• Sonuç bulunamadı

Straurogyne repens (nees) Kuntze’de doku kültürü çalışmaları

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Straurogyne repens (nees) Kuntze’de doku kültürü çalışmaları"

Copied!
61
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

Staurogyne repens (Nees) Kuntze’DE DOKU KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI

Merve Şifa Hane KÖSE Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Gökhan SADİ

(2)

T.C.

KARAMANOĞLU MEHMETBEY ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Staurogyne repens (Nees) Kuntze’DE DOKU KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI

YÜKSEK LİSANS TEZİ Merve Şifa Hane KÖSE

Anabilim Dalı: Biyoloji

Tez Danışmanı: Doç. Dr. Gökhan SADİ

İkinci Danışman: Arş. Gör. Dr. Muhammet DOĞAN

(3)
(4)

i ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

Staurogyne repens (Nees) Kuntze’DE DOKU KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI Merve Şifa Hane KÖSE

Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Ana Bilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Gökhan SADİ

İkinci Danışman: Arş. Gör. Dr. Muhammet DOĞAN Eylül, 2019, 49 sayfa

Bu çalışmada, Staurogyne repens (Nees) Kuntze'in doku kültürü teknikleri ile çoklu ve hızlı üretimi hedeflenmiştir. S. repens’in yüzey sterilizasyonu için farklı süre ve konsantrasyonlarda hidrojen peroksit (H2O2) kullanılmıştır. Maksimum steril-canlı eksplantlar, 20 dakikalık uygulama süresi ile %5,5’lik H2O2'den elde edilmiştir. Steril bitkilerden boğum eksplantları izole edilmiş ve in vitro çoğaltım çalışmalarında kullanılmıştır. Boğum eksplantları sitokininleri (BAP, TDZ ve KIN) ve oksini (IAA) farklı dozlarda ve kombinasyonlarda içeren Murashige ve Skoog (MS) temel besin ortamında altı hafta süre ile kültüre alınmıştır. Eksplant başına maksimum sürgün sayısı (16,11 adet) 1,25 mg/LBAP içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. En uzun sürgünler (2,82 cm) 1,50 mg/L KIN eklenmiş kültür ortamında tespit edilmiştir. Rejenere sürgünlerin in vitro köklendirilmesi için kültür ortamlarına farklı konsantrasyonlarda (0,25-1,00 mg/L) IAA ve NAA ilave edilmiştir. Sürgün başına en fazla kök sayısı (14,88 adet) ve en uzun kökler (1,22 cm) 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında kaydedilmiştir. Köklendirilen sürgünler dış koşullara alıştırılması için akvaryuma aktarılmıştır. Dört hafta sonunda bitkilerin akvaryum şartlarına başarıyla adapte olduğu gözlenmiştir. Bu tez çalışması, akvaryum bitkisi S. repens’in doku kültürüyle çoklu ve hızlı üretimini sunmaktadır. Bu çalışma sonuçları ileride bu bitkinin ticari amaçlı üretimine yardımcı olabilir.

Anahtar Kelimeler: Boğum eksplant, in vitro üretim, sitokinin, oksin, sürgün rejenerasyonu

(5)

ii ABSTRACT

MsThesis

TISSUE CULTURE STUDIES IN Staurogyne repens (Nees) Kuntze Merve Şifa Hane KÖSE

Karamanoğlu Mehmetbey University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Biology

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Gökhan SADİ Co-Supervisor: Res. Assist. Dr. Muhammet DOĞAN

September, 2019, 49 pages

In this study, multiple and rapid propagations of Staurogyne repens (Nees) Kuntze by tissue culture techniques was aimed. Hydrogen peroxide (H2O2) was used at different time periods and concentrations for surface sterilization of S. repens. Maximum sterile and alive explants were obtained from 5.5% H2O2 with 20 min application time. Nodal explants were isolated from the sterile plants and used for in vitro propagation studies. The nodal explants were cultured in Murashige and Skoog (MS) nutrient medium containing cytokinins (BAP, TDZ and KIN) and auxin (IAA) in different doses and combinations for six weeks. The maximum number of shoots per explant (16.11) was obtained in MS nutrient medium containing 1.25 mg/L BAP. The longest shoots (2.82 cm) were detected in culture medium supplemented with 1.50 mg/L KIN. IAA and NAA were added to the culture media at different concentrations (0.25-1.00 mg/L) for in vitro rooting of the regenerated shoots. Maximum number of roots per shoot (14.88) and the longest roots (1.22 cm) were recorded in MS nutrient medium supplemented with 0.25 mg/L IAA. Rooted shoots were transferred to the aquarium to acclimate them to the external conditions. After four weeks, the plants were successfully adapted to the aquarium conditions. The results of this study mignht be helpful in the commercial production of this plant in the future.

(6)

iii ÖNSÖZ

Yüksek lisans öğrenim dönemim sürecinde, çalışmalarım esnasında ilgisini ve önerilerini dikkate aldığım danışman hocam Doç. Dr. Gökhan SADİ'ye,

Yüksek lisans öğrenim hayatım boyunca her konuda destekçim olan, değerli bilgilerini paylaşanbenim için sarf ettiği bütün kelimelerin yaşantımda çok yere dokunduğu saygıdeğer danışman hocam Arş. Gör. Dr. Muhammet DOĞAN'a,

Yoğun çalışmalarım sırasında bana sabır gösteren canım annem Zeynep KÖSE' ye ve kardeşim Süleyman Kerem KÖSE'ye,

Çalışmalarım boyunca bana gerekli desteği gösterip, sebat eden ablam Ayşe Sefa Nur KÖSE'ye ve arkadaşım Ayşenur AKSOY'a

Yüksek lisans gayretini birlikte yaşadığımız takım arkadaşım Kübra UĞUR 'a

Son olarak, bu günlere gelmem de maddi ve manevi desteği olan amcam Ramazan KÖSE' ye

Teşekkürlerimi arz ederim

Merve Şifa Hane KÖSE Karaman-2019

(7)

iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii İÇİNDEKİLER ... iv ÇİZELGELER DİZİNİ ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ ... viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ... ix 1. GİRİŞ ... 1

2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 3

2.1. Kuramsal Temeller ... 3

2.1.1. Yüzey Sterilizasyonu ... 3

2.1.2. Bitki Doku Kültürü Tekniği... 3

2.1.3. Mikroçoğaltım ... 4

2.1.4. Organogenez ... 4

2.2. Kaynak Araştırması ... 5

3. MATERYAL VE METOT ... 13

3.1. Materyal ... 13

3.1.1. Deneme Yeri ve Bitki Materyali ... 13

3.1.2. Besin Ortamı ve Doku Kültürü Koşulları ... 13

3.1.3. Bitkilerin Yüzey Sterilizasyonu ... 13

3.1.4. Eksplant İzolasyonu ve Kültürü... 14

3.1.5. In vitro Köklendirme ... 15

3.1.6. Bitkilerin Dış Koşullara Alıştırılması ... 15

3.1.7. Verilerin Analizi ... 15

4. BULGULAR ... 16

4.1. Yüzey Sterilizasyonu Çalışmaları ... 16

4.2. In vitro Çoğaltım Çalışmaları... 19

4.2.1. Farklı BAP Konsantrasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi ... 19

4.2.2. Farklı BAP+IAA Kombinasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi ... 21

(8)

v

4.2.3. Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından

Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi ... 24

4.2.4. Farklı KIN + IAA Kombinasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi ... 27

4.2.5. Farklı TDZ Konsantrasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi ... 29

4.2.6. Farklı TDZ+IAA Kombinasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi ... 32

4.3. In Vitro Köklendirme Çalışmaları ... 34

4.4. Alıştırma Çalışmaları ... 38

5. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 39

KAYNAKLAR ... 43

(9)

vi

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge Sayfa

Çizelge 3-1 Murashige ve Skoog (1962) ortamında bulunan maddeler ve konsantrasyonları ... 14 Çizelge 4-1 Farklı konsantrasyonlarda H2O2 ile muamale edilen S. repens’in boğum eksplanlarının yüzey sterilizasyonu verileri ... 16 Çizelge 4-2 Farklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi ... 20 Çizelge 4-3 Farklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 20 Çizelge 4-4 0,25 mg/L IAA vefarklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi ... 23 Çizelge 4-5 0,25 mg/L IAA vefarklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 23 Çizelge 4-6 Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi ... 25 Çizelge 4-7 Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 26 Çizelge 4-8 0,25 mg/L IAA vefarklı KIN dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 28 Çizelge 4-9 0,25 mg/L IAA vefarklı KIN dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 28 Çizelge 4-10 Farklı TDZ dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi... 30 Çizelge 4-11 Farklı TDZ dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 31 Çizelge 4-12 0,25 mg/L IAA vefarklı TDZ dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi ... 33 Çizelge 4-13 0,25 mg/L IAA vefarklı TDZ dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi ... 33 Çizelge 4-14 Farklı IAA ve NAA dozlarının S. repens’in sürgünlerinin in vitro köklendirmesine ait varyans analizi ... 35

(10)

vii

Çizelge 4-15 Farklı IAA dozlarının S. repens’in sürgünlerinin in vitro köklendirmesine üzerine etkisi ... 35 Çizelge 4-16 Farklı NAA dozlarının S. repens’in sürgünlerinin in vitro köklendirmesine üzerine etkisi ... 36

(11)

viii

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil Sayfa Şekil 4-1 Yüzey sterilizasyonu amacıyla H2O2 ile farklı oran ve periyotlarda muamele

edilen S. repens eksplantları ... 18 Şekil 4-2 Farklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu ... 19 Şekil 4-3 0,25 mg/L IAA vefarklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu ... 22 Şekil 4-4 Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu ... 25 Şekil 4-5 0,25 mg/L IAA vefarklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu ... 27 Şekil 4-6 Farklı TDZ konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu ... ...30 Şekil 4-7 0,25 mg/L IAA vefarklı TDZ konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. ... 32 Şekil 4-8 Farklı IAA içeren kültür ortamında S. repens sürgünlerinin in vitro köklendirilmesi

... 37 Şekil 4-9 Farklı NAA içeren kültür ortamında S. repens sürgünlerinin in vitro köklendirilmesi ... 37 Şekil 4-10 In vitro koşullarda üretilen S. repens’lerin akvaryum koşullarında gelişimi ... 38

(12)

ix SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama g, mg Gram, Miligram HCl Hidroklorik Asit H2O2 Hidrojen Peroskit

HgCI2 Civa Klorit

H2SO4 Sülfirik Asit

l, ml, μM, M Litre, Mililitre, Mikro Molar, Molar

cm Santimetre

NaOCl Sodyum Hipoklorit

NaOH Sodyum Hidroksit

Kısaltmalar Açıklama

BAP 6-Benzilaminopurin

2,4-D 2, 4-Diklorofenoksi

Asetik Asit

2-iP 2- izopentenil adenin

GA3 Giberellik Asit

IBA Indol 3 Butirik Asit

IAA Indol-3-Asetik Asit

KIN Kinetin

MS Murashige ve Skoog

Temel Besin Ortamı

NAA α- Naftalen Asetik Asit

TDZ Thidazuron

(13)

1 1. GİRİŞ

Bitki doku kültürü, ana bitkiden izole edilmiş bitki parçalarının steril koşullar altında yapay bir besin ortamında büyümesi olarak tanımlanmaktadır. Doku kültürü ortamı, normal bir bitki yetiştirmek için gereken tüm besin maddelerini içermelidir. Bu besin ortamı esas olarak; makro besinler, mikro besinler, vitaminler, diğer organik bileşenler, bitki büyüme düzenleyicileri, karbon kaynağı ve bazı jelleştirici maddelerdir. Murashige ve Skoog (MS) besin maddeleri, birçok bitki türünün in vitro üretimi için en çok kullanılan besin ortamıdır. Besiyerinin pH'ı, bitki büyüme düzenleyicilerinin ve bitki büyümesinin faaliyetlerini önemli ölçüde etkiler. Bu sebeple, besiyerinin pH değeri 5,4 ile 5,8 arasında ayarlanmıştır. Ayrıca, bitki ortamları, bitki büyüme düzenleyicileri ve besin ortamındaki azot kaynakları da sürgün rejenerasyonu için çok önemlidir (Saad ve Elshahed, 2012; Doğan, 2019a).

Doku kültürü teknolojisinin temel avantajı, mevsim ve hava koşullarından bağımsız olarak, steril koşullar altında yıl boyunca çoğaltılabilen yüksek kaliteli bitki veya bitkisel ürünlerin elde edilebilmesidir. Ancak, bu teknoloji için sermaye, emek ve enerji gerektirmektedir (Ahloowalia ve ark., 2004).

Doku kültürleri, beş geniş araştırma ve uygulama alanında kullanılmıştır. Bunlar, hücre davranışı, bitki modifikasyonu ve gelişimi, patojen içermeyen bitki üretimi ve germplazm depolanması, klonal yayılım ve ikincil ürün üzerine yapılan araştırmalardır. İn vitro yöntemler, 1960'lardan bu yana bitkilerin modifikasyonu ve iyileştirilmesi için geleneksel üreme yöntemlerine ek olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır (Gaspar ve ark.,1996). Burada hücrelerin, dokuların ve organların in vitro kültürünün tüm yönlerini incelemek için kullanılan bitki doku kültürü, genellikle bitki hormonlarının ve bitki büyüme düzenleyicilerinin etkin rol aldığı bir tekniktir (Mahna ve ark., 2013). Ayrıca, doku kültürü teknikleri, birçok akademik araştırma türü için ve bitki biliminin uygulamalı yönleri için çok önemlidir. Geçmişte, bitki doku kültürü teknikleri, totipotensin akademik incelemelerinde ve sito-farklılaşma ve organogenezdeki hormonların rollerini anlamada kullanılmıştır. Günümüzde, genetik olarak tasarlanmış doku kültürü ile üretilmiş bitkiler, bitki moleküler biyolojisi ve gen düzenlemesi hakkında fikir vermektedir. Bitki doku kültürü teknikleri, bitki biyoteknolojisi ve tarım

(14)

2

da dahil olmak üzere uygulamalı bitki biliminin yenilikçi alanlarının merkezindedir (Mineo, 1990).

Bitkiler süsleme, tıbbi ve diğer birçok amaç için doğal ortamlarından aşırı şekilde toplanıp, istila edilmektedir. Bu durum bitki türlerinin neslinin yok olmasına sebebiyet vermekte ve bu bitki türleri ile beslenen diğer canlı türlerinin ölmesine neden olabilmektedir. Bu nedenle, önemli bitki türlerinin seri şekilde çoğaltılmaları ve korunmalarını sağlayacak etkili yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır (Doğan, 2019a).

Akvaryum ve süs bitkileri alanı dünya genelinde yıllık %14 oranında büyüyen bir sektördür. Bu sektörde ihracat tutarının çoğunluğu gelişmekte olan ülkelere girmektedir (Padilla ve Williams, 2004). Akvaryum bitkileri, çevresel olarak sürdürülebilir kalkınma için önem arz etmektedir (Erkoyuncu ve Yorgancılar, 2016).

Staurogyne repens (Nees) Kuntze, Acanthaceae familyasına ait tatlı su bitkisidir. Bu özel tür Güney Amerika'daki Cristalino Nehri'nde bulunmaktadır. Bu bitki akvaryumlarda peyzaj tasarımında yaygın olarak kullanılmaktadır. S. repens akvaryum suyunun kalitesini yükseltir ve akvaryumu temiz tutmaya yardımcı olur. Fotosentezle su ve suda çözünen nitrat ve toksinlerin bir kısmını uzaklaştırırken oksijeni serbest bırakır. Bu bitkiyi diğer bitkilerden ayrı kılan parlak yeşil renkler ve gür görünümüdür. Ayrıca bileşimlerinde tat uyarıcıları olan benzersiz glikozit kaynaklarına sahiptir. Akvaryumlarda ön plan ve zemin alanların da kullanım için tercih edilen bir bitkidir. Gelişimi yavaş olan fakat yüksek ışık ve düzenli CO2 isteyen bir türdür. (Sereda ve ark., 2017; Anonim, 2019).

Literatürde S. repens'in doku kültürü ile üretimine yönelik geniş kapsamlı bir çalışma tespit edilmemiştir. Bu nedenle çalışmamızın amacı, akvayum bitki ticaretinde ekonomik öneme sahip S. repens'in doku kültürü teknikleri ile hızlı ve etkili üretimidir. S. repens'in in vitro üretimi için tasarlanmış bu üretim yöntemi, bu bitkinin ticari amaçlı üretimi için de kullanılabilir.

(15)

3

2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI

2.1. Kuramsal Temeller 2.1.1. Yüzey Sterilizasyonu

Doku kültürü tekniklerinde bakteri, fungus gibi mikroorganizmaların varlığı bitki büyüme ve gelişmesini engelleyici faktörlerdendir. Bitkilerin in vitro kültür yoluyla çoğaltılabilmesi için steril koşullarda muhafaza edilmesi gerekmektedir. Bunu için mikroorganizmaların zarar verici etkisini azaltmak için steril laboratuvar şartları oluşturulmaktadır. Eksplantlar için yüzey sterilizasyonu uygulanmasına rağmen, kültürler bazen bakteri ve funguslardan arındırılamaz. Genellikle bakterilerin kültür ortamında varlığı ilk aşamada belirgin olabilir. Ancak diğer zamanlarda besin ortamında mikroorganizma çıkışı, kültürün ilerleyen aşamalarında da gözlenebilmektedir. Bitki doku kültürlerinde kirlenmenin en aza indirilmesi için çeşitli kimyasallar kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları; etanol, kalsiyum veya sodyum hipoklorit, civa klorür ve hidrojen peroksittir (Orlikowska ve ark., 2017).

2.1.2. Bitki Doku Kültürü Tekniği

Bitki doku kültürü, kontrollü aseptik koşullar altında bütün bir bitki, organ, doku veya hücrelerin yetiştirilmesine izin veren bir sistemdir. Bu sistem, besin ortamında bitki veya eksplant büyümesi için gerekli tüm besin maddelerini, enerjiyi ve suyu sağlamaktadır. Ek olarak, kontrollü inkübasyon koşulları, büyümeyi teşvik etmek için uygun ışık ve sıcaklık ayarları sağlanır. Bitki gelişimi daha sonra, belirli büyüme veya olgunlaşma aşamalarında bitki büyüme düzenleyicilerinin (doğal fitohormonlar veya sentetik versiyonlar) eklenmesiyle manipüle edilebilir (Phillips ve Garda, 2019).

Bitki doku kültürü ortamı; makro besinler, mikro besinler, vitaminler, amino asitler veya azot takviyeleri, karbon kaynakları, tanımlanmamış organik takviyeler, büyüme düzenleyicileri ve katılaşan maddeler gibi bileşenlerin bazılarını veya tümünü içermelidir (Saad ve Elshahed, 2012). Bitki hücre veya doku kültürü ortamındaki temel elementler, C, H ve O'nun yanı sıra, makro elementleri içerir: azot, fosfor, potasyum, kalsiyum, magnezyum ve kükürt büyüme ve gelişme için gereklidir (Orlikowska ve ark., 2017). Bitki hücresi ve doku büyümesi için temel mikro besinler, demir,

(16)

4

manganez, çinko, bor, bakır ve molibden içerir. Demir genellikle tüm mikro besleyiciler için en etkin olanıdır (Saad ve Elshahed, 2012).

Bitki doku kültüründe kullanılan bitki hormonları üretim teknikleri için çığır açmıştır. Çünkü iki veya daha fazla hormon arasındaki dengenin bitkilerde farklı organ ve hücrelerin büyümesini azalttığı veya arttırdığı görülmüştür. Bununla birlikte, bitki büyüme düzenleyicileri bitkilerde kimyasal olarak uyarılmayı sağlamayarak fenolik bileşiklerin üretimini geliştirmek için de kullanılabilir (Hasancebi ve ark., 2011).

Aynı zamanda bitki büyüme düzenleyicilerinin keşfi, bitkilerin çimlenmesinden organ ve dokular gibi özelleşmiş hücreler oluşumuna kadar fizyolojik sürecin belirli bir şekilde kontrol etmenin kilit noktasıdır. Bitki hormonları, in vitro bitki kültürünün devrim yaratan sonuçlarına katkı sağlamıştır (Dias ve ark., 2016).

2.1.3. Mikroçoğaltım

Mikroçoğaltım, in vitro kültür teknikleri kullanılarak sürgün, boğum, meristem, embriyo ve kök gibi eksplant kısımları ile yeni rejene bitkilerin oluşmasıdır (Singh, 2015). Mikroçoğaltımın geleneksel bitkisel çoğalmaya göre birçok avantajı vardır ve bahçecilik, tarım ve ormancılıktaki kullanımı şu anda dünya çapında genişlemektedir. Mikroçoğaltım kavramı, son zamanlarda üretim maliyetlerini azaltma ve seri olarak bitki üretme yönünde geniş bir yelpaze alanı açmıştır. Ayrıca, mikroçoğaltım ticari olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır (Kozai, 1991).

2.1.4. Organogenez

Bitkilerin çoğaltılmasında kullanılan bütün hücre ve doku kültürü tekniklerinde görülen farklılaşma tipleri, sürgün ve kök üretimi ile sonuçlanmaktadır. Bu iki olayın birlikte gerçekleşmesine organogenez adı verilir. Organogenezin kontrolü uygun bitki büyüme düzenleyicilerin besin ortamına uygulanması ile yapılır. Bu büyüme düzenleyicilerin doğası türler arasında farklılık göstersede, ayrıoksin-sitokinin oranı değişik sistemlerde belirli bir etkiye sahiptir. Kültüre alınan hücrelerin organogenezi, önceden var olan veya teşvik edilmiş meristematik primordiyumların varlığına bağlıdır. Bu primordiyumlar hızlıca bölünen meristematik hücre gruplarına sahiptir ve biyokimyasal organizasyon derecesi farklılaşmaya yardımcı olur (Onay ve ark., 2012).

(17)

5 2.2. Kaynak Araştırması

Karataş ve ark. (2013a) Bacopa monnieri L.'yi 6-benzil amino purin (BAP) ve naftalin asetik asit (NAA)'in çeşitli kombinasyonları ile desteklenmiş MS ortamında farklı boğumarası ve yaprak eksplantlarını kullanarak kültüre almışlardır. Yaprak eksplantlarından elde edilen sürgünler, diğer eksplantlardan daha uzun bulunmuştur. Eksplant başına maksimum sürgün sayısı 0,25 mg/L BAP + 0,25 mg/L NAA ile desteklenmiş MS ortamlarında yaprak eksplantlarından 21,77 adet, 1. boğumarası eksplanttan 21,89, 2. boğumarası eksplanttan 21,22 adet, 3. boğumarası eksplanttan 23,11 adet olarak bulunmuştur. 0,25 mg/L BAP + 0,25 mg/L NAA takviye edilmiş MS ortamında en uzun sürgün uzunluğu yaprak eksplantında 3,02 cm olarak tespit edilirken boğumar asıeksplantlarda sırasıyla 1. boğumarası eksplanttan 3,06 cm, 2. boğumarası eksplanttan 2,89 cm ve 3. boğumarası eksplanttan 3,04 cm olarak kaydedilmiştir. Rejenere sürgünler, IBA ile desteklenmiş MS ortamında başarıyla köklenmiştir. Köklenmiş bitkiler, 4,0-10,00 arasında çeşitli pH seviyelerinde suya alınarak başarılı bir şekilde iklimlendirilmiştir. Sucul koşullarda pH 8.0'in bitki büyümesi için daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

Pandey ve ark. (2013) Psoralea corylifolia'nın in vitro mikroçoğaltım için bir çalışma yapmışlardır. Sürgün ucu meristem eksplantları BAP, KIN ve NAA kombinasyonlarını içeren MS besin ortamında kültürle alınmıştır. En yüksek sürgün rejenerasyonu (%95), 10,0 μM NAA, 15,0 μM KIN ve 12,0 μM BAP içeren MS ortamında elde edilmiştir. Sürgün çoğaltımı için en iyi oran BAP 12,0 μM olarak bulunmuştur. Rejenere sürgünler oksin hormonu takviye edilmiş MS ortamında iki hafta içinde köklendirilmiştir. Köklü bitkiler, dış koşullara alıştırılmak için saksılara aktarılmış ve başarılı şekilde büyümeleri gözlenmiştir. Burada bildirilen mikroçoğaltım protokolü, sürgünlerin hızlı bir şekilde çoğalmasını, rejenere sürgünlerin kolay köklenmesini ve oluşan bitkilerin dış ortama kolayca alıştırılmasını açıklamıştır.

Karataş ve ark. (2014) Ceratophyllum demersum L.'un in vitro üretimi için boğum eksplantlarını 0,05-0,80 mg/L BAP ilave edilmiş katı ve sıvı MS besin ortamına aktarmıştır. Hem katı ortamda hem de sıvı kültür ortamında in vitro sürgün rejenerasyonu kaydedilmiştir. Sıvı ortamda katı ortama göre daha çok sayıda sürgün sayısı raporlanmıştır. Her iki kültür ortamı üzerindeki tüm eksplantlardan maksimum

(18)

6

sürgün rejenerasyon frekansı 0,05 mg/L BAP'da elde edilmiştir. Katı kültür ortamında eksplant başına sürgün sayısı (16,75), sıvı kültür de eksplant başına sürgün sayısı (204,33) olarak saptanmıştır. Rejenere bitkiler başarıyla akvaryumlara aktarılarak dış koşullara alıştırılmıştır.

Khan ve ark. (2014) Steviare baudiana'nın boğum eksplantlarından in vitro bitki rejenerasyonu için etkin bir protokol geliştirmişlerdir. En fazla sürgün sayısını KIN (9,3 μM) ve adenin sülfat (Ads) (40 mg/L) ile takviye edilmiş MS ortamında gözlenmiştir. Rejenere sürgünler, farklı konsantrasyonlarda NAA ve IBA içeren köklendirme ortamına aktarılmıştır. En iyi köklenme 5,3 μM NAA içeren kültürde kaydedilmiştir. Köklendirilmiş bitkiler dış koşullara adapte edilmek için saksılara aktarılmıştır. Bunun sonucunda bitkiler normal büyüme ile %65 oranında hayatta kalmıştır.

Doğan ve ark. (2016) Pogostemon erectus (Dalzell) Kuntze (Lamiaceae)'un sürgün ucu ve boğum eksplantlarını 0,25-1,25 mg/L KIN tek olarak ve 0,25-1,25 mg/L KIN + 0,25 mg/L NAA ile kombinasyon olarak içeren MS besin ortamında kültüre almıştır. Eksplant başına maksimum sürgün sayısı 1,0 mg/L KIN + 0,25 mg/L NAA ile zenginleştirilmiş MS ortamında sırasıyla, sürgün ucu için 22,61 adet, boğum eksplantları için 24,44 adet olarak elde edilmiştir. En yüksek sürgün uzunluğu, sırasıyla sürgün ucu eksplantları kullanılarak 1,0 mg/L KIN içeren MS ortamında 5,64 cm, boğum eksplantlarında ise 1,25 mg/L KIN içeren MS ortamında 5,13 cm olarak kaydedilmiştir. Dört hafta boyunca farklı IAA konsantrasyonlarında (0,25-1,00 mg/L) içeren MS ortamında, rejenere edilmiş sürgünlerin in vitro köklenmesi sağlanmış ve bu köklü bitkiler akvaryumda başarılı bir şekilde iklimlendirilmiştir.

Jabir ve ark. (2016) Lindernia antipoda L. (Alston), akvaryum ticaretinde önemli potansiyele sahip olan değerli sucul süs bitkilerinden biridir. Bu çalışmada, L. antipoda’nın hızlı sürgün rejenerasyonu için bir deneme kurulmuştur. 1 mg/L BAP içeren yarı MS ortamının kültürün başlatılması ve kurulması için en iyi ortam olduğu bulunmuştur. Çoklu sürgün rejenerasyonu için etkili ortam MS + 1 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA olarak belirlenmiştir. En yüksek sürgün rejenerasyonu ve sürgün uzunluğu da bu kültür ortamında elde edilmiştir. 1,0 mg/L BAP ve 0,2 mg/L NAA eklenmiş MS ortamında en yüksek in vitro çiçeklenme kaydedilmiştir. Sürgünlerini tüm NAA

(19)

7

konsantrasyonlarında köklendirilmiş ve akvaryum koşullarına başarıyla alıştırılmıştır (%90).

Kam ve ark. (2016) sucul bir süs bitkisi olan Aponogeton ulvaceus Baker’un botanik yönleri, bitkinin morfolojisi, anatomisi ve fizyolojisini incelenmiş ve olgunlaşmamış yumru eksplantları kullanılarak in vitro çoğaltımı için etkin bir protokol belirlemişlerdir. Yapraklarda glandülertrikomların varlığı keşfedilmiştir. Meristemli olgunlaşmamış yumru segmentleri, kallus indüksiyonu için çeşitli BAP ve NAA kombinasyonları (0, 1, 2 ve 3 mg/L) ile desteklenmiş MS ortamında kültürle alınmıştır. Kallus üretiminin en yüksek yüzdesi (%100) iki farklı tedavide elde edilmiştir: 1 mg/L BAP + 3 mg/L NAA ve 2 mg/L BAP + 3 mg/L NAA. 22,50 adet sürgün sayısı ve 29,50 adet kök sayısı 1 mg/L BAP + 1 mg/L NAA kombinasyonunda kaydedilmiştir.

Frómeta ve ark. (2017) Gerbera jamesonii Boluse x Hooker f. (gerbera)'un sürgünlerini çoğaltmak için geçici bir daldırma biyoreaktörü kullanmanın uygulanabilirliğini değerlendirmişlerdir. Daldırma frekansı (6, 8 ve 12 saat), ek havalandırma (her 2 saatte bir 1 dakika) ve sürgün kültürü süresinin uzunluğu (14, 21, 28 ve 35 gün) faktörler yoluyla test etmişlerdir. Her 8 saatte bir ek havalandırma ile daldırma yapılarak daha fazla sürgün üretilmiştir. Ortalama sürgün oranı, eksplant başına 9 sürgün olarak saptanmıştır. Bununla birlikte filizler her 6 saatte bir daldırıldığında, sürgünlerin daha taze ve kuru ağırlığa sahip olduğu görülmüştür. Sürgünler IAA ile desteklenmiş ortama aktarılmış ve köklendirilmiştir. Bitkilerin %87'si fazlası hayatta kalmıştır.

Doğan (2018a) Limnophila aromatica (Lamk.) Merr.'un çoklu ve hızlı üretimi için boğum ve boğumarası eksplantlarını kullanarak 0,10 mg/L GA3 ve 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,80 ve 1,60 mg/L TDZ kombinasyonlarını içeren MS besin ortamında sekiz hafta boyunca kültüre almıştır. Genel olarak her iki tip eksplant için de yüksek sürgün rejenerasyon yüzdeleri elde edilmiştir. Boğum eksplantlarında eksplant başına maksimum sürgün sayısı (21,44 adet) 0,10 mg/L GA3 + 0,40 mg/L TDZ içeren MS ortamında ve en uzun sürgünler ise 0,10 mg/L GA3 + 0,10 mg/L TDZ (1,68 cm) içeren MS ortamında elde edilmiştir. Boğumarası eksplantlarında en fazla sürgün sayısı 0,10 mg/L GA3 + 0,20 mg/L TDZ'li MS besin ortamında (17,46 adet), en uzun sürgünler 0,10 mg/L GA3 + 0,05 mg/L TDZ eklenmiş MS ortamında (1,60 cm) kaydedilmiştir. İki

(20)

8

eksplant karşılaştırıldığında boğum eksplantı, boğumarası eksplantından daha fazla rejenere sürgün vermiştir. Rejenere sürgünler 0,25 mg/L IBA içeren MS ortamında köklendirilmiştir. Köklenen sürgünlerin akvaryum ortamına alıştırılması başarıyla sağlanmıştır.

Doğan (2018b) Lysimachia nummularia L.'un boğum eksplantlarının farklı konsantrasyonlarda tek BAP 'ı veya BAP ile IBA kombinasyonunu içeren MS besin ortamında kültüre almıştır. En fazla eksplant başına sürgün sayısı (12,27 adet) 1,6 mg/L BAP içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. En kısa sürgünler her iki hormon uygulamasında 0,05 mg/L BAP içeren MS ortamında tespit edilmiştir. Kültür ortamında BAP konsantrasyonunun artması ile sürgün sayısı arttığı belirlenmiştir. En uzun sürgünler 0,1 mg/L BAP eklenmiş MS ortamında (4,6 cm) kaydedilmiştir. En kısa sürgün uzunlukları 1,6 mg/L BAP eklenmiş MS ortamında tespit edilmiştir. Kültür ortamlarındaki rejenere sürgünler yoğun kök oluşturdukları için ayrıca köklendirme çalışması yapılmamıştır. Köklü bitkiler başarılı şekilde akvaryum ortamına alıştırılmıştır.

Kaviani ve ark. (2019) Aglaonema widuri'nin apikal tomurcuklarından in vitro sürgün ve kök oluşumu için bir protokol geliştirmişlerdir. Bitki büyüme düzenleyici olarak BAP (0, 3, 3,5 ve 4 mg/L), TDZ (0, 0,5 ve 1 mg/L) ve 2-iP (0 ve 7 mg/L) ve NAA (0, 0,1, 0,2, 0,3 ve 0,4 mg/L) kullanılmıştır. 4 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA + 0,5 mg/L TDZ kombinasyonunda maksimum sürgün sayısı üretilmiştir (eksplant başına 13,25). En fazla yaprak (eksplant başına 4,25), 3,5 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA içeren ortamda tespit edilmiştir. 3 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA içeren besiyerinde maksimum kök saysı (eksplant başına 14,25) elde edilmiştir. Köklendirilmiş bitkiler saksılara aktarılmış ve %95 başarı oranıyla serada hayatta kalmıştır.

Alam ve Anis (2019) Mucuna pruriens'in sürgün ucu eksplantlarını in vitro çoğaltım için kültüre almıştır. Bu çalışmada, ekspkantlar önce farklı konsantrasyonlarda BAP (0-8,5 µM) içeren MS besin ortamına aktarılmıştır. En yüksek sürgün sayısını 7,67 adet olarak 2,5 µM BAP içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. Ardından ise en yüksek sürgünler 5,33 adet olarak 4,5 µM BAP'lı kültür ortamında kaydedilmiştir. İkinci aşamada 2,5 µM BAP ve farklı konsantrasyonlarda IAA, IBA ve NAA (0,05-1,50 µM)

(21)

9

içeren MS ortamlarında çoğaltım çalışması yapılmıştır. IAA denemesinde, en yüksek sürgün sayısı (7,67 adet) ve en uzun sürgünleri (2,40 cm) 0.05 µM IAA + 2,5 µM BAP içeren kültür ortamında belirlenmiştir. Benzer şekilde, IBA ve NAA denemelerinde de en yüksek sürgün sayıları ve uzunlukları 0,05 µM IBA ve NAA + 2,5 µM BAP eklenmiş MS ortamında elde edilmiştir. Rejenere sürgünlerin köklendirilmesi için farklı MS ve IBA kullanılmıştır. En fazla kök oluşumu (4,67 adet) ve kök uzunluğu (4,30 cm) 1/2 MS + 0,30 µM IBA'lı ortamında tespit edilmiştir. Köklendirilen bitkilerin %90 başarıyla dış koşullara alıştırılmıştır.

Doğan (2019b) Rotalaro tundifolia (Buch-Ham. exRoxb) Koehne'ın boğum eksplantlarını BAP ve GA3’in farklı kombinasyonlarını içeren kültür ortamına aktarmışlardır. Sekiz hafta sonunda sürgün rejenerasyon oranı %72,22-100 arasında sıralanmıştır. %100 sürgün rejenerasyon oranı 0,25-0,75 mg/L BAP + 0,25 mg/L GA3 içeren MS ortamında kaydedilmiştir. Eksplant başına maksimum sürgünler (18,38 adet) ve en uzun sürgünler (2,36 cm) 0,25 mg/L BAP + 0,25 mg/L GA3 eklenmiş kültürde elde edilmiştir. Rejenere sürgünlerin akvaryum ortamına alıştırılması başarıyla sağlanmıştır.

Doğan (2019a) Pogostemon erectus (Dalzell)’un sürgün ucu ve boğum eksplantlarını farklı kombinasyonlarda TDZ ve 2,4-Diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) içeren MS besin ortamında kültürle almıştır. Eksplantlarda ilk sürgün oluşumu 15. günde gözlenmiştir. Her bir eksplant için sürgün sayısı, sürgün ucu eksplantlarında 2,85-29,39 arasında ve boğum eksplantlarında 2,72-32,24 arasında değişmiştir. Sürgün ucu eksplantlarında maksimum rejenerasyon sürgün sayısı 0,20 mg/L TDZ + 0,10 mg/L 2,4-D içeren MS ortamında 29,39 adet, en uzun sürgünler 0,10 mg/L TDZ + 0,10 mg/L 2,4-D eklenmiş MS ortamında 1,76 cm olarak elde edilmiştir. Boğum eksplantında, sürgün ucu eksplantlarına kıyasla kısa sürgünler elde edilmiştir. Boğum eksplantı için en fazla sürgün sayısı 32,24 adet ile 0,10 mg/L TDZ + 0,10 mg/L 2,4-D ortamında, en yüksek sürgün uzunluğu 1,64 cm olarak 0,10 mg/L TDZ + 0,10 mg/L 2,4-D ile desteklenmiş MS ortamında kaydedilmiştir. Rejenere edilmiş sürgünler 0,25 mg/L IAA içeren MS ortamında köklendirilerek akvaryum koşullarına alıştırılmıştır.

(22)

10

Haque ve Ghosh (2019) akvaryumlarda süs amaçlı kullanılan Echinodorus ‘IndianRed’ için in vitro çoğaltılma ve dış koşullara alıştırılması için etkili bir yöntem geliştirmişlerdir. Sürgün ucu eksplantları iki tabakalı bir besin ortamında kültüre alınmıştır. Katı alt tabakada MS bazal ortamı ile %3,0 sakaroz, %0,8 agar-agar ve farklı kombinasyonlarda ve konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri yer alırken, sıvı üst tabakada steril damıtılmış su yer almıştır. 60 gün sonunda, 2,5 mg/L BAP ve 1,0 mg/L NAA kombinasyonunu içeren kültür ortamında eksplant başına maksimum 26,8 ± 0,51 sürgün elde edilmiştir. Aynı kültür ortamında her bir rejenerasyon döngüsü ile çoğaltımış sürgünlerin sayısı da artmıştır. İlk rejenerasyon döngüsünde eksplant başına 26,8 ± 0,51 sürgün, ikinci rejenerasyon döngüsünde eksplant başına 33,5 ± 0,58 sürgün ve üçüncü rejenerasyon döngüsünde eksplant başına 38,3 ± 0,62 sürgün elde edilmiştir. Sürgün başına en fazla sayıda kök (8,3 ± 0.28), 1,0 mg/L IAA içeren kültür ortamında tespit edilmiştir, ancak bu köklerin uzunlukları kısa kalmıştır. Rejenere bitkiler, su altındaki koşullarda %100 hayatta kalmıştır.

Imtiaz ve ark. (2019) Krizantem morifolium boğum eksplantları sürgün rejenerasyonu için kültüre almışlardır. Rejenere edilmiş filizler köklenme için MS, ½ MS ve ¼ MS ortamında alt kültürlenmiştir. MS'de kültürlenen eksplantlarda hiçbir sürgün indüksiyonu kaydedilmemiştir, ancak MS ortamına eklenen fito hormonlar ile %100 sürgün indüksiyonu tespit edilmiştir. 44,39 μM BAP ile desteklenmiş MS ortamında maksimum sürgün tomurcukları 12 adet olarak ve sürgün uzunluğu 6,06 cm olarak kaydedilmiştir. MS ortamının BAP + NAA ile desteklenmesi durumunda, MS + 88,79 μM BAP + 10,74 μM NAA ortamında kültürlenen eksplantlarda maksimum 11 adet sürgün elde edilmiştir. MS + 88,79 μM BAP + 9,08 μM TDZ’de ekilmiş olan eksplantlar için maksimum sürgün sayısı 6,67 adet olarak belirlenmiştir. Yenilenen sürgünler daha sonra köklenme için MS, ½ MS ve ¼ MS ortamında alt kültüre alınmıştır. Kültüre alınan sürgünler için maksimum 15,78 adet kök kaydedilmiştir.

Liu ve ark. (2019) Asya nilüferleri (Nelumbo nucifera Gaertn.)’nin in vitro üretilmesi için deneme kurmuşlardır. Eksplant olarak olgun embriyolar kullanılmıştır. Eksplantlardan çıkan sürgünler büyüme düzenleyicilerinin tiplerine göre farklılık göstermiştir. 0,5 ila 2,0 mg/L KIN içeren besin ortamı gövdenin uzaması için uygunken, 1,0 ila 2,0 mg/L BAP içeren besin ortamında gövdeler daha kısa olmuştur. BAP’ın 3,0

(23)

11

mg/L’dan daha yüksek kullanılması sürgün sayısını olumlu etkilemiştir. Benzer şekilde, sıvı-katı çift katmanlı ortam da bitki büyümesini olumlu etkilemiştir. Nilüferlerden kallus oluşumu için besin ortamına 2,4-diklorofenoksiasetik asit ve TDZ ilave edilmiş ve genç embriyolardan başarılı şekilde kallus oluşumları da kaydedilmiştir.

Paul ve ark. (2019) BAP ile takviye edilmiş MS ortamında NAA'ın farklı kombinasyonlarının Cymbidium aloifolium (L.) Sw.'un in vitro çoğaltımı üzerine etkisini araştırmışlarıdır. Tohum çimlenmesi 0,5 mg/L BAP ve 0,5 mg/L NAA ile takviye edilmiş MS ortamında %98 olarak elde edilmiştir. 1,0 mg/L BAP ve 0,5 mg/L NAA içeren MS ortamında, sürgün ucu eksplantlarından maksimum sürgün sayısı 9,6 adet olarak belirlenmiştir. En etkili kök üretimi (sürgün başına 3,2 kök), 0,5 mg/L BAP + 1,0 mg /L IBA kombinasyonunda tespit edilmiştir. Dış koşullara alıştırılan bitkilerin hayatta kalma oranı %99 olarak kaydedilmiştir.

Rajput ve ark. (2019) Dendrocala musstrictus (Roxb.) Nees 'un boğum eksplantlarını çeşitli konsantrasyonlarda BAP içeren MS ortamında kültüre almışlardır. 4,0 mg/L BAP içeren kültür ortamında 4-5 sürgün oluşumu gözlenmiştir. Yeni oluşturulan tomurcuklar, sürgün elde etmek için farklıkombinasyonlarda BAP içeren (1,0-5 mg/L) + 0,5 mg/L NAA'lı ortama aktarılmıştır. En fazla sayıda sürgün 3,0 mg/L BAP ve 0,5 mg/L NAA içeren katılaşmış MS ortamında elde edilmiştir. Üç çeşit oksin (IBA, IAA ve NAA) sürgünlerin köklenmesi için çeşitli kombinasyonlarda kullanılmıştır. Yaklaşık %93'lük köklenme, 3,0 mg/L NAA'lı MS ortamında kaydedilmiştir. Köklü bitkiler, dış koşullara alıştırılmak için sera ve tarlaya aktarılmış ve başarılı şekilde büyümeleri gözlenmiştir. Bu bitki türlerinde doğal koşullar altında %90'dan fazla hayatta kalma kaydedilmiştir.

Singh ve Pandey (2019) Bergenia ciliata'nın yaprak eksplantlarını kullanarak etkili bir in vitro çoğaltma çalışması yürütmüşlerdir. Eksplant başına en fazla rejenere sürgün sayısı 5 μM BAP ve 5 μM IAA kombinasyonu ile desteklenmiş katı MS ortamında elde edilmiştir. %100 köklenme, sıvı MS ortamındaki 6 haftalık sürgünlerde gözlenmiştir. Bitkiler, serada dış koşullara %100 seviyesinde alıştırılmıştır.

(24)

12

Unal ve ark. (2019) önemli bir sucul süs bitkisi olan Cryptocoryne wendtii’nin etkin bir in vitro çoğaltımı ve iklimlendirmesi için protokol geliştirmişlerdir. En fazla sayıda sürgün 4,0 mg/L BAP + 1,0 mg/L IBA içeren MS ortamında elde edilmiştir. İkinci alt kültürde eksplant başına sürgün sayısı 7,2'den 51,8'e yükselmiştir. Eksplant başına sürgün uzunluğu köklenen sürgünlerin yüzdesi ve sürgün başına kök sayısı 1,0 mg/L IBA ile desteklenmiş MS ortamında maksimum çıkmıştır. İn vitro köksüz ve köklü sürgünler akvaryumlarda iklimlendirilmiştir.

Sonuç olarak bu çalışma kapsamında doku kültürü teknikleri ile S. repens'in çoklu üretimine ait kapsamlı bir rapor bulunamamıştır. Bu nedenle, S.repens 'in büyüme şartlarının in vitro koşullarda optimize edilmesi planlanmıştır. Böylece, mevsimsel şartlardan bağımsız ekonomik öneme sahip bu bitki ticari olarak üretilebilme yetisine sahip olabilabilecektir. Ayrıca bu alanda literatüre önemli bir katkı sunulacaktır.

(25)

13 3. MATERYAL VE METOT

3.1. Materyal

3.1.1. Deneme Yeri ve Bitki Materyali

Bu tez çalışması, Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi Kamil Özdağ Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için materyal olarak S. repens akvaryumculardan temin edilmiştir.

3.1.2. Besin Ortamı ve Doku Kültürü Koşulları

Çalışmalarda besin ortamı olarak MS (Murashige ve Skoog, 1962) mineral tuz ve vitaminleri kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Ayrıca besin ortamına %3 sükroz (Duchefa) içeren %0,65’lik agar (Duchefa) ile katılaştırılan temel besin ortamı kullanılmıştır. Farklı oranlarda sitokininler (BAP, TDZ, KIN) 0,25-1,50 mg/L tek olarak veya 0,25 mg/L IAA ile farklı oranlardaki kombinasyonlarında denemeler kurulmuştur. Besin ortamının pH’sı 1 N NaOH/KOH ya da 1 N HCl kullanılarak 5,7±1 ayarlandıktan sonra 1,2 atmosfer basınç altında 121°C’de 20 dakika tutularak steril edilmiştir. Kültürler sıcaklık ve ışık kontrollü iklimlendirme dolabında yerleştirilmiş ve altı hafta sonunda denemeler sonlandırılmıştır.

3.1.3. Bitkilerin Yüzey Sterilizasyonu

Bitki yüzey sterilizasyonundan önce üzerinde bulundurduğu yabancı atıklardan uzaklaştırmak için 30 dk akan çeşme suyu altında bekletilmiştir. Daha sonra en iyi sonucun alınacağı en düşük dezenfektan belirlenerek sterilizasyon çalışması başlatılır. Yüzey sterilizasyonu için farklı süre (10-30 dk) ve konsantrasyonlarda H2O2 (%3,7-7,4 v/v) kullanılarak yüzey sterilizasyonu denemeleri kurulmuştur. Sonrasında ise üç kez steril saf su ile beşer dakika bitkiler için durulama işlemi gerçekleştirilmiştir.

(26)

14

Çizelge 3-1 Murashige ve Skoog (1962) ortamında bulunan maddeler ve konsantrasyonları Ortamda Bulunan Maddeler Konsantrasyon (mg L-1)

Makro Elementler NH4NO3 1650,000 KNO3 1900,000 CaCI2.2H2O 440,000 MgSO4.7H2O 370,000 KH2PO4 170,000 Mikro Elementler KI 0,830 H3BO3 6,200 MnSO4.4H2O 22,300 ZnSO4.7H2O 8,600 Na2MoO4.2H2O 0,250 FeSO4.7H2O 27,850 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 Na2EDTA.2H2O 37,250 Vitaminler Myo-Inositol 100,000 Nicotinic Acid 0,500 Pyrotinic Acid 0,500 Thiamine-HCI 0,100 Glycine 2,000 3.1.4. Eksplant İzolasyonu ve Kültürü

Yüzey sterilizasyonu işlemi tamamlandıktan sonra bitkiden elde edilen sürgün ucundan sonraki 1. boğum ve 2. boğum eksplantları, içerisinde MS besin tuz ve minerallerini içeren kültür tüpleri içerisine yerleştirilmiştir. Sterilizasyonun başarıyla sağlandığı boğum eksplantları çoklu sürgün rejenerasyonu denemeleri için kullanılmıştır.

(27)

15 3.1.5. In vitro Köklendirme

Rejenerasyon çalışmaları neticesinde elde edilen sürgünler yaklaşık 3 cm uzunluğunda kesilmiştir. Ardından, içerisinde farklı oranda NAA ve IAA (0,25-1,0 mg/L) bulunan köklendirme ortamlarına aktarılmıştır. Köklendirme denemeleri dört hafta sonra sonlandırılmıştır.

3.1.6. Bitkilerin Dış Koşullara Alıştırılması

Kültür ortamlarından üretilen ve ardından köklendirilen bitkiler üzerindeki besin ortamı kalıntıları dikkatlice uzaklaştırılmış ve ardından dış koşullara alıştırılması için akvaryum ortamına transfer edilmiştir. Akvaryum tabanına 4-5 cm yüksekliğinde dere kumu yerleştirilmiş olup, 24ºC sıcaklık ayarlı termostat (Tetratec HT-100, 100W) ve 16 saat beyaz floresan (Roxin RX-500 12W) aydınlatma kullanılmıştır. Dört hafta sonunda bitkilerin durumu gözlenmiştir.

3.1.7. Verilerin Analizi

Denemeler tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmuş ve her muamele içerisinde 1 adet eksplantın bulunduğu altı tekrarlı cam tüpler kullanılmıştır. Elde edilen verilerin analizi SPSS 21.0 istatistik veri paketi aracılığı ile gerçekleştirilmiştir. Yüzde değerler, istatistik analizinden önce arcsin değerlerine çevrilmiştir (Snedecor ve Cochran, 1967).

(28)

16 4. BULGULAR

4.1. Yüzey Sterilizasyonu Çalışmaları

Bitkinin yüzey sterilizasyonu için bitkiler akan çeşme suyu içerisinde 30 dk bekletilmiştir. Ardından üst kısımları kesilerek (3-5 cm) farklı süre (10, 15, 20 ve 30 dk) ve konsantrasyonlarda (%3,7, 5,5 ve 7,4 v/v) H2O2 ile muamele edilmiştir (Çizelge 4-1). Bitki parçaları ardından 5 dk süre ve 3 tekrar ile steril saf su ile durulanmıştır. Sterilizasyon çalışmalarında boğum eksplantları kullanılmıştır. Eksplantlar deney tüplerine aktarılmıştır. Dört hafta sonunda da sterilizasyon için tüm değerler alınmıştır.

Çizelge 4-1 Farklı konsantrasyonlarda H2O2 ile muamale edilen S. repens’in boğum eksplanlarının yüzey sterilizasyonu verileri.

Hidrojen Peroksit (H2O2) Bulaşık Oranı (%) Steril ve Ölen Eksplant Oranı (%) Steril ve Canlı Eksplant Oranı (%) % Süre (dk) 3,7 10 100 - - 3,7 15 100 - - 3,7 20 85 10 5 3,7 30 75 20 5 5,5 10 100 - - 5,5 15 85 5 10 5,5 20 55 20 25 5,5 30 50 30 20 7,4 10 90 - 10 7,4 15 70 20 10 7,4 20 50 35 15 7,4 30 40 50 5

(29)

17

Kültür ortamında yer alan eksplantlar etrafında ilk bulaşıklar 5. günde gözlenmeye başlanmıştır. Bu kontaminasyonlar dört hafta sonunda daha da belirgin hale gelmiştir. Hatta bazı eksplantların etrafını ve üzerini sararak ölümüne sebep olmuştur. Genel olarak bakteriyel kontaminasyonlar gözlenmiş olup (Şekil 4.1a), fungal kontaminasyonlar da tespit edilmiştir (Şekil 4.1b). Uygulanan H2O2 konsantrasyonu ve uygulama süresi arttıkça bulaşık oranı azalmıştır. Bazı eksplantlar yüksek H2O2 konsantrasyonu ile zarar görmüş ve hatta ölmüştür.

H2O2 uygulaması sonucu tespit edilen kontaminasyon yüzdeleri oranları %40-100 arasında kaydedilmiştir. Maksimum kontaminasyon seviyeleri (%100) %3,7 H2O2 ile 10 dk ve 15 dk muamele edilen eksplantlarda gözlenmiştir. Genel olarak yüksek H2O2 ile muamele edilen kültürlerde tespit edilen kontaminasyon seviyesi düşük çıkmıştır. En az seviyede kontaminasyon (%40) %7,4 H2O2 ile 30 dk muamele edilen eksplantlarda saptanmıştır.

Kültür ortamında bazı eksplantlar steril olmasına rağmen, H2O2’nin olumsuz etkilerinden dolayı ölmüşür. Bu ölüm seviyeleri %0-50 arasında gerçekleşmiştir. En az ölüm seviyesi (%0) %3,7 H2O2 ile 10 ve 15 dk, %5,5 H2O2 ile 10 dk ve %7,4 H2O2 ile 10 dk muamale edilen ortamlarda elde edilmiştir. Ardından ise %5 ile %5,5 H2O2 ile 15 dk muamele edilen eksplantlarda belirlenmiştir.

Yüzey sterilizasyonu denemelerinde steril ve canlı eksplant seviyeleri %5-25 arasında tespit edilmiştir. En yüksek steril eksplantlar (%25) %5,5 H2O2 ile 20 dk etkileşimde bırakılan eksplantlarda elde edilmiştir (Şekil 4.1 c ve d). Ardından ise %20 ile %5,5 H2O2 ile 30 dk muamele edilen eksplantlarda kaydedilmiştir. Çoğaltım çalışmaları için bu ortamlarda steril edilen eksplantlardan çıkan sürgünler stoklanmış ve ardından eksplantlar izole edilerek kullanılmıştır.

(30)

18

Şekil 4-1 Yüzey sterilizasyonu amacıyla H2O2 ile farklı oran ve periyotlarda muamele edilen S. repens eksplantları. (a) eksplant üzerinde bakteriyel kontaminasyon (b) fungal kontaminasyon, (c,

(31)

19 4.2. In vitro Çoğaltım Çalışmaları

4.2.1. Farklı BAP Konsantrasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi

Bu denemede, S. repens’in boğum eksplantlarıin vitro sürgün rejenerasyonu için 0-1,50 mg/L BAP içeren MS besin ortamında altı hafta boyunca kültüre alınmıştır. İki hafta sonra sürgün gelişimi gözlenmeye başlamıştır. Altı hafta sonunda deneme sonlandırılmış (Şekil 4.2) ve sürgün rejenerasyon verileri alınarak varyans analizi uygulanmıştır (Çizelge 4.2).

Şekil 4-2 Farklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. Üç hafta (a) ve altı hafta sonunda (b,c) 1,25 mg/L BAP içeren kültür ortamında boğum eksplantlarından in vitro sürgün rejenerasyonları.

(32)

20

Çizelge 4-2 Farklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi.

Varyasyon

Kaynakları Serbestlik Derecesi

Sürgün Rejenerasyon

Yüzdesi (%)

Eksplant Başına Sürgün

Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm)

Kareler

Ortalaması değeri F Ortalaması Kareler değeri F

Kareler Ortalama F değeri Ortam 6 136,74 2,07ös 60,69 37,44** 0,35 16,42** Hata 14 66,16 - 1,62 - 0,02 - Genel Toplam 20 - - - -

** p<0,01 düzeyinde önemli; ös Önemsiz

Varyans analizi incelendiğinde (Çizelge 4-2) sürgün rejenerasyon oranı bakımından ortamlar istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur. Buna karşın, eksplantlarda eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasında p<0,01 düzeyinde anlamlı bir farklılık bulunmuş ve ardından Duncan testi uygulanmıştır (Çizelge 4-3).

Çizelge 4-3 Farklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi. BAP (mg/L) Sürgün Rejenerasyon Oranı (%) Eksplant Başına

Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) 0 83,33b 2,53e 0,98e 0,25 94,44ab 8,95d 1,08de 0,50 88,87ab 10,04d 1,47bc 0,75 100,00a 10,72cd 1,62b 1,00 100,00a 12,94bc 1,70ab

1,25 100,00a 16,11a 1,93a

1,50 100,00a 14,83ab 1,32cd

(33)

21

Çizelge 4-3’de görüldüğü gibi sürgün rejenerasyon oranı sürgün ucu eksplantında %83,33 ile %100,00 arasında kaydedilmiştir. Genel olarak yüksek sayıda sürgün rejenerasyon yüzdeleri elde edilmiştir. Düşük oranda BAP kullanımı sürgün rejenerasyon frekansını olumsuz etkilemiştir.

Eksplant başına sürgün sayısı 2,53-16,11 adet arasında sıralanmıştır (Çizelge 4-3). En fazla eksplant başına sürgün sayısı 16,11 adet ile 1,25 mg/L BAP içeren MS ortamında elde edirken, en az sayıda sürgün 2,53 adet ile kontrol grubu eksplantlarında tespit edilmiştir. BAP konsantrasyonlarının kültür ortamında yüksek kullanılması sürgün sayısı üzerinde olumlu etki göstermiştir.

Sürgün uzunlukları boğum eksplantlarında 0,98-1,93 cm arasında belirlenmiştir (Çizelge 4-3). En uzun sürgünler 1,93 cm ile 1,25 mg/L BAP içeren kültür ortamında, ardından ise 1,70 cm ile 1,0 mg/L BAP içeren kültür ortamında tespit edilmiştir. Kısa sürgün uzunlukları ise kontrol gubunda ve 0,25 mg/L BAP içeren MS besin ortamında kaydedilmiştir.

4.2.2. Farklı BAP+IAA Kombinasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi

Çoklu sürgün rejenerasyonu için S. repens’in boğum eksplantlaları 0,25 mg/L IAA ve 0,25-1,50 mg/L BAP eklenmiş kültür ortamında altı hafta süreyle kültüre alınmıştır. Altı hafta sonunda deneme sonlandırılmış (Şekil 4-3) ve sürgün rejenerasyon verileri alınarak varyans analizi uygulanmıştır (Çizelge 4-4).

(34)

22

Şekil 4-3 0,25 mg/L IAA vefarklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. Üç hafta (a) ve altı hafta sonunda (b) 1,50 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA içeren kültür ortamında boğum eksplantlarından in vitro sürgün rejenerasyonları.

(35)

23

Çizelge 4-4 0,25 mg/L IAA vefarklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi.

Varyasyon Kaynakları

Serbestlik Derecesi

Sürgün Rejenerasyon

Yüzdesi (%) Eksplant Başına Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) Kareler

Ortalaması F değeri Ortalaması Kareler F değeri Ortalaması Kareler F değeri

Ortam 5 395,22 5,12* 7,08 4,58* 0,23 4,69*

Hata 12 77,19 - 1,55 - 0,05 -

Genel

Toplam 17 - - - -

* p<0,05 düzeyinde önemli

Çizelge 4-4’de verilen varyans analizi incelendiğinde, sürgün rejenerasyon oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasında istatistiksel olarak p<0,05seviyesinde önemli bir farklılıkbulunmuş ve ardından Duncan testi uygulanmıştır (Çizelge 4-5).

Çizelge 4-5 0,25 mg/L IAA vefarklı BAP konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi.

Büyüme Düzenleyicileri (mg/L) Sürgün Rejenerasyon Oranı (%) Eksplant Başına Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) BAP IAA 0,25 0,25 77,77b 8,19c 1,18b 0,50 0,25 77,77b 8,62bc 1,27b 0,75 0,25 100,00a 9,00bc 1,28b

1,00 0,25 100,00a 10,99ab 1,48ab

1,25 0,25 100,00a 11,22ab 1,74a

1,50 0,25 100,00a 11,77a 1,87a

(36)

24

BAP+IAA içeren kültür ortamlarında sürgün rejenerasyon yüzdeleri %77,77 ile %100,00 arasında değişmiştir (Çizelge 4-5). Maksimum sürgün rejenerasyon yüzdesi (%100) 0,75-1,50 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA uygulaması ile tespit edilmiştir. Minimum sürgün rejenerasyon frekansı (%77,77) 0,25-0,50 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA uygulaması ile kaydedilmiştir.

Boğum eksplantlarından ortalama eksplant başına sürgün sayıları 8,19-11,77 adet arasında sıralanmıştır (Çizelge 4-5). En fazla eksplant başına sürgün sayısı (11,77 adet) 1,50 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında elde edilmiştir. Kültür ortamındaki BAP seviyesi arttıkça, sürgün sayısı da artış göstermiştir. En az sayıda sürgünler 0,25 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında saptanmıştır. Ortalama sürgün uzunlukları 1,18-1,87 cm arasında kaydedilmiştir (Çizelge 4-5). BAP+IAA içeren besin ortamlarında en uzun sürgünler 1,87 cm ile 1,50 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında tespit edilmiştir. Buna karşın en kısa sürgünler 1,18 cm ile 0,25 mg/L BAP + 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında bulunmuştur.

4.2.3. Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi

In vitro sürgün rejenerasyonuiçin S. repens’in boğum eksplantlaları 0-1,50 mg/L KIN içeren kültür ortamında altı hafta süre ile kültüre alınmıştır. Eksplantlar üzerinde iki hafta sonra sürgün çıkışları gözlenmeye başlanmıştır. Altı hafta sonunda deneme sonlandırılmış (Şekil 4-4a ve b) ve sürgün rejenerasyon verileri alınarak varyans analizi uygulanmıştır (Çizelge 4-6).

(37)

25

Şekil 4-4 Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. (a,b). Altı hafta sonunda 0,50 mg/L KIN içeren kültür ortamında boğum eksplantlarından in vitro sürgün rejenerasyonları.

Çizelge 4-6 Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi.

Varyasyon Kaynakları

Serbestlik Derecesi

Sürgün Rejenerasyon

Yüzdesi (%) Eksplant Başına Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) Kareler Ortalaması F değeri Kareler Ortalaması F değeri Kareler Ortalaması F değeri Ortam 6 198,49 3,75** 15,96 13,95** 1,17 36,90** Hata 14 52,93 - 1,14 - 0,03 - Genel Toplam 20 - - - -

(38)

26

Çizelge 4-6 incelendiğinde, sürgün rejenerasyon oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasında istatistiksel olarak p<0,01 seviyesinde önemli bir farklılık tespit edilmiştir. Bu farklılığın anlamlılık seviyeleri Duncan testi Çizelge 4-7’de verilmiştir.

Çizelge 4-7 Farklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi. KIN (mg/L) Sürgün Rejenerasyon Oranı (%) Eksplant Başına

Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) 0 77,77b 2,66d 1,03e 0,25 100,00a 7,16ab 1,69d 0,50 100,00a 10,27a 2,02c 0,75 100,00a 6,66ab 2,14bc 1,00 94,44a 6,38ab 2,41b

1,25 88,89ab 5,51ab 2,73a

1,50 94,44a 5,10c 2,82a

Aynı sütunda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasında fark p<0,05 düzeyinde önemlidir

Kültür ortamlarında sürgün rejenerasyon frekansı %77,77 ile %100,00 arasında sıralanmıştır (Çizelge4-7). En yüksek sürgün rejenerasyon frekansları (%100) 0,25, 0,50 ve 0,75 mg/L KIN içeren MS besin ortamında görülmüştür. En düşük sürgün rejenerasyon frekansı (%77,77) KIN içermeyen kültür ortamında belirlenmiştir.

Ortalama eksplant başına sürgün sayıları 2,66-10,27 adet arasında kaydedilmiştir (Çizelge 4-7). Maksimum sayıda rejenere sürgünler 0,50 mg/L KIN ilave edilmiş kültür ortamında, ardından ise 7,16 adet ile 0,25 mg/L KIN eklenmiş kültür ortamında elde edilmiştir. KIN içeren kültür ortamlarında en az sayıda sürgünler 1,50 mg/L KIN eklenmiş MS besin ortamında 5,10 adet olarak tespit edilmiştir.

(39)

27

Sürgün uzunlukları 1,03-2,82 cm arasında değişmiştir (Çizelge 4-7). Kültür ortamında tespit edilen en uzun sürgünler 2,82 cm ile 1,50 mg/L KIZ içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. Bununla beraber 1,25 mg/L ve 1,50 mg/L KIN içeren ortamdaki sürgünlerin uzunlukları istatistiksel olarak önemsiz çıkmıştır. En kısa sürgün uzunluğu 1,03 cm ile kontrol grubunda ardından ise 1,69 cm ile 0,25 mg/L KIN içeren MS besin ortamında tespit edilmiştir.

4.2.4. Farklı KIN + IAA Kombinasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi

Bu denemede, 0,25 mg/L IAA ve 0,25-1,50 mg/L KIN eklenmiş MS besin ortamında S. repens’in boğum eksplantlalarından in vitro çoğaltımı amaçlanmıştır. İkinci haftada eksplantlardan ilk rejenere sürgünlerin çıkışı gözlenmiştir. Altı hafta sonunda deneme sonlandırılmış (Şekil 4-5a ve b) ve sürgün rejenerasyon verileri alınarak varyans analizi yapılmıştır (Çizelge 4-8).

Şekil 4-5 0,25 mg/L IAA vefarklı KIN konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. (a,b) altı hafta sonunda 0,25 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA içeren kültür ortamında boğum eksplantlarından in vitro sürgün rejenerasyonları.

(40)

28

Çizelge 4-8 0,25 mg/L IAA vefarklı KIN dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi.

Varyasyon

Kaynakları Serbestlik Derecesi

Sürgün Rejenerasyon

Yüzdesi (%)

Eksplant Başına Sürgün

Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm)

Kareler Ortalamas ı F değeri Kareler Ortalaması F değeri Kareler Ortalaması F değeri Ortam 5 163,64 1,51ös 3,66 4,95** 0,24 9,76** Hata 12 108,07 - 0,74 - 0,02 - Genel Toplam 17 - - - -

** p<0,01 düzeyinde önemli ; ös Önemsiz

Varyans analizi incelendiğinde (Çizelge 4-8), sürgün rejenerasyon oranı istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur (p>0,05). Buna karşın, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasında istatistiksel olarak p<0,01 seviyesinde önemli bir farklılık bulunmuştur. Bu farklılığın anlamlılık seviyelerini belirlemek amacıyla Duncan testi Çizelge 4-9’de verilmiştir.

Çizelge 4-9 0,25 mg/L IAA vefarklı KIN dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi. Büyüme Düzenleyicileri (mg/L) Sürgün Rejenerasyon Oranı (%)ös Eksplant Başına

Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) KIN IAA 0,25 0,25 100,00 6,55a 1,76c 0,50 0,25 100,00 5,00b 1,88c 0,75 0,25 100,00 4,33b 2,04bc 1,00 0,25 100,00 3,55b 2,35a 1,25 0,25 88,89 4,41b 2,49a 1,50 0,25 83,33 3,63b 2,26ab

Aynı sütunda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasında fark p<0,05 düzeyinde önemlidir. ös Önemsiz

(41)

29

Kültür ortamlarında sürgün rejenerasyon yüzdeleri %83,33-100,00 arasında sıralanmıştır (Çizelge 4-9). En yüksek sürgün rejenerasyon yüzdesi (%100) 0,25-1,00 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA içeren MS besin ortamında elde edilirken, en düşük sürgün rejenerasyon frekansı (%83,33) 1,50 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA içeren MS besin ortamında elde edilmiştir.

Eksplant başına ortalama sürgün sayıları 3,63-6,55 adet arasında sıralanmıştır (Çizelge 4-9). Maksimum eksplant başına sürgün sayısı (6,55 adet) 0,25 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında elde edilmiştir. MS besin ortamında kullanılan KIN oranı azaldıkça, sürgün sayısı artış göstermiştir. En az sayıda sürgünler 1,50 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA içeren kültür ortamında belirlenmiştir.

Sürgün uzunlukları 1,76-2,49 cm arasında sıralanmıştır (Çizelge 4-9). Kültür ortamında en uzun sürgünler 2,49 cm ile 1,25 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA içeren MS besin ortamında, ardından ise 2,35 cm ile 1,00 mg/L KIN + 0,25 mg/L IAA eklenmiş kültür ortamında elde edilmiştir. Buna karşın, en kısa sürgünler 1,76 cm ile 0,25 mg/L KIZ + 0,25 mg/L IAA eklenmiş MS besin ortamında tespit edilmiştir.

4.2.5. Farklı TDZ Konsantrasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi

Yürütülen bu denemede, S. repens’in boğum eksplantlaları in vitro çoklu sürgün rejenerasyonu için 0-1,50 mg/L TDZ’li MS besin ortamında altı hafta boyunca kültüre alınmıştır. Üç hafta sonra sürgün gelişimi gözlenmeye başlamıştır. Altı hafta sonunda deneme sonlandırılmış (Şekil 4-6) ve sürgün rejenerasyon verileri alınarak varyans analizi uygulanmıştır (Çizelge 4-10).

(42)

30

Şekil 4-6 Farklı TDZ konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. Üç hafta (a) ve altı hafta sonunda (b) 1,50 mg/L TDZ içeren kültür ortamında boğum eksplantlarından in vitro sürgün rejenerasyonları.

Çizelge 4-10 Farklı TDZ dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonuna ait varyans analizi.

Varyasyon

Kaynakları Serbestlik Derecesi

Sürgün Rejenerasyon

Yüzdesi (%) Eksplant Başına Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) Kareler Ortalaması F değeri Kareler Ortalaması F değeri Kareler Ortalaması F değeri Ortam 6 330,82 2,50ös 71,49 12,85* * 0,28 8,58** Hata 14 132,33 - 5,56 - 0,03 - Genel Toplam 20 - - - -

** p<0,01 düzeyinde önemli; ös Önemsiz

Varyans analizi incelendiğinde (Çizelge 4-10) sürgün rejenerasyon oranı bakımından ortamlar istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur. Buna karşın, eksplantlarda eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasında p<0,01 düzeyinde anlamlı bir farklılık bulunmuştur. Bu farklılığın anlamlılık seviyeleriiçin Duncan testi uygulanmıştır (Çizelge 4-11).

(43)

31

Çizelge 4-11 Farklı TDZ dozlarının S. repens’in boğum eksplantlarında sürgün rejenerasyonuna etkisi. TDZ (mg/L) Sürgün Rejenerasyon Oranı (%)ös Eksplant Başına Sürgün Sayısı (adet) Sürgün Uzunluğu (cm) 0 77,77 2,42c 1,02ab 0,25 100,00 4,66c 1,15a 0,50 100,00 5,11c 0,80bc 0,75 77,77 6,15cd 0,65cd 1,00 83,33 9,59bc 0,56cd 1,25 77,77 13,68ab 0,39d 1,50 77,77 15,36a 0,35d

Aynı sütunda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasında fark p<0,05 düzeyinde önemlidir. ös Önemsiz

Çizelge 4-11’de görüldüğü gibi sürgün rejenerasyon oranı sürgün ucu eksplantında %77,77 ile %100,00 arasında sıralanmıştır. Yüksek seviyede TDZ kullanımı sürgün rejenerasyon derecesini düşürmüştür.

Eksplant başına sürgün sayısı 2,42-15,36 adet arasında sıralanmıştır (Çizelge 4-11). En fazla eksplant başına sürgün sayısı 15,36 adet ile 1,50 mg/L TDZ içeren MS ortamında, ardından ise 13,68 adet ile 1,25 mg/L TDZ içeren kültür ortamında belirlenmiştir. En az sayıda sürgünler 2,42 adet ile kontrol grubu eksplantlarında kaydedilmiştir. TDZ’nin MS besin ortamında artması sürgün sayısını olumlu etkilemiştir.

Sürgün uzunlukları boğum eksplantlarında 0,35-1,15 cm arasında belirlenmiştir (Çizelge 4-11). En uzun sürgünler 1,15 cm ile 0,25 mg/L TDZ’li kültür ortamında, ardından ise 1,02 cm ile kontrol grubu eksplantlarında elde edilmiştir. Kısa sürgün uzunlukları ise kontrol gubunda ve 1,50 mg/L TDZ içeren MS besin ortamında kaydedilmiştir.

(44)

32

4.2.6. Farklı TDZ+IAA Kombinasyonlarının S. repens’in Boğum Eksplantlarından Sürgün Rejenerasyonuna Etkisi

Sürgün rejenerasyonu için S. repens’in boğum eksplantlaları 0,25 mg/L IAA ve 0,25-1,50 mg/L TDZ ilave edilmiş MS besin ortamında altı hafta süre ile kültüre alınmıştır, Altı hafta sonunda deneme sonlandırılmış (Şekil 4-7) ve sürgün rejenerasyon verileri alınarak varyans analizi uygulanmıştır (Çizelge 4-12).

Şekil 4-7 0,25 mg/L IAA vefarklı TDZ konsantrasyonlarının S. repens’in boğum eksplantlarından sürgün rejenerasyonu. (a) altı hafta sonunda 1,0 mg/L TDZ + 0,25 mg/L IAA içeren kültür ortamında boğum eksplantlarından in vitro sürgün rejenerasyonları.

Şekil

Çizelge 3-1 Murashige ve Skoog (1962) ortamında bulunan maddeler ve konsantrasyonları
Çizelge  4-1  Farklı  konsantrasyonlarda  H 2 O 2  ile  muamale  edilen  S.  repens’in  boğum  eksplanlarının yüzey sterilizasyonu verileri
Şekil  4-1  Yüzey  sterilizasyonu  amacıyla  H 2 O 2   ile  farklı  oran  ve  periyotlarda  muamele  edilen  S
Şekil  4-2  Farklı  BAP  konsantrasyonlarının  S.  repens’in  boğum  eksplantlarından  sürgün  rejenerasyonu
+7

Referanslar

Benzer Belgeler

Akademik Birimler, Araştırma ve Uygulama Merkezleri, Bilim, Eği- tim, Sanat, Teknoloji, Girişimcilik, Yenilikçilik Kurulu (Gazi BEST), Araştırma-Geliştirme Kurum

* Ġthalat ve Ġhracat numunelerine ait ücretlendirme GIDA KONTROL LABORATUVAR MÜDÜRLÜKLERĠ DÖNER SERMAYE ĠġLETMELERĠ 2014 YILI BĠRĠM FĠYATLARI'na

ALOCORT;ani gelişen egzama alerjik ve temas nedenli deri iltihabı, zehirli (toksik) hücre bozulmasına neden egzama (dejeneratif egzama), yağlı egzama, madeni para

Öte yandan uluslararası piyasalarda i lem gören benzer irketlerin tarife yapılarının farklı olması, elektrik da ıtımı ve elektrik perakende faaliyetleri haricinde

P, (E) düzlemi içinde değişen bir nokta olduğuna göre AP  PB toplamı en küçük olduğunda P noktasının koordinatları aşağıda- kilerden hangisi

Tam Say›lar Kümesinde Modüle Göre, Kalan S›n›flar›n Özelikleri 1.1. Kalan S›n›flar Kümesinde Toplama ve Çarpma ‹flleminin

[r]

[r]