onlara invazif ve metastatik olabilmelerini sağlayacak mutasyonların birikmesi için zaman kazandırmaktadır (Hassan ve ark. 2014). Kanser hücrelerinin apoptozdan kaçışları aşağıdaki mekanizmalar yoluyla olmaktadır (Wong 2011):
(1) Pro-apoptik ve anti-apoptik protein dengesinin bozulması
14 (2) Kaspaz işlevinin azaltılması/engellenmesi
(3) Ölüm reseptörleri aracılığıyla olan sinyal iletiminin bozulması
Birçok kanserde tedaviye yönelik temel yaklaşımın merkezinde de apoptoz yolakları yer almaktadır ve halen klinik kullanımda olan geleneksel kanser ilaçlarının çoğu kanser hücrelerinin apoptozunu indüklemeyi hedeflemektedir (Wong 2011; Liu ve ark. 2015; Pfeffer ve Singh 2018).
2.3.1. Apoptoz Sırasında Hücrede Meydana Gelen Değişiklikler
Apoptoz sırasında hücrede birçok karakteristik olay meydana gelir. Bu değişiklikleri “kaspaz” (sistein aspartil-spesifik proteazlar) adı verilen sistein protein ailesi üyesi proteazlar başlatır ve sürdürür (Pfeffer ve Singh 2018). Kaspazların hedefinde hücre iskeleti proteinleri ve nükleer proteinler gibi pek çok hücresel protein bulunur (Pistritto ve ark. 2016). Kaspaz-2, -8, -9 ve -10 “başlatıcı kaspazlar” olarak;
kaspaz-3, -6 ve -7 “efektör ya da cellat/infazcı kaspazlar” olarak; kaspaz-1, -4 ve -5 de
“inflamatuvar kaspazlar” olarak tanımlanır. Diğer kaspazlar ise bu üç kaspaz sınıfından daha farklı ve spesifik şekilde fonksiyon gösterirler (Obeng 2021).
Kaspazlar sentezlendikleri andan itibaren hücrede zimojenler halinde bulunurlar ve bu haldeyken “prokaspaz” olarak adlandırılırlar. Daha sonra otoaktivasyon ile ya da bir başka molekül veya kaspazın aktivasyonu ile prokaspazlar aktif kaspazlara dönüşür. İlk kaspaz aktivasyonu bir kez meydana gelince proteolitik kaskad da başlar (Pistritto ve ark. 2016). Kaspaz aktivasyonu ve proteolitik kaskad ile birlikte hücrede de apoptozun karakteristik olayları gerçekleşmeye başlar: Sitoplazmik hücre büzüşmesi meydana gelir ve hücre hacminin yaklaşık yarısı kadarını kaybeder (piknoz). Hücrenin komşu hücrelerle ve ekstrasellüler matriksle olan bağlantıları zayıflar. Plazma membranı süreç boyunca bütünlüğünü korur (Majno ve Joris 1995).
Sürecin başlarında hücre membranının iç tabakasında bulunan fosfatidil serin dış tabakaya transloke olur. Bu yer değişikliği sürecin sonunda apoptoza uğramış hücrelerin makrofajlar tarafından tanınıp, pro-inflamatuvar hücresel bileşenler ortama salınmadan fagosite edilmelerini sağlar (Hengartner 2001). Çekirdekte ise kromatin kondensasyonu başlar ve kromatin parçalanıncaya kadar ileri yoğunlaşmalar gerçekleştirerek kümeler oluşturur (karyoreksiz) (Majno ve Joris 1995). Sürecin sonuna doğru sitoplazmik membranda kabarcıklanmalar, sitoplazmik organellerde de ultrastrüktürel değişiklikler meydana gelir ve membran bütünlüğü kaybolur (Kroemer ve ark. 2005). Son aşamada apoptik hücre “apoptik cisimcik” adı verilen veziküllere
15 ayrılır. Ancak genellikle daha apoptik cisimcikler oluşmadan fagositik hücreler apoptik hücreyi ortadan kaldırırlar (Bucur ve ark. 2001).
2.3.2. Apoptoz Yolakları
Kaspaz aktivasyonu ile gerçekleşen iki apoptoz yolağı vardır: İç Yolak (intrinsik ya da mitokondriyal yolak) ve Dış Yolak (ekstrinsik ya da ölüm reseptörü aracılı yolak).
2.3.2.1. İç Yolak (İntrinsik ya da Mitokondriyal Yolak)
Onarılamayan genetik hasar, hipoksi, büyüme faktörü eksikliği, sitoplazmik Ca+2 konsantrasyonunda artış ve şidditli oksidatif stres gibi faktörlerin varlığında devreye giren; mitokondri ve mitokondriyal proteinlerin kullanıldığı apoptoz yolağıdır (Oren ve Rotter 1999). Yolak BCL-2 (B-cell Lymphoma 2) ailesine ait bir grup protein tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. BCL-2 ailesi proteinleri iki genel gruba ayrılır:
“Pro-apoptik BCL-2 proteinleri” ve “Anti-apoptik BCL-2 proteinleri”. Pro-apoptik proteinler de “Çoklu domeyn üyeleri” (BOX, BAK ve BOK) ile “Sadece BH3 bölgesi içeren üyeler” (BİD, BİM, BAD, PUMA, NOXA ve diğerleri)’ den oluşur. Anti- apoptik proteinler ise BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL-1, A1 ve BCL-B’yi içerir.
Sadece BH3 bölgesi içeren proteinler, anti-apoptik proteinlerin inhibisyonunda iş görürken; anti-apoptik proteinler de çoklu domeyn pro-apoptik proteinlerin baskılayıcısı olarak etki ederler (Carneiro ve Deiry 2020).
Hücrede apoptoz sinyali alındığında sadece BH3 bölgesi içeren proteinler aktive olur. Bu aktivasyon anti-apoptik proteinlerin inhibisyonuna ve dolaylı olarak çoklu domeyn pro-apoptik proteinleri BAX ve BAK’ın aktivasyonuna yol açar (Adams ve ark. 2019). Oligomerize olan BAX ve BAK mitokondriyal membrana yönelirler ve dış zara bağlanırlar. Bu bağlanma mitokondri dış zarının geçirgenliğini artırır. Böylece apoptozda kritik eşik aşılmış olur ve artık apoptotik süreç geri dönüşümsüz şekilde işlemeye başlar (Jopez ve Tait 2015). Zar geçirgenliğinin artışı ile sitokrom c, Smac, DIABLO, Omi/HtrA2 ve AIF (Apoptosis Inducing Factor) gibi apoptik proteinler mitokondriden sitoplazmaya geçer (Oren ve Rotter 1999; Pistritto ve ark. 2016). Sitokrom c sitoplazmada Apaf-1’e bağlanır. Sitokrom c, Apaf-1 ve dATP “Apoptozom” adı verilen bir kompleks oluştururlar. Bu yapıya Prokaspaz-9 da katılır ve kesime uğrayarak aktive olur ve Kaspaz-9’a dönüşür. Kaspaz-9 da Prokaspaz-3’ü keserek Kaspaz-3’ü aktive etmiş olur. Sitoplazmaya geçen apoptik
16 proteinlerden Smac, DIABLO ve Omi/HtrA2 apoptoz inhibitör proteinlerinin (IAP) engelleyicisi olarak iş görürler. NAIP, XIAP, Survivin, Apollon gibi proteinlerden oluşan AIP’ların görevleri ise Kaspaz-9 ve Kaspaz-3 etkileşimini engellemektir.
Böylece AIP’ların Smac, DIABLO ve Omi/HtrA2 tarafından engellenmesi Kaspaz-9 ve Kaspaz-3 üzerindeki baskılayıcı etkinin ortadan kalkmasına neden olur (Oren ve Rotter 1999). Sitoplazmaya geçen AIF ise nukleusa ulaşarak kromatin fragmentasyonunu başlatır (Lorenzo ve ark.1999).
2.3.2.2. Dış Yolak (Ekstrinsik ya da Ölüm Reseptör Yolağı)
Ölüm reseptörleri adı verilen hücre yüzey reseptörlerine hücre dışı ligandların bağlanmasıyla aktive olan apoptoz yolağıdır. Bu yolaktaki ölüm reseptörleri ve bu reseptörlere bağlanan ligandları TNFR1-TNFα, FAS (CD95, APO-1)-FASL, TRAILR1 (DR4)-TRAIL ve TRAILR2 (DR5)-TRAIL’i kapsar. Ölüm reseptörleri ligandlar ile uyarıldıklarında oligomerizasyona uğrarlar. Ardından sitoplazmik ölüm domeynlerini (death domain, DD) ortaya çıkarmak için yapısal bir değişim geçirirler.
Böylece DD içeren diğer proteinlerle homotipik etkileşimler mümkün hale gelmiş olur (Pistritto ve ark. 2016). Adaptör moleküller FADD (Fas-associated death domain) ve TRADD (TNF receptor-associated death domain) ölüm reseptörlerine gelirler.
Başlatıcı prokaspazlar -8 ve -10 adaptör proteine bağlanarak hep birlikte DISC (death- inducing signalling complex) adı verilen bir kompleks oluştururlar. Prokaspaz-8 ve - 10 DISC tarafından aktive edilir. Etkinleşen Kaspaz-8 ve -10, Efektör Prokaspaz-3, - 6 ve -7’yi keserek aktive ederler. Efektör Kaspazlar da hedeflerindeki hücresel proteinleri proteolitik kesime uğratırlar (Pfeffer ve Singh 2018).
Diğer taraftan Kaspaz-8, pro-apoptik sadece BH3 bölgesi içeren proteinlerden Bid’i aktive eder. Bu aktivasyon özellikle bazı hücrelerde ekstrinsik yolağın etkinliğini amplifiye etmiş olur. Aktive olan Bid, mitokondriyal dış membranın geçirgenliğini artırmaları için BAX ve BAK’ı etkinleştirir. Böylece dış yolak, iç yolak ile kesişmiş olur ve apoptik süreç iç yolak ile de devam eder (Şekil 2.5) (Pistritto ve ark. 2016;
Pfeffer ve Singh 2018).
17
Şekil 2.5. İç (İntrinsik) ve dış (ekstrinsik) apoptoz yolakları (Pistritto ve ark. 2016; Pfeffer ve Singh 2018).
2.3.3. Kanser Tedavisinde Apoptozun Rolü
Kanserde başvurulan tedavi stratejilerinin başında hücrenin kendi ölüm mekanizmasını harekete geçirmek gelmektedir. Apoptozdan kaçış tüm kanserlerin ortak özelliklerinden birisi olduğundan tedavide apoptozu hedeflemek son derece etkin bir yöntem gibi görünmektedir. En çok intrinsik yolak hedeflenmekle birlikte her iki yolakda da çeşitli aşamaları ve molekülleri hedefleyen klinik olarak kullanılan ya da ön çalışmaları sürdürülmekte olan birçok antikanser ajanı/ilacı vardır (Pfeffer ve Singh 2018). Apoptoz-kanser arasındaki bağlantının ortaya konulmasıyla ve apoptoz sürecine dahil olan molekül/proteinlerin işlevlerinin ve birbirleriyle ilişkilerinin gün geçtikçe daha iyi anlaşılmasıyla moleküler hedefli kanser terapötiklerinin geliştirilmesi için yeni ufukların açılmasına yol açmıştır (Nicholson 2000; Reed 2002;
Kaufmann ve David 2003; Fesik 2005; Ashkenazi 2008).
Terapötik hedefleme için yaygın olarak kullanılan 2 yaklaşım bulunmaktadır:
1) Pro-apoptik moleküllerin uyarılması, 2) Anti-apoptik moleküllerin inhibisyonu.
BCL-2 ailesi proteinleri kanser tedavisi için önemli hedeflerden birisidir (Ferreira ve ark. 2002). BCL-2 ailesi üyelerini antagonize etmek ya da seviyelerini düşürmek suretiyle kanser hücrelerinin apoptozunu uyaran çeşitli tedavi yaklaşımları
18 geliştirilmiştir. BCL-2’nin antisens deoksioligonükleotidlerle hedeflenmesi bu yaklaşımlardan biridir. Antisens deoksioligonükleotidler tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla hedef mRNA’lar ile hibridize olurlar ve onların degredasyonunu uyarırlar (Frankel 2003; Tamm 2006). Bu yöntem ile Survivin ve XIAP gibi anti-apoptik diğer proteinler de hedeflenebilmektedir (Call ve ark. 2008). Diğer bir yaklaşım BH3 mimetiklerinin kullanımıdır. BH3 mimetikleri, sadece BH3 bölgesi içeren proteinlerin anti-apoptik BCL-2 proteinlerine bağlanmasını taklit eden küçük moleküllerdir. Bu moleküller BCL-2’yi (Casara ve ark. 2018), BCL-XL’yi (Tao ve ark. 2014), ve Mcl- 1’i (Abulwerdi ve ark. 2014) inhibe etmektedir.
Pro-apoptik moleküllerin uyarılmasına yönelik olarak ise başlıca 2 yaklaşım vardır: TRAIL-R1 ve TRAIL-R2’yi hedefleyen agonist monoklonal antikorlar ve rekombinant pro-apoptik ligandlar aracılığıyladır (Call ve ark. 2008). Her iki apoptoz yolağındaki her bir aşama ve molekül potansiyel olarak terapötik hedef adayıdır, ancak hangi hedefin daha etkin olduğuna/olabileceğine dair net bir gösterge bulunmamaktadır.
2.3.4. Kanser Tedavisinde ve Önlenmesinde Fitokimyasallar
Fitokimyasallar bitkilerde bulunan doğal biyoaktif bileşiklerdir. Bitki metabolizmasındaki fonksiyonlarına göre ikiye ayrılır: “Primer metabolitler” ve
“sekonder metabolitler”. Primer metabolitler protein, amino asit, karbonhidrat, lipid ve klorofil gibi bitkinin temel metabolizması için gerekli olan bileşiklerdir. Sekonder metabolitler ise bitkinin temel metabolizması için esansiyel olmayan, bitkinin çevre şartlarına adaptasyon sağlamak veya predatörlerinden korunmak amacıyla ürettiği bileşiklerdir (Dias ve ark. 2012). Sekonder metabolitler aynı zamanda mikrobiyal çoğalmayı yavaşlatmak, metabolik yolakları engelleyebilmek veya gen ekspresyonunu ve sinyal aktarımını değiştirebilmek gibi fonksiyonlara da sahiptir (Lee ve ark. 2013).
Sekonder metabolitlerinin bu özel fonksiyonları sayesinde bitkiler çok eski zamanlardan beri çeşitli tıbbi amaçlarla ilaç kaynağı olarak kullanılmaktadır.
Bitkilerin tedavi amaçlı kullanımlarına dair en eski yazılı kayıtlara M.Ö. 2600'e ait Mezopotamya kil tabletlerinde ve M.Ö. 2900'e ait Mısır Ebers papirüsünde rastlanmaktadır (Dias ve ark. 2012). Son yıllarda kanser tedavisi ve önlenmesindeki rollerinden dolayı sekonder bitki metabolitlerine olan ilgi artmıştır. Mevcut geleneksel kanser terapötik ajanlarının çoğunun yüksek sitotoksisiteye sahip olması, kemorezistansa yol açması, tümör nüksü ve metastazını önleyememesi gibi nedenler
19 daha etkin ama daha az sitotoksik ajan ihtiyacıyla birlikte sekonder metabolitlere olan bu ilgiyi sürekli beslemiştir (Dias ve ark. 2012). Bugün çok sayıda bitki-türevli anti- kanser ajanının pre-klinik ve klinik çalışmaları devam etmektedir; muhtemelen bazıları yakın gelecekte anti-kanser ilacı olarak tedavi protokollerindeki yerini alacaktır.
Sekonder metabolitlerin anti-kanserojen etki mekanizmaları hakkında bilgiler son yıllarda artmış olmakla birlikte, hala yeni bilgiler tanımlanmaya devam etmektedir. En çok bilinen kanser önleme mekanizması serbest radikal absorbsiyonu ya da anti-oksidan enzimlerin ekspresyonlarının uyarılmasıdır (Finley ve ark. 2011;
Lee ve ark. 2013). Ayrıca anti-inflamatuar özellik sergileyerek; büyüme, invazyon ve metastaz ilişkili sinyal yolaklarını modüle ederek; hücre döngüsünü durdurarak;
apoptozu teşvik ederek ya da hormonal mekanizmalarla da anti-kanserojenik özellik gösterebilirler (Thomas ve ark. 2015). Nitekim Epigallokateşin (yeşil çay sekonder metaboliti) hücre proliferasyonunu inhibe ve apoptozu aktive ederek (Thangapazham ve ark. 2007); Apigenin (maydanoz), Dicumarol (Sarı taş yoncası), Gingerol (Zencefil) ve Thymol (Kekik) apoptozu uyararak (Kaur ve ark. 2008; Martin ve ark. 2017; Chen ve ark. 2020; Elbe ve ark. 2020); Sulforaphane (Brokoli) ve Resveratrol (Japon madımağı, üzüm) hücre döngüsünü durdurarak ve apoptozu uyararak (Wu ve ark.
2019; Wang ve ark. 2021), anti-kanserojen etki gösterirler. Curcumin (Zerdeçal) de çeşitli sinyal yolaklarını düzenler ve p53 ekspresyonunu düzenler (Elena ve ark. 2012).
Quercetin (mor renkli sebze ve meyveler) anti-inflamasyon, pro-oksidasyon, anti- proliferasyon ve hücre döngüsünün durmasını kapsayan çeşitli mekanizmalar üzerinden etkisini gösterir (Vafadar ve ark. 2020). Baicalein (Çin takkesi) anti- kanserojenik etkisini MAPK, ERK ve p38 sinyal iletim yolaklarını modüle ederek ortaya koyar (Han ve ark. 2019).
Çok sayıdaki fitokimyasal bileşik arasından FDA onayı alarak güncel kanser tedavisinde kullanılan 4 bileşik sınıfı vardır: Vinca alkaloidleri, taxanlar, camptothecin türevleri ve podophyllotoxinler. Vinca alkaloidleri Catharanthus roseus (rozet çiçeği)'dan elde edilen ilaçların bir alt sınıfıdır. Mikrotübül polimerizasyonunu ve organizasyonunu engelleyerek mitozu bloke ederler. Vinblastine ve vincristine doğal olarak izole edilmiş alkaloidlerdir. Vinorelbin ve vindensin ise bu gruptaki yarı- sentetik analoglardır. Bu ajanlar lösemi, Hodgkin ve non-Hodgkin lenfomalar, Kaposi's sarkomu, ilerlemiş testiküler karsinom, meme ve akciğer kanserini kapsayan çeşitli kanserlerin tedavisinde kombin kemoterapi şeklinde uygulanmaktadır (Amit ve
20 ark. 2020). Taxanlar Yew ağacı kabuğundan elde edilir. Mikrotubül üzerine etki ederek hücre döngüsünün durmasına ve mitozun metafaz veya anafazda sonlandırılmasına neden olur. Meme, baş-boyun, prostat ve mide kanserlerinin tedavisinde kullanılır. Paclitaxel doğal formu, Docetaxael yarı sentetik türevidir (Safarzadeh ve ark. 2014; Amit ve ark. 2020). Camptothecinler, Camptotheca acuminata (Çin ağacı)'dan izole edilirler. DNA Topoizomeraz I inhibitörü olarak etkili olurlar. Yarı sentetik türevleri Irinotecan kalın bağırsak ve rektum kanserlerinin, Topotecan ise tekrarlayan over, küçük hücreli akciğer kanseri ve servikal kanser gibi çeşitli kanserlerin tedavisinde kullanılır (Amit ve ark. 2020). Phodophyllotoxinler, Podophyllum peltatum (ayak otu/ördek otu)'dan izole edilir. Phodophyllotoxin tubuline bağlanarak etkili olurken, türevleri olan Etoposide ve Teniposide Topoizomeraz II'yi inhibe ederek iş görürler (Amit ve ark. 2020).
Bu dört ana sınıfın dışında başka sınıflardan bitki türevli ilaçlar da vardır:
Ingenol mebutat (IM) Euphorbia peplus'tan izole edilen diterpene ingenolün hidrofobik esteridir. Yüksek konsantrasyonda hücre ölümünü uyarırken, düşük konsantrasyonda inflamatuvar yanıtı aktive eder. Homoharringtonine (HHT) Cephalotaxus cinsi ağaçlardan izole edilir. Ribozoma bağlanarak protein sentezini inhibe eder. Combretastatinler Combretum caffrum'dan izole edilirler. Bu sınıf bileşikleri tubbulin polimerizasyonunu engelleyerek etkili olurlar (Amit ve ark. 2020).
Sekonder metabolitler dört ana sınıfa ayrılır: Polifenoller, alkaloidler, terpenoidler ve thioller. Polifenoller flavanoidler, fenolik asitler ve diğer non- flavanoid polifenoller alt gruplarına; alkaloidler gerçek alkaloidler, protoalkaloidler, polyamin alkaloidler, peptid ve siklopeptid alkaloidler alt sınıflarına; terpenoidler karotenoidler ve non-karotenoidler alt sınıflarına; thioller de glucosinolatlar, allylic sülfidler, indoller ve miscellaneous alt sınıflarına ayrılırlar (Şekil 2.6; Nguyen ve ark.
2021).
21
Şekil 2.6. Fitokimyasalların sınıflandırılması (Nguyen ve ark. 2021).
2.3.5. Diosmetin
Diosmetin (3',5,7-trihidroksi-4'metoksi flavon), polifenollerin flavonoid alt sınıfına ait bir flavanoldür. Kimyasal formülü C16H12O6 şeklinde olup (Şekil 2.7;
Patel ve ark. 2013), maydanoz, turunçgiller, kasımpatı, kekik, zeytin ve baklagil yapraklarında bolca bulunur (Yoshikawa ve ark. 2000; Radušienė ve ark. 2008; Lin ve Harnly 2010; Patel ve ark. 2013; Abad‐García ve ark. 2014), Diosmetin anti-oksidan (Liao ve ark. 2014), anti-inflamatuvar (Chandler ve ark. 2010), anti-bakteriyel (Wang ve ark. 2014), gibi çeşitli farmakolojik özelliklere sahiptir. Hücresel reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve malondialdehitin (MDA) oluşumunu engelleyerek anti-oksidan sistem enzimlerinin etkilerini artırır (Liao ve ark. 2014). Proliferasyonu baskılayarak (Zhao ve ark. 2011; Ge ve ark. 2015), hücre döngüsünü durdurarak (Androutsopoulos ve ark. 2009), apoptozu indükleyerek (Roma ve ark. 2018), metastazı inhibe ederek (Liu ve ark. 2016a), anti-karsinojenik aktivite de gösterebilir.
22
Şekil 2.7. Diosmetinin kimyasal yapısı. (Patel ve ark. 2013).
2.4. Çalışmanın Hipotezi
Fitokimyasalların sahip oldukları antikarsinojenik potansiyel çok uzun süreden beri bilinmektedir. Bu potansiyeldeki beklentinin büyük kısmını apoptozu teşvik edebilme ve proliferasyonu engelleyebilme özellikleri oluşturmaktadır. Bu çalışmada da hipotezimiz “Bir bitki sekonder metaboliti olan Diosmetinin antikarsinojenik etkinliğini apoptoz uyarımı ve proliferasyon inhibisyonu üzerinden gösterebileceği, apoptozu uyarımını da her iki yolak üzerinden gerçekleştirebileceği” şeklindedir.
23 3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Kullanılan Cihaz ve Sarf Malzemeler
Deneysel aşamada kullanılan cihaz ve teçhizatlara dair bilgiler Tablo 3.1’de verilmiştir.
Tablo 3.1. Çalışmada kullanılan makine ve teçhizat listesi.
Makine/Teçhizat Model/Markası
Soğutmalı Santrifüj Nüve (NF 200)
ELISA Plaka Okuyucu Biotek Epoch
-20°C Derin Dondurucu Arçelik
-80°C Dondurucu VWR Symphony
RT-PCR Bio-Rad CFX Connect
Hassas Terazi KERN-Sohn GmbH
Mikro Santrifüj Hettich 200R
Santrifüj Hettich Rotofix 32A
Laminar Flow Kabini Sınıf 2 Scanlaf
Buz Makinesi Skotsman
Güç Kaynağı Thermo Scientific
Işık Mikroskobu Olympus
İnverted Mikroskop Olympus
Nanodrop Spektrofotometre Maestro
Co2’li İnkübatör Thermo
Vorteks VWR
Güç Kaynağı Thermo Scientific
Yatay Jel Elektroforezi Cleaver
Jel Görüntüleme Sistemi Syngene
Otomatik Mikro Pipet Seti Eppendorf
Derin Dondurucu Arçelik
Otoklav VWR
Thermal Cycler Peqlab
Manyetik Karıştırıcı Hidolpe
Cell Scraper Biologix
PZR Cihazı/Isısal Döngü Cihazı Bioneer MyGenie 96 Thermal Block Deneysel aşamada kullanılan saf malzeme ve kimyasallar Tablo 3.2’de verilmiştir.
24
Tablo 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasallar ve sarf malzemeler
Kullanılan kimyasallar ve sarf malzemeler Marka
Diosmetin Sigma
Dimetil Sülfoksit (DMSO) Bioshop
Penisilin/Streptomisin Lonza
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) High Glucose (4.5 g/l), with L-Glutamine
Capricorn Scientific DPBS-Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Tuzlu
fosfat tamponu)
Biowest
L-glutamin VWR
Agaroz Peqlab
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest
Tripsin-EDTA Capricorn Scientific
Kristal Viole Sigma
Trizol RiboEx
15 ml Santrifüj Tüpleri Nest Scientific
50 ml Santrifüj Tüpleri Nest Scientific
5 ml Steril Serolojik Pipet Nest Scientific
10 ml Steril Serolojik Pipet Nest Scientific
Steril filtre ucu (0,45 μm) Sarstedt
Trypsin-EDTA (0.25%) in HBSS (1x) with Phenol Red Capricorn Scientific
Pipetleyici Labcon
Pastör Pipeti Superior
24 -Kuyulu Hücre Kültür Kabı Nest Scientific
6-Kuyulu Hücre Kültür Kabı Nest Scientific
2 Ml Kriyovial Tüp Isolab
T75 Kültür Flaskı Nest Scientific
T25 Kültürü Flaskı Nest Scientific
PCR-8 Şeritli Tüpleri Nest Scientific
PCR-8 Şeritli Tüp Kapakları Nest Scientific
Deneysel aşamada kullanılan kitler Tablo 3.3’de verilmiştir.
25
Tablo 3.3. Çalışmada kullanılan kitler
Kullanılan kitler Marka
Cell Proliferation Kit (XTT based) Capricorn Scientific iScript™ cDNA Synthesis Kit Bio-Rad
EvaGreen 2X qPCR MasterMix ABM (Applied Biological Materials) Cell Death Detection ELISA PLUS 96T Sigma
DNase I, RNase-free (1 U/µL) Thermo Scıentıfıc
3.2. Hücre Kültürü
Çalışmada kullanılan insan kolon karsinoma hücre hatlarından HCT 116 hücreleri, Doç. Dr. Abdullah YALÇIN’ın laboratuvarlarından alınmıştır. HCT 116 hücre hattının özellikleri ve morfolojisi Tablo 3.4 ve Şekil 3.1’de gösterilmiştir. HCT 116 hücreleri, Laminar Flow Class II içerisinde, % 10 FBS (fetal sığır serumu) ve %1 Penisilin-Streptomisin eklenmiş yüksek glukozlu DMEM besiyerinde (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (4.5 g/l) kültüre edilmiştir. Kültüre alınan HCT 116 hücreleri, T25’lik flasklarda 37°C, % 5 CO2 ve % 95 nem içeren etüvde inkübe edilmiştir. Hücre büyümeleri, 2 günde bir inverted mikroskop altında kontrol edilmiştir.
Tablo 3.4. HCT 116 hücre hattının özellikleri
Organizma Homo Sapiens, İnsan
Doku Kolon
Morfolojisi Epitel
Kültür özellikleri Adherent (Yapışarak Çoğalan)
Hastalık Kolorektal Karsinom
Cinsiyet Erkek
Yaş Yetişkin
Kimlik Doğrulama ATCC Hücre Hattı
