Fungal Ksilanaz Enziminin E. coli’de
Rekombinant Olarak Üretilmesi
Hümeyra SALTIK Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. Necmettin Yılmaz
2014
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FUNGAL KSİLANAZ ENZİMİNİN E.coli’de REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ
Hümeyra SALTIK
TOKAT 2014
i ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
FUNGAL KSİLANAZ ENZİMİNİN E.coli’de REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ
Hümeyra SALTIK Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Necmettin YILMAZ
Ksilan, polisakkarit yapıya sahip olup bitkilerde selülozdan sonra en fazla bulunan hemiselülozdur. Ksilan, ksilozların glikozid bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur. Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi adı verilir. Bu gurupta β-1,4-Endoksilanaz, β-Ksilozidaz, β-Laraninofuranozidaz, β-Glukuronidaz, Asetil ksilan esteraz ve Fenolik asit (Ferulik ve p- Kumarik asit) esteraz yer almaktadır. Ksilanaz enzimi, ksilanın β-1,4 glikozid bağlarını hidrolize ederek hemiselülozik maddelerin biyo yararlılığını artırır. Ksilanaz kağıt ve kağıt hamuru başta olmak üzere gıda ve hayvan yemi endüstrisi gibi alanlarda temel endüstriyel enzim olarak çok büyük öneme sahiptir. Bu enzimin hayvanların et ağırlığı üzerine verim ve performansını olumlu yönde değiştirdiği belirtilmektedir. Ksilanaz enzimi bakteri, maya ve fungus grubunda yer alan çeşitli mikroorganizmalar tarafından doğal olarak dışarıdan karbon kaynağını karşılamak için üretilebilmektedir. Bu çalışmada Aspergillus niger mikroorganizmasının (Fungus) ürettiği ksilanaz (endo-1,4-β-ksilanaz) enzimini kodlayan xynB geni pET28b vektör sistemine klonlanmış ve ekspresyon amacıyla E.coli BL21(DE3) pLysE hücrelerine transfer edilmiştir. Böylece ksilanaz enzimi rekombinant olarak üretilmiştir. Üretilen enzimin DNS yöntemiyle: pH’nın etkisi, sıcaklığın etkisi, sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi, substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisi testleri yapılmış ve optimum sıcaklığı 50°C, optimum pH’sı ise 5,0 olarak bulunmuştur. Elde edilen bu sonuçlara göre enzimin aktivite gösterdiği anlaşılmıştır. Yapılan literatür taraması ve sonuçlar değerlendirildiğinde üretilen enzimin yem endüstrisinde kullanılabilir nitelikte olduğu belirlenmiştir.
2014, 54 sayfa
ii ABSTRACT
M.Sc. THESIS
Expression of recombinant Fungal Xylanase enzyme in E. Coli.
Hümeyra SALTIK
Gaziosmanpasa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Necmettin YILMAZ
Xylan is a hemicellulose that consist of polysaccharide structure and is second of the most abundant components in the plant. Xylan is formed by binding xyloses with glycoside bonds. All of the enzymes which hydrolyse xylan is called xylanolytic enzyme system. In this group there are endo-1,4- β -xylanase, β- xylosidase, β- L -arabinofuranosidase, β- glucuronidase, acetylxylan esterase and Fenolic acid esterase. Xylanase hydrolyse β-1,4- glycoside bonds of xylan and increase biobenefit of hemicellulosic components. Xylanase plays an important role as a essential enzyme in
animal feed and food industry and also in pulp and paper industry. It is suggested that this enzyme improve yield and performance of weight gaining of animals. Xylanase naturally is produced by various microorganisms such as bacteria, yeast and fungus to use xylan as carbon source from outside.
In this study, xynB gene encoding Xylanase (endo-1,4- β –xylanase) from Aspergillus niger is clonned to pET28b vector system and transfered to E.coli BL21(DE3) pLysE cells for expression. Tests of effect of pH, effect of temperature, determine of temperature stabilization, effect of substrat concentration on enzyme activation was performed with DNS method. Optimum temperature was found as 50 ˚C and optimum pH was found as 5. Acording to this results, it is determined that enzym work. When literature search and results are evaluated it is determined that produced enzyme can be use in feed industry.
2014, 54 pages
iii ÖNSÖZ
Bu çalışmada bana araştırma ve kendimi geliştirme olanağı sağlayan, tez konumun belirlenmesinde, çalışmam süresince yakın ilgi ve önerileriyle bana yol gösterip beni yönlendiren danışmanım Sayın Prof. Dr. Necmettin YILMAZ’a, çalışmanın yürütülmesi çalışma sürem boyunca laboratuarlarının tüm imkanlarını kullanmama izin veren ve tez yazım aşamasında beni yönlendiren değerli hocam Sayın Prof. Dr. İsa GÖKÇE’ye, çalışmalarım sırasında bilgi ve deneyimleriyle bana yardımcı olan Arş. Görv. Hülya KUDUĞ’a, tezimin enzim aktivitesinin belirlenmesi konusunda bana bilgi ve deneyimleriyle yol gösteren ve yardımlarını esirgemeyen Arş. Görv. Sema BİLGİN ŞENTÜRK’e çok teşekkür ederim.
Her zaman yanımda olan ve benden maddi manevi desteklerini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürler.
iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET...i ABSTRACT...ii ÖNSÖZ...iii İÇİNDEKİLER...iv
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ...vii
SEKİLLER DİZİNİ...viii
ÇİZELGELER DİZİNİ...ix
1. GİRİŞ ...1
2. KAYNAK ÖZETLERİ (KURAMSAL TEMELLER / GENEL BİLGİLER ...2
.1. Enzim Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi……….2
2.2. Enzim Üretiminde Mikroorganizmalar’ın Kullanılması………4
2.3. Endüstriyel Enzimler………..5
2.4. Ksiloz ve Ksilan………..8
2.5. Ksilanazlar………10
2.6. Ksilanolitik Enzimler ve Ksilanın Enzimatik Hidrolizi………...11
2.7. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları……….13
2.8. Ksilanaz Gen Kaynakları………...15
2.9. Ksilanazla İlgili Yapılan Daha Önceki Çalışmalar………...15
3. MATERYAL VE YÖNTEM………17 3.1. Materyal………17 3.1.1. Kullanılan Cihazlar………17 3.1.2. Kullanılan Kimyasallar………...18 3.1.3. Kullanılan Enzimler………...20 3.1.4. Primerler………20
3.1.5. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar……...21
3.1.6. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler………...21
3.1.7. Kullanılan Çözeltiler………..23
3.1.7.1. Tampon Çözeltiler ve Hazırlanışları………...23
v
3.1.7.3. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Poliakrilamid Jel Elektroforezinde Kullanılan
Çözeltiler……….24
3.1.7.4. Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler………24
3.1.7.5. Enzim Saflaştırmada Kullanılan Çözeltiler………....25
3.1.7.6. Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Çözeltiler………25
3.1.7.7. Diğer Çözeltiler………..25
3.2. Yöntem……….26
3.2.1. Ksilanaz Gen Kaynağı………...26
3.2.2. PCR İşlemi için Primerlerin Tasarımı………...26
3.2.3. PCR İle Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu………..26
3.2.4. PCR Ürünlerinin Saflaştırılması………28
3.2.5. Restriksiyon Enzimleri ile Kesim………..28
3.2.6. DNA Ligasyonu……….29
3.2.7. Kompotent Hücre Hazırlanması………30
3.2.7.1. PİPES’li Kompotent Hücre Hazırlanması………..30
3.2.7.2. FSB’li Kompotent Hücre Hazırlanması……….30
3.2.8. Transformasyon……….31
3.2.9. Plazmit DNA Saflaştırılması……….31
3.2.10. Doğrulama Restriksiyon Kesimi……….32
3.2.11. DNA Dizileme……….33
3.2.12. E. coli BL21(DE3) pLysE Hücresinin pET28b(+)-xynB Plazmidi ile. Transformasyonu ve Ksilanaz’ın Ekspresyonu………...33
3.2.13. SDS-PAGE ile E. coli Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi...34
3.2.14. E. coli BL21 pLysE Hücrelerinin Parçalanması………..35
3.2.15.E.coli BL21(DE3) pLysE’de Ekspres Edilen Ksilanaz Enziminin Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması………....35
3.2.16. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrillamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) İle Ksilanaz Proteininin Analizi………35
3.2.17.Saflaştırılan Proteinin Kantitatif Analizi……….….36
3.2.18. DNS Yöntemi İle Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi………..37
3.2.19. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi………..37
vi
3.2.19.2. Sıcaklığın Etkisi………..…..38
3.2.19.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi………..38
3.2.19.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi………38
4.BULGULAR VE TARTIŞMA………..39
4.1. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu……….39
4.2. Klonlama Sonrası Plazmid DNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Analizi……….39
4.3. DNA Dizileme………..40
4.4. SDS-PAGE İle Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi……...42
4.5. Saflaştırılan pET-xynB Proteininin Kantitatif Analizi……….44
4.6. Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi………45
4.6.1. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi ………...45
4.6.1.1. pH’nın Etkisi………...45
4.6.1.2. Sıcaklığın Etkisi………..45
4.6.1.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi………46
4.6.1.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktiviesi Üzerine Etkisi………...47
5. SONUÇ………...48
KAYNAKLAR………...50
vii SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama bç baz çifti μl mikro litre µM mikro molar M Molar mM mili molar nm nano metre P Fosfat
rpm Dakikadaki devir sayısı (rotatory per minute) Kısaltmalar Açıklama
Amp Ampisilin
APS Amonyumpersülfat
BSA Sığır (Bovine) Serum Albümini dH2O distile su
DMSO Dimetil sülfoksit DNA Deoksiribonükleikasit dNTP Deoksiribonükleosit trifosfat E. coli Escherichia coli
FSB “Frozen Storage Buffer”
IPTG İzopropil β-D-1 tiyogalaktopiranozid LB Luria-Bertani
OD Optik dansite
PCR Polimeraz zincir (chain) reaksiyonu PMSF Fenil metil sülfonil florit
SDS Sodyum dodesil sülfat
SDS-PAGE SDS poliakrilamid jel elektroforezi TAE Tris-asetat-EDTA
TEMED N,N,N’,N’-Tetrametilenetilendiamin Tris 2-Amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1. Ksilan’ın Diyagramatik Yapısı………..8
Şekil 2.2. Ksilanaz Enziminin Etki Spesifitesi………..9
Şekil 2.3. Ksilanolitik Enzim Sistemi………..11
Şekil 2.4. Ksilan’ın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler Ve Etki Bölgeleri…………...12
Şekil 3.1. pET-28a (+) Vektörünün Dairesel Haritası Ve Poli-linker Bölgesinin Detaylı Restriksiyon Enzimleri İle Birlikte Verilen DNA Dizisi……….22
Şekil 3.2. Ksilanaz Genini Çoğaltmak Amacıyla Kullanılan İleri Ve Geri Primerlerin Nükleotit Sıraları……….26
Şekil 4.1. pET-28b Vektör Sistemi İçin Koloni PCR sonucunun %1’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü………39
Şekil 4.2. pET-28b Vektör Sistemi İçin Doğrulama Kesim Sonucunun %1’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü………....40
Şekil 4.3. NEBcutter V2.0 Programı Kullanılarak Elde Edilen pET-28b Klonlama Bölgesinin xyn Genine Ait Restriksiyon Enzim Haritası………40
Şekil 4.4 Dizi Analizi Sonucu Elde Edilen Kromotogram………..41
Şekil 4.5. SDS-PAGE Analiz Görüntüsü………43
Şekil 4.6. Saflaştırma Sonrası SDS-PAGE Analiz Görüntüsü………43
Şekil 4.7. Ksilanaz Enziminin pH Bağımlılık Eğrisi………...45
Şekil 4.8. Ksilanaz Enziminin Sıcaklık Bağımlılık Eğrisi………...46
Şekil 4.9. Ksilanaz Enziminin Isıl Kararlılık Eğrisi………46
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 2.1. Ksilanazların Potansiyel Uygulama Alanları ………...7
Çizelge 3.1. Kullanılan Cihazlar………..17
Çizelge 3.2. Kullanılan Kitler Ve Kimyasal Malzemeler ………...18
Çizelge 3.3. Kullanılan Enzimler……...……….20
Çizelge 3.4. Ksilanaz Genini Çoğaltmak Amacıyla PCR’da Kullanılan Primerler……20
Çizelge 3.5. Klonlama Ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar….21 Çizelge 3.6. Klonlama Ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler………21
Çizelge 3.7. Kesim İşlemi İçin Gereken Madde Miktarları………28
Çizelge 3.8. pET-28b Vektör Sistemi Ligasyon İçin Gereken Madde Miktarları……...29
Çizelge 3.9. pET-28b Doğrulama Kesimi İçin Gereken Madde Miktarları………33
Çizelge 3.10. SDS-PAGE Elektroforezinde Kullanılan Bileşenler Ve Oranları……….36
1 1.GİRİŞ
Enzimlerin hücrelerde oldukça önemli metabolik görevleri vardır, biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir ve çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere gündelik ve ekonomik hayata girmişlerdir. Endüstride kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Çünkü mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır. Ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerlerinin çok yüksek olması gibi nedenlerle enzim teknolojisi giderek gelişmektedir ve biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır (Wiseman, 1987). Özellikle son yıllarda rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998).
Türkiye büyük bir biyoteknoloji ürünleri tüketicisidir. Tüketicisi olduğumuz bu pazarın en önemli alanlarından birisini “endüstriyel enzimler” oluşturmaktadır. Türkiye’nin yerli enzim üretimi hemen hemen yok gibidir. Enzimler farklı kategorilerde farklı isimler, sektörler ve kalemler altında yerli pazara girdikleri ve tüketildikleri için pazar hacminin bütününün tek bir rakam halinde tespiti de mümkün değildir fakat bilinen kadarıyla bile tüketimimiz milyar dolarlar seviyesindedir. Enzimlerin endüstriyel kullanım alanları incelendiğinde ne kadar yaygın, yüksek hacimli ve ticari fırsatlarla dolu bir pazar oluşturduğu görülmektedir (Özer, 1999). Enzimler genellikle endüstride; ilaç, gıda, tekstil, deri, kâğıt, yem ve deterjan sanayilerinde ve moleküler biyolojide kullanılmaktadır (Anonim, 2013a).
Bu çalışmayla literatürde var olan rekombinant enzim üretim sistemlerini kullanmak ya da bu sistemler üzerinde ihtiyaca yönelik değişiklikleri yapmak suretiyle enzim üretimine katkıda bulunulması hedeflenmiştir. Bu hedefe ulaşabilmek için gıda, yem, kağıt sanayisinde kullanılan ksilanaz enzimi (Fungal; A. niger) pET28b vektörü ile rekombinant olarak Escherichia coli’de üretimi yapılmış, üretilen enzim saflaştırılmış, enzimin optimum çalışma sıcaklık ve pH’sı belirlenmiştir.
2
2. KAYNAK ÖZETLERİ (KURAMSAL TEMELLER / GENEL BİLGİLER)
2.1. Enzim Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi
Biyoteknoloji, çok çeşitli alanlarda gelişme gösteren ve günümüzde moleküler biyolojik yöntemlerinde yaygın şekilde kullanımıyla birlikte, giderek moleküler biyoteknoloji şeklinde transformasyona uğrayan ve çağımıza damgasını vuran bir alandır.
Rekombinant DNA teknolojisi; Hamilton Smith tarafından 1970’de Heamophilius influenzae’den elde edilen restriksiyon endonükleaz enzimlerin keşfi ile başlamıştır. Bu enzimler özgün DNA bölgelerini tanıyıp DNA’yı bu özgün bölgelerden kesen enzimlerdir (Sultuybek ve ark., 1995).
Rekombinant DNA teknolojisinin ve destekleyen gelişmelerin tarihçesi; 1871: Spermde DNA’nın keşfi.
1944: Avery, Macleod ve Mc Carty genetik materyalin DNA olduğunu gösterdi. 1953: Watson ve Crick DNA’nın yapısını belirledi.
1958: DNA replikasyonunun çift sarmalın komplementer ipliklerinin ayrılmasını kapsadığı kanıtlandı.
1960: Haberci RNA’nın keşfi.
1965: Bakteride antibiyotiğe dirençli genleri içeren ve hücre duvarı içinde otonom olarak replike edilen ekstrakromozomal yapılara plazmid denildi.
1966: Tüm genetik kodun çıkarılması.
1970: İn vitro koşullarda genlerin sentezlenmesi ve ilk restriksiyon endonükleaz enziminin Hamilton Smith tarafından izole edilmesi.
1972: İlk rekombinant DNA molekülünün hazırlanması.
1972: Khurana ve arkadaşları bütün bir tRNA genini sentezlediler. 1973: Gen klonlanması için plazmid vektörlerinin kullanımı. 1973: Boyer ve Cohen rekombinant DNA teknolojisini yarattılar. 1974: İlk rekombinant DNA Dünya kongresi yapıldı.
1977: Gilbert ve Sangers tarafından DNA dizileri için yeni metotların kullanımı. 1977: İlk genetik mühendislik şirketi olan “Genentech” kuruldu.
1978: E.coli bakterisi kullanılarak insan insülini üretildi. 1979: Viral antijen hepatit B’nin klonlanması.
3
1981: Orak hücreli anemi DNA’sı restriksiyon enzimi analiziyle teşhis edilen ilk hastalık oldu.
1982: İnsan tümör genlerinin karakterizasyonu.
1983: Bakteriyofaj λ’nın DNA dizisi 48 502 baz çifti olarak saptandı.
1983: Genetik olarak değiştirilmiş plazmidler, bitkilerin transformasyonu için kullanıldı.
1986: Kary B. Mullis tarafından polimeraz zincir reaksiyonu tekniği geliştirildi. 1989: AIDS virüsü dizilendi.
1990: İnsan genom projesi resmen başlatıldı. 1997: Koyun (Dolly) klonlandı.
2001: İnsan gen haritası tamamlandı. 2002: Fare genomu aydınlatıldı.
2004: Rat genomu aydınlatıldı, (Sultuybek ve ark, 1995; Tarım, 2004).
Rekombinant DNA teknolojisi, genetik rekombinasyon olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan ve bugün dev adımlarla ilerlemekte olan bir gen mühendisliği konusudur. Bu teknoloji ile çeşitli amaçlar için adeta ısmarlama genler ve proteinlerin üretimi mümkün olmaktadır. Bu iş için istenen gen orijinal kromozomdan restriksiyon endonüklez enzimleri ile kesilip alınmata ve sonra bir vektöre takılıp konak hücre içine sokularak çoğaltılmaktadır. Yerine göre ya doğrudan çoğaltılmış olan bu genler kullanılmakta ya da bunların ekspresyonu ile elde edilen proteinler kullanılmaktadır. (Watson JD, Tooze, Kurtz DT, 1983).
Rekombinant DNA teknolojisi, günümüzde genetik hastalıklarda tanı, rekombinant aşı yapımı, başka canlılardan gen transferi yoluyla transgenik bitki ve hayvan soyları elde edilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır (Alper, 2003; Alper, 2004).
Rekombinant DNA teknolojisinin temelini gen klonlama süreci oluşturur. Bu sürecin temel basamaklarını Klug ve Cummings asağıdaki gibi açıklamıştır:
1. Doku ya da hücrelerden DNA izole edilir.
2. DNA moleküllerini özgül dizilerden tanıyıp kesen restriksiyon endonükleazlar ya da restriksiyon enzimleri denilen enzimlerle DNA parçaları oluşturulur.
3. Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçaları, vektör ya da taşıyıcı molekül adı verilen diğer DNA molekülleri ile birleştirilir. İçine bir DNA parçası sokulmuş olan vektör, bir rekombinant DNA molekülüdür.
4
4. Kendi DNA’sı ile birlikte, üzerinde yabancı DNA molekülünü taşıyan vektörün oluşturduğu rekombinant molekül konakçı içerisinde kendini esler ve klon olarak bilinen birbirine özdeş düzinelerce kopyasını oluşturur.
5. Konakçı hücre kendini eşlerken, rekombinant DNA molekülleri de yavru hücrelere geçer ve her biri klonlanmış DNA dizisinin kopyalarını taşıyan konakçı hücre topluluğu oluşur.
6. Klonlanmış DNA konakçı hücrelerden izole edilebilir ve incelenebilir.
7. Potansiyel olarak klonlanmış DNA transkripsiyona uğrayabilir, mRNA’sı translasyona yönlendirilebilir, gen ürünü izole edilebilir ve araştırma için ya da ticari amaçlarla satılmak için kullanılabilir.
Bu çalışmada rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak endüstriyel bir enzim olan ksilanaz üretilmiş ve üretilen ksilanaz çeşitli karakterizasyon çalışmalarında kullanılmıştır.
2.2. Enzim Üretiminde Mikroorganizmalar’ın Kullanılması
Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark, 2003). Bugüne kadar yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda kullanım için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu %10 içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar, biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark.,1998). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı mikroorganizmaların fermentasyonu ile üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı mikroorganizmalardan üretilmektedir (Wolfgang, 2004).
5
Mikroorganizma kökenli enzimlerin biyoteknolojik işlemlerle daha ekonomik biçimde üretimi ve suda çözünmeyen matrikslerle immobilize edilerek daha uzun süre kullanılabilmesi, mikrobiyal enzimlerin endüstriyel alanlarda kullanılmasındaki artış nedenleridir (Gümüşel, 2002).
Enzim kaynağı olarak mikroorganizmaların tercih edilmesinin nedenleri; yan ürün oluşturmalarının az olması
aktivitelerinin yüksek olması daha ekonomik olması stabiliteye sahip olması
yüksek oranlarda ve saflıkta üretilebilmeleridir (Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999).
Mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin tüm dünya genelinde yıllık kullanım oranlarına bakıldığında %25 alkalin proteaz, %21 diğer proteazlar, %18 amilaz, %10 renin, %3 tripsin, %3 lipaz ve %10 diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz gibi), %10 kadar ise analitik ve farmasötik enzimlerin olduğu şeklinde bir dağılım belirlenmiştir (Rao ve ark., 1998).
2.3. Endüstriyel Enzimler
Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır. Özellikle son yıllarda stratejik alan şeklinde değerlendirilen rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998).
Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının yaklaşık 1,6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir (Schallmey ve ark., 2004).
Bu enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında; %29’unun gıda endüstrisinde
%15’inin hayvan yemi sektöründe %56’sının ise genel amaçlı
6
Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75’ini hidrolitik enzimler oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken, karbohidratları parçalayan enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992; Bhat, 2000). Karbonhidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında yaklaşık %25’lik bir paya sahiptir (Sidhu ve ark., 1997; Rao ve ark., 1998). Son zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt hamurunun beyazlatılması için ksilanazların endüstride kullanılması Viikari ve arkadaşlarının (1986) buluşu ile artışa geçmiştir. Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin, bir ürünün üretilmesinde bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir.
Buna göre, bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına bağlıdır (Wisema, 1987; Sarıkaya, 1995).
Bu çalışmada üretilen ksilanaz enziminin endüstrideki kullanım alanları Çizelge 2.1’ de verilmiştir:
7
Çizelge 2.1. Ksilanazların Potansiyel Uygulama Alanları (Collins ve ark., 2005)
ENDÜSTRİSİ UYGULAMA ALANI FONKSİYONU
Biyodönüşüm
Endüstriyel,evsel ve tarımsal atıkların çevreye karşı zararlarının önlenmesi.
Çöp arıtımı, fermente edilebilen ürünlerin üretimi, yenilenebilir bioetanol ve zararsız kimyasalların üretimi
Tekstil Keten, kendir, jüt ve rami işlenmesi Enzimatik yüzey düzleştirimi
Hayvan beslemesi
Monogastrik (domuz ve kümes hayvanları) ve geviş getirenlerin yemleri
Nişasta ihtiva etmeyen polisakkaritlerin içeriğini azaltır, intestinal vizkoziteyi azaltarak hayvanın protein ve nişastadan maksimum ölçüde faydalanmasını sağlar.
Kağıt ve kağıt hamuru üretimi
Kağıt hamurunun ağartılması
Kağıt imalatı esnasında klorin ve toksik disakkaritlerin kullanımlarının
azaltılması Biyoleke yok edilmesi
Alkali kullanımının azaltılması ve biyoleke çıkarılması süreçlerinin kolaylaştırılması
Nişasta Nişasta gluten ayırımı
Pasta hamuru viskozitesinin azaltılması ve gluten topaklanmasının artırılması.
Fırıncılık Hamur ve pastacılık ürünleri
Hamur elastikiyetini ve dayanıklılığını artırır.
Meyve ve sebze işleme süreçleri, demleme, şarap imalatı
Meyve ve sebze suyu, nektar ve püre eldesi ile bitkisel yağ, şarap imalatı
Meyve suları viskozitesini azaltıcı etkisi yanında yumuşatma özelliği ile kaliteyi artırır.
8 2.4. Ksiloz ve Ksilan
Ksiloz, yenilebilir birçok bitkinin tohumunda bulunan bir şeker olup, odun veya saman gibi bitkisel yapılarda bulunan bir maddedir. Hayvansal tıpta ksiloz, bağırsaktaki emilim sorununun teşhisi için suyla karışık olarak aç karnına verilmektedir. Eğer kanda bir süre sonra ksilozla karşılaşılırsa bu bağırsakta bir sorun olmadığını gösterir. Katalitik hidrojenasyon ile ksiloz, bir tür tatlandırıcı olan ksilitole dönüşür. Ksiloz ve ksilitolün her ikisi de indirgeyici şeker olup sanayide tatlandırıcı olarak kullanılmaktadır.
Ksiloz ayrıca serin veya treonin, proteoglikan tip O-glikozilasyonda eklenen ilk polisakkarittir. Bu nedenle heparan sülfat ve kondroitin sülfat gibi çoğu anyonik polisakkaritlerin biyosentetik yolundaki ilk polisakkarittir. Ksilan, ksilozların glikozid bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur. Bitkilerin hücre duvarında, selülozdan sonra en fazla bulunan hemiselülozik bir polisakkarittir.
Şekil 2.1. Ksilanın diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d)
Ksilanlar, doğada yaygın olarak bulunan ve hemiselülozların yapısını oluşturan temel polisakkaritlerdendir. Karasal bitkilerin hücre duvarlarındaki, lignin ve selüloz ara yüzeyinde bir başka deyişle, bitki hücrelerinin ikincil hücre duvarında yer almaktadırlar (Wong ve ark,1988, Seyis,1997). Ksilan bazı bitkilerde toplam kuru maddenin % 35’kadarını meydana getirmektedir. (Coughlan, 1985).
Ksilan tahıl danelerinin lif içeriklerinin önemli bir kısmını oluşturur. (Cowan, 1996). Ksilan, selüloz ve lignin birbirlerine kovalent ya da non-kovalent bağlarla bağlanmış olup birlikte bitki hücre duvarının ana yapısını oluştururlar (Beg ve ark., 2001). Ksilanlar, ksilanazlar (β-1,4-D-endoksilanaz (EC 3.2.1.8)) tarafından β-1,4 bağlarının hidrolizi ile D-ksiloz ünitelerine parçalanır ( Biely, 1985) (Şekil 2.1).
9
Şekil 2.2. Ksilanaz Enziminin Etki Spesifitesi
Arabinoksilanlar, pangola çayırları, bambu filizleri ve çavdar çayırları gibi bazı diğer bitkilerde tanımlanmasının yanında arpada, buğdayda, çavdarda, pirinçte, yulafta da tanımlanmıştır (Izydorczyk ve Biliaderis, 1995). Bu polisakkaritler tüm tahılların minör
bileşenleri olsa da onlar bitki hücre duvarlarının önemli bir parçasını oluşturur. Glukuronoksilanlar ve glukuronoarabinoksilanlar hücre duvarının bütünlüğü için temel olan lignin selüloz ve diğer polimerlerle kovalent ve non-kovalent bağlar oluşturarak yapıştırıcı olarak işlev görür. Ksilanlar hemiselülozların en önemli sınıfıdır. Angiospermlerde toplam kuru ağırlığın %15-30 unu oluştururlar fakat gymnspermlerde daha az bulunurlar (%7-12 ksilan) (Haltrich ve ark., 1996). Glukuronoksilanlar, ksiloz ile bağlı β-D-ksilopiranosil ünitelerinin lineer polimerleridir.
Bu polisakkarit iskeleti 4-O-metil-α-D-glukuranopiranosil ünitelerine, 4 pozisyonunda metilenmiş D-glukuronosil ünitelerinden ve 2 veya 3 pozisyonuna dahil olmuş ve β-D-ksilopiranosil’e sahiptir (Coughlan ve Hazlewood, 1993). Angiosperm glukuronoksilanlar, β-ksilopiranosil’in 2 veya 3 pozisyonunda asetil gruplarıyla yüksek değişim oranına sahiptir bu durum ksilana sudaki kısmi çözünürlüğünü verir. Tipik olarak yumuşak ağaçlarda bulunan Glukuronoarabino ksilanlar aynı ksilan iskelete sahiptir fakat her birinde 10 tane β-D-ksilopiranosil ünitesi α-L-arabinofuranosil ile yerine konulmaktadır. Yumuşak odunlar sert odunlardan daha yüksek 4-O-metil-α-D-glucuronopiranosil üniteleri içeriğine sahiptir. Bu ksilanlar asetillenmemiştir ve onların furanosit yapısından dolayı arabinoz yan grupları asit tarafından hidrolizlenmektedir (Ferreira-Filho 1994; Sunna ve Antranikian, 1997).
10
2.5. Ksilanazlar
Ksilanazlar ksilanların hidrolizini katalizler. Bu enzimler temelde mikroorganizmalar tarafından üretilmektedir ve polisakkaritleri hidrolizleyen diğer enzimlerle birlikte bitki hücre duvarının yıkımında rol alır ayrıca ksilanazlar bazı tohumların çimlenmesi sürecinde ksilanı da sindirir (örneğin arpa tanelerinin malt haline dönüştürülmesinde). Ksilanazlar ayrıca marina alglerinde, protozoalarda, kabuklu hayvanlarda, böceklerde, salyangozlarda ve toprak bitkilerinin tohumlarında da bulunabilir
(Sunna ve Antranikian,1997).
Mikrobiyal kaynaklar arasında özellikle de flamentli mantarlar bu enzimleri ortama salgıladığı için ve onların ksilanaz seviyeleri mayalarda ve bakterilerde olandan çok çok daha yüksek olduğu için ilginçtir. Bakterilerde ksilanazlar mantarlarda olduğundan daha düşük aktivite seviyelerinde üretilmemekte intrasellüler veya periplazmik miktarlarla sınırlı kalmaktadır. Dahası bakteride eksprese edilen enzimler glikozilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlara maruz kalmamaktadır.
Ksilanazlar, katalitik domainlerinde ki aminoasit dizi benzerliklerine bakılarak iki glikanaz ailesine ayrılmıştır. İki ksilanaz ailesi, enzim hareket metodu, moleküler ağırlık, net elektrik yükü vb özellikler bakımından birbirinden ayrılır (Gregory, A. C. E, O’Connell, A. P, Paul, B. G, 1998) Günümüze kadar pek çok çeşit ksilanaz klonlandı. Farklı özellikteki ksilanazlar farklı uygulamalarda kullanılmaya uygundur. Örneğin alkali ksilanazlar kağıt endüstrisinde asidik ksilanazlar ise yem endüstrisinde kullanılır. Bunlara ek olarak, spesifik aktivite, termal stabilite, katyon ve kimyasallara direnç gibi ksilanazların bazı temel özellikleri de uygulamalar için önemli faktörlerdir
( Prade, R. A, 1995).
Günümüzde giderek popülarite kazanan ksilanazların, bitki hücre duvarının hemiselüloz kısmını parçaladığı; ot yiyen hayvanların ve bazı bitki patojenlerinin bitkileri parçalamak için ksilanaz içerdikleri saptanmıştır. Pek çok bakteri ve küf mantarının, hemiselüloz-ksilan içeren ortamlarda heterotrofik olarak gelişmesini sağlayan ve ortamda son ürün olarak serbest ksiloz oluşturan hücre dışı ksilanazlar oluşturduğu anlaşılmıştır (Kulkarni ve ark.,1999). Birçok mikroorganizmaya ek olarak, bazı otçul böcekler, kabuklular ve bazı alglerin üretebildiği ksilanazı, memeliler üretememektedirler (http://www.nature.nps.gov/benefitssharing/xylanase.htm..2004).
11
2.6. Ksilanolitik Enzimler ve Ksilanın Enzimatik Hidrolizi
Ksilan çok karmaşık bir moleküldür. Bu nedenle ksilanın hidrolizi için farklı enzimlere ihtiyaç duyulur. Ksilan molekülünün hidrolizini gerçekleştiren enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi denir (Şekil 1. 7.). β-1,4-endoksilanaz, β- ksilozidaz, α-L-arabinofuranosidaz, α-glukuronidaz, asetil ksilan esteraz ve fenolik asit (Ferulik ve p-Kumarik asit) esteraz enzimleri bu bahsedilen enzim sistemi içinde yer almaktadır (Subramaniyan ve Prema, 2000).
Şekil 2.3. . Ksilanolitik Enzim Sistemi (Anonim, 2009e)
Ksilanın, heterojen ve karmaşık yapısı nedeni ile tamamen hidrolizi için işbirliği içerisinde çalışan bir grup mikrobiyal enzimi gerektirmektedir. Bu grubu oluşturan enzimler şunlardır (Gilbert ve Hazlewood 1993, Collins ve ark., 2004);
Ksilan iskeletindeki iç glikozid bağları rast gele kıran β-1,4-endoksilanazlar (β-1,4–D-ksilanazlar; β-1,4-D-ksilan ksilanohidrolazlar; E.C. 3.2.1.8). Ksilobiyozu ksiloza hidrolize eden, başka bir deyişle ksilooligosakkaritleri İndirgen olmayan uçlarından kıran β-D-ksilosidazlar (β-1,4-D-ksilozid ksilohidrolazlar; E.C.3.2.1.37 ).
Ksilandaki arabinoz yan zincirlerini hidrolize eden α-L-arabinofuranosidazlar (E.C. 3.2.1.55).
12
Ksiloz gruplarından glukuronik asit yan zincirlerini ayıran α-D-glukuronidazlar (E.C. 3.2.1.139 ).
Asetat gruplarını serbestleştiren asetil-ksilan esterazlar (E.C.3.1.1.72 ). Ferulik asit esterazlar (E.C. 3.1.1.73 ).
p-kumarik asit esterazlar (E.C. 3.1.1.- ).
Ekzo-β-1,4-ksilanazlar (α - 1,4-D-ksilan ksilohidrolazlar ).
Bunlardan en önemlisi 1.gruptaki 1,4- β - endoksilanazlar’dır. Endoksilanazlar, ksilan omurgasındaki iç glikozid bağları, ekzoksilanazlar ise endoksilanazların etkisi sonucu oluşan ksilooligosakkaritleri hidrolize ederler; ve bu yolla ksilanın hidroliz oranı yükseltilmiş olur (Wong ve ark.,1988).
Şekil 2.4’de ksilanaz enzimlerinin ksilan omurgasındaki etki noktaları şematik olarak gösterilmektedir (Beg ve ark., 2001).
13 2.7. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları
Ksilanazlar, gıdaların fiziksel özelliklerini geliştirmede, sıvı ya da gaz yakıtların üretimi, çözücüler ve şeker gruplarının üretimi gibi genel uygulamalarda, tek hücre proteini üretmede, lignoselülozik materyallerin dönüşümü, tarımsal atıkların fermentatif ürünlere parçalanarak dönüşümü, meyve sularının berraklaştırılması, biranın kıvamının düzenlenmesi, kağıt endüstrisinde ağartmayı iyileştirici olarak kullanılırlar ve biyoteknolojik uygulamalar için yaygın potansiyelleri vardır (Beg ve ark., 2001; Subramaniyan ve Prema, 2002). Ayrıca ksilanaz enzimi, özellikle öncelikli alan olan hayvan besleme işleminde; kanatlı kümes hayvanlarında (Bedford ve Classen, 1992), domuzlarda (Thacker ve Baas, 1996) ve sığırlarda (Beachemin ve ark., 1999b) verim ve performansı artırmada etkin bir şekilde kullanılmaktadır ve ksilanaz kullanımı hayvanlardaki kütle artışında önemli bir rol oynamaktadır. Yemlere enzim ilavesi yapılmasıyla hayvanların yeterince veya hiç salgılayamadıkları enzimlerin salgılanması, istenilmeyen bazı maddelerin etkisiz hale getirilmesi, yemlerdeki sindirimi güç olan karbonhidratlarla diğer organik ve inorganik unsurlardan daha fazla yararlanılması amaçlanmaktadır (Güçlü ve Kara, 2009).
Collins ve arkadaşları (2004) ksilanaz enzimlerinin endüstriyel kullanım alanlarını temel olarak 4 grupta toplamışlar ve bu alanları:
Kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi Hayvan besleme (Yem endüstrisi) Gıda endüstrisi
Diğerleri olarak ifade etmişlerdir.
Ksilanazların en ümit verici uygulamalarından birisi, kağıt hamuru hazırlamada beyazlastırma ajanı olarak klor kullanımınının azaltılması ve kağıt hamurundan lignini ayırma özelliğidir. Enzim uygulaması kağıt hamurunun fibrilasyonunu ve su tutusunu artırır, islenmemiş kağıt hamurunda dövme sayısını düşürür, hurda kağıt hamurunda bağları onarır, çözünen hamurdan ksilanların selektif giderimini sağlar.
Ksilanazlardan ayrıca odun hamurunda biobeyazlatma, sentetik ipek üretiminde ise hamurdan selüloz eldesinde faydalanılır (Viikari ve ark., 1986; Beg ve ark., 2001).
14
Ksilan tarım ve gıda endüstrisi atıklarında bol miktarda bulunmaktadır. Ksilanaz uygulamaları ile atık sulardaki ksilan ksiloza dönüştürülür (Rani ve Nand,1996).
Yemlere ksilanaz eklenmesinin sindirimi kolaylaştırarak gelişme hızını arttırdığı, bir başka deyişle, ksilanın kısmi hidrolizi ile ruminal sindirimde selüloza erişilebilirliğin geliştiği ve bu yolla hayvan yemlerinin besinsel değerinin arttığı, ancak yemden ksilanın tamamen uzaklaştırılmasının istenmediği çünkü hemiselülozların besinsel liflerin önemli bir bileşeni olduğu ve bunların uzaklaştırılması ile bağırsak hastalıklarının artabileceği anlaşılmıştır (Wong ve ark.,1988). Hayvan beslenmesinde kullanılan ksilanazların esas kaynağının fungal olduğu, en çok kullanılanlar arasında da Trichoderma ve Aspergillus türlerinden elde edilen ksilanazların yer aldığı açıklanmıştır (Aehle, 2004).
Yemlerde doğal olarak bulunan ve besinsel değeri olmayan bazı faktörleri yıkarak besi hayvanlarında daha çok ağırlık artışı sağlamak, ya da yemden daha iyi yararlanarak hayvanın performansını arttırmak; protein, nişasta ve minerallerin kullanılabilir olmayan kaynaklardan, elde edilebilirliklerini arttırmak gibi amaçlarla hayvan beslemede ticari enzim preparatlarının kullanıldığı ve ksilanazlar veya endo-1,4-β-ksilanazlar (E.C.3.2.1.8)’ ın bu amaçla en çok kullanılan enzimler olduğu belirtilmiştir (Aehle, 2004).
Meyve ve sebzelerin suyunun çıkarılması ve meyve sularının berraklaştırılması amacıyla pektinaz ve selülaz ile birlikte kullanılır. Ayrıca ruminantların beslenmesinde sindirimi artırmak amacıyla yem bitkilerinin ön işleminde kullanılmaktadır (Gilbert ve Hazlewood, 1993). Bazı ksilanazlar bitki hücrelerinden protoplast üretimi için hücre duvarının yumusatılmasında da kullanılır (Wong ve ark., 1988).
Ksilanazlar gıda endüstrisinde de kullanılmaktadır, bu alanda en çok fırıncılıkta kullanıldığı ve unda bulunan, suda çözünmeyen hemiselülozu çözünür hemiselüloza dönüştürdüğü; çözünür hemiselülozun ise hamurda ağırlığının yaklaşık 10 katı su bağladığı ve bu yolla hamurun sağlamlığını arttırdığı, makineye yapışmasını önlediği bilinmektedir. Ksilanaz ilave edilmiş hamurla yapılan ekmeklerin somun hacminin arttığı, daha iyi daha uniform kırıntı, daha yumuşak ekmek elde edilebildiği, tazeliğin de uzun süre korunduğu saptanmıştır (Kulkarni ve ark.,1999i; Beg ve ark., 2001).
15 2.8.Ksilanaz Gen Kaynakları
Ksilanazlar, genellikle saf ksilan veya ksilanca zengin ortamlarda gelişen mikroorganizmalarda bulunan indüktif enzimlerdir. Bakteriler, fungiler, protozoalar, algler, karındanbacaklılar ve antropodları da içine alan bir grup organizma tarafından üretildikleri bildirilmiştir (Beg ve ark.,2001).
Bazı genel özelliklerine göre, ksilanaz üreten mikroorganizmaları aşağıdaki gibi gruplandırmak mümkündür (Köksal, 1998).
1. Bakteriler; Bacillus sp., Cellulumonas fimi, Micrococcus sp. AR-135, Staphylococcus sp. SG-1, Thermotoga maritima MSB8 vb.
2. Küf mantarları; Aspergillus niger ve Aspergilius nidulans gibi Aspergilli, Aureobasidium pullulans vb.
3. Funguslar; Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Thermomyces vb. 4. Actinomycetes; Streptomyces sp., Thermomonospora curvata vb.
5. Rekombinant mikroorganizmalar.
Ayrıca genetik mühendisliği, moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojileri ile üretilip endüstride kullanılan çok sayıda ticari ksilanaz da bulunmaktadır. Ksilanazların ticari üretiminde kullanılan suşlar Trichoderma reesei, Thermomyces lanuginosus, Aureobasidium pullulans, Bacillus subtilis ve Streptomyces lividans’ dır
(Beg ve ark., 2001).
2.9. Ksilanazla İlgili Yapılan Daha Önceki Çalışmalar
Lowe ve ark. (1987a), ksilanaz üretimini en çok etkileyen ksilan olsada ksilanazların buğday samanı, selüloz, sellobiyoz, glukoz ya da ksilozda büyümüş anaerobik funguslar tarafından da üretileceğini bildirmişlerdir. Bunun, anaerobik funguslar tarafından sürekli olarak üretilen ksilanazın temel seviyesi olduğunu ve üretimi ksilanın varlığını artırdığını da eklemişlerdir.
Lowe ve ark. (1987c) ve Mountfort ve Asher (1989) yaptıkları çalışmalarında ksilanlı ortamda, ksilanaz ve ksilobiaz enzimlerinin her ikisinin de kültür sıvısında ksilanın parçalanarak; ksiloz, ksilobioz ve ksilo-oligosakkaritlerin oluşması süresine dek görev aldığını belirtmişlerdir.
16
Mountfort ve Asher (1989), ksilanazın esasen ekstraselüler ya da kısmen hücre bağlantılı olarak salgılanabildiğini ve enzimin optimum pH’sının 5.5–6.0 arası, optimum sıcaklığının ise 50ºC olduğunu bildirmişlerdir.
Gilbert ve ark. (1992), rekombinant bir ksilanazı (xynA), Neocallimastix patriciarum’un mRNA’sından elde edilen bir E. coli’nin barındırdığı xylA’dan saflaştırmış, bu enzimin çavdar ksilanından ksilobioza kadar etkin olduğunu saptamışlardır. Ancak bu enzimin katalitik etki alanının farklı olması sebebiyle selülotik substratlara ve bu yapıların birimlerine etkili olmadığını eklemişlerdir.
Gilbert ve Hazlewood (1993) çalışmalarında selülaz celB geni gibi, Neocallimastix patriciarum ve bazı bakteriyel ksilanaz enzimlerinin sekanslarının karşılaştırmış ve bu enzimler arasındaki belirgin homolojiyi açığa çıkarıp, rumen prokaryotları ve düşük ökaryotlar arasında horizontal gen transferinin olabilirliğini ve ortak bir evrimsel orijininin olabileceğini rapor etmişlerdir.
Garcia-Campayo ve Wood (1993), Neocallimastix frontalis’ten B-D-ksilosidazı saflaştırmışlardır. Enzimin 2 polipeptit alt ünitesinin moleküler ağırlığının 83 kDa ve 53 kDa olduğunu belirtmişlerdir. İzole edilen enzimin optimum sıcaklığı 37ºC, optimum pH’sı 6,4 olup, enzim, ksilo-oligosakkaritler ve ksilobioz üzerinde tipik bir ekzo-aktiviteye sahiptir ve D-ksiloz varlığında enzim aktivitesi ciddi miktarda azalır. Katalitik aktivitelerin polipeptit alt ünitelerinin biri ya da her ikisine bağlı olup olmadığı net değildir ancak enzimin Cu2+,
Ag2+, Zn2+, EDTA ve SDS tarafından yavaşlatıldığını ve Ca2+, Mg2+ varlığında uyarıldığını da eklemişlerdir.
17 3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Kullanılan Cihazlar
Çalısmada kullanılan cihazlar Çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1 Kullanılan cihazlar
Cihaz Adı Firma Model
Mikrodalga Fırın Arçelik MD500
Sonikatör Bandelin Sonopuls HD3100
Mikrotüpler İçin Termal Sallayıcı
Biosan TS-100 Thermo
Shaker
Spin Cihazı Biosan Combi Spin FVL
2400N
Thermal cycler BioRad
Agaroz Jel Elektroforezi BioRad PAGE Elektroforezi BioRad
Güç Kaynağı BioRad Power PAC 300
PCR makinesi BioRad DNA Engine
Santrifüj Hettich Vision 300.000 I MIKRO 22R
Dondurucu (-80°C) Hettich
Mikrosantrifüj Hitachi
Otoklav Hiclave
İnkübatör Memmert, Biosan
Jel Görüntüleme Sistemi Syngene and Kodak
pH Metre Sartorius Professional meter pp 15
Dikey Soğutucu +4oC Uğur
UV/VIS Spektrofotometresi Varian carry 50
18
Buzdolabı Vestel GTP 455A
Isıtıcı-Magnetik karıştırıcı Velp Scientifica ARE
Terazi Vibra
Buz Makinesi VISION
Yüksek Hızlı Santrifüj VISION VS 30 000i
Kar makinesi VISION
Saf Su Cihazı Younglın ınstrument
Orbital Çalkalayıcılı inkübatör
Zcheng ZHWY-111C
3.1.2. Kullanılan Kimyasallar
Çalısmada kullanılan kitler ve kimyasal malzemeler Çizelge 3.2’de verilmiştir. Çizelge 3.2 Kullanılan kitler ve kimyasal malzemeler
Kimyasal Madde/Malzeme Firma
LB Broth Base Invitrogen- lennox L Broth Base
Agar BD BactoTM Agar
Dekstroz Merck
Pepton BD
Tripton BD- BactoTM
D-Glukoz monohidrat Alfa Aesar
Gliserol Euromedex
KCH3COO Merck
KCl Sigma
NaCl Carlo Erba
MgSO4.7H2O Riedel de Haën
CaCl2.2H2O Carlo Erba
Kanamisin Sigma Aldrich
Kloramfenikol Sigma
IPTG Amresco
19
Agaroz Bioron
Etidyum bromür ICN
Akrilamid Amresco
SDS Serva
APS Biorad
TEMED Biorad
PiPES Alfa Aesar
Trisma baz Sigma Aldrich
HCl Merck PMSF Sigma Aldrich Bezamidin Merck İmidazol Merck Etanol Merck Metanol Merck C6H5Na3O7 Sigma-Aldrich Tampon D Promega Tampon K Takara Tampon E Promega
T4 DNA ligaz tamponu Promega
Triton X100 Takara
BSA Promega/Takara
DNS Alfa Aesar
20
Ksilan TCl
Plazmid DNA saflastırma kiti Promega
PCR ürünleri temizleme kiti Bio Basic
3.1.3. Kullanılan Enzimler
Çalısmada kullanılan enzimler Çizelge 3.3’de verilmistir. Çizelge 3.3 Kullanılan enzimler
Enzim Firma
Taq DNA Polimeraz Fermentas/Promega
T4 DNA ligaz Promega/Takara
XhoI Promega
NcoI Takara
XbaI Takara
3.1.4. Primerler
Çizelge 3.4 Ksilanaz genini çoğaltmak amacıyla PCR’de kullanılan primerler
Primer Primer dizisi Tm
pET28xynBNcoISense TTTTTCCATGGGTTCTACCCCTAGTTCTACT 60.4
21
3.1.5. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar
Klonlama ve ekspresyon işlemlerini gerçekleştirmek amacıyla kullanılan mikroorganizmalar Çizelge 3.5’de verilmiştir.
Çizelge 3.5. Klonlama ve ekspresyon işlemlerinde kullanılan mikroorganizmalar
Tür Suş Kullanım amacı
Escherichia coli DH5α Klonlama
Escherichia coli BL21(DE3) pLysE Ekspresyon
3.1.6. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler
Klonlama ve ekspresyon işlemlerini gerçekleştirmek amacıyla kullanılan plazmitler Çizelge 3.6’da verilmiştir.
Çizelge 3.6. Klonlamada ve ekspresyonda kullanılan plazmitler
Plazmit Firma Kullanım amacı
pET28b(+) Novagen Klonlama ve ekspresyon
vektörü
Şekil 3.1’de pET-28a(+) vektörüne ait dairesel harita ve poli-linker bölgesinin detaylı dairesel restriksiyon enzimleri ile birlikte DNA dizisi verilmiştir.
22
Şekil 3.1. pET-28a(+) vektörünün dairesel haritası ve poli-linker bölgesinin detaylı dairesel restriksiyon enzimleri ile birlikte verilen DNA dizisi (Novagen)
23 3.1.7. Kullanılan Çözeltiler
3.1.7.1. Tampon Çözeltiler ve Hazırlanışları
FSB çözeltisi: 7,4 g KCl, 7,5 g CaCl2.2H2O, 100g gliserol, 10 ml 1M (pH=7,5)
KCH3COO alınarak pH=6,2’ye ayarlandı ve hacim 1 L’ye tamamlandı. Otoklavlandı.
PİPES’li tampon çözeltisi: 0,5 M, 50 ml PiPES çözeltisi hazırlandı. KOH ile pH 6,7’e getirildi. Ardından 6,92 g MnCl2, 1,66 g CaCl2 ve 18,64 g KCl 980 ml suda çözüldü.
Üzerine 20 ml PiPES çözeltisi eklendi ve hacim 1 L’ye tamamlandı. 0,45 μm’lik filtreden geçirildi ve steril şişelere bölünerek, -20˚C’de saklandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 4): 61,45 ml 0,1 M sitrik asit ve 38,55ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 5): 48,50 ml 0,1 M sitrik asit ve 51,50 ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 6): 39,85 ml 0,1 M sitrik asit ve 63,15 ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 7): 17,65 ml 0,1 M sitrik asit ve 82,35 ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Tris-HCl tamponu (100 mM pH 8): 1,21 g Tris yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1M HCl ile 8’e ayarlanarak toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. 3.1.7.2. Sıvı ve Katı Besiyerleri
LB Agar: 20 g LB (Luria-Bertani) Broth Base (10 g pepton, 5 g maya özütü, 5 g NaCl)1 L suda çözüldü. Hazırlanan 1 L’lik çözelti 400’er ml olacak şekilde 2 tane stok şişesine alındı ve üzerlerine 6’şar g agar ilave edilip karıştırıldı, otoklavlandı.
Artan LB çözeltisi yaklaşık 5’er ml olacak şekilde deney tüplerine konuldu ve ağız kısımları alüminyum folyo ile kapatıldı, otoklavlandı. (LB: 10 g yeast ekstrakt, 10 g tripton, 5 g NaCl).
SOB: (Super Optimal Broth): 20 g tripton, 5 g maya özütü, 2 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M KCl, 10 ml 1 M MgCl2 ve 10 ml 1 M MgSO4.7H2O büyük bir behere alınarak üzeri
24
3.1.7.3. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Poliakrilamid Jel Elektroforezinde
Kullanılan Çözeltiler
Ayırma jeli tamponu: 18,2 g Tris (1,5 M) ve 0,4 g SDS (%0,4 w/v) yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M HCl ile 8,8’e ayarlanıp toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı.
Yükleme jeli tamponu (4xTris-HCl/SDS): 6,05 g Tris (0,5 M) yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M HCl ile 6,8’ ayarlanıp toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. 0,4 g SDS (%0,4 w/v) ilave edildi. +4°C’de muhafaza edildi.
Numune tamponu (2x): 25 ml 4x Tris-HCl/SDS (pH6,8), 20 ml gliserol (%20 w/v), 4 g SDS (%4 w/v), 2 ml β-merkaptoetanol, 1 mg bromfenol mavisi ve 53 ml suyun karıstırılmasıyla hazırlandı. Küçük kısımlara ayrılarak -20°C’de muhafaza edildi. Amonyum persülfat (APS) çözeltisi (%10w/v): 0,1 g APS 1 ml saf suda çözüldü. Running Buffer (5X): 15 g Tris, 72 g glisin ve 5 g SDS yaklasık 900 ml suda çözüldükten sonra toplam hacmi saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı.
Stain çözeltisi: 0,5 g Coomassie brillant blue 250 ml metanol, 50 ml glasiyel asetik asitte çözüldükten sonra toplam hacim saf suyla 500 ml’ye tamamlandı.
Destain çözeltisi: 250 ml metanol ve 50 ml glasiyel asatik asit karıstırılarak toplam hacim saf suyla 500 ml’ye tamamlandı.
3.1.7.4. Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler
Etilendiamin tetra asetik asit (0,5 M pH 8 EDTA): 186,1 g Na2EDTA.2H2O 700 ml saf
suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M NaOH ile 8,0’e ayarlanarak toplam hacim saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı.
Tris Asetat EDTA (50xTAE) tamponu: 242 gr Tris, 57,1 ml glasiyel asetik asit, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) bir miktar suda çözüldükten sonra pH’sı glasiyel asetik asitle 8,5’e ayarlanarak toplam hacim saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı.
Örnek yükleme boyası (6x): 25 mg bromfenol mavisi ve 3 ml gliserol saf su ile iyice karıştırılarak toplam hacmi 10 ml’ye tamamlandı.
25
3.1.7.5. Enzim Saflaştırmada Kullanılan Çözeltiler:
NaH2PO4-Na2HPO4 tamponu (100 mM pH 7,6): 65 ml 0,2 M NaH2PO4 ve 0,2 M 435
ml Na2HPO4 karıştırıldıktan sonra toplam hacim saf su ile 1000 ml’ye tamamlandı.
Yükleme tamponu (Loading Buffer)(100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4-Na2HPO4 pH 7,6): 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4-Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü.
Yıkama tamponu (Wash Buffer)(25 mM imidazol 100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4- Na2HPO4 pH 7,6): 0,85 g imidazol, 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4-Na2HPO4
tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü.
Elüsyon tamponu (Elution Buffer)(300 mM imidazol 100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4-Na2HPO4 pH 7,6): 10,21 g imidazol, 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4
-Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü.
3.1.7.6. Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Çözeltiler
Dinitrosalisilik asit (DNS): 1 g DNS 50 ml saf suda çözüldü, üzerine 30 g K-Na-Tartarat ve 20 ml 2N NaOH ilave edilerek toplam hacim saf suyla 100 ml’ye tamamlandı. +4°C’de muhafaza edildi.
Ksilan substratı (%1’lik(w/v)): Çözelti konsantrasyonu %1’lik (w/v) olacak sekilde beechwood xylan tartıldı ve üzerine çalışılacak tampon çözeltiden ilave edildi. Birkaç dakika kaynatıldıktan sonra bir gece boyunca magnetik karıştırıcıda karıştırıldı.
Ksiloz standart çözelti: Konsantrasyonu 10 mg/ml olacak şekilde, hesaplanan miktarda ksiloz saf suda çözülerek ana stok çözelti hazırlandı. Hazırlanan bu stok çözeltiden saf suyla seyreltmeler yapılarak çalışılacak farklı konsantrasyonlarda strandart çözeltiler hazırlandı.
3.1.7.7. Diğer Çözeltiler
IPTG: 1 g IPTG, 10 ml steril suda çözüldü ve nitro selüloz membrandan süzüldü. 1’er ml olacak şekilde ependorflara bölündü ve dondurucuya (-20 ˚C) kaldırıldı. PMSF çözeltisi: 200 μg PMSF %99’luk 1 ml etanol ile çözüldü. -20°C’de muhafaza edildi.
26
Benzamidine çözeltisi: 15,66 mg benzamidin hidroklorür 1 ml suda çözüldü. -20°C’de muhafaza edildi.
İmidazol çözeltisi: (300 mM) 2,045 g imidazol, bir miktar tris tamponunda çözüldü. Son hacim tris tamponuyla 100 ml’ye getirildi.
Kloramfenikol Çözeltisi: Kloramfeikol 34 mg/ml olacak sekilde mutlak etanolde çözüldü ve 0,2 μm’lik filtreden geçirilerek steril edildi. -20°C’de saklandı.
Kanamisin çözeltisi: 0,25 g kanamisin 5 ml otoklavlanmıs ultra saf suda çözüldü ve 0,2 μm’lik filtreden geçirilerek steril edildi. Ardından küçük hacimler halinde steril ependorf tüplerine dağıtılarak -20°C’de muhafaza edildi.
3.2. Yöntem
3.2.1. Ksilanaz Gen Kaynağı
Ksilanaz geninin eldesi (Plazmid DNA şeklinde Prof. Dr. Mehmet İNAN tarafından: Akdeniz Üniversitesi Mühendislik fakültesi Gıda Mühendisliği) bölümünden temin edildi.
3.2.2. PCR İşlemleri için Primerlerin Tasarımı
Ksilanaz enziminin üretimi için gerekli olan DNA dizisi, DNA kütüphanelerinden belirlendi. Aspergillus niger xynB geninin DNA dizisinin çoğaltılması için PCR işleminde gerekli olan primerler pET28b plazmit sistemi için dizayn edildi.
Primerler DNA Dizisi
pET28xynBNcoISense TTTTTCCATGGGTTCTACCCCTAGTTCTACT pET28xynBXhoIReverse TTTTTTCTCGAGTTAGTGATGGTGGTGATGATGTT Şekil 3.2. Ksilanaz genini çoğaltmak amacıyla kullanılan ileri ve geri primerlerin nükleotit sıraları 3.2.3. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu
PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) islemleri için satın alınan primerler 5 μM olacak sekilde, yüksek saflıktaki oligonükleotidler ise PCR islemlerinde kullanılacak konsantrasyonda hazırlanarak asağıda içeriği ve koşulları verilen PCR gerçekleştirildi.
27 50 μl’lik PCR karısımı:
27,5 μl H2O (DNAz & RNAz free)
5 μl 10x tamponu 4 μl MgCl2 4 μl dNTP karışımı (25 mM) 4 μl primer “sense” 4 μl primer “reverse” 1 μl Kalıp DNA
0,5 μl Taq DNA polimeraz
Şeklinde toplam 50 µl olan PCR tüpleri hazırlandı. PCR işleminde; sıcaklık değerleri her bir döngü için aşağıda gibi ayarlanmış ve toplamda 30–35 döngüyle PCR işlemi tamamlanmıştır. PCR koşulu: 4°C 10 dk 95°C 2 dk 94°C 1 dk 55°C 1 dk 35 döngü 72°C 1 dk 72°C 5 dk 4°C ∞ 1. Denatürasyon: 94 C 2. Primer Annealing: 55C 3. Ekstensiyon: 72 C
PCR işlemleri gerçekleştirildikten sonra 10 μl PCR karışımından alınarak %1‘lik agaroz jelinde analiz edildi ve jelin fotoğrafı alındı.
28 3.2.4. PCR ürünlerinin Saflaştırılması
PCR işlemi gerçekleştirildikten sonra, DNA PCR karışım çözeltisinden “Biobasic Gel and PCR Clean-Up” kiti kullanılarak üreticinin tavsiye ettiği protokole uygun olarak saflaştırıldı.
Protokol aşağıdaki gibidir:
DNA karışımı 1.5 ml Eppendorf tüpüne transfer edilir ve karışımın hacminin 3 katı kadar “Cleanup Solution” eklenir.
Karışım EZ-10 Spin kolona eklenir ve 2 dk oda sıcaklığında bekletilir. Ardından 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır.
Alttaki sıvı atılır. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve kolon aynı toplama tüpüne geri koyulur.
Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve Wash Solution’ın kalan miktarını çıkarmak için 10000 rpm de 1dk santrifüj yapılır.
Kolon 1.5 ml temiz Eppendorf tüpüne transfer edilir. Kolonun merkezine 30-50 μl “Elution Buffer” ya da su eklenir ve 50 °C’de 2 dk bekletilir.
10000 rpm (8000xg)‘de 2 dk santrifüj yapılır.
3.2.5. Restiriksiyon Enzimleri ile Kesim
Çizelge 3.7 Kesim işlemi için gereken madde miktarları:
xynB Geni İçin Kesim pET28b Vektörü İçin Kesim
28 µl DNA 20 µl Vektör DNA
4 µl 10x Buffer K 3 µl 10x Buffer K
4 µl BSA 3 µl BSA
2 µl NcoI 2 µl NcoI
29
Çizelge 3.7’deki gibi olmak üzere, PCR ürünü için toplam hacmi 40 μl, vektör için 30 μl olan tüpler hazırlandı ve vortekslendi. Ardından mikrosantrifüjle 3-5 saniye hızlıca döndürülerek 37˚C’de inkübasyona bırakıldı.
4 saat boyunca her saat başı tüpler mikrosantrifüjde hızlıca döndürüldü ve 37˚C’de inkübasyona devam edildi.
2 saat sonra tüpler alınarak; sadece vektörün kesildiği tüplere 1’er μl XhoI ve NcoI 0,2 μl 10x Buffer K eklendi.
Ardından tüm tüpler hızlıca döndürülerek tekrar 37˚C’de inkübasyona bırakıldı. 4. saatin sonunda tüpler hızlıca döndürülerek kesim işlemi sonlandırıldı.
Şeklinde sıralanan işlemlerle kesim 4 saatte tamamlandı ve “Biobasic Gel and PCR Clean-Up” kiti ile saflaştırıldı.
3.2.6. DNA Ligasyonu
NcoI ve XhoI ile kesilen plazmid DNA’lar ve PCR ürünleri Promega T4 DNA Ligaz kullanılarak birleştirildi. Ligasyon karışımı için işlemler Çizelge 3.8’de verildiği şekilde yapıldı:
Çizelge 3.8. pET28b vektör sistemi ligasyon için gereken madde miktarları:
Ligasyon Karışımı I Ligasyon Karışımı II
1 µl kesilmiş pET28b plazmiti 2,5 µl kesilmiş pET28b plazmiti
3 µl T4 DNA Ligaz Tamponu (10x) 3µl T4 DNA Ligaz Tamponu (10x) 20 µl kesilmiş xynB Geni 18,5 µl kesilmiş xynB Geni
1 µl T4 DNA Ligaz 1 µl T4 DNA Ligaz
Çizelge 3.8’de verilen miktarlarda yapılan pipetlemenin ardından, hazırlanan ligasyon karışımı mikrosantrifüjde hızlıca döndürüldü ve +16 ˚C’de gece boyu inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonun ardından transformasyon işlemlerinde kullanılıncaya kadar +4˚C’de muhafaza edildi.
30 3.2.7. Kompotent Hücre Hazırlanması
3.2.7.1. PİPES’li Kompotent Hücre Hazırlanması
Petriye DH5α ekildi ve 16 saat inkübe edildi.
16 saatlik inkübasyonun ardından alınan petriden 1 koloni alınarak; içinde 25 ml SOB bulunan 250 ml‘lik erlene inoküle edilerek, 250 rpm ve 37˚C de 6 saat inkübe edildi.
6 saatin ardından kültür için içinde 250 ml SOB bulunan 3 tane erlen hazırlandı ve bir önceki DH5α‘dan; 10 ml, 4 ml ve 2 ml inoküle edildi. Hazırlanan erlenler 18-22˚C arası 14 saat boyunca 150 rpm‘de inkübe edildi.
Kültürlerin 600 nm‘deki OD‘leri her 45 dakikada bir okundu ve değer 0,55‘e ulaştığında kültür çalkalayıcıdan alındı.
10 dakika buzlu-su banyosunda bekletildi.
Ardından hücreler +4˚C‘de 2500 g (3900 rpm)‘de 10 dakika santrifüjlendi. Besiyeri boşaltıldı ve santrifüj şişesinin içinde kalan besiyeri temizlendi.
Hücrelere 0˚C’deki 80 ml PiPES‘li tampon ilave edilerek, hassas olarak yeniden süspansiyon haline getirildi.
Hücreler, +4˚C 2500 g (3900 rpm)‘de 10 dakika santrifüjlendi. Tüpün içindeki tampon boşaltıldı ve temizlendi.
Hücrelere 0˚C‘de 20 ml PiPES‘li tampon ilave edildi ve hassasça yeniden süspansiyon hale getirildi.
1,5 ml DMSO eklendi, hafifçe karıştırıldı. Buz banyosuna alındı ve 10 dakika beklendi.
Hızlı bir şekilde hücreler steril ependorf tüplere bölündü ve hızlıca donması için sıvı azota atıldı. Ardından hücreler -80˚C‘de saklandı (Inoue ve ark., 1990).
3.2.7.2. FSB’li Kompotent Hücre Hazırlanması
1 gece önce inoküle edilen kültürden 1 ml ve 0,5 ml alınarak 2 tane steril erlene eklendi. Üzerine 50 ml LB (Luria Bertani) eklenerek; 370C ve 250 rpm’de inkübasyona
31
Optik dansite, 600 nm’de absorbans yaklaşık olarak 0,7 olduğunda erlenler inkübatörden alındı ve +40
C 5000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi.
Süpernatant atıldı. Pelet üzerine 50 ml soğuk FSB (dondurulmuş saklama tamponu) çözeltisi eklendi çok iyi vortekslendi. Ardından 1 saat buz banyosunda inkübe edildi.
1 saatin ardından; +40
C, 4000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant atıldı.
Pelet üzerine 8 ml soğuk FSB çözeltisi eklendi ve tüpe vurarak çözünme sağlandı.
Peletin tamamı çözününce üzerine 560 μl DMSO eklendi ve 3 saat buza gömüldü.
saatin ardından kompotent hücre hazır hale geldi (Hanahan, 1983).
3.2.8. Transformasyon
Buz banyosunda bulunan kompotent hücrelerden 200 μl’lik kısımlar alındı. Gerekli sayıda ependorfa pipetleme yapıldı. Üzerine 5 μl ligasyon ürünü eklendi ve karıştırılarak 1 saat buz banyosuna gömüldü.
1 saatin ardından 2 dakika 42oC’de ısı şokuna maruz bırakıldı.
Tekrar buza gömülerek 5 dakika inkübe edildi.
Üzerine 300 μl (veya kullanılan kompotente göre SOB) LB eklendi ve yarım saat 370C ve 250 rpm’de inkübasyona bırakıldı.
Yarım saatin ardından her bir ependorf içeriği seçici besiyerine pET28b sistemi için kanamisinli petriye sprader ile yayıldı. 370C’de 1 gece inkübasyona bırakıldı
(Hanahan,1985).
3.2.9. Plazmid DNA Saflaştırılması
Petri tabaklarından elde edilen koloniler kanamisin ihtiva eden 4 ml’lik steril sıvı LB içerisine tek koloni olarak inoküle edildikten sonra 37 °C de gece boyu inkübe edilerek yetistirildiler. Santrifüjle ependorf tüplerine toplanan hücrelerden plazmit DNA
32
“Biobasic Plasmid DNA Purification” kiti kullanarak aşağıdaki protokole göre saflaştırıldı. Protokol aşağıdaki gibidir:
Kültürden 1.5-5 ml tüpe transfer edilir, 2 dk 12000 rpm ‘de santrifüj yapılır ve sıvı tamamen dökülür.
100 μl Solution 1 eklenir ve iyi bir şekilde karıştırılır (vorteksle) ve 1dk beklenir. Karışıma 200 μl Solution 2 eklenir ve nazikçe 4-6 kez alt üst edildikten sonra 1dk
oda sıcaklığında bekletilir. (Genomik DNA kontaminasyonlarını engellemek için vorteksleme yapılmamalıdır).
Karışıma 350 μl Solution 3 eklenir ve nazikçe karıştırılıp oda sıcaklığında 1 dk bekletilir.
12000 rpm’de 5 dk santrifüj yapılır.
Süpernatant EZ-10 Spin kolona eklenir ve 2 dk 10000 rpm ‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm ‘de
santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve kolon aynı toplama tüpüne geri koyulur. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj
yapılır.
Alttaki sıvı atılır ve Wash Solution’ın kalan miktarını çıkarmak için ekstradan 1dk daha santrifüj yapılır.
Kolon 1.5 ml temiz Eppendorf tüpüne transfer edilir. Kolonun merkezine 50 μl steril distile su eklenir ve 50 ˚C’de 2 dk bekletilir.
10000 rpm‘de 2 dk santrifüj yapılarak plazmit DNA’lar saflaştırılır.
Saflaştırılan plazmid DNA’lar restiriksiyon enzim analizinde kullanılmak üzere -20 ˚C’de muhafaza edilir.
3.2.10. Doğrulama Restriksiyon Kesimi
Saflaştırılan plazmid DNA (pET28b-xynB), XbaI ve XhoI ile kesildikten sonra bu plazmidin istenilen uzunlukta DNA parçalarını (insertleri) (564 bç) ihtiva edip etmedikleri %1’lik agaroz jel üzerinde analiz edildi.
33
Çizelge 3.9. pET28b vektör sistemi doğrulama kesimi için gereken madde miktarları: pET28b Vektör Sistemi İçin Kesim
18 µl Plazmit DNA (pET-XynB ) 2,5 µl 10x Buffer D
2,5 µl BSA 1µl XbaI
1µl XhoI
Olmak üzere tüpler hazırlandı, vortekslendi. Mikrosantrifüjle 3-5 saniye hızlıca döndürüldü ve 37˚C’ye ayarlanmış bir ısıtıcı blok üzerinde 2,5 saatlik inkübasyona bırakıldı.
2,5 saatlik inkübasyon süresince her 45 dakikada tüpler alınarak hızlıca döndürüldü ve inkübasyona devam edildi.
2,5 saat sonra tüpler alınarak hızlıca döndürüldü.
Alınan belirli miktardaki numunelerin üzerine DNA boyası eklenerek agaroz jele yaklasık olarak 15 μl yükleme yapıldı. Yürütme tamamlandıktan sonra jelin fotoğrafı alındı.,
3.2.11. DNA Dizileme
Restriksiyon enzim analizi sonucu pozitif olduğu düşünülen 1,3,9,10 nolu plazmit DNA’lardan 30 μl alındı ve T7 promotor primeri ile dizi analizi yapılmak üzere DNA dizilemeye gönderildi.
3.2.12. E. coli BL21(DE3) pLysE Hücresinin pET28b(+)-xynB Plazmidi ile Transformasyonu ve Ksilanaz’ın Ekspresyonu
Protein ekspresyon çalışmaları için E. coli BL21 pLysE suşu kullanıldı. -80 0
C derin dondurucudan çıkarılan stok hücreler 4 µl kloramfenikol içeren 4 ml’lik LB besiyerine inoküle edilerek bir gece 37 0C’de 250 rpm çalkalama hızında yetiştirildi.
