臺北醫學大學公共衛生暨營養學院 保健營養學系碩士論文
Master`s Thesis
School of Nutrition & Health Sciences College of Public Health & Nutrition
Taipei Medical University
黃豆皂素粗萃取物對於 1,2-dimethylhydrazine 誘導 F344 大鼠結腸癌前期 病變異常腺窩灶的影響及機制之探討
The effect and mechanism of extracted crude soybean saponins on 1,2-dimethylhydrazine-induced ACF in F344 rats colon cancer
研究生：郭宇薇 撰 (Yu-Wei Guo) 指導教授：林士祥 博士 (Shyh-Hsiang Lin, Ph.D.) 中華民國九十六年六月 June 2007
中文摘要
本研究目的為探討黃豆皂素粗萃取物對結腸癌前期病變異常腺窩 灶 (aberrant crypt foci, ACF) 的影響，並探討黃豆皂素粗萃取物降低結 腸癌發生的可能機制。以雄性 Fisher 344 鼠做為動物模式，實驗分成五 組在飲食當中添加不同劑量黃豆皂素粗萃取物，給予實驗飲食後第 5 週，以腹腔注射方式給予致癌物 1,2-dimethylhydrazine (DMH) 誘發老鼠 結腸癌的發生。在第 15 週予以犧牲，取出結腸，觀察結腸黏膜上 ACFs 數量、環氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 蛋白質表現量、前列腺素 E2 (prostaglandins E2, PGE2) 含量及 β-葡萄糖醛酸酵素 (β-glucuronidase)
活性。結果顯示飲食中黃豆皂素粗萃取物可降低結腸黏膜上 ACFs 數量 及β-glucuronidase 活性，但不會影響 COX-2 蛋白質表現量及 PGE2含量。
飲食中的黃豆皂素粗萃取物對於結腸癌前期病變 ACFs 確實有一抑制功 效，其機制可能與降低β-glucuronidase 活性相關，而與 COX-2 及 PGE2
發炎反應的路徑無關。
關鍵字：異常腺窩灶、黃豆皂素、環氧化酶、前列腺素、β-葡萄糖醛酸 酵素
Abstract
This study investigated the effect of extracted crude soybean saponins on preneoplastic lesions, aberrant crypt foci (ACF), and the related inhibitory mechanism of extracted crude soybean saponins. Rats assigned into five groups according to different doses of extracted crude soybean saponins and received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) injection in week 5. In week 15, all rats were sacrificed. The number of ACFs, the cyclooxygenase-2 (COX-2) protein expression, the level of prostaglandins E2 (PGE2) and the activity of β-glucuronidase were examed. Results
revealed that the consumption of extracted crude soybean saponins decreased the number of ACFs and theactivity ofβ-glucuronidase in rats, while did not affect the COX-2 protein expression and PGE2 level. In
conclusion, extracted crude soybean saponins decreased the number and size of ACFs. The mechanism may be correlated to the activity of β-glucuronidase in colonic mucosa but not the COX-2 protein expression and PGE2level.
Keywords : aberrant crypt foci (ACF), soybean saponins, prostaglandins (PGE2), cyclooxygenase (COX-2),β-glucuronidase
致謝
兩年的碩士生涯轉眼之間就過去了！但寫論文的心路歷程實在很 難為外人道，經過多少坐在電腦前面，伴隨著累積成冊的 paper，隨便 解決一頓的夜晚及假日，又常常眼睛乾澀的不聽使喚，用掉多少灌的人 工淚液，就只是為了遇到盲點時，從零到有的解決問題－也許這是成就 感的所在。如今，終於～完成了，我得一一感謝這過程中教導我、開導 我、幫助我以及鼓勵我的人 首先要感謝我的指導老師林士祥老師，兩年來的大大小小事情，老 師總是不厭其煩又帶點囉嗦的叮嚀我，在儀器操作、結果統計跟論文撰 寫方面，老師也都不吝惜一次又一次反覆的提點我，而可愛的老師只要 一包零食、一杯好咖啡就可以滿足，很感謝有你這個老師，也很開心有 你這個老師！另外感謝在百忙之中抽空審查我的論文的陳玉華老師以 及林聖敦老師，感謝你們的建議，使得我的論文得以更完善。謝謝簡怡 雯老師及謝榮鴻老師，兩位老師慷慨的借我實驗上所要用到的儀器，讓 我的實驗才可順利進行。謝謝施純光老師以及趙振瑞老師，在我實驗有 疑慮時，謝謝你們盡可能的幫我解決問題，減少了我不少煩惱。謝謝保 健營養系上的老師們，你們總是很親切的微笑著，這樣的大環境，溫馨 的讓人不捨。了，還老被我的電話奪命連環 call 回來。謝謝假馬來人欣怡，你的出 現不但分擔了我不少忙，也給實驗室帶來許多歡樂。謝謝純瑤、小賀還 有品瑄，可愛的學妹們，實驗還好有你們的幫忙。 而在北醫就學期間的另一大重要收穫，就是跟十三金釵結緣－改 子、阿包、柏方、阿布、倩瑢、小可愛、苯丸、阿毛、阿芬、歆倩、芷 琪還有利岑。尤其是改子跟阿包，一切的感謝我想你們懂。 最後要感謝我的家人，這兩年來生活的不規律，使得跟家人相處的 時間很少，所幸家人的包容及諒解，讓我今天完成了我的畢業論文。感 謝駿煇先生，在我遇到挫折，心情低落時，總是有你可以讓我開懷的大 聲笑，謝謝你包容我的無理及任性，但願有一天，我也可以當那個幫助 你度過低潮的人。 這本論文獻給我感謝的你們～
目錄
中文摘要 ...I Abstract... II 致謝 ...III 目錄 ... V 圖目次 ... VIII 表目次 ... X 第一章 研究動機與目的 ...1 第二章 文獻回顧 ...3 第一節 結腸癌 ...3 (一) 腺窩與結腸癌...3 (二) 結腸癌之影響因子...4 (三) 結腸癌與發炎反應...7 (四) 結腸癌與腸道微生物酵素 β-glucuronidase... 11 (五) 結腸癌之動物模式...12 第二節 黃豆、黃豆皂素與異黃酮素 ...13 (一) 黃豆...13 (二) 黃豆皂素...13 (三) 異黃酮素...14第三節 黃豆皂素之抗腫瘤作用 ...16 第三章 實驗設計與材料方法 ...18 第一節 實驗設計 ...18 (一) 實驗對象和飼養方式...18 (二) 實驗分組...18 (三) 實驗流程...19 (四) 劑量擬定方式...20 第二節 實驗材料 ...21 (一) 飼料成分...21 (二) 黃豆皂素粗萃取物製備 ...21 (三) 1, 2-dimethylhydrazine 配製 ...21 第三節 分析項目及方法 ...23 (一) 動物犧牲及樣品收集...23 (二) 黃豆皂素粗萃取物成分分析 ...24 (三) 血漿異黃酮素分析...25 (四) 血脂分析...26
(五) Aberrant crypt foci 染色觀察 ...26
(六) 老鼠結腸黏膜組織中 COX-2 蛋白質表現量...27
(八)β-glucuronidase 酵素活性測定...30 (九) 肝臟組織切片...31 第四節 試劑配方 ...32 第五節 統計方法 ...34 第四章 實驗結果 ...35 第一節 黃豆皂素粗萃取物分析 ...35 第二節 動物攝食和生長狀況 ...38 第三節 結腸癌相關指標 ...46 第五章 討論 ...55 第一節 黃豆皂素粗萃取物抗癌的成分 ...55 第二節 結腸癌的動物誘發模式 ...58 第三節 黃豆皂素抗癌功效 ...60 第四節 黃豆皂素對發炎反應相關物質的影響...62 第五節 黃豆皂素對腸道微生物酵素活性的影響...64 第六章 結論 ...65 第七章 參考文獻 ...66 附錄一 實驗試劑耗材與儀器一覽表...74 附錄二 動物與人體每公斤體重計量折算係數表...77 附錄三 SAS 程式碼...78
圖目次
第二章 圖 2-1、結直腸癌的發展...3 圖 2-2、結腸癌誘發致癌物 AOM 對基因突變和蛋白質表現影響 ...10 圖 2-3、不同種類黃豆皂素之化學結構式...14 圖 2-4、不同種類之異黃酮素化學結構式...15 第三章 圖 3-1、實驗分組...18 圖 3-2、實驗流程...19 圖 3-3、ACFs 分類 ...27 第四章 圖 4-1、利用 HPLC 觀察在波長 248 nm 下異黃酮素含量的層析曲線圖譜 ...36 圖 4-2、利用 HPLC 觀察在波長 260 nm 下皂素含量的層析曲線圖譜....37 圖 4-3、實驗期間老鼠體重變化...40圖 4-4、以 Hematoxylin and eosin 染色觀察老鼠肝臟組織切片 ...45
圖 4-6、老鼠結腸黏膜 COX-2 蛋白質表現量...52 圖 4-7、結腸黏膜 PGE2濃度 ...53
表目次
第三章 表 3-1、各組實驗飲食組成...22 表 3-2、皂素 HPLC 分析移動相給予梯度濃度條件 ...24 表 3-3、異黃酮素 HPLC 分析移動相給予梯度濃度條件 ...25 第四章 表 4-1、老鼠體重增加、飼料攝食量及攝食效率 ...41 表 4-2、老鼠肝臟重量及相對肝重 ...42 表 4-3、老鼠結腸重量及相對結腸重 ...43 表 4-4、老鼠第 0 及 15 週血脂分析 ...44 表 4-5、老鼠小型 ACFs 計數 ...49 表 4-6、老鼠大型的 ACFs 計數 ...50 表 4-7、老鼠各段結腸 ACFs 計數 ...51第一章 研究動機與目的
近年來癌症為國人十大死亡原因排名第一位。癌症又稱惡性腫瘤， 是人體內一些不正常的細胞，因為生長速度快，而去影響及侵犯到正常 的組織器官，造成壓迫、潰爛、感染或其他等原因，導致出血、疼痛或 器官功能喪失等症狀。癌的成因，還無法完全確定，環境和遺傳因素都 與癌的發生有關。依據行政院衛生署癌症登記資料統計，台灣地區男性 和女性容易罹患的癌症部位，包括有：鼻咽癌、食道癌、肺癌、乳癌、 肝癌、胃癌、結直腸癌、子宮頸癌。其中結直腸癌由 1990 年至 2005 年 為國人癌症死因排名第三位，近年來居高不下，對國人的生命造成極大 的威脅。目前雖然癌症的研究有相當程度的進展，如腫瘤基因及腫瘤抑 制基因的發現，但致癌的機轉仍不十分明瞭。手術切除所有之腸癌組 織，是目前唯一有效治療之方法，但其五年之存活率大約為 50% 左右， 如果想要改進其存活率，就是從致病源去著手。要多瞭解其致病機轉， 才可以想辦法去預防。對於結腸癌發生的原因，目前認為可能與食物或 遺傳有關。近年來，台灣地區由於經濟繁榮以及受到西方文明的影響， 傳統的生活型態和飲食習慣發生很大的改變。在食物方面，肉類、脂肪 的攝取量提高很多，結腸癌有明顯增加的趨勢，年紀輕的結腸癌患者也 不少。遺傳方面，結腸癌的家屬或癌症家族徵候群等，得癌的機會也比能的原因為東亞國家較西方國家攝取較多的黃豆及豆製品。黃豆中主要 的抗癌成分有皂素 (saponin)、異黃酮素 (isoflavone) 及蛋白酶抑制劑 (protease inhibitor)，目前已有研究證實大豆蛋白及異黃酮素抗結腸癌的 功效，而研究亦指出，黃豆皂素可降低結腸癌前期病變 aberrant crypt foci (ACF) 的生成 (Koratkar and Rao, 1997)。但目前尚未有明確足夠的機制 來說明黃豆皂素和結腸癌之關係。
本研究探討癌症發生前，飲食中黃豆皂素粗萃取物的介入是否可達 到預防結腸癌前期病變異常腺窩灶發生，並探討黃豆皂素粗萃取物是否 藉由降低結腸黏膜上發炎反應相關因子或是影響腸道中微生物酵素活 性，來達到降低結腸癌前期病變異常腺窩灶發生的可能機制。
第二章 文獻回顧
第一節 結腸癌
(一) 腺窩與結腸癌
結直腸癌的形成是一種細胞轉變的多步驟過程，從正常的結直腸黏 膜上皮細胞，產生不正常的增生，上皮細胞當中的腺窩 (crypt) 膨大分 支成異常腺窩 (aberrant crypt, AC)，慢慢堆積長大變成息肉和腺瘤，然 後腺瘤變大，腺瘤上的細胞再逐漸產生癌變，最後則侵犯蔓延其他組織 (圖 2-1)，整個癌細胞的發展過程大約需要 5~30 年 (Smyrk and Lynch, 1997)。主要發生在遠端結腸，也就是降結腸和乙狀結腸的部分 (Kune, 1996)。而在結腸癌發展的早期，結腸黏膜上皮腺窩細胞分支為異常腺 窩，進一步會增生分裂 (multiplicity) 成異常腺窩灶 (aberrant crypt foci, ACF)。
圖 2-1、結直腸癌的發展
1987 年 Bird 在研究致癌劑對動物作用時，觀察到結腸黏膜上出現 明顯早於細胞增生及腺瘤的一種輕微損傷，稱為異常腺窩 (aberrant crypt, AC)，AC 會增生分裂成異常腺窩灶 (aberrant crypt foci, ACF)。一 個 ACF 由一個腺窩發生結構改變演變而來，ACFs 腺窩的大小比周圍正 常腺窩至少擴大兩倍、管腔呈橢圓、上皮層較正常腺窩厚。為結腸癌細 胞發生前期之病灶。ACFs 是結腸癌發展早期良好的指標，與癌症的發 生及腫瘤大小具有指標性的作用 (Bird, 1987；1995)。 (二) 結腸癌之影響因子 目前結腸癌的成因，主要是和先天遺傳及後天環境因素 (包括飲 食、飲酒抽煙習慣、生理活動以及手術的影響) 有關。近年來，台灣地 區由於經濟繁榮以及受到西方文明的影響，傳統的生活型態和飲食習慣 發生很大的改變。在食物方面，肉類、脂肪的攝取量提高很多，結腸癌 有明顯增加的趨勢，年紀輕的結腸癌患者也不少；遺傳方面，結腸癌的 家屬或癌症家族徵候群等，得癌的機會也比正常人高 (Yeh and Cowdry, 1954)。目前雖然癌症的研究有相當程度的進展，如腫瘤基因及腫瘤抑制 基因的發現，但致癌的機轉仍不十分明瞭。因此結腸癌的形成是由許多 因素造成，絕對不是由單一因素所導致的，而且它是由多種步驟演變而 成。影響結腸癌的成因包括：
1. 環境因素： 不同種族其結腸癌罹患率不同常非由基因控制。種族遷移至一新地 區後，罹患率就類似新地區的原在民族，像是一般華人罹患率較白人 低，但在夏威夷的華人結腸癌罹患率卻高居當地各民族之第二位，甚至 夏威夷及加州的男性華人罹患率高至超越美國華人 (鄭，1989)。另經濟 落後國家的罹患率普遍比發達國家低。但在同一國家種族中，上流社會 人士罹患率顯著比下層人士高 (黃，2000)，顯示並非由內在種族基因決 定結腸癌的罹患率。 2. 基因與遺傳：
遺傳性之家族性大腸息肉症 (Familial adenomatous polyposis) 病人 的直系血親，得結腸癌及腺瘤的機會比正常人高數倍 (Bulow et al., 2006)。另外遺傳性非息肉症性大腸癌 (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer) 為一顯性體染色體遺傳之疾病。病人在年輕時就會發生大腸癌， 多半在右側結腸，其大腸中常無息肉存在 (Kwak and Chung, 2007)。此兩 情況顯與基因有關。
3. 飲食因素： (a) 脂肪
消耗動物性脂肪多的國家，人民死於結腸癌的比率較高，如南美的 阿根廷，烏拉圭及蘇格蘭等的產牛區 (Matos and Brandani, 2002)。另有
些動物實驗亦發現含 n-6 多元不飽和脂肪酸亦有致癌性 (Kromhout, 1990；Singh et al., 1997)。 (b) 蔬菜及纖維素： 吃蔬菜可減少結腸癌發生率。可能是由於纖維素一來增加糞便體 積，進而稀釋致癌物；二來促進腸道蠕動，糞便排空，從而減少致癌物 與腸壁接觸的時間 (Cameron et al., 1997)。 (c) 鈣 鈣可與腸道中之膽酸，脂肪酸結合而使之成不可吸收之鈣鹽，從而 減少致癌機會 (Kune, 1996)。 (d) 硒及維生素 A, C, D, E 硒為一抗氧化劑，可幫助去除氧游離基。流行病調查發現同一社區 居民血中硒濃度低者結直腸癌之發生率為高者之五倍 (Scieszka et al., 1997)。維生素在動物實驗中可減少化學物誘發之結腸癌，可能與其可為 抗氧化劑有關 (Burnstein, 1993)。 4. 大腸炎症：
潰瘍性結腸炎 (Ulcerative colitis) 及克隆氏病 (Crohn's disease) 都 有很高惡性變化的機率，尤其是潰瘍性結腸炎，病程愈久，範圍愈大， 則惡性變化的機率愈高 (Jess et al., 2005；Yang and Pei, 2006)。
在影響結腸癌的各種因素當中，以飲食佔相當重要地位，近年來許 多研究導向以飲食調控來預防結腸癌的發生 (Kune, 1996)。
(三) 結腸癌與發炎反應
惡性腫瘤初期發展和發炎反應有顯著相關性，而長期慢性發炎則會 加重惡性腫瘤的惡化，進一步導致癌症發生 (Farrow and Evers, 2002)。 體 內 發 炎 反 應 相 關 因 子 ， 包 括 細 胞 激 素 (cytokines) 、 活 性 氧 分 子 (reactive oxygen species, ROS) 、 促 發 炎 反 應 酵 素 (pro-inflammatory enzyme) 環 氧 化 酶 -2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 和 一 氧 化 氮 合 成酶 (nitric oxide synthase, iNOS)、前列腺素 (prostaglandins, PGs)、一氧化氮 (nitric oxide, NO) 及 NF-κB生成量增加時，會加重慢性發炎情況，進一 步導致癌症發生 (Farrow and Evers, 2002)。以下分別介紹 COX-2 及 iNOS。
1. 環氧化酶：
環氧化酶 (cyclooxygenase, COX) 是將花生四烯酸 (arachidonic acid, AA) 轉變為前列腺素 (prostaglandins, PGs) 的酵素，分為COX-1和COX-2 兩種 (Simth et al., 2000)。在正常情況下，COX-1常在性的表現，調控血 栓形成和腸胃道的恆定；而COX-2屬於誘發性酵素，在正常細胞中， COX-2不會有顯著表現；而COX-2在組織發炎時會大量表現，和AA作用
生成PGs引起發炎反應，進而抑制細胞進入程式凋亡進而導致細胞不斷增 生 (Williams et al., 1999a；Williams et al., 1999b)。PGs包括有PGE2
(Prostaglandin E2)、PGD2 (Prostaglandin D2) 及TXA2 (Thromboxane A2)
等，不同的PGs有不同的生理作用，包含增加血管通透性、增加血管擴張、 支氣管收縮及引起嗜中性球的趨化作用等 (Simth et al., 2000)。PGE2過度
產生會增加細胞增殖的情形，進一步導致癌症發生 (Eisinger et al., 2007)。Eisinger等人 (2007) 指出，50% 結腸腺瘤病患和超過85% 結腸 癌病患有COX-2表現量增加的情形。給予HCT-116癌細胞COX-2抑制劑， 會降低其癌細胞增殖的情形 (Meade et al., 1993)。顯示癌細胞的生成與增 生和COX-2之表現量有顯著的關聯。Wakabayashi K (2000) 指出非固醇類 抗發炎藥物 (Nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID) 可降低發炎反 應、COX-2蛋白質表現量而降低大腸癌的發生。Botting J (2000) 亦指出 另一種抑制大腸癌的藥物COX-2抑制劑，亦是藉由降低COX-2蛋白質表 現量而降低大腸癌的發生。顯示發炎反應為造成大腸癌之重要因子之 ㄧ。抑制COX-2的抗腫瘤效應可用作研究結腸癌化學預防ㄧ個良好的指 標。 2. 一氧化氮合成酶： 人 體 內 生 性 一 氧 化 氮 氣 體 ， 是 由 一 氧 化 氮 合 成 酶 (nitric oxide
synthase, NOS) 在進行氨基酸L-arginine轉換至L-citrulline的過程中所產 生的 (Knowles and Moncada, 1994)。一氧化氮合成酶分為神經元型NOS (neuronal NOS, nNOS)、誘導型NOS (inducible NOS, iNOS) 和內皮細胞型 NOS (endothelial NOS, eNOS) 三種，是依照最初發現的組織或細胞而命 名 (各在神經突觸、巨噬細胞和血管內皮)。後來發現 nNOS 和 eNOS 不 只 存 在 神 經 突 觸 和 血 管 內 皮 ， 因 此 較 正 確 的 用 法 是 分 別 以 第 一 型 (NOS-I) 、 第 二 型 (NOS-II) 和 第 三 型 (NOS-III) 來 表 示 (Knowles, 1996)。其中nNOS 和eNOS是組合式，需要鈣和調鈣蛋白先組合進一步活 化，可製造微量 (picomolar) 的一氧化氮氣體，在生理過程中扮演恆定的 角色；iNOS 是誘發式，不需要鈣和調鈣蛋白，會受到細胞激素直接誘發 iNOS 產生催化作用，由於不需要鈣的調控，iNOS 常一誘發就無法抑 制，造成一氧化氮的過度製造 (Lechner et al., 2005)。iNOS 在發炎部位 可產生大量一氧化氮，自氧化後產生的中間物會破壞DNA的修復，造成 DNA損害，進而促進癌化的發生 (Lechner et al., 2005)。人類結直腸癌腫 瘤發展過程早期，降低iNOS蛋白質的表現可降低癌症發生的危險性 (Hao et al., 2001)。
給予動物致癌物質azoxymethane (AOM)，同時會增加結腸黏膜上 COX-2及iNOS蛋白質表現量，iNOS下游產物NO會進一步活化COX-2，
增加PGE2生成，增加癌細胞的增殖，增加癌症發生危險 (Takahashi and
Wakabayashi, 2004) (圖2-2)。而在MCG 101 tumors致癌原誘發C57BL小鼠 腫瘤生長實驗中，給予COX-2及iNOS的抑制劑，分別可降低COX-2及 iNOS蛋白質表現量而降低腫瘤發生 (Cahlin et al., 2000)。COX-2及iNOS 兩者皆受到NF-κB的調控，當受到外來刺激NF-κB表現增加時，會促使 COX-2及iNOS蛋白質的合成，進而增加NO及PGE2的生成，因此降低
NF-κB可降低癌症發生危險 (Yamamoto and Gaynor, 2001)。
圖 2-2、結腸癌誘發致癌物 AOM 對基因突變和蛋白質表現影響
Figure 2-2. Gene mutations and altered expression of proteins in rat colon carcinogenesis induced by AOM. (Takahashi and Wakabayashi, 2004)
(四) 結腸癌與腸道微生物酵素β-glucuronidase
人 體腸胃道中微生物 產生的酵素如 nitroreductase、 azoreductase及 β-glucuronidase會使大腸內的致癌物先質轉變致癌物，因而提高結腸癌發 生率 (Nakamura et al., 2002)。降低這些酵素的活性，可減少致癌物形成， 降低突變原活性，抑制腫瘤細胞生長 (Leblanc and Perdigon, 2005)。研究 指出，致癌物質二甲基聯胺1,2-dimethylhydrazine (DMH) 和azoxymethane (AOM) 非直接在動物體注射部位產生腫瘤，而是需要受到代謝而活化 (Weisburger, 1973)。在動物體當中，隨食物或藥品進入腸內之致癌物質被 腸管吸收，由門脈循環送至肝臟經由和糖醛酸 (glucuronic acid) 的結合， 成為之糖醛酸結合體 (glucuronide) 而解毒，一部份排到尿中，一部份由 膽 汁 一 起 排 泄 到 腸 內 ， 排 泄 到 腸 內 之 糖 醛 酸 結 合 體 ， 由 帶 有 β-glucuronidase之腸內細菌解離結合型態，再成為毒性物質而由腸再吸收 而又回到肝臟，如此在腸與肝臟間發生腸肝循環，使致癌物質易蓄積於 體內，可促進致癌 (Weisburger, 1971)。DMH的注射會增加腸道中微生物 酵 素β-glucuronidase 活 性 ， 會 增 加 在 腸 道 中 會 受 到 微 生 物 酵 素 β-glucuronidase分解，釋出致癌物，增加致癌物和腸道接觸機會 (Nalini et al., 2004)。因此抑制腸內細菌β-glucuronidase活性也是預防癌症之一種方 法。
(五) 結腸癌之動物模式
目前最常用的誘發動物結直腸癌模式的致癌物質為二甲基聯胺 1,2-dimethylhydrazine (DMH)、azoxymethane (AOM)。DMH 本身並非致 突變物，而是其代謝化合物 AOM 及 methylazoxymethanol (MAM)會與 DNA 結合，使 DNA 甲基化 (alkylation)，破壞 DNA 而增加了癌症發生 的機率 (Cooper et al., 1978)。研究指出，注射每公斤體重大於 20 毫克的 DMH，無論是單次注射或是連續注射，會使得結腸發生突變並且可觀察 到有明顯 ACFs 產生 (Newell and Heddle, 2004)。由於 AOM 的藥物毒性 太強，國內廠商已沒有代理，因此本次實驗選用注射的致癌物為 DMH， 但並不影響 ACFs 判定化學預防的功效。
統合上述文獻致癌物 DMH 對結腸具有組織特異性，會增加動物結 腸中 ACFs 產生，增加結腸癌發生危險；同時影響了一些體內生化質的 改變，包括增加結腸黏膜上 COX-2 及 iNOS 蛋白質表現量，增加 PGE2
含 量 導 致 細 胞 增 殖 情 形 上 升 ； 同 時 會 增 加 腸 道 當 中 微 生 物 酵 素 β-glucuronidase 活性，導致致癌物釋出，增加致癌物和腸道黏膜的接觸 機會，來增加結腸癌發生的危險性。
第二節 黃豆、黃豆皂素與異黃酮素 (一) 黃豆 黃豆為常見植物性蛋白質來源，其營養價值非常豐富，含有 38~40 % 的蛋白質及 17~20% 的油脂。黃豆的蛋白質中含有米麵蛋白中最缺乏的 離胺酸，因此和米麵共食，會有胺基酸的互補效果，所含油脂是以人體 必需的亞麻油酸及次亞麻油酸為主，並含有豐富的維生素、礦物質及膳 食纖維 (National Soybean Research Laboratory, USA)。研究指出，黃豆本 身除了有控制血膽固醇的效果 (Carroll et al., 1978)，亦有其他提升健康 的功效因為 除了營養素之外，黃豆含有的皂素及異黃酮素等一些植物性 化學物質，被認為有助於捕捉自由基，減輕婦女更年期症狀，甚至於預 防癌症 (Burke et al., 2003；Yamamoto et al., 2003；Squadrito et al., 2003)。
(二) 黃豆皂素
皂素 (saponins) 大部分存在植物當中，依其結構可分為兩部分，親 脂性的 aglycone 端及親水性的配醣基 (glycoside chains) (Ireland and Dziedzic, 1985) ， 去 掉 醣 基 的 aglycone 端 為 皂 苷 (sapogenins) 。 依 aglycone 結 構 的 不 同 ， 皂 素 可 分 為 固 醇 類 (steroid) 及 三 萜 類 (triterpenoid)，黃豆皂素屬於三萜類 (Wina et al., 2005)。結構上第 21 碳 接上不同的官能基可以分為不同的黃豆皂素 (圖 2-3)，若接上 OH 基，
為黃豆皂素 A；若接上 H 基則為黃豆皂苷 B、E 及 DDMP (Gurfinkel and Rao, 2003)。在動物實驗模式中，不論是大鼠、小鼠或雞，經口攝取黃 豆皂素過後，在血液中檢測不到皂素或是皂苷 (Gestetner et al., 1968)。 在動物體實驗中也發現，黃豆皂素部分會被人體腸道內的微生物代謝成 黃豆皂苷及一些醣基 (Jiang et al., 2004)，只有少部分會被消化吸收，絕 大部分可在糞便中檢測到 (Akao et al., 1998)。 圖 2-3、不同種類黃豆皂素之化學結構式
Figure 2-3. The structures of the different soyasaponins. (Gurfinkel and Rao, 2003)
(三) 異黃酮素
異黃酮素在植物中主要以 glycosides 型式存在，攝食後經腸內 glycosidases 水解成 aglycones，如大豆中的二種異黃酮素：genistin 和
daidzin 即經由 glycosidases 作用成為 genistein 和 daidzein (圖 2-4)，這些 aglycones 進一步的代謝物化學結構與哺乳類動物的雌激素 (estrogen) 非常相似 (Barnes et al., 2000)。依據臨床研究顯示，大豆異黃酮具有多 重的健康益處，包括改善更年期症狀、改善更年期骨質疏鬆、降低心血 管疾病等功能 (Tikkanen and Adlercreutz, 2000；Phipps et al.,2002)，甚至 可以降低乳癌及子宮癌罹患率 (Sarkar and Li, 2002)。研究指出，給予 TRAMP (Transgenic adenocarcinoma mouse prostate) mice 每公斤 AIN76 飼料中含 250 mg Genistein，能降低前列腺腫瘤發生的危險 (Wang et al., 2007)。而給予 SD 大鼠每公斤 AIN76 飼料中含 250mg Daidzein，同樣可 降低乳癌發生危險 (Lamartiniere et al., 2002)。顯示達有效劑量之異黃酮 素，具有抑制癌症的功效。
圖 2-4、不同種類之異黃酮素化學結構式
第三節 黃豆皂素之抗腫瘤作用
動物模式當中，注射 azoxymethane (AOM) 誘發其 aberrant crypt foci (ACF) 生成的 CF1 小鼠，第四週時在其 AIN-76 飲食中添加 3% 由黃豆 粉萃取的黃豆皂素，飼養十四週後犧牲。結果發現和施打 AOM 且未添 加黃豆皂素的組別相比，可以顯著降低 ACFs 的生成。除此之外，未施 打 AOM 且添加黃豆皂素的組別和控制組相比，不會影響小鼠正常的生 長發育 (Koratkar and Rao, 1997)。
在細胞培養模式中，50 ppm (per part million) 黃豆皂素的介入與控 制組相比較可顯著降低人類結腸癌細胞 HT-29 的生長 (Gurfinkel and Rao, 2003)。而 150、300、600 ppm 黃豆皂素的介入，降低細胞生長， 並 增 加 alkaline phosphatase (AP) 活 性 以 及 降 低 12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate (TPA) 所誘導的 protein kinase C (PKC) 的活化 (Oh and Sung, 2001)。AP 是一細胞分化的指標，當 AP 活性上升，表示細胞 有顯著分化的情形 (Chung et al., 1985)；TPA 是腫瘤促進劑，會使 PKC translocation 到細胞膜上，活化 PKC (Darbon et al., 1986)；PKC 則是會 刺激結腸上皮細胞的增生 (Basson et al., 1995)。促進結腸腫瘤的形成。 2004 年 Kim 等人更指出了，黃豆皂素會降低 HT-29 細胞的生長，呈現 負向劑量效應 (negative dose-dependent)，同時會降低 COX-2 以及 PKC 的蛋白質表現量 (Kim et al., 2004)。另外黃豆皂素的介入亦可降低人類
結腸癌細胞 HCT-15 的生長，研究結果顯示黃豆皂素是透過干擾細胞週 期 及 使 細 胞 走 向 自 噬 凋 亡 (macroautophagy) 所 致 (Ellington et al., 2005)。而在 WiDr 癌細胞實驗中，添加 150~1200 ppm 黃豆皂素粗萃取 物，實驗結果發現，黃豆皂素會經由和細胞膜交互作用，誘導細胞走向 死亡 (type II autophagic death)，同時會增加 AP 活性，降低 TPA 所誘導 的 PKC 活性，並且降低癌細胞的生長 (蔡，2005)。
第三章 實驗設計與材料方法
第一節 實驗設計 (一) 實驗對象和飼養方式 實驗動物為 50 隻雄性 Fisher 344 大鼠，5~6 週齡。分別飼養於不銹 鋼網籠內，置於室溫 23 ± 2 ℃，溼度 55 ± 10%，十二小時日夜交替，並 給予自由攝食及飲水，基本飲食為 AIN93G。每日記錄攝食量且每週記 錄其體重變化。實驗共為期 15 週，進行前一週為適應期。 (二) 實驗分組 圖 3-1、實驗分組Figure 3-1. The experimental groups assigned.
50 隻 Fisher 344 適應期一週，隨機分五組 DS1 DS0.5 DS0 PS0 PS0.5 注射 DMH 注射食鹽水 實驗飲食四週後， 於腹腔注射 DMH/saline，
實驗動物分成五組 (圖 3-1)，分別是 DS0 (注射 DMH，AIN93G 飲 食，n=10)；DS0.5 組 (注射 DMH，AIN93G 飲食+0.5% 黃豆皂素，n=10)； DS1 組 (注射 DMH，AIN93G 飲食+1% 黃豆皂素，n=10)；PS0 組 (注 射 saline，AIN93G 飲食，n=10)；PS0.5 組 (注射 saline，AIN93G 飲食+ 0.5% 黃豆皂素，n=10)。 (三) 實驗流程 圖 3-2、實驗流程
Figure 3-2. The procedure of the experiment.
各組以實驗飲食餵食四週後，DS0 組、DS0.5 組與 DS1 組開始於腹 腔下注射 20 mg/kg 之 DMH。每週注射兩次，為期六週；而 PS0 組與 PS0.5 組則以腹腔注入 2 mL/kg 生理食鹽水，每週注射兩次，為期六週。於第 0 週及第 15 週收集血液樣本，於第 15 週實驗結束時將全部老鼠犧牲 (圖 -1 0 5 6 7 8 9 10 15 適應期 注射 DMH/saline 抽血 犧牲 (weeks)
(四) 劑量擬定方式
小鼠誘發結腸癌模式當中，飲食中添加 3% 黃豆皂素，可有效降低 結腸上 ACFs 數目 (Koratkar and Rao, 1997)。依據苗 (1997) 動物樣品劑 量換算之方法： B 動物每公斤體重劑量= (A 動物樣品劑量克數/A 動物體重公斤數) × A 對 B 折算係數 小鼠的有效劑量 3% 小鼠樣品劑量= 2 g (每天給予飲食量) × 3% 小鼠體重= 20 g 小鼠換大鼠折算係數= 0.7 大鼠每公斤之劑量= 0.06 ÷ 0.02 × 0.7 ≒ 2.1 200 g 大鼠有效劑量≒ 0.4 g 飲食重量百分比= 0.4 ÷ 30 g (每天給予飲食量) ≒ 1%
第二節 實驗材料 (一) 飼料成分 基本飲食為 AIN93G，每公斤提供 4147.94 kcal，醣類佔 63% (w/w)， 蛋白質佔 20% (w/w)，脂質佔 7% (w/w)。由於皂素在腸道中會被分解為 皂苷及醣基，醣基被吸收，因此飲食中添加的皂素萃取物是取代蔗糖的 部份。各飲食組成如表 3-1。 (二) 黃豆皂素粗萃取物製備
取 100 g 大豆蛋白 (Soy Protein Isolate, SPI)，以 1 L 80% methanol 在 40 ℃加熱下攪拌 2 小時進行萃取，過濾後萃取液經減壓濃縮至糖漿 狀後再加入水溶出，溶出的樣品置於冷凍乾燥機，經冷凍乾燥 3 天後 即得黃豆皂素粗萃取物。每 100 g 大豆蛋白平均可萃取出約 3~4 g 黃豆 皂素粗萃取物 (Lin et al., 2005)。 (三) 1, 2-dimethylhydrazine 配製 將 1,2-dimethylhydrazine (DMH) 溶於食鹽水中，配成相當於 1% DMH 溶液，以 2 N NaOH 溶液將 pH 值調至 6.5~7.0，置於 4 ℃冷藏庫 中貯存備用。
表 3-1、各組實驗飲食組成
Table 3-1. The components of each group diet.
(g/kg) DS0 DS0.5 DS1 PS0 PS0.5 Corn starch 529.5 529.5 529.5 529.5 529.5 Casein 200 200 200 200 200 Sucrose 100 95 90 100 95 Cellulose 50 50 50 50 50 Soybean oil 70 70 70 70 70 Minteral mix1 35 35 35 35 35 Vitamin mix1,2 10 10 10 10 10 L-cystine 3 3 3 3 3 Choline 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 T-butylhydroquinine 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014 Crude saponins -- 5 10 -- 5 Energy (kcal/kg) 4147.94 4147.9 4147.94 4147.94 4147.94 1
The composition of AIN-93 Vitamin Mixture and AIN-93 Mineral Mixture is as described in American Institute of Nutrition (Reeves et al., 1993)
2
第三節 分析項目及方法 (一) 動物犧牲及樣品收集 動物隔夜禁食，秤量體重後，以乙醚進行麻醉，自腹腔靜脈採血， 收集於含有肝素 (heparin) 的採血管中。取下肝臟及結直腸部位組織， 以生理食鹽水清洗瀝乾後，冷凍存於-80 ℃，以供日後分析使用。各組 織樣品處理方式為： 血液：血液於 3000 × g；4 ℃下，離心 15 分鐘，取上層血漿儲存於-20 ℃， 以供日後分析使用。
肝臟：以 phosphate buffer saline (PBS) 灌洗肝臟，去除肝臟中血液，清 洗後的肝臟瀝乾秤重。之後每個肝臟切 0.5 × 1 × 2 cm 浸泡在 10% 福馬林當中，利用 hematoxylin and eosin (H & E) 染色做觀察。 剩餘肝臟則儲存於-80 ℃冰箱中。
結腸：各組部分動物 (4 隻/組) 取下結腸至肛門段並記錄長度，依縱切 方向剪開直腸，去除糞便測量重量，將其分為盲腸端、中段及肛 門端三段，置於兩張濾紙間，浸泡在放有福馬林塑膠培養皿中， 以封口膜封口，固定 24 小時待觀察其 aberrant crypt foci (ACF)。 結腸黏膜：各組其餘動物 (6 隻/組) 將結直腸分為盲腸端、中段、肛門
端三段，洗淨去除糞便，刮除結直腸上黏膜，收集於微量離 心管中，並儲存於-80 ℃冰箱中。
(二) 黃豆皂素粗萃取物成分分析 皂素分析：
利用市售黃豆皂素 (192-08851, Wako) 配置 1000 ppm 標準品；樣品 配製則是取 0.01 g 黃豆皂素粗萃取物溶於 1 mL 水中。以 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 分析，利用 ChromQuest 4.X 軟體分析比較。HPLC 分析條件，使用 C18 管柱 (Inertsil 6, ODS-3, 4.6 × 250 mm, Vercopak)，注射容積為 20 μL，流速為 1 mL / min，利用 溫度控制箱 (Super CO-150, Enshine) 將溫度控制在 30 ℃，UV 吸收值 為 260 nm，移動相給予濃度梯度，條件如下表。
表 3-2、皂素 HPLC 分析移動相給予梯度濃度條件 Table 3-2. The condition of HPLC analysis of soy saponins.
Time scale Solvent A Solvent B
0.05 % trifluoroacetic acid acetonitrile in water 01 - 12 min 63% 60% 37% 40% 12 - 37 min 60% 52% 40% 48% 37 - 38 min 52% 0% 48% 100% 38 - 40 min 0% 100% 40 - 45 min 0% 63% 100% 37% 異黃酮素分析：
(G6649, Sigma)；Genistin (G0897, Sigma) 作為標準品；樣品配製則是取 0.5 g 黃豆皂素粗萃取物溶於 20 mL 80% methanol (MS1992, Tedia)中。以 HPLC 分析，利用 ChromQuest 4.X 軟體分析比較。HPLC 分析條件， 使用 C18 管柱 (Inertsil 6, ODS-3, 4.6 × 250 mm, Vercopak)，注射容積為 20 μL，流速為 1 mL / min，溫度控制在 40 ℃ (Super CO-150, Enshine)， UV 吸收值為 248 nm，移動相給予濃度梯度，條件如下表。
表 3-3、異黃酮素 HPLC 分析移動相給予梯度濃度條件 Table 3-3. The condition of HPLC analysis of isoflavones.
Time scale Solvent A Solvent B
acetonitrile 0.1 % acetic acid 01 - 04 min 15% 35% 85% 65%
04 - 48 min 35% 65%
49 - 52 min 35% 15% 65% 85%
(三) 血漿異黃酮素分析
取50 μl血漿加入 3 ml tert-butyl methyl ester (TBME) 混勻 1 分 鐘，震盪 10 分鐘，以 6500 × g 離心 3 分鐘，取上層並抽乾有機溶劑， 加入250 μlmethanol-0.05 M ammoium acetate (pH 4.7) (30:70) 溶液，以 HPLC 分析，利用 ChromQuest 4.X 軟體分析比較。HPLC 分析條件， 使用 C18 管柱 (Inertsil 6, ODS-3, 4.6 × 250 mm, Vercopak)，注射容積為
20 μL，流速為 1.2 mL / min，溫度控制在 40 ℃ (Super CO-150, Enshine)， UV 吸收值為 248 nm，移動相給予固定濃度，條件為 methanol-0.1 M ammoium acetate (pH 4.7) (40:60)。
(四) 血脂分析
利 用 全 自 動 分 析 儀 (Dri-Chem 3500, Fuji) 、 TG 試 片 (440804, Fujifilm) 及 TCHO 試片 (240707, Fujifilm) 測量血漿中三酸甘油酯和總 膽固醇含量，每次樣品所需量為 10 μl。
(五) Aberrant crypt foci 染色觀察
以 10% 福馬林之固定液固定 24 小時後，取出結腸，以水清洗黏附 在濾紙，過一次食鹽水，再以 0.5% 亞甲藍 (methylene blue) 染色約 1 分鐘，於食鹽水清洗，將染色過的結腸組織置於載玻片上，在顯微鏡 40 倍率下觀察，由左至右、由上至下計算數目。發現有 aberrant crypt foci (ACF)，紀錄座標並在 400 倍率顯微鏡下拍照。將所觀察到的 ACFs 作 以下分類，A 為正常腺窩細胞；B 為有一個異常腺窩的 ACF，標示為 1 AC/ACF；C 為 2 AC/ACF；以此類推 (圖 3-3)。並且依照 Cassand 等人 (1997) 將一至三異常腺窩的 ACFs 定義為小型 ACFs；大於三個異常腺 窩的 ACFs 定義為大型 ACFs。計算其大小型 ACFs 數目及 ACFs 的總數。
圖 3-3、ACFs 分類
Figure 3-3. The classification of ACFs.
(六) 老鼠結腸黏膜組織中 COX-2 蛋白質表現量 細胞蛋白質之萃取：
將 500 μl均質化緩衝液 (1X RIPA buffer, 20-188, upstate : Protein Inhibitor, p8340, Sigma = 200 : 1) 加入黏膜組織中，在冰上均質，均質液 在 4 ℃下以 19300 x g 離心 20 分鐘，取上清液至新的微量離心管，即為 所需之蛋白質萃取液。
蛋白質之定量：
使用蛋白質分析試劑 (BCA1 and B9643, Sigma) 定量細胞中蛋白 質的含量，以 Bovine serum albumin (BSA) 為標準品做出標準曲線，濃 度為 31.25 μg /mL~1 mg / mL。標準品以水稀釋 1X、2X、4X、8X、16X 及 32X，取 10 μL 至 96 孔培養盤；而蛋白質樣品 (細胞蛋白質萃取液) 加水稀釋 1X、2X 及 4X，取 25 μL 至 96 孔培養盤，加入 200 μL之 BCA 蛋 白 質 分 析 試 劑 (Bicinchoninc acid solution : Copper sulfate
Normal crypt 1 AC / ACF
A B
2 AC / ACF 3 AC / ACF
pentahydrate 4% solution = 50 : 1)，混合均勻在 37 ℃下作用 30 分鐘利用 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 光度計讀取波長 562 nm 的吸光值。
硫酸十二酯鈉－聚丙烯醯胺凝膠電泳：
利用十二基硫酸鈉電泳法 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 和西方墨點法 (Western blot) 來分析 COX-2 及 iNOS 蛋白質的表現。COX-2 及 iNOS 的分子量分別為 70 kDa、 130 kDa。選用 10% resolving gel 和 7% stacking gel 之 SDS-PAGE 進行 分析，並以β-actin (42 kDa) 作為 internal control。
取 80 μg之蛋白質樣品，加入四分之ㄧ體積量的 5 倍樣品緩衝液 (sample buffer)，於 97 ℃下加熱 3 分鐘，使蛋白質變性。處理後即可注 入已製作完成之電泳膠片的齒孔中，另注入 2.5 μL 的蛋白質標記 (LC5925, invitrogen)，並於電泳槽內外注入適量電泳液 (Tank buffer)， 於室溫下先以 60 伏特電壓跑膠 30 分鐘，當蛋白質完全通過 stacking gel 後，再施以 90 電壓跑膠 2 小時，使蛋白質可依分子量大小於凝膠上展 開。
西方墨點法：
一層 polyvinyldene diflouride (PVDF) 膜，應注意避免覆蓋所產生之氣泡 而影響通電，組裝完成以轉移緩衝液 (Towbin transfer buffer) 在冰上， 並於 300 安培下進行 2 小時的轉移。轉移後，PVDF 膜標定蛋白質標記 的位置，並將其浸於 25 mL 1% 胎牛血清 (albumin from bovine serum, BSA) 之 TBST (Tris-buffered saline plus 0.1% Tween-20) 溶液中，於室溫 震盪隔夜，進行阻斷 (Blocking)，使之預先排除非專一性之結合。阻斷 後將其浸於 10 mL TBST 溶液沖洗四次，再以 10 mL TBS (Tris-buffered saline) 溶液清洗 PVDF 膜 2 次，每次 10 分鐘，移除 TBS 溶液後，加 入以 1% BSA 稀釋之一級抗體，於室溫環境下搖動作用 2 小時。回收一 級抗體後，使用 TBST 溶液以及 TBS 溶液沖洗 PVDF 膜，再加入以 1% BSA 溶液稀釋之二級抗體，於室溫環境下搖動 40 分鐘。回收二級抗體 後，再以 TBST 溶液以及 TBS 溶液沖洗 PVDF 膜。最後移除 TBS 溶液， 加 入 1 mL Western LightningTM
Chemiluminescence Reagent Plus (Perkinelmer life sciences, USA) 反應試劑組避光作用 2 分鐘，用保鮮膜 包覆後固定於壓片匣中，於暗房中將 Fuji medical x-ray film 放進壓片匣 壓片，經 5 分鐘時間反應後將底片取出，以顯影劑及定影劑沖洗 X-ray 底片，顯影後觀察結果。顯影後的底片，掃瞄影像至電腦，利用 Image-Pro Plus 4.5 軟體，計算各個影像密度。
Rockford, USA)，正反面在室溫下震盪各 15 分鐘將抗體脫離，再以 TBS 溶液清洗 10 分鐘。處理過的 PVDF 膜即可再進行阻斷繼續和其他抗體 作用。
(七) 老鼠結腸黏膜組織中 PGE2含量
結腸黏膜以均質緩衝液 (Homogenization buffer, 13.69 g phosphate 先加入少許 ddH2O，調整 pH 值至 7.4 + 357.8 mg EDTA + 3.6 mg
indomethacin，以 ddH2O 定量至 1000 mL) 均質，加入 2~4 倍樣品體積
丙酮 (acetone) 震盪，在室溫下反應 5 分鐘，以 1500 × g 離心 10 分鐘後， 取上清液，真空抽乾 acetone，所得樣品以商業試劑配方 (Prostaglandin E2
EIA Kit, Cayman) 測量黏膜組織中 PGE2含量。
(八) β-glucuronidase 酵素活性測定
β-glucuronidase (GUS) 會 催 化 基 質 p-nitrophenyl β-D-glucuronide (pNPG)，水解產生黃色的生成物p-nitrophenol，測定生成物質的吸光值， 可以推算酵素的活性 (Jefferson et al, 1986)；催化反應如下式：
吸取20 μL的蛋白質樣本，小心注入微量滴定盤中，避免氣泡產生。 每一樣品槽加入200 μL GUS基質液 (pNPG, N-1627, Sigma) 31.5 mg，溶 於100 mL 50 mM Na3PO4, pH 7.0)，混合均勻，每十分鐘以Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 光度計測定波長415 nm之吸光值，共測定 一小時。以上步驟，只可測定GUS 活性的相對大小，並非酵素絕對活性 單位的測定方法。酵素的活性單位定義為：每分鐘所能催化生成物之μ mole數。因此將所測定之單位時間內吸光值的變化，轉換成生成物的莫 耳數，即可求得其真正的活性單位。酵素比活性計算公式 (nmole/min/mg protein) =【V/(E × d × p × v)】× △A415nm/△t (Lowry et al., 1951)。
V= 酵素反應液總溶液 (ml) E= 分子吸光係數 (E= 6.2 ml/μ mole.cm) d= 光路徑 (光路徑= 1 cm) p= 肝臟酵素測定液蛋白質濃度 (mg protein/mL) v= 酵素測定液容積 (ml) △A415nm/△t= 單位時間內，酵素反應液於 415 nm 時的吸光值變化 (九) 肝臟組織切片
老鼠肝臟組織切片，以 Hematoxylin and eosin (H & E) 染色，由病 理科醫師判定其脂肪病變、發炎和纖維化的情形。
第四節 試劑配方
(1) SDS-PAGE (適用於 Bio Rad mini gel 兩片膠的量)
(ml) 10 % Resoling gel 7 % Stacking Gel
Total 10 2 H2O 4 1.4 40% Acrylamide 2.5 0.33 1.5M Tris (pH8.8) 2.5 1.5M Tris (pH6.8) 0.16 10% SDS 0.1 0.02 10% APS 0.1 0.02 TEMED 0.004 0.002 (2) 1.5 M Tris (pH 8.8) 貯存在 4 ℃ 18.171 g Tris-base + 90 mL ddH2O (調整 pH 值至 8.8)，以 ddH2O 定量 至 100 mL。 (3) 1.5 M Tris (pH 6.8) 貯存在 4 ℃ 23.64 g Tris-HCl + 90 mL ddH2O (調整 pH 值至 6.8)，以 ddH2O 定量 至 100 mL。 (4) 10 倍 Electrophoresis 30.28 g Tris-base + 144.2 g Glycine + 10 g SDS，以 ddH2O 定量至 1000 mL。 (5) Tank buffer 100mL 10X Electrophoresis，以 ddH2O 定量至 1000 mL。
(6) Towbin transfer buffer
(7) 10X TBS
24.2 g Tris-base + 80 g NaCl，以 ddH2O 定量至 1000 mL。
(8) 1X TBST
500 ml 1X TBS + 2.5 ml Tween 20 (9) 初級抗體
β-actin (Mouse anti-β-actin Monoclonal antibody, A 5441, SIGMA)； COX-2 (Goat anti-Cox monoconal antibody, sc-19999, Santa Cruz)； iNOS (Rabbit anti-NOS2 Polyconal antibody, sc-649, Santa Cruz)，皆以 1：1000 稀釋於含 1% BSA 之 TBST 中。
(10) 次級抗體
β-actin (rabbit anti-mouse IgG, A9044, SIGMA) ； COX-2 (Donkey anti-mouse IgG, sc-2020, Santa Cruz)；iNOS (Goat anti-rabbit IgG, sc-2004, Santa Cruz)，皆以 1：5000 稀釋於 1% BSA 之 TBST 中。 (11) Homogenization buffer
13.69 g phosphate 先加入少許 ddH2O (調整 pH 值至 7.4) + 357.8 mg
EDTA + 3.6 mg indomethacin，以 ddH2O 定量至 1000 mL。
(12) GUS基質溶液 (GUS reaction buffer)
pNPG (p-nitrophenylβ-D-glucuronide, N-1627, Sigma) 31.5 mg，溶於100 mL Buffer A (50 mM Na3PO4, pH 7.0)
第五節 統計方法
數值以 Mean ± SEM 表示。數據利用 SAS9.0 軟體以 One-way analysis of variance (ANOVA) 分 析，利 用 Fisher`s Least Significant Differences (LSD) 及 Dunnett 做組間之比較。當 p < 0.05 具有統計意義。
第四章 實驗結果
第一節 黃豆皂素粗萃取物分析
本實驗黃豆皂素粗萃取物萃取率為 3~4%，約每 100 g 大豆蛋白 (Soy protein isolate, SPI) 粉末可萃取出 3~4 g 的黃豆皂素粗萃取物。
在 HPLC 分 析 方面， 分別 分析 黃豆皂 素粗 萃取 物 之異 黃酮素 (Isoflavones) 及皂素 (Saponins) 含量。在波長 248 nm 下觀察異黃酮素 標準品 HPLC 圖譜 (圖 4-1)，在第 7、14、26 及 28 分鐘出現的波峰，分 別是 Daidzin、Genistin、Daidzein 及 Genistein。而黃豆皂素粗萃取物其 異黃酮素含量，對照標準品做比較，結果顯示每克黃豆皂素粗萃取物中 含有 Daidzin 1180 ± 44 μg、Genistin 923 ± 11 μg、Daidzein 173 ± 58 μg 及 Genistein 474 ± 197 μg，總含量為 2751 ± 309 μg。
皂素含量分析方法則是參考 Hu 等研究 (2002)，在波長 260 nm 下 觀察黃豆皂素粗萃取物之皂素含量，並且和皂素標準品做比較 (圖 4-2)，比較圖譜 0~15 分鐘的曲線下面積，結果顯示每克黃豆皂素粗萃取 物中含有皂素 778289 ± 3771 μg。
圖 4-1、利用 HPLC 觀察在波長 248 nm 下異黃酮素含量的層析曲線圖譜 Figure 4-1. HPLC chromatogram of isoflavone standard and extracted crude soybean saponins detected with UV absorbance spectra at 248 nm.
A. HPLC chromatogram of isoflavone standard detected with UV absorbance spectra at 248 nm.
B. HPLC chromatogram of extracted crude soybean saponins detected with UV absorbance spectra at 248 nm. Daidzein Genistin Daidzin Genistein Daidzein Genistin Daidzin Genistein A B
圖 4-2、利用 HPLC 觀察在波長 260 nm 下皂素含量的層析曲線圖譜 Figure 4-2. HPLC chromatogram of soybean saponins standard and extracted crude soybean saponins detected with UV absorbance spectra at 260 nm.
A. HPLC chromatogram of soybean saponins standard detected with UV absorbance spectra at 260 nm.
B. HPLC chromatogram of extracted crude soybean saponins detected with UV absorbance spectra at 260 nm.
A
第二節 動物攝食和生長狀況 在體重方面，隨老鼠週齡增加體重逐漸上升，各組之間沒有顯著的 差異 (圖 4-3)。實驗期老鼠平均每天體重增加在 DS0 組為 1.77 ± 0.04 g； DS0.5 組為 1.68 ± 0.06 g；DS1 組為 1.79 ± 0.06 g；PS0 組為 1.86 ± 0.06 g； PS0.5 組為 1.85 ± 0.08 g，各組體重的增加亦沒有統計差異 (表 4-1)。而 注射 DMH 使體重增加量略小於注射食鹽水組。 在食物攝取方面，老鼠每天攝食平均 DS0 組為 16.44 ± 0.26 g；DS0.5 組為 15.45 ± 0.35 g；DS1 組為 15.95 ± 0.33 g；PS0 組為 16.78 ± 0.24 g； PS0.5 組為 15.85 ± 0.38 g，每日攝食量沒有統計差異 (表 4-1)。計算其 攝食效率，以老鼠體重增加的克數除上每日食物攝取量，DS0 組為 10.83 ± 0.38%；DS0.5 組為 10.91 ± 0.36%；DS1 組為 11.28 ± 0.35%；PS0 組為 11.09 ± 0.34%；PS0.5 組為 11.60 ± 0.31%，各組攝食效率亦沒有統計差 異 (表 4-1)。在食物攝取及攝食效率，各組之間沒有顯著差異。顯示黃 豆皂素的添加並不影響動物攝食的狀況。 在組織重量方面，老鼠肝臟重量及相對肝重各組分別是 DS0 組為 12.82 ± 0.37 g (3.80 ± 0.09%)；DS0.5 組為 12.36 ± 0.64 g (3.77 ± 0.15%)； DS1 組為 11.63 ± 0.58 g (3.41 ± 0.13%)；PS0 組為 13.1 9 ± 0.56 g (3.79 ± 0.12%)；PS0.5 組為 12.59 ± 0.98 g (3.58 ± 0.19%)，肝臟重量及相對肝重 各組間沒有統計差異 (表 4-2)。老鼠結腸長度各組分別是 DS0 組為 14.15
± 0.46 cm；DS0.5 組為 13.76 ± 0.33 cm；DS1 組為 14.43 ± 0.46 cm；PS0 組為 15.24 ± 0.39 cm；PS0.5 組為 13.69 ± 0.46 cm，結腸長度各組間沒有 統計差異 (表 4-3)。而老鼠結腸重量及相對結腸重各組分別是 DS0 組為 1.45 ± 0.04 g (0.43 ± 0.01%)；DS0.5 組為 1.45 ± 0.03 g (0.44 ± 0.01%)； DS1 組為 1.43 ± 0.03 g (0.42 ± 0.01%)；PS0 組為 1.32 ± 0.02 g (0.38 ± 0.01%)；PS0.5 組為 1.40 ± 0.03 g (0.41 ± 0.01%)，結腸重量及相對結腸 重各組間沒有統計差異 (表 4-3)。 在血脂分析方面，由於各組基準值的不同，比較其實驗期間的變化 量。在三酸甘油酯變化量各組分別是 DS0 組為-28.3 ± 9.4 mg/dL；DS0.5 組為-21.4 ± 7.4 mg/dL；DS1 組為-35.0 ± 11.6 mg/dL；PS0 組為 8.75 ± 2.9 mg/dL；PS0.5 組為 29.5 ± 19.6 mg/dL，各組間沒有統計差異 (表 4-4)。 在總膽固醇變化量各組分別是 DS0 組為-7.8 ± 3.5 mg/dL；DS0.5 組為 -23.4 ± 5.0 mg/dL；DS1 組為-8.0 ± 7.7 mg/dL；PS0 組為-11.4 ± 4.1 mg/dL；PS0.5 組為 3.0 ± 4.4 mg/dL，各組間沒有統計差異 (表 4-4)。 在肝臟病理切片方面，由病理科醫師判定，各組之間無論在脂肪病 變、發炎以及纖維化的情形，皆沒有顯著差異 (圖 4-4)。
100 150 200 250 300 350 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 weeks g
PS0
PS0.5
DS0
DS0.5
DS1
圖 4-3、實驗期間老鼠體重變化1,2Figure 4-3. Body weight of experimental phase1,2
1
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
2
表 4-1、老鼠體重增加、飼料攝食量及攝食效率1,2,3
Table 4-1. The body weight gain, food intake and food efficiency of rats1,2,3
Group Body weight gain
(g/day) Food intake (g/day) Food efficiency4 (%) PS0 1.86 ± 0.06 16.78 ± 0.24 11.09 ± 0.34 PS0.5 1.85 ± 0.08 15.85 ± 0.38 11.60 ± 0.31 DS0 1.77 ± 0.04 16.44 ± 0.26 10.83 ± 0.38 DS0.5 1.68 ± 0.06 15.45 ± 0.35 10.91 ± 0.36 DS1 1.79 ± 0.06 15.95 ± 0.33 11.28 ± 0.35 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=8~10)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
There was no statistic different between each other (p > 0.05)
4
表 4-2、老鼠肝臟重量及相對肝重 1,2,3
Table 4-2. The liver weight and relative liver weight of rats1,2,3
Group Liver weight
(g)
Relative liver weight4 (%) PS0 13.19 ± 0.56 3.79 ± 0.12 PS0.5 12.59 ± 0.98 3.58 ± 0.19 DS0 12.82 ± 0.37 3.80 ± 0.09 DS0.5 12.36 ± 0.64 3.77 ± 0.15 DS1 11.63 ± 0.58 3.41 ± 0.13 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=8~10)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
There was no statistic different between each other (p > 0.05)
4
表 4-3、老鼠結腸重量及相對結腸重 1,2,3
Table 4-3. The colon length, weight and relative colon weight of rats1,2,3
Group Colon length
(cm)
Colon weight (g)
Relative colon weight4 (%) PS0 15.24 ± 0.39 1.32 ± 0.02 0.38 ± 0.01 PS0.5 13.69 ± 0.46 1.40 ± 0.03 0.41 ± 0.01 DS0 14.15 ± 0.46 1.45 ± 0.04 0.43 ± 0.01 DS0.5 13.76 ± 0.33 1.45 ± 0.03 0.44 ± 0.01 DS1 14.43 ± 0.46 1.43 ± 0.03 0.42 ± 0.01 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=8~10)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
There was no statistic different between each other (p > 0.05)
4
表 4-4、老鼠第 0 及 15 週血脂分析 1,2
Table 4-4. The change of blood lipid in rats from week 0 to 151,2
Group TG (mg/dL) TC (mg/dL) week 0 15 △0~15＊ 0 15 △0~15＊ PS0 102.6 ±36.6 111.4±36.4 8.75±2.9 75.9±15.7 64.5±9.6 -11.4±4.1 PS0.5 140.0±51.7 169.5±73.4 29.5±19.6 71.9±10.5 75.0±12.8 3.±4.4 DS0 150.6±43.7 122.4±29.8 -28.3±9.4 71.7±12.1 63.9±9.7 -7.8±3.5 DS0.5 111.7±40.2 90.2±18.3 -21.4±7.4 77.3±15.6 53.9±20.9 -23.4±5.0 DS1 126.6±67.4 91.6±25.6 -35.0±11.6 77.0±15.8 61.3±10.4 -8.0±7.7 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=8~10)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
*
圖 4-4、以 Hematoxylin and eosin 染色觀察老鼠肝臟組織切片1,2
Figure 4-4. The pathological assessment by Hematoxylin and eosin (H & E) stain in liver tissue of rats1,2
1
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
2
Between each group, the servereness of fibrosis, inflammation and fat pathological change, was not significantly different.
DS0 DS0.5
PS0 PS0.5
第三節 結腸癌相關指標
在 aberrant crypt foci (ACF) 計數結果方面，結果顯示 DS0、DS0.5 以及 DS1 組發現皆有 1 至 6 個不等異常腺窩 (AC) 的 ACFs 的存在 (圖 4-5)。PS0 及 PS0.5 組則完全沒有 ACFs 發生。
依 ACFs 的大小分類比較，依據 Cassand 等人 (1997) 研究，將 1 至 3 個 AC 的 ACFs 定義為小的 ACFs，而大於 3 個 AC 的 ACFs 定義為 大的 ACFs。各組分別做比較，結果顯示 DS0 組 1 個及 2 個 AC 的 ACFs 數目顯著低於 DS0 組 (p < 0.05)。比較小的 ACFs 總數，DS0、DS0.5 及 DS1 三組間有負向的劑量差異 (p < 0.05)，也就是劑量越高，小的 ACFs 總數越少 (表 4-5)。而比較大的 ACFs 總數，DS1 組則顯著的低於 DS0 組 (p < 0.05) (表 4-6)。 依腸區域比較 ACFs 數目比較，各組分別做比較，結果顯示 DS1 組 在盲腸端 ACFs 總數顯著低於 DS0 組 (p < 0.05)。在中段結腸，DS1 組 ACFs 總數顯著低於 DS0 組和 DS0.5 組 (p < 0.05)。在肛門端，DS0.5 組 和 DS1 組 ACFs 總數顯著皆低於 DS0 組 (p < 0.05)。將結腸不分段，比 較總 ACFs 總數，DS0、DS0.5 及 DS1 三組間有負向的劑量差異 (p < 0.05) (表 4-7)。 在 COX-2 蛋白質表現量分析方面，在注射 DMH 的 DS0、DS0.5 及 DS1 三組有 COX-2 的表現，在注射 PBS 的組別則沒有 COX-2 的表現。
比較 DS0、DS0.5 及 DS1 三組蛋白質表現量 (圖 4-6A)，各組之間沒有 顯著差異。而依腸區域分開比較 DS0、DS0.5 及 DS1 三組，無論是在盲 腸端、中段或是肛門端 COX-2 蛋白質表現量，各組之間沒有顯著差異 (圖 4-6B~C)。在 iNOS 蛋白質表現量分析方面，本實驗各組皆沒有偵測 到其蛋白質表現。 在 PGE2濃度分面，DS0 組為 16205 ± 2910 pg/mL；DS0.5 組為 6523 ± 2823 pg/mL；DS1 組為 4507 ± 396 pg/mL；PS0 組為 2704 ± 415 pg/mL； PS0.5 組為 3146 ± 537 pg/mL。在注射 DMH 的 DS0 組顯注高於注射 PBS 的 PS0 組 (p < 0.05)，DS0、DS0.5 及 DS1 三組之間則沒有顯著差異 (圖 4-7)。 在 β-glucuronidase 酵素相對活性方面，DS0 組為 346.9 ± 15.6 nmole/min/mg protein；DS0.5 組為 209.6 ± 17.1 nmole/min/mg protein； DS1 組為 163.7 ± 5.2 nmole/min/mg protein；PS0 組為 158.4 ± 8.8 nmole/min/mg protein；PS0.5 組為 159.3 ± 6.3 nmole/min/mg protein。DS0 組顯著高於 PS0 組 (p < 0.05)，DS0.5 組及 DS1 組顯著低於 DS0 組 (p < 0.05) (圖 4-8)。
圖 4-5、以亞甲藍染色觀察老鼠結腸黏膜上 ACFs (10×40)1,2
Figure 4-5. The pathological assessment by methylene blue stain in the ACFs of the colonic mucosa of rats1,2
1
ACFs：aberrant crypt foci
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
DS0-1 DS0-2 DS0-3 DS0-4
DS0.5-1 DS0.5-2 DS0.5-3 DS0.5-4
DS1-1 DS1-2 DS1-3 DS1-4
表 4-5、老鼠小型 ACFs 計數1,2
Table 4-5. The counts of small ACFs in rats1,2
The incidence of ACFs3
1AC 2AC 3AC small4
PS0 0/4 ND5 ND ND ND PS0.5 0/4 ND ND ND ND DS0 6/6 10.16 ± 1.22a 9.00 ± 1.46a 5.83 ± 0.70 25.00 ± 1.89a DS0.5 6/6 5.67 ± 0.59ab 6.00 ± 0.75ab 3.83 ± 0.41 15.50 ±0.54b DS1 6/6 2.83 ± 0.39b 1.83 ± 0.50b 3.00 ± 0.63 7.67 ± 1.32c 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=6)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
The incidence of ACFs= (the number of ACF rats/the number of total rats)
4
small ACFs：1~3AC/ACF
5
ND：No detection
abc
Letters in each column sharing the different superscripts are significantly different (p < 0.05)
表 4-6、老鼠大型的 ACFs 計數 1,2
Table 4-6. The counts of large ACFs in rats1,2
The incidence of ACFs3
4AC 5AC 6AC large4
PS0 0/4 ND5 ND ND ND PS0.5 0/4 ND ND ND ND DS0 6/6 1.67 ± 0.27 0.17 ± 0.09 0.17 ± 0.09 2.00 ± 0.20a DS0.5 6/6 1.17 ± 0.17 0 0 1.17 ± 0.17ab DS1 6/6 0.17 ± 0.09 0.17 ± 0.09 0 0.33 ± 0.12b 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=6)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
The incidence of ACFs= (the number of ACF rats/the number of total rats)
4
large ACFs：>3AC/ACF
5
ND：No detection
ab
Letters in each column sharing the different superscripts are significantly different (p < 0.05)
表 4-7、老鼠各段結腸 ACFs 計數1,2
Table 4-7. Distribution of ACFs according to different sections of colon1,2
The incidence of ACFs3
proximal middle distal total
PS0 0/4 ND4 ND ND ND PS0.5 0/4 ND ND ND ND DS0 6/6 4.50 ± 0.67a 7.17 ± 0.62a 15.50 ± 1.35a 27.00 ± 1.91a DS0.5 6/6 2.00 ± 0.28ab 4.83 ± 0.33a 9.83 ± 0.43b 16.67 ± 0.44b DS1 6/6 1.00 ± 0.35b 1.83 ± 0.50b 5.17 ± 0.81b 8.00 ± 1.41c 1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=6)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
The incidence of ACFs= (the number of ACF rats/the number of total rats)
4
ND：No detection
abc
Letters in each column sharing the different superscripts are significantly different (p < 0.05)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 PS0 PS0.5 DS0 DS0.5 DS1 C O X -2 / β-ac ti n r at io 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 PS0 PS0.5 DS0 DS0.5 DS1 C O X -2 / β-ac ti n r at io A. B. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 PS0 PS0.5 DS0 DS0.5 DS1 C O X -2 / β-ac ti n r at io C. D. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 PS0 PS0.5 DS0 DS0.5 DS1 C O X -2 / β-ac ti n r at io 圖 4-6、老鼠結腸黏膜 COX-2 蛋白質表現量1,2
Figure 4-6. The expression of COX-2 protein in the colonic mucosa1,2
A. The total expression of COX-2 protein in the colonic mucosa. B. The expression of COX-2 protein in proximal colonic mucosa. C. The expression of COX-2 protein in middle colonic mucosa. D. The expression of COX-2 protein in distal colonic mucosa.
1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=3~4)
2
The image of western blot was representative.
ab
Letters at the top of each bar sharing the different superscripts are significantly different (p < 0.05) COX-2 β-actin ( 70 kDa ) ( 42 kDa ) b b b a a COX-2 β-actin ( 70 kDa ) ( 42 kDa ) b b b a a COX-2 β-actin ( 70 kDa ) ( 42 kDa ) COX-2 β-actin ( 70 kDa ) ( 42 kDa ) b b b a a b b b a a
0 5000 10000 15000 20000 25000 PS0 PS0.5 DS0 DS0.5 DS1 P G E 2 le v el (p g /m g p ro te in ) 圖 4-7、結腸黏膜 PGE2濃度 1,2
Figure 4-7. The PGE2level in the colonic mucosa 1,2
1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=3~4)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
ab
Letters at the top of each bar sharing the different superscripts are significantly different (p < 0.05)
b
ab
ab
0 100 200 300 400 PS0 PS0.5 DS0 DS0.5 DS1 E n zy m e a ct iv it y (n m o le /m in /m g p ro te in ) 圖 4-8、結腸黏膜 β-glucuronidase 酵素活性1,2,3
Figure 4-8. The activity of β-glucuronidase in the colonic mucosa1,2,3
1
Data are expressed as Mean ± SEM (n=3~4)
2
PS0：received saline and fed AIN93G diet；PS0.5：received saline and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins ； DSO ： received 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and fed AIN93G diet；DS0.5：received DMH and fed AIN93G diet containing 0.5% saponins； DS1：received DMH and fed AIN93G diet containing 1% saponins.
3
The enzyme activities are derived from the changes of activity at 0 and 60 mins.
abc
Letters at the top of each bar sharing the different superscripts are significantly different (p < 0.05)
b
ac
ac
第五章 討論
第一節 黃豆皂素粗萃取物抗癌的成分
本實驗所萃取黃豆皂素粗萃取物，每克中含有異黃酮素共 2.75 mg (Daidzin 1180 ± 44 μg、Genistin 923 ± 11 μg、Daidzein 173 ± 58 μg及 Genistein 474 ± 197 μg)，含有黃豆皂素 778.3 mg。相當本次實驗 DS1 組 老鼠在每天飼料中含有 20 × 1% × 77.8% = 0.16 g 黃豆皂素，含有 20 × 1% × 0.275% = 0.00055 g = 0.55 mg 異黃酮素 (Daidzin 0.24 mg、Genistin 0.17 mg、Daidzein 0.03 mg 及 Genistein 0.09 mg)。
Cassand 等人 (1997) 指出 aberrant crypt foci (ACF) 的總數以及大 型 ACFs 的數目為結腸癌發生的良好指標。本實驗當中，ACFs 總數結 果隨著實驗添加黃豆皂素粗萃取物劑量的增加，ACFs 數目愈少。顯示 黃豆皂素粗萃取物對於 1,2-dimethylhydrazine (DMH) 誘發鼠具有抑制 ACFs 產生的功效。
在異黃酮素抗癌方面，研究指出，給予 Transgenic adenocarcinoma mouse prostate (TRAMP) 小鼠每公斤 AIN76 飼料中含 250 mg Genistein (換算成大鼠劑量，每天 20 g 飼料當中含有 3.5 mg Genistein)，能降低前 列腺腫瘤發生的危險 (Wang et al., 2007)。而給予 SD 大鼠每公斤 AIN76 飼料中含 250 mg Daidzein (換算成大鼠劑量，每天 20 g 飼料當中含有 5
mg Daidzein)，可降低乳癌發生危險 (Lamartiniere et al., 2002)。因此大 鼠每天攝取 3.5 mg Genistein 或是 5 mg Daidzein 有降低癌症發生的功 效。而在異黃酮素降低心血管疾病方面，給予 C57B1/6J 小鼠高脂飲食， 添加 0.2% Genistein (換算成大鼠劑量，每天 20 g 飼料當中含有 28 mg Genistein)，可有效降低老鼠血漿中總膽固醇及三酸甘油酯的濃度 (Yang et al., 2006)。而 Kunming 小鼠的動物模式下，給予高脂飲食，每公斤體 重添加 50 mg Soy isoflavone (含有 Genistein 和 Genistin 11.17 mg， Daidzin 和 Glycetein 8.96 mg。換算成大鼠劑量，每天 20 g 飼料當中含有 Genistein 和 Genistin 1.56 mg，Daidzin 和 Glycetein 1.25 mg)，同樣具有 降 低 因 高 脂 飲食增 加 的 血 膽 固醇和 三 酸 甘 油 酯的功 效 (Liu et al., 2007)。因此大鼠每天攝取 28 mg Genistein 或者是 7 mg 大豆異黃酮素可 降低心血管疾病發生的危險。 在異黃酮素吸收狀況，DS1組老鼠在每天飼料中含有0.55 mg異黃酮 素，在血漿中並沒有偵測到異黃酮素 (數據不顯示)。在林 (2003) 研究 中，飼料中含有0.956 mg異黃酮素，在血漿中同樣沒有偵測到異黃酮素的 含量。推測可能原因是飲食中異黃酮素的含量少，相對吸收量少，不足 以影響血漿含量，因而無法偵測到。亦可能是由於異黃酮素的半衰期短 (Genistein 8.4小時，Daidzein 5.8小時)，在血液中的廓清速度快，因而在 禁食12小時的老鼠血液中無法偵測異黃酮素含量 (Watanabe et al., 1998)。
在本次實驗當中，血三酸甘油酯變化量及總膽固醇變化量各組間沒 有統計差異 (表 4-4)。可能原因是飲食當中的異黃酮素，並沒有達到一 降低血脂的有效劑量，亦有可能是本次實驗飲食非高脂飲食，並不會促 使血膽固醇和三酸甘油酯濃度增加。而黃豆皂素粗萃取物的異黃酮素每 天給予量，未達到文獻中降低新血管疾病發生的危險及可降低癌症發生 的劑量，因此本次實驗黃豆皂素粗萃取物降低 ACFs 的功效可能是由於 黃豆皂素。
第二節 結腸癌的動物誘發模式
結腸癌發展初期的生化指標除了 ACF 還包括 mucin depleted foci (MDF)、beta-catenin-accumulated crypts (BCAC)、dysplastic ACF (DACF) (Ochiai et al., 2005；Yamada et al., 2000；Caderni et al., 2003)。然而 MDF 作為結腸癌標記的研究尚未完全建立，加上 ACFs 不需要將組織切片易 於觀察，且和腫瘤發生有顯著相關，因此 ACFs 仍為較適用化學預防的 生物標記 (Corpet and Tache, 2002)。
研究指出，給予動物 DMH 20 mg/kg wt 無論是單次注射或是連續注 射，在結腸當中可明顯觀察到 ACFs 的產生 (Newell and Heddle, 2004)。 而在本次實驗有注射 DMH 的組別，會明顯觀察到 1 至 6 個不等異常腺 窩 ACFs 的存在。在注射食鹽水的組別，則沒有 ACFs 的產生。顯示本 次實驗誘發動物結腸癌的模式可成功誘發結腸 ACFs 的產生。
結腸黏膜上ACFs數目會受到動物品系、鼠齡、性別，致癌物的注射 劑量和頻率，不同段結腸區域以及計數人判定所影響 (Bird and Good, 2000)。在本次實驗誘發大鼠結腸癌模式，給予老鼠DMH 20 mg/kg wt， 每週注射2次連續6週，第一次誘發後11週犧牲，誘發組ACFs的總數目為 27.0 ± 1.9個。比較同品系F344雄性大鼠，鼠齡在5~6週之間，不同劑量致 癌物對ACFs數目的影響。在相同誘發劑量下，在第一次誘發後14週犧牲， 其誘發組ACFs數目為28.3 ± 0.6個 (Park et al., 2004)。而同樣注射DMH 20
