G‹R‹fi
Stafilokoklar, sistemik ve lokal bir çok infeksiyona neden olan ve son y›llarda baz› antimikrobial ajanla-ra dirençli hale gelmesi nedeniyle daha da önem ka-zanan bakterilerdir. Stafilokoklar›n identifikasyonu için gerek manuel ve gerekse de otomatize bir çok metod ticari olarak mevcuttur (1).
Çal›flmam›zda stafilokoklar›n identifikasyonunda, Microbial ID (MIDI, Newark,DE,USA) taraf›ndan üretilen, Mikrobiyal ‹dentifikasyon Sistem (M‹S)’den yararlan›lm›flt›r. Sistem türlere özgü olan tüm ya¤ asiti metil esterleri, dimetil asetil, aldehid gibi bileflikleri yüksek ayr›flt›rma özelli¤indeki gaz-s›v› kromatografisi vas›tas›yla tan›mlar. M‹S tam
Stafilokok Sufllar›n›n Gaz Kromatografi Metoduyla
Tan›m-lanmas› ve Antibiyotik Duyarl›l›klar› (*)
(*) XXX. Türk Mikrobiyoloji Kongresin’de (30 Eylül-05 Ekim, 2002 Antalya) sunulmufltur. (**) Atatürk Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Erzurum
Ekrem K‹REÇC‹(**), Ayfle Esin AKTAfi(**)
ÖZET
Bu çal›flmada, çeflitli klinik örneklerden izole edilen stafilokoklar gaz kromatografi metoduyla tan›mlanm›flt›r. Stafilokoklar›n identifikasyonunda mikroskobik deneyler ve çeflitli biyokimyasal testlerin klasik olarak uygulanmas› yan›nda birçok basit ti-cari sistemler ortaya konmufltur. Bu sistemler ya fenotipik ya da genotipik karakterizasyon esas›na göre uygulanmaktad›r. Ticari olarak mevcut olan bilgisayar destekli Mikrobiyal ‹dentifikasyon Sistem (M‹S), bakterilerin ya¤ asitlerini gaz kroma-tografi metoduyla analiz edilebilmektedir. Çal›flmada 54stafilokok suflunun identifikasyonu için M‹S kullan›lm›flt›r. ‹zole ve identifiye edilen stafilokok türlerinin antibiyotiklere duyarl›l›klar› disk difüzyon metoduyla araflt›r›lm›flt›r. Metsilin direnci koagülaz pozitif ve koagülaz negatif stafilokoklarda s›ras› ile 47.0-%40.5 olarak bulunmufltur. Metisiline dirençli stafilokok sufllar›n›n, metisiline duyarl› stafilokok sufllar›na göre antibiyotiklere daha dirençli olduklar› saptanm›flt›r. Sufllar›n tamam› vankomisine ve teikoplanine duyarl› bulunmufltur
Anahtar sözcükler: Staphylococcus, ya¤ asit analizi, M‹S, antibiyotiklere duyarl›l›k SUMMARY
Identification by Gase Chromatograhy Method and Antibiotic Susceptibilities of Staphylococcus Strains
In this study, staphylococci isolated from various clinical specimens were identified by gase chromatograhy method. While the classical method of identifying staphylococci relies on microscopic examination followed by a variety of biochemical tests, a number of commercial systems have been introduced to simplify the procedure. These systems operate by either phenotypic or genotipic characterization. A commercially available, computer-assisted microbial identification system (MIS) employs gas-liquid chromatographic analyses of bacterial fatty acids. In this study, the MIS was used to identify 54 isolates of Staph-ylococcus species were tested. Antibiotic susceptibilities of the strains were examined by disk diffusion method. Methicilline resistance were found to be 47.0% and 40.5% in coagulase positive and negative staphylococci, respectively. Methicillin-re-sistant Staphylococcus strains were found to be more reMethicillin-re-sistant to other antibiotics than methicillin-sensitive Staphylococcus strains. All Staphylococcus strains were susceptible to vancomycine and teicoplanin.
Key words: Staphylococcus, fatty acid analysis, MIS, antibiotics sensitivity
‹letiflim :: Ekrem Kireçci
iki dakika kadar buz içerisinde bekletilmifltir. Meti-lasyon basama¤› olarak bilinen bu safhada serbest ya¤ asitlerine ester ba¤lar› ile metil eklenmifl olur ve ya¤ asitlerinden ya¤ asit metil esterleri oluflur. Böy-lece ya¤ asit esterleri yüksek s›cakl›kta uçuculuk özelli¤i kazan›r.
Üçüncü basamakta so¤utulmufl tüplere 1.25 ml çö-zelti üç eklenerek 10 dakika çalkalanm›flt›r.Bu süre sonunda tüplerde iki faz oluflmufltur. Alt fazda asi-dik, üstte organik s›v› faz oluflup pastör pipeti ile dik-katli bir flekilde asidik faz at›lm›flt›r.
En son aflamada her tüpe 3 ml çözelti dört eklenmifl-tir. Befl dakika çalkalan›p, 10 dakika oda s›cakl›¤›n-da bekletilmifltir. Bazik y›kama denilen bu safhas›cakl›¤›n-da ya¤ asit metil esterleri daha saf olarak elde edilmifl-tir. Bekleme sonunda tüplerde oluflan iki faz›n üstte kalan› ya¤ asitlerinin saf metil esterleri olup bu alan-dan pastör pipeti ile 2ml gaz kromatografisi tüpleri-ne transfer edilmifltir. A¤›zlar› s›k›ca kapat›larak MIS cihaz› üzerindeki örnek depolama tepsisine dik-katli bir flekilde yerlefltirilmifltir.Sistem k›lavuzuna uygun flekilde tek tek analiz edilmifl ve CLIN40 kü-tüphanelerine göre sonuçlar› al›nm›flt›r (2,3,4). (Tab-lo 1)
Çözelti 1:Saponifikasyon ( Hücre parçalanmas› )
NaOH 45 gr Metil alkol 150 ml Saf su 150 ml Çözelti 2:Metilasyon HCl2 325 ml Metil alkol 275 ml Çözelti 3: Saflaflt›rma Hekzan 200 ml Meti-tert-butil eter 200 ml
Çözelti 4:Bazik y›kama
NaOH 10.8 gr Saf su 900ml otomatik bilgisayar destekli, h›zl› sonuç veren,
dü-flük maaliyetli olup laboratuvarda izole edilen bir çok mikroorganizman›n identifikasyonunda kullan›l-maktad›r (2,3).
Bu çal›flmada çeflitli klinik örneklerden izole edilen 54 stafilokok suflu M‹S ile tür düzeyinde tan›mlan-m›flt›r. Ayr›ca sufllar›n antibiyotik duyarl›l›klar› da incelenmifltir.
GEREÇ VE YÖNTEM
Stafilokok sufllar›. Atatürk Üniversitesi Araflt›rma Hastanesinde çeflitli servislerde yatan hastalardan la-boratuvar›m›za gönderilen 18'i kan, 12'si yara, 10'u idrar, yedisi vajen, dördü trakeal aspirat ve üçü bo-¤az kültüründen izole edilen ve infeksiyon etkeni olabilece¤i düflünülen toplam 54 stafilokok suflu in-celenmifltir. Sufllar, koloni morfolojisi, Gram boya-ma özelli¤i, katalaz , boya-mannitol ferboya-mantasyonu, novo-biocin duyarl›l›¤› ve koagülaz testleri ile tan›mlan-m›flt›r.
Kontrol suflu olarak Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcu.epidermidis ATCC 14990, Staphylococcu saprophyticus ATCC 15305 kullan›l-m›flt›r.
M‹S. M‹S sistemi dört ana parçadan oluflan ve bilgi-sayar kontrolünde çal›flan bir sistemdir. Bu ana par-çalar; 1-Gaz kromatografisi 2-Kromatografiyi besle-yen gaz tanklar› (hidrojen, azot ve hava) 3-Bilgisa-yar sistemi 4-Database'ler (Sherlock system softwa-re, library generation softwasoftwa-re, bakteri ve fungus için haz›rlanm›fl kütüphaneler) (2,3).
Tan›s›n› yapmak istedi¤imiz stafilokok izolatlar›n›n kanl› agar besiyerinde saf kültürlerinden, yine kanl› agar besiyerine ekim yap›larak 37 oC de 24 saat inkü-be edilmifltir. Daha sonra stafilokoklar›n ya¤ asiti metil esterlerinin izolasyonu ve saflaflt›r›lmas› için bir öze dolusu ( yaklafl›k 40 mg) izolat steril bir cam test tüpüne (5ml) aktar›larak a¤z› s›k›ca kapat›lm›fl-t›r. Her bir test tüpüne 1ml çözelti bir eklenmifltir, 5-10 saniye çalkalanm›flt›r ve 25 dakika süre ile 5-100oC lik s›cak su banyosunda inkübasyona b›rak›lm›flt›r. Bu ifllem ile canl› hücreler parçalan›p ya¤ asitlerinin serbest kalmas› sa¤lanm›flt›r.
‹kinci basamakta test tüplerine 2 ml çözelti iki eklen-mifltir. 5-10 sn çalkaland›ktan sonra 10 dk 80oC'de ve
Duyarl›l›k testleri, tan›mlanan bakterilerin antimik-robiyal ajanlara duyarl›l›klar› NCCLS kriterleri do¤-rultusunda disk difüzyon yöntemi ile araflt›r›l›p de-¤erlendirilmifltir (5).
BULGULAR
‹zole edilen toplam 54 stafilokok suflunun 17' si S.aureus, 23'ü S.epidermidis,3' ü S.hominis, 3'ü S.ureolyticus, 3 'ü S.warneri, 1' i S.kloosii, 1' i S.sap-rophyticus, 1' i S.simulans, 1'i S.arlettae, 1' i S.hae-molyticus, 1' i S.capitis olarak tan›mlanm›flt›r. S.au-reus ve KNS sufllar›n›n s›ras›, ile penisiline %0-%72.9’u, seftazidime %5.8-%64.8’i, ampisilin-sul-baktama %41.1-%94.5’i duyarl› bulunmufltur. Met-silin direnci koagülaz pozitif ve koagülaz negatif sta-filokoklarda s›ras› ile 47.0-%40.5 olarak bulunmufl-tur. Metisiline dirençli stafilokok sufllar›n›n, metisili-ne duyarl› stafilokok sufllar›na göre antibiyotiklere daha dirençli olduklar› saptanm›flt›r. Sufllar›n tamam› vankomisine ve teikoplanine duyarl› bulunmufltur (Tablo 2).
TARTIfiMA
Stafilokoklar›n tür düzeyinde tan›mlanmas› için kla-sik yöntemlerin yan›s›ra Mikrobiyal identifikasyon sistem gibi alternatif yöntemlerde mevcuttur. M‹S, stafilokoklar› ayn› gün tür düzeyinde tan›mlama ola-na¤› vermektedir (6).
Daha önce yap›lan bir araflt›rmada Stoakes ve ark. MIS'i, konvansiyonel ve di¤er ticari tekniklerle (API Staph-Ident, DMS Staph-Trac, Minitek, Pos ID panel) karfl›laflt›rm›fllar, MIS yöntemi ile 470 stafilokok su-flunun 413 ( % 87.8)' ünü do¤ru olarak isimlendirir-ken, 57 suflu ise isimlendirememifllerdir (6).Ayn› ça-l›flmada MIS'in stafilokoklar›n identifikasyonunda performans› yüksek alternatif bir yöntem oldu¤unu belirtilmifltir. Yine bir çal›flmada Kotilainen ve ark. koagülaz negatif sufllardan S.capitis, S.haemolyticus, S. warneri ve S.lugdunensis'i MIS ile isimlendirmifl-lerdir (7).
MIS ile tan›mlanan sufllar (n) S.aureus (17) S.epidermidis (23) S.hominis (3) S.ureolyticus (3) S.warneri (2) S.kloosii (1) S.saprophyticus (1) S.simulans (1) S.arlettae (1) S.haemolyticus (1) S.capitis (1) Penisilin Du* -15 3 3 1 1 -1 1 1 1 Di** 17 8 -1 -1 -Sefazolin Du 1 13 3 1 2 1 -1 1 1 1 Di 16 10 -2 -1 -Oksasilin Du 8 2 3 3 2 1 1 1 1 1 1 Di 9 21 -Amp./Sulb Du 7 21 3 3 2 1 1 1 1 1 1 Di 10 2 -Vankomisin Du 17 23 3 3 2 1 1 1 1 1 1 Di -Teikoplanin Du 17 23 3 3 2 1 1 1 1 1 1 Di
-Tablo 2. ‹dentifiye edilen stafilokok sufllar›n›n antibiyotik duyarl›l›klar› (n)
Behme ve ark (8) stafilokoklar›n tan›mlanmas›nda bi-yokimyasal testler ile ya¤ asiti analizine dayanan MIS’i karfl›laflt›rm›fllard›r. Çal›flmalar›nda her iki yön-temle de 35 stafilokok suflunun hepsini tan›mlam›fllar-d›r. Araflt›rmac›lar, tan›da ya¤ asit analizinin yan›s›-ra biyokimyasal test verilerinin de kullan›ld›¤›nda, her iki yöntemin birbirini destekleyici pratik bir sis-tem olabilece¤ini belirtmifllerdir. Çal›flmam›zda sufl-lar›n tiplendirilmesinde biyokimysal testler ile MIS karfl›laflt›r›lmam›flt›r. Ancak sufllar›n ilk izolasyo-nunda, koagülaz, mannitol fermentasyonu ve novo-biocin duyarl›l›¤› gibi klasik test sonuçlar› ile MIS identifikasyon sonuçlar› aras›nda paralellik görülmüfl-tür.
Stafilokoklarda 1950’li y›llarda penisilinin yan›s›ra eritromisin, tetrasiklin, streptomisin gibi o dönemde kullan›mda olan di¤er antibiyotiklere de direnç gelifl-mifltir. 1970’li y›llardan itibaren ise metisilin dirençli S.aureus (MRSA) sufllar› yayg›n olarak kullan›lan bir çok antibiyoti¤e dirençli hale gelmeye bafllam›flt›r ( 9).
Türkiye’de yap›lan çeflitli çal›flmalarda metisilin di-renci S.aureus sufllar›nda %43 ile %65 aras›nda, KNS’larda %44 ve %57 aras›ndaki oranlarda tespit edilmifltir (10-15). Avrupa’da hastane infeksiyonlar›-na yönelik bir prevalans çal›flmas›nda,10 ülkede top-lam 43 labotatuvardan gönderilen 7333 izolat›n %12.8’nin metisiline dirençli oldu¤u bildirilmifltir (16). Çal›flmam›zda S.aureus sufllar›n›n %47’si, KNS’lar›n %40.5’i metisiline dirençli bulunmufltur. Araflt›rmam›zda stafilokok sufllar›nda metisiline di-rençlilik oran›n›n, Avrupa’da elde edilen oranlardan yüksek oldu¤u, ancak Türkiye’de yap›lan çal›flmala-ra paçal›flmala-ralellik gösterdi¤i belirlenmifltir.Çal›flmam›zda stafilokok sufllar›n›n hiçbirinde vankomisin ve teikop-lanin direnci saptanamazken, S.aureus sufllar›nda di-¤er antibiyotiklere yüksek oranda direnç görülmüfltür. Sonuç olarak MIS’in tan›da kullan›ld›¤› çal›flmam›z-da bu yöntemin klasik yöntemlerden çal›flmam›z-daha h›zl› ve oldukça güvenilir sonuç vermesi nedeniyle tan›da yar-d›mc› bir yöntem olabilece¤i, ancak di¤er identifikas-yon teknikleri ile karfl›laflt›rmal› çal›flmalar yap›lmas› gerekti¤i kan›s›na var›lm›flt›r.
TEfiEKKÜR
Bu çal›flmam›z› destekleyen Atatürk Üniversitesi Bi-yoteknoloji Araflt›rma Laboratuar› çal›flanlar›na
te-flekkür ederiz. KAYNAKLAR
1. Murray P, Rosenthal KS, Kobayash› GS,Pfaller M.A: Medical Microbiology. p 175-180, 3. bask›, Mosby Co, New York, (1998).
2. Onderdonk, A.B, Sasser, M:Gas-liquid and high-per-formance liquid chromatographic methods for the identifi-cation of microorganisms. “E.J. Baron, P.R. Murray, M.A. Pfaller, F.C. Tenovar, R.H.Yolken (eds): Manual of Clini-cal Microbiology”, p123-129, 6. bask›, Washington D.C. (1995).
3. Miller I, Berger T:Bacteria identification by gase chro-matograhy of whole cell fatty acids. Hawlett-Packard gase chromatograhy application note, Hawlett-Packard Co., Al-to, CA,8, (1985).
4. Buyer, S.J:Identification of bacteria from single coloni-es by fatty acid ananlysis. J Mic Meth, 48: 259 (2002). 5. National Committee For Clinical Labotaory Stan-dars: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibi-lity Testing; Ninth Informational Supplement. NCCLS do-cument M100-S9, Wayne,Pennsylvania USA (1999). 6. Stoakes L, John A,M., Lannigan R., Ramos M: Gas-li-quid chromatography of cellular fatty acids for identificati-on of staphylococci. J Clin Mic 32:1908 (1994).
7. Kotilainen, P., Huovinen, P., Eerola, E:Application of gas-liquid chromatograph analysis of cellular fatty acids for species identification and typing of coagulase-negatif staphylococci. J Clin Microbiol 29:315 (1991).
8. Behme, R.J., Shuttleworth, R., McNabb, A. &Colby, W.D:Identification of staphylococci with a self-educating system using fatty acid analysis and biochemical tests. J Clin Microbiol 34 (Suppl 1):3075 (1996).
9. Çetinkaya Y, Ünal S:Metisilin dirençli S.aureus infek-siyonlar›:Epidemiyoloji ve kontrol. Flora (1996).
10. Arslan H, Tunçbilek S, Nazl›er S:Nozokomiyal infek-siyonu olarak izole edilen stafilokoklarda glikopeptid anti-biyotiklerin in vitro etkinli¤i.‹nfeks Derg12:347 (1998). 11. De¤erli K, Özbakkalo¤lu B, Sürücüo¤lu S, Sezgin C, Kurutepe S: Klinik örneklerden soyutlanan Staphylococ-cus aureus sufllar›n›n çeflitli antimikrobiklere duyarl›l›klar›. ‹nfeks Derg 14:87 (2000).
12. Özgünç D, Vural T, Çolak T, Gültekin M, Mutlu G: Klinik örneklerden izole edilen metisiline dirençli koagülaz negatif stafilokok sufllar›n›n antibiyotiklere direnç
özellikle-ri. ‹nfeks Derg 12:157 (1998).
13. Songür M, Sayan M, Yüce A, Yulu¤ N: Staphylococ-cus aureus’a karfl› vankomisin ve trimetoprim-sulfametok-sazol etkinli¤inin karfl›laflt›r›lmas›. ‹nfeks Derg 12:39 (1998).
14. Türk Ar›bafl E, Özcan M, Alt›ndifl M:Klinik örnek-lerden izole edilen stafilokoklar›n antibiyotik direnç
oran-lar›. ‹nfeks Derg 15:73 (2001).
15. Vardar Ünlü G, Ünlü M:Yara örneklerinden soyutla-nan Staphylococcus aureus kökenlerinin glikopeptid antibi-yotiklere duyarl›l›¤›. ‹nfek Derg 15:239 (2001).
16. Voss A, Milatovic D, Wallrauch-Schwarz , Roshdal VT, Braney I:Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13:50 (1994).
