92
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33: 92-95
Salmonella typhimurium’a Dirençli Farelerin Peritoneal
Makrofajlar›nda Akut Faz Apoptoz-Nekroz Yan›tlar›n›n
De¤erlendirilmesi
Hüseyin BASKIN (*), Yasemin BASKIN (**), Yavuz DO⁄AN (*), ‹. Hakk› BAHAR (*)
ÖZET
Salmonella typhimurium’ un hücre içinde oluflturdu¤u infeksiyonun patogenezinin aç›klanabilmesi, bir çok etkenin hücre içi infeksiyonunun patogenezinin de aç›klanmas›nda yard›mc› olabilir. Fare peritoneal makrofajlar›nda haz›rlanan hücre içi in-feksiyon modeli özellikle ülkemiz araflt›rma koflullar›nda “düflük maliyetli”, ancak bir “nifl” oluflturabilecek çal›flmalar yara-tabilir, hatta yurt d›fl›ndaki araflt›rma kurulufllar› ile iflbirli¤i koflullar› da oluflturabilir. Bu çal›flmada Salmonella typhimuri-um’ a karfl› dirençli oldu¤u bilinen C57/BL farelerin peritoneal makrofajlar› hücre kültürü koflullar›nda infekte edilmifl ve Ho-echst 33342 ve propidium iodide boyalar› ile hücrelerin apoptoz yan›tlar› de¤erlendirilmifltir. Sonuç olarak C57/BL farelerin oluflturdu¤u apoptoz yan›t›n›n “nekrotik” do¤ada oldu¤u sonucuna var›lm›flt›r.
Anahtar Kelimeler: C57/BL, apoptoz, nitrik oksit, Salmonella typhimurium, nekroz SUMMARY
Evaluation of Acute Phase Apoptosis-Necrosis Responses in Peritoneal Macrophages of Mice Resistant to Salmonella typhimurium
P robable explanations of the pathogenesis of intracellular infections of Salmonella typhimurium can be of help for the exp-lanations of other intracellular pathogenes’ s infections. Studies on these intracellular infection models with mouse peritone-al macrophages may be useful in establishing “low cost” research areas, and may support probable studies which can be de-fined as “niches”, especially in our country research conditions, and even may be helpful to build up collaberative research studies with foreign research laboratories. In this sudy, peritoneal macrophages of C57/BL mice which is known to be resis-tant to Salmonella typhimurium, were infected with Salmonella typhimurium, and apoptosis responses were evaluated by Ho-echst 33342 and propidium iodide dyes. As a result, we may say that the nature of the “resistant” response of C57/BL is mostly of “necrotic” origin.
Key Words: C57/BL, apoptosis, nitric oxide, Salmonella typhimurium, necrosis
G‹R‹fi
Fizyolojik hücre ölümü, konak genomu taraf›ndan kodlanan proteinlerle yönlendirilen bir mekanizmay-la, bir organizma içindeki bir hücre öldü¤ünde orta-ya ç›kar. Bu sürecin amac›, istenmeyen konak hücre-lerini öldürmektir. Öldürme süreci üç amaçla ortaya ç›kar: 1. Geliflme ve homeostaz için, 2. Savunma me-kanizmas› olarak, 3. Yafllanma için (1). Tek hücreli canl›larda ise, çok hücrelilere benzer bir yafllanma veya ölüm süreci oldu¤u flimdiye kadar bilinmese de, son zamanlarda yap›lan çal›flmalarda tek hücreli canl›lar›n kendi nesillerinin yaflam›n› sürdürmesi
le-hine intihar edebildiklerini bildiren çal›flmalar art-maktad›r (2).
Hücre içi bir bakteri olan Salmonella typhimurium’ un apoptozla iliflkileri de son derecede ilgi çekicidir. Bu bakterilerin apoptoza neden olabilmesi için inva-zif olmalar› gerekti¤i ileri sürülmüfltür (3). Ancak bir baflka çal›flmada da, makrofajlar›n invazif etkenlerle de¤il, ekzojen etkenlerle apoptoza gitti¤i ileri sürül-müfltür (4).
S. typhimurium infeksiyonuna dirençte nitrik oksid (NO) üretiminin rolü bilinmektedir (5), C57BL fare-(*) Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹zmir.
93 lerin bakteri ile infeksiyonunda yüksek NO yan›t›
el-de edilmifl (6), ayr›ca alkol al›m›n›n C57BL fareler-de S. typhimurium infeksiyonuna direnci düflürdü¤ü tespit edilmifltir (7). BALB/c farelerin ise S. typhi-murium infeksiyonuna duyarl› oldu¤u bilinmektedir (8). Literatürde dirençli farelerin apoptozla iliflkileri ele al›nmam›flt›r. Bu çal›flmada S. typhimurium in-feksiyonuna dirençli farelerin bu özelliklerinin apop-tozla iliflkisi sorgulanacakt›r.
GEREÇ ve YÖNTEM
Sufl: Salmonella typhimurium, KUEN 1357, S1-28-9. ‹stanbul T›p Fakültesi, Mikroorganizma Kültür Koleksiyonlar› Araflt›rma ve Uygulama Merkezi’ nden sa¤lanm›flt›r. Kültürler infekte edilmeden önce bakteriler, optimal üreme konumuna ulaflmalar› için, Luria-Bertoni Medium (LBM: Bacto Tryptone 10.0 gr, yeast extract 5.0 gr, NaCl 5.0 gr, Bacto agar 15.0 gr, Deionize su 800 mL)’ da bir gece 37°C’ de inkü-be edilmifllerdir.
F a reler: Dokuz Eylül Üniversitesi, T›p Fakültesi, Multidisiplin Laboratuvar›, Deney Hayvanlar› Mer-kezi’ nden sa¤lanan BALB/c ve C57 fareler çal›flma-da kullan›lm›flt›r. Çal›flmaya yaln›zca 8-12 haftal›k difli fareler al›nm›flt›r.
Peritoneal makrofajlar›n eldesi: Çal›flmalarda uya-r›lmam›fl, do¤al halde elde edilen makrofajlar kulla-n›lm›flt›r. BALB/c ve C57 fareler aras›ndaki direnç farkl›l›klar›n› göstermek için, 96’ l›k pleyt çal›flmala-r›na paralel gidecek flekilde BALB/c fareler de kat›l-m›flt›r. Makrofajlar›n eldesi Ellerman-Eriksen ve ark (9), tan›mlad›¤› flekilde yap›lm›flt›r, Fareler usulüne uygun olarak servikal dislokasyonla öldürüldükten sonra, s›rtüstü yat›r›larak ekstre-mitelerinden i¤ne-lenmifltir. Kar›n derisi alkolle silindikten sonra steril makasla kar›n bofllu¤u aç›larak, % 5 fetal calf serum (FCS) lu-heparinli (0, 4 mL/100 mL)-steril fosfatla tamponlanm›fl tuzlu suyla (PBS) periton bofllu¤u y›-kanm›fl ve makrofajlar uygun koflullarda laboratuar ortam›na al›nm›flt›r. Makrofajlar steril koflullarda % 5’ lik FCS’ lu RPMI-1640 (10. 000 U/mL Penisi-lin+10 mg/mL Streptomisin) ile y›kanarak say›mlar› yap›lm›fl ve 2x106/mL olacak flekilde 24 gözlü pleyt-lere lamellerin üzerine da¤›t›mlar› yap›lm›fl, daha sonra 37°C ve % 5 CO2’ li ortamda bir gecelik
kon-trol inkübasyonlar› yap›lm›flt›r. Ertesi gün M.O.I (multiplicity of infection) 1:1 olacak flekilde hücreler 60 dakika 37°C, % 5 CO2’ li ortamda infekte edil-mifl, sürenin sonunda 200 mg/mL gentamisinli RPMI-1640 ile çukurlar 3 kez y›kanm›fl, böylece hücre d›fl›ndaki bakteriler öldürülmüfltür. Bir çok ça-l›flma bu antibiyoti¤in hücre içi bakterilerin üremesi-ni engellemedi¤iüremesi-ni göstermifltir (10) Bu aflamadan sonra makrofajlar›n 100 mg/mL gentamisin içeren RPMI-1640 ile 37°C, % 5 CO2’ li ortamda inkübas-yonu sürdürülmüfltür.
Apoptozun de¤erlendirilmesi: Deneylerde 24 saat-lik sonuçlar de¤erlendirilmifltir. Deneylerde C57 fa-relerin makrofajlar›nda oluflacak olas› apoptoz-nek-roz, Hoechst 33342 (HOE) ve propidium iodide (PI) boyalar› ile saptanm›flt›r (11). Yöntem k›saca flöyle-dir: Hücreler 15 dakika 37°C’ de HOE ile inkübe edilmifl (5 mg/mL, PBS’ te). Süre sonunda hücreler s›cak PBS ile y›kand›ktan sonra hemen PI (1mg/mL PBS’ te) ile boyan›p, lamel pleytten kald›r›lm›fl ve la-ma kapat›l›p floresan mikroskopta (Jena Lula-mar, Carl Zeiss Jena, Germany) (eksitasyon dalga boyu 330-380; engelleme filtresi: 420 nm) apoptoza giren-nek-roza giren hücreler de¤erlen-dirilmifltir.
Boya bize canl› hücreleri (normal çekirdek); mem-brana yap›fl›k apoptotik hücreleri (parlak mavi kro-matin); membran-geçirgen apoptotik hücreleri (par-lak k›rm›z› kromatin); nekrotik hücreleri (k›rm›z›, büyümüfl çekirdek); piknotik/nekrotik hücreleri (par-lak k›rm›z›-parçal› çekirdek) görüntüleyebimektedir. Bu boyayla hücreler say›larak indeks ç›kar›lm›fl ve hücrelerin apoptoza m› / nekroza m› gitti¤i sorusuna yan›t bulunmaya çal›fl›lm›flt›r.
Bakterilerin hücre içi yerlefliminin de¤erlen-diril-mesi: Benzer koflullarda 96’ l›k pleytlerde haz›rlan-m›fl makrofaj kültürlerindeki (5x105) bakteriler de (M.O.I 1:1), ayn› sürelerde inkübe edilmifl ve 24 saa-tin sonunda, makrofajlar›n steril distile suyla patlat›l-mas›ndan sonra LB besiyerine koloni ekimi yap›la-rak 37°C’ de CFU (colony forming unit) cinsinden oluflumlar› de¤erlendi-rilmifltir.
BULGULAR
LBM’ de yap›lan CFU de¤erlendirmelerinde 24 saat sonunda, BALB/c farelerin peritoneal makro-fajla-H. Bask›n ve ark., Salmonella typhimurium’a Dirençli Farelerin Peritoneal Makrofajlar›nda Akut Faz Apoptoz-Nekroz Yan›tlar›n›n De¤erlendirilmesi
Türk Mikrobiyol Cem Derg 33:92-95
94
r›nda (3x104bakteri/mL) ve C57 farelerin peritoneal makrofajlar›ndaki (3x103 bakteri/mL) bakterilerin üremelerinde farkl›l›k görülmektedir (fiekil 1). M.O.I 1:1 ile infekte edilmifl makrofajlar›n apoptoz-nekroz oranlar› fiekil 2’ de sunuldu¤u gibidir. Yirmi dört saat sonunda dirençli olan hücrelerde “% ölüm indeksi” nekroza e¤ilimli bulunmufltur (% 25 apop-toz - % 75 nekroz).
TARTIfiMA
S. typhimurium insanlarda s›n›rl› bir gastroenterit ya-parken, farelerde tifo benzeri sistemik bir hastal›¤a neden olur. S. typhimurium kültür ortam›nda karfl›-laflt›klar› duyarl› hücrelerin membranlar›n› bozarak hücre içine girerler (10).
Çal›flmam›zda BALB/c ve C57 farelerde ilk 24 saat
boyunca, hücre içindeki bakteri üremeleri aras›nda anlaml› fark görülmüfltür. Bu fark direnç-duyarl›l›k paternleri aras›ndaki fark› yans›tmaktad›r.
S. typhimurium’ a dirençli farelerin makrofajlar›nda 24 saatte oluflan apoptoz-nekroz indeksinin, nekroz lehine oldu¤u gözlenmifltir. S. typhimurium’ a di-rençli olan C57 farelerin 24 saat içinde BALB/c fa-relere oranla, hücre içine daha az bakteri ald›klar›, bu süreç boyunca da “nekroz” un ön planda oldu¤u gö-rülmüfltür.
Hücre içine girifli s›ras›nda S. typhimurium, hücre içi kalsiyum düzeyleri, fosfolipaz A2 aktivitesi ve lö-kotrien üretimi gibi ikincil mesajc›lar›n art›fl›n›, pro-tein kinaz art›fl›n› tetikler. ‹kincil mesajc›lar prog-ramlanm›fl hücre ölümünün (apoptoz) aktivasyonun-da rol oynayabilir (1). Bu bulgular elde etti¤imiz so-nuçlarda, “nekroz” un ön planda oluflunu destekler niteliktedir.
Bu deneysel modellerle yap›lan çal›flmalar araflt›r-mac›ya hem infeksiyon modelini ayr›nt›s›yla tasarla-ma flans› tan›tasarla-makta hem de infeksiyon etkenlerinin patojenitelerini tan›mlama flans› yan›nda, ayn› za-manda ba¤›fl›kl›k sisteminin çal›flma koflullar› hak-k›nda karfl›l›kl› bilgi verebilmektedir.
Bundan sonraki deneylerde, S. typhimurium’ a di-rençli ve duyarl› farelerin apoptoz-nekroz yan›tlar›-n›n karfl›laflt›r›lmas› ve bu yan›tlara efllik eden olas› yolaklar› (pathway) irdelemeye çal›flaca¤›z.
KAYNAKLAR
1. Vaux DL and Strasser A: The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2239 (1996). 2. Shub DA: Bacterial viruses. Bacterial altruism?. Curr Biol 6: 555(1994).
3. Monack MD, Raupach B, Hromockyj EA and Fal-kow S: Salmonella typhimurium invasion induces apopto-sis in infected macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 93: 9833 (1996).
4. Mohr S, McCormick ST and Lapetina GE: Macrop-hages resistant to endogenously generated nitric oxide-me-diated apoptosis are sensitive to exogenously added nitric oxide donors: Dichotomous apoptotic response indepen-dent of caspase 3 and reversal by the mitogen-activated protein kinase kinase (MEK) inhibitor PD 098059. Proc Natl Acad Sci USA 95: 5045 (1998).
5. Shiloh UM, Nathan FC: Reactive nitrogen
intermedia-aaaa 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 Bakteri say›s› C 57 BALB/C
fiekil 1.Salmonella typhimurium’a dirençli (C57) ve duyarl› (BALB/c) farelerde 24 saat sonundaki hücre içi bakteri üremeleri
Apoptoz Nekroz aaaa 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Hücreler in ölüm indeksi (%)
fiekil 2.Salmonella typhimurium’a dirençli (C57) farelerde 24 saat sonundaki oluflan apoptoz-nekroz ölüm indeksi(%).
95
tes and the pathogenesis of Salmonella and Mycobacteria. Curr Opin Microbiol 3:35 (2000).
6. Schwacha GM, Meissler JJ, Jr, and Eisenstein KT: Salmonella typhimurium infection in mice induces nitric-oxide mediated immunosupression through a natural killer cell-dependent pathway. Infect Immun 66:5862 (1998). 7. Sibley D, Jerrels RT: Alcohol consumption by C57BL/6 mice is associated with depletion of lymphoid cells from the gut-associated lymphoid tissues and altered resistance to oral infections with Salmonella typhimurium. J. Infect Diseas 182:482 (2000).
8. Mastroeni P, Harrison JA, Chabalgoiti JA, Horma-eche CE: Effect of interleukin-12 neutralization on host resistance and gamma interferon production in mouse typhoid. Infect Immun 64:189 (1996).
9. Ellerman-Eriksen S, Liberto CM, Ianello D, Mogen-sen SC: X-linkage of the early in vitro gamma/beta inter-feron response of mouse peritoneal macrophages to HSV type 2. J Gen Virol 67: 1025 (1986).
10. Gahring CL, Heffron F, Finlay BB, Falkow S: Inva-sion and replication of Salmonella typhimurium in animal cells. Infect Immun 58:443 (1990).
11. Lee Y-J, Shacter E : Bcl-2 does not protect Burkitt’ s lyphoma cells from oxidant-induced cell death. Blood 12: 4480 (1997)..
H. Bask›n ve ark., Salmonella typhimurium’a Dirençli Farelerin Peritoneal Makrofajlar›nda Akut Faz Apoptoz-Nekroz Yan›tlar›n›n De¤erlendirilmesi
