FIRAT ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
HAYVAN BESLEME VE BESLENME
HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
BAKIR SÜLFAT TOKSİSİTESİ OLUŞTURULAN RATLARDA KRİSİN VE FLUNİKSİN MEGLUMİNİN
YEM TÜKETİMİ, CANLI AĞIRLIK, ANTİOKSİDAN DURUM, BAZI KAN VE YANGI PARAMETRELERİ
ÜZERİNE ETKİLERİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
HAKAN GÜLLÜOĞLU
Kendime ait çalışmalar ile bu tez çalışmasını gerçekleştirdiğimi, çalışmaların planlanmasından, bulgularının elde edilmesine ve yazım aşamasına kadar tüm aşamalarında etiğe aykırı davranışım olmadığını, bu tezdeki tüm bilgileri ve verileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışması içinde yer alan ancak bu tez çalışmasının bulguları arasında yer almayan verilere, bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi beyan ederim.
Prof.Dr. Pınar TATLI SEVEN Danışman
Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı ELAZIĞ
TEŞEKKÜR
Tez çalışmasının planlanması, yürütülmesi ve gerçekleştirilmesinde değerli bilgilerini benimle paylaşan, sonuçların değerlendirilmesi ve yazım aşamasında bana büyük katkılar sağlayan kıymetli tez danışmanım Sayın Prof.Dr. Pınar TATLI SEVEN hocama teşekkürü bir borç bilirim.
Bu tez çalışmasında benden yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen Sayın Prof.Dr. Kazım ŞAHİN, Sayın Prof.Dr. Talat GÜLER, Sayın Prof.Dr. Nurhan ŞAHİN, Sayın Prof.Dr. Mehmet ÇİFTÇİ, Sayın Doç.Dr. Cemal ORHAN, Sayın Arş.Gör.Dr. Seda İFLAZOĞLU MUTLU hocalarıma saygı ve şükranlarımı sunarım. Bu tez çalışmanın uygulama ve analizlerin de destek aldığım Sayın Doç.Dr. İsmail SEVEN, Sayın Dr.Öğr.Üyesi Burcu GÜL BAYKALIR, Sayın Dr.Öğr.Üyesi Tuba PARLAK AK ve Sayın Arş.Gör.Dr. Neşe BAŞAK TÜRKMEN’e teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
BAŞLIK SAYFASI i
ONAY SAYFASI ii
ETİK BEYAN iii
TEŞEKKÜR v İÇİNDEKİLER vi TABLOLAR LİSTESİ ix ŞEKİLLER LİSTESİ x ÖZET 1 ABSTRACT 2 1. GİRİŞ 3 1.1. Bakır (Cu) 3
1.2. Bakır ve Oksidatif Stres Oluşumu 5
1.3. Krisin 8
1.4. Fluniksin Meglumin 9
1.5. Serbest Radikaller 11
1.6. Antioksidan Savunma Sistemleri 11
1.6.1. Malondialdehid (MDA) 12
1.6.2. Katalaz (CAT) 13
1.6.3. Super Oksit Dismutaz (SOD) 13
1.6.4. Redükte Glutatyon (GSH) 14
2. GEREÇ ve YÖNTEM 15
2.1. GEREÇ 15
2.1.2. Yem 15
2.2. YÖNTEM 16
2.2.1. Deneme Düzeni 16
2.2.2. Işıklandırma 17
2.2.3. Grupların Yem Tüketiminin (YT) Belirlenmesi 17 2.2.4. Canlı Ağırlık ve Canlı Ağırlık Değişimlerinin Belirlenmesi 17
2.2.5. Ölüm Oranının Belirlenmesi 17
2.2.6. Analitik İşlemler 17
2.2.6.2. Kan ve Doku Analizleri 17
2.2.6.2.1. Kan Analizleri 18
2.2.6.2.2. Doku Analizleri 18
2.2.6.2.2.2. Katalaz (CAT) Aktivitesi Tayini 18 2.2.6.2.2.3. Redükte Glutatyon (GSH) Tayini 19
2.2.6.2.2.4. Doku SOD Tayini 19
2.2.6.2.2.5. TNF-α Analizi 19
2.2.6.2.2.6. Histopatolojik Değerlendirmeler 19
2.2.6.3. İstatistik Analizler: 21
3. BULGULAR 22
3.1. Grupların Yem Tüketimi Değerleri 22
3.2. Gruplarının Canlı Ağırlık Ortalamaları 22 3.3. Gruplarının Canlı Ağırlık Değişimleri 22 3.4. Grupların Bazı Biyokimyasal Parametre Değerleri 24 3.5. Grupların Böbrek ve Karaciğer Dokularındaki MDA Düzeyleri ile GSH,
3.6. Grupların Plazma TNF-α Düzeyleri 27 3.7. Grupların Işık Mikroskobik Bulguları 27
3.7.1. Kontrol Grubu 27
3.7.2. Bakır Grubu 28
3.7.3. Fluniksin Meglümin Grubu 35
3.7.4. Krisin Grubu 36
3.7.5. Bakır-Fluniksin Meglümin Grubu 37
3.7.6. Bakır-Krisin Grubu 41
4. TARTIŞMA 46
4.1. Performans 46
4.2. Grupların Bazı Biyokimyasal Parametre Değerleri 48 4.3. Araştırma Gruplarının Böbrek ve Karaciğer Dokularındaki MDA Düzeyleri
ile GSH, SOD ve CAT Aktiviteleri 50
5. SONUÇ 56
6. KAYNAKLAR 57
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 1: Kullanılan yemin besin madde bileşimi ... 15 Tablo 2: Deneme gruplarının performans parametreleri üzerine etkileri ... 21 Tablo 3: Deneme gruplarının kan parametreleri üzerine fluniksin ve krisin’in
etkileri ... 25 Tablo 4: Deneme gruplarının karaciğer dokusundaki MDA (µg/ml homojenat)
düzeyleri ile GSH (nmol/mg protein) SOD (U/ml) ve CAT (k/g protein) aktiviteleri ... 26 Tablo 5: Deneme gruplarının böbrek dokusundaki MDA (µg/ml homojenat)
düzeyleri ile GSH (nmol/mg protein). SOD (U/ml) ve CAT (k/g protein) aktiviteleri ... 26 Tablo 6: Deneme gruplarının plazma TNF-α (pg/ml) düzeyleri ... 27
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1: Kontrol grubu normal karaciğer görünümü, H&E... 28 Şekil 2: Kontrol grubu normal böbrek görünümü, H&E. ... 28 Şekil 3: Kontrol grubu normal karaciğer görünümü, Kaspaz. ... 28 Şekil 5: Bakır grubu karaciğerde sentrilobuler hepatosellüler dejenerasyon ve
nekrotik hücreler (oklar), H&E. ... 30 Şekil 6: Bakır grubu karaciğerde hepatositte karyomegali (kalın ok) ve karyolitik
çekirdekli fokal nekroz alanları (ince oklar), H&E. ... 30 Şekil 7: Bakır grubu karaciğerde çift çekirdekli hepatositler (oklar), H&E. ... 30 Şekil 8: Bakır grubu karaciğerde Kupffer hücrelerinde proliferasyon (oklar),
H&E. ... 30 Şekil 9: Bakır grubu karaciğerde sinuzoidlerde vazokonjesyon ve dilatasyon
(oklar), H&E. ... 31 Şekil 10: Bakır grubu karaciğerde sinuzoidlerde vazokonjesyon ve dilatasyon
(oklar), H&E. ... 31 Şekil 11: Bakır grubu karaciğerde periportal bölgelerde mononükleer inflamatuar
hücre infiltrasyonları (oklar), H&E. ... 31 Şekil 12: Bakır grubu karaciğerde Vena Sentralis çevresinde vakuolizasyonla
birlikte yağ dejenerasyonu ve nekroz (oklar), H&E. ... 31 Şekil 13: Bakır grubu karaciğerde Vena Sentralis’te hiperemi ile beraber
dilatasyon (oklar), H&E. ... 32 Şekil 14: Bakır grubu karaciğerde Vena Sentralis’te hiyalin kalıntısı (ok), H&E. 32
Şekil 15: Bakır grubu karaciğerde hepatik kord alanlarında disorganizasyon (ince oklar) ve portal bölgede safra kanalında proliferasyon (kalın oklar), H&E. ... 32 Şekil 16: Bakır grubu böbrek korteksinde tubulusların dejenerasyonu ve nekrotik
hücreler (oklar), H&E. ... 32 Şekil 17: Bakır grubu böbrek korteksinde proksimal tubulusların epitel
hücrelerinde şişme, karyomegali (uzun oklar) ve karyolizis (kısa ok), H&E. ... 33 Şekil 18: Bakır grubu böbrek korteksinde proksimal tubuluslarda konjesyon (kısa
ok) ve epitelyal hücre deskuamasyonu (uzun oklar), H&E. ... 33 Şekil 19: Bakır grubu böbrek korteksinde proksimal tubulusta hiyalin silindirleri
(ok), H&E. ... 33 Şekil 20: Bakır grubu böbrek korteksindeki glomerulusta büzüşme ile birlikte
konjesyon (yıldız), bazal membranda kalınlaşma (oklar), Bowman kapsülünde dilatasyon ve dejenerasyon (kare), H&E. ... 33 Şekil 21: Bakır grubu böbrek korteksinin intersitisyel dokusundaki kan
damarlarında konjesyon (oklar), H&E. ... 34 Şekil 22: Bakır grubu böbrek korteksinde fokal mononükleer hücre
infiltrasyonları (oklar), H&E. ... 34 Şekil 23: Bakır grubu karaciğerde hepatositlerde aktif kaspaz-3 pozitif reaksiyon,
Kaspaz. ... 34 Şekil 24: Bakır grubu karaciğerde hepatositlerde aktif kaspaz-3 reaksiyonu
Şekil 25: Bakır grubu böbrek korteksinde tubulus epitellerinde aktif kaspaz-3
reaksiyon, Kaspaz. ... 35
Şekil 26: Bakır grubu böbrek korteksinde tubulus epitellerinde aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz. ... 35
Şekil 27: FM grubu normal karaciğer görünümü, H&E. ... 36
Şekil 28: FM grubu normal böbrek görünümü, H&E. ... 36
Şekil 29: FM grubu karaciğerde çok az sayıda hepatositte pozitif olmayan aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz. ... 36
Şekil 30: FM grubu böbrek korteksindeki çok az sayıda tubulusta pozitif olmayan aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz. ... 36
Şekil 31: Krisin grubu normal karaciğer görünümü, H&E. ... 37
Şekil 32: Krisin grubu normal böbrek görünümü, H&E. ... 37
Şekil 33: Krisin grubu normal karaciğer görünümü, Kaspaz. ... 37
Şekil 34: Krisin grubu normal böbrek görünümü, Kaspaz. ... 37
Şekil 35: Bakır-FM grubu karaciğerde hafif derecede dejeneratif, nekrotik ve infiltratif değişiklikler, H&E. ... 39
Şekil 36: Bakır-FM grubu karaciğerde hepatositlerde karyomegali (uzun oklar) ve karyolitik çekirdekli fokal nekroz alanları (kısa ok), H&E. ... 39
Şekil 37: Bakır-FM grubu karaciğerde çok sayıda çift çekirdekli hepatosit (oklar), H&E. ... 39
Şekil 38: Bakır-FM grubu karaciğerde sinuzoidlerde hafif vazokonjesyon (kalın oklar) ve dilatasyon (uzun ok), Vena Senralis’te hafif hiperemi (yıldız) ve dilatasyon (kısa ok), H&E. ... 39
Şekil 39: Bakır-FM grubu karaciğerde hepatik kord alanlarında hafiflemiş
disorganizasyon, H&E. ... 40 Şekil 40: Bakır-FM grubu böbrek korteksindeki proksimal tubulus epitel
hücresinde karyomegali (kısa ok) ile proksimal tubulusların lümeninde epitelyal hücre deskuamasyonu (uzun ok) ve hiyalin oluşumları (kalın ok) H&E. ... 40 Şekil 41: Bakır-FM grubu böbrek korteksindeki glomeruluslarda hafif derecede
büzüşme ve konjesyon (kısa ok), Bowman kapsülünde hafif dilatasyon (yıldız) ve bazal membranda normal görünüm (uzun ok), H&E. ... 40 Şekil 42: Bakır-FM grubu böbrek korteksinin intersitisyel dokusundaki kan
damarlarında hafif konjesyon (uzun ok) ve mononükleer hücre
infiltrasyonu, H&E. ... 40 Şekil 43: Bakır-FM grubu karaciğerde bazı hepatositlerde aktif kaspaz-3 pozitif
reaksiyon, Kaspaz. ... 41 Şekil 44: Bakır-FM grubu karaciğerde birkaç hepatositte aktif kaspaz-3 pozitif
reaksiyonu (oklar), Kaspaz. ... 41 Şekil 45: Bakır-FM grubu böbrek korteksinde bazı tubulus epitellerinde aktif
kaspaz-3 reaksiyon, Kaspaz. ... 41 Şekil 46: Bakır-FM grubu böbrek korteksinde birkaç tubulus epitelinde aktif
kaspaz-3 reaksiyonu (yıldız) ve pozitif aktif kaspaz- 3 reaksiyonu vermeyen birçok tubulus (kare), Kaspaz. ... 41 Şekil 47: Bakır-Krisin grubu karaciğerde çok sayıda çift çekirdekli hepatosit ile
Şekil 48: Bakır-Krisin grubu karaciğerde birçok hepatositte karyomegali (oklar) sinuzoidlerde hafif derecede vazokonjesyon ve dilatasyon, H&E. ... 43 Şekil 49: Bakır-Krisin grubu karaciğerde hepatik kord alanlarında hafiflemiş
disorganizasyon ve Vena Sentralis’te hafif hiperemi ile dilatasyon (yıldız), H&E. ... 44 Şekil 50: Bakır-Krisin grubu böbrek korteksinde proksimal ve distal tubuluslarda
birkaç nekrotik hücre (oklar), H&E. ... 44 Şekil 51: Bakır-Krisin grubu böbrek korteksinde proksimal tubulusta hafif
konjesyon (uzun oklar), proksimal tubulus epitel hücrelerinde karyomegali (yıldız) ve intraluminal epitelyal hücre deskuamasyonu (kısa ok) ve hiyalin silindirleri (kalın ok), H&E. ... 44 Şekil 52: Bakır-Krisin grubu böbrek korteksinde büzüşme ve konjesyonun
olmadığı glomerulus (yıldız) ve normal görünümlü bazal membran (ok) , H&E. ... 44 Şekil 53: Bakır-Krisin grubu karaciğerde bazı hepatositlerde aktif kaspaz-3 pozitif reaksiyon, Kaspaz. ... 45 Şekil 54: Bakır-Krisin grubu karaciğerde birkaç hepatositte aktif kaspaz-3 pozitif
reaksiyonu (oklar), Kaspaz. ... 45 Şekil 55: Bakır-Krisin grubu böbrek korteksinde bazı tubulus epitellerinde aktif
kaspaz-3 reaksiyon, Kaspaz. ... 45 Şekil 56: Bakır-Krisin grubu böbrek korteksinde birkaç tubulus epitelinde aktif
kaspaz-3 reaksiyonu (yıldızlar) ve pozitif aktif kaspaz- 3 reaksiyonu vermeyen birçok tubulus (oklar), Kaspaz. ... 45
ÖZET
Bu araştırma, aşırı bakıra maruz bırakılmış ratlarda krisin ve fluniksin meglümin’in, yem tüketimi, canlı ağırlık değişimi, antioksidan durum, bazı kan ve yangı parametreleri ve histolojik değişimler üzerine koruyucu etkilerini belirlemek amacıyla yapıldı. Araştırmada bireysel olarak barındırılan 36 adet erkek Sprague-Dawley rat kullanıldı ve Kontrol, Bakır Sülfat (Cu, 500 ppm canlı ağırlık (CA)/gün, gavaj), Fluniksin Meglumin (FM; 2,2 ppm CA/gün, ip), Krisin (Krisin, 50 ppm CA/gün, gavaj), Bakır Sülfat+Fluniksin Meglumin (Cu+FM; 500 ppm BW/gün bakır sülfat, gavaj ve 2,2 mg/kg CA/gün fluniksin meglumin, ip) ve Bakır Sülfat+Krisin (500 ppm CA/gün bakır sülfat, gavaj ve 50 ppm CA/gün krisin, gavaj) olarak altı gruba ayrıldı. Yem tüketimi (YT) Cu grubuyla karşılaştırıldığında, Cu+Krisin grubunda önemli oranda arttı (P<0.01). Cu toksisitesi, oksidatif stresin göstergesi olan malondialdehiti (MDA) önemli oranda artırdı. Krisin ve FM uygulaması karaciğer ve böbrek dokularında önemli oranda MDA düzeyini azalttı, ve superoksit dismutaz ve katalaz aktivitelerini artırdı (P<0.001). Serum TNF-α düzeyi bakır grubuyla karşılaştırıldığında Cu+FM ve Cu+Krisin gruplarında önemli oranda daha düşüktü (P<0.001). Cu uygulanan ratların karaciğer ve böbrek dokularında FM ve krisin uygulamaları dejenerasyonu, nekrozu ve apoptozisi iyileştirdiği görüldü. Krisinin serbest radikalleri temizleyerek ve antioksidanların aktivitesini artırarak YT ile karaciğer ve böbrek üzerine olan olumsuz etkileri iyileştirdiği ortaya çıktı.
Anahtar Kelimeler: Bakır toksisitesi, krisin, fluniksin meglumin, yem tüketimi, canlı ağırlık değişimi, antioksidan durum, kan, yangı, histolojik
ABSTRACT
The Effects of Flunixin Meglumine and Chrysin on Some Blood and Inflamation Parameters, Antioxidant Status, Body Weight, Feed Intake on
Toxicity Induced Copper Sulphate in Rats
This experiment was conducted to determine the protective effects of chrysin and flunixin meglumine on feed intake, body weight change, antioxidant status, some blood and inflamation parameters, and histological changes in rats exposed to excess copper. Thirty-six Sprague Dawley male rats were housed in individual cages and randomly divided into six groups; Control, Copper Sulphate (Cu; 500 ppm body weight (BW/day, gavage) Flunixin Meglumine (FM; 2.2 ppm BW/day, ip), Chrysin (Chrysin; 50 ppm BW/day, gavage), Copper Sulphate + FM (Cu+FM; 500 ppm BW/day of copper sulphate, gavage and 2.2 ppm BW/day of FM, ip) and copper sulphate + Chrysin (Cu+Chrysin; 500 ppm BW/day of copper sulphate, gavage and 50 ppm BW/day of chrysin, gavage). Feed intake (FI) in the Cu+Chrysin group significantly increased in comparison with that of Cu group (P<0.01). Cu toxicity significantly increased MDA indicating oxidative stress. Chrysin and FM administration significantly decreased MDA levels, and increased the superoxide dismutase and catalase activities in the liver and kidney tissues (P<0.001). Serum TNF-alfa levels were significantly lower in the Cu+FM and Cu+Chrysin groups in comparison to the Cu group (P<0.001). It was seen that FM and chrysin treatments alleviated degeneration, necrosis and apoptosis in the liver and kidney tissues of the Cu-treated rats. Chrysin appeared to ameliorate the adverse effects on FI and liver and kidney tissues by scavenging where the free radicals are located, and increasing activity of antioxidants.
Key words: Copper toxicity, chrysin, flunixin meglumine, feed intake, body weight change, antioxidant status, blood, inflammation, histological parameters, rat
1. GİRİŞ
Artan çevre kirliliği ve gıda güvenliğinde yaşanan sorunlardan dolayı insan yaşamı ve sağlığı gün geçtikçe daha fazla tehdide maruz kalmaktadır. Bilim insanları, bu gibi faktörlerden kaynaklanabilecek olumsuzlukların giderilmesinde yeni teknikler araştırma ve geliştirme çabalarını sürdürmektedir. Özellikle ağır metaller çevre kirliliğinde önemli rol oynamaktadırlar. Kurşun, çinko bakır, kobalt, kadmiyum, krom, nikel, arsenik, civa ve gümüş gibi metallerin iyonları normalde canlı sistemlerinde gerekli olmalarına karşın belirli bir dozun üstüne çıktıklarında son derece toksik olabilmektedirler (1). Metaller, ya işlevsel ve yapısal molekülleri etkileyerek doğrudan, ya da serbest radikal oluşumunu artırarak dolaylı yoldan etki ederler.
1.1. Bakır (Cu)
Bakır, periyodik cetvelde simgesi Cu olarak gösterilen, 1B geçiş grubu elementi olan, kırmızı ya da kahverengi görünümlü önemli bir metaldir. Dünya'nın hemen hemen tüm bölgelerinde bulunması nedeniyle geniş ölçüde üretimi yapılabilmektedir. Elektriği diğer bütün metaller içinde gümüşten sonra en iyi ileten metaldir (2).
Bakır; hücrede birçok enzimin fonksiyonunda rol oynayan önemli bir iz elementtir. Özellikle hücrede enerjinin üretildiği mitokondride etkili olduğu, demirin homeostazisi, serbest radikallerin temizlenmesi, kollojen ve elastinin bağ oluşturması gibi mekanizmalarda görev alan enzimlerin katalizlenmesinde rol oynamaktadır (3-5). Hücre fizyolojisi yanında sanayide de çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Özellikle elektrik ve boya sanayinde, tesisat borularının
antelmentik olarak, tarımda ise fungisit olarak bakır sülfat sıklıkla kullanılmaktadır (5,6). Tarımsal alanda özellikle bağ yetiştiriciliğinin yaygın olduğu bölgelerde fungusit olarak kullanılan bakır (35- 40 kg Cu/ha/yıl) toprakta bakır birikimine yol açabilmektedir. Özellikle Akdeniz Bölgesinde seracılık yapılmakta ve seralarda bakır kaynaklı gübreler ve fungisitler oldukça fazla kullanılmaktadır (7). Nitekim, Akdeniz Bölgesinde gerçekleştirilen bir araştırmada (8), Antalya yöresinde ki sera topraklarının % 8’inin bakır içeriğinin kritik toksisite sınırının üzerinde olduğu ve yaprak örneklerinin bakır içeriğinin (yapraktan uygulanan bakır içeren kimyasallardan dolayı) çok yüksek olduğu belirtilmiştir. Yaprak da fazla olmasının sebebi olarak da bakır uygulamalarının yaprağa yapılmasından kaynaklandığını bildirmişlerdir.
Tüm bu alanlarda yaygın olarak kullanılan bakırın hava, su, gıda veya bakır içeren bileşiklerin deri yoluyla teması sonucunda vücuda alınması mümkün olmaktadır. Bakırın yüksek oranda organizmaya alınması ciddi zehirlenmelere yol açmaktadır. Özellikle oral yolla alındığında ciddi toksikasyonlara yol açtığı bildirilmektedir (6). Bakır toksisitesinde kanda bakır yükselir ve hemolize neden olur. İlk biriktiği yerin karaciğer olmasından dolayı karaciğer ile ilgili biyomarkırlar öncelikli olarak etkilenmektedir. Aspartat transaminaz (AST) ve alanin amin transferaz (ALT) aktiviteleri karaciğer fonksiyon testlerinde önemli biyomarkırlardır. Yapılan bir çalışmada (9), bakır verilen tüm ratların plazma ALT ve AST aktivitelerinin önemli oranda arttığı belirlenmiştir (sırasıyla p<0.001 ve p<0.001). Bakır alımının ALT ve AST aktivitelerindeki artışa neden olması karaciğer fonksiyonu üzerine olumsuz etkili olduğunu göstermektedir (10).
Dokularda birikebilmesinden dolayı belirli konsantrasyonlarda özellikle karaciğer ve böbrek olmak üzere birçok dokuda hasar oluşturmaktadır (3,5). Bakırın metabolize olduğu organ karaciğer olduğu için birincil hasar oluşturduğu organ karaciğerdir. Hepatositlerin çekirdek ve lizozomlarında birikerek hasar yapmaktadır. Bu yapılardaki hasarı sonucu kana geçer ve kandaki filtrasyon yolu ile böbrek tubulus epitelleri tarafından emilir ve sitoplazmada birikerek böbrekte de hasar oluşturur (5).
1.2. Bakır ve Oksidatif Stres Oluşumu
Bakır fazlalığı serbest oksijen radikallerinin üretimini tetikleyerek mitokondride lipit peroksidasyonuna yol açmaktadır. Normalde hidrojen peroksit (H2O2) kendi başına çok zayıf oksidan özelliği gösterir. Hidrojen peroksit; glutatyon peroksidaz, katalaz (CAT) ve belirli peroksidazlar tarafından ortadan kaldırılabilir. Fakat antioksidan savunma sistemi yeterli olmadığında hidrojen peroksit serbest bir radikal olmadığı halde, reaktif oksijen sistemi (ROS) içine girer ve serbest radikaller içerisinde önemli bir rol oynar. Çünkü demir (Fe) ve bakır (Cu) gibi geçiş metalleri varlığında süperoksit ile reaksiyona girerek en reaktif ve en zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir. Süperoksit radikallerinin asıl zararları ise hidrojen peroksit kaynağı ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarındandır. İki süperoksit radikalinin bir araya gelmesi sonucu hidrojen peroksit meydana gelir (11-13).
Süperoksit radikali ve peroksil radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olurken diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonu sonucu da hidrojen peroksit ve oksijen oluşur.
HO2 + O2.- + H + → H2O2 + O2 Fe+2 veya Cu+
H2O2 + O2.- OH. + OH- + O2
Diğer taraftan geçiş metallerinin otooksidasyonu sonucunda da süperoksit radikali oluşabilmektedir.
Cu+ + O2 → Cu+2 + O2
Bu reaksiyonlar geri dönüşümlü redoks reaksiyonları olup serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir (13).
Mitokondrinin membranını etkileyerek geçirgenliğini bozar ve eriyebilir bileşiklerin membrandan içeri girmesine sebep olmaktadır. Bunun sonucu olarak mitokondri büyür, osmotik basınç artar ve sitokrom C’nin sitosole salınımının artmasına yol açmaktadır. Bu durum kaspaz-9 enziminin aktive olmasına sebep olmaktadır (5,14-16). Kaspaz enzimleri (Cystein Aspartate Specific Proteases-KASPAZ) sistein proteaz grubu enzimlerdir. İnaktif proteinlerdir, ancak çeşitli yollarla aktive edilirler. Hücre ölümleri sırasında oluşan birçok değişimin sorumlusu olarak bilinmektedir (17). Bakır toksisitesinin ratların karaciğerinde serbest radikallerin artmasına yol açarak tümör nekröz faktör-alfa (TNF-α)’yı indükleyerek kaspaz enzimlerini aktive ettiği bildirilmiştir (18). TNF birçok hücre tipi tarafından salgılanır ve 185 aminoasitlik glikoprotein hormonlardır. TNF’lerden biri olan TNF-α (kaşektin, kaşeksin) daha çok makrofajlar tarafından üretilmektedir. Makrofajlarda artması oksidanların, inflamasyon lipidlerinin ve
prostaglandin E2’nin üretimini uyarmaktadır (19). Ratlarda deneysel olarak bakır zehirlenmesi oluşturulup karaciğer ve böbrek hücrelerinde ki apoptozisin araştırıldığı bir çalışmada (5) bakır sülfat solüsyonu I.deneme grubundaki sıçanlara günlük 75 mg/kg dozda ve 14 gün süreyle, II.deneme grubundakilere ise aynı dozda 28 gün süreyle gastrik sonda ile uygulanmıştır. Histopatolojik incelemelerde karaciğer hücrelerinde dejenerasyon, portal mononükleer hücre infiltrasyonları ve nekroz olduğu belirlenmiştir. Karaciğerde hücresel dejenerasyonun birinci grupta daha şiddetli olduğu, ikinci grupta ise nekrotik hücrelerin sayısının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Her iki grupta da böbreklerde dejenerasyon ve lenfosit infiltrasyonu olduğu belirlenmiştir. Deneme gruplarında apoptozin tespit edilmesi amacıyla kaspaz 3,8 ve 9 aktivitelerine bakılmış, her iki deneme grubunda ve her iki organda hücrelerin hem apoptozis hem de nekroz ile ölebildiği ancak her iki organda birinci grupta apoptotik hücrelerin, ikinci grupta ise nekrotik hücrelerin sayısının daha fazla olduğu tespit edilmiştir.
Bakırın diğer ağır metallerde olduğu gibi oksidatif strese yol açtığı bildirilmektedir. Oksidatif stres ile apoptozis arasında ilişki mevcuttur (20,21). Normal durumlarda mitokondride hücresel solunum sırasında az miktarda serbest oksijen radikalleri üretilirken, hücre organellerinde bakır biriktiğinde özellikle lizozomda serbest oksijen radikallerinin üretiminin arttığı belirlenmiştir (5). Bakır toksisitesi ile ilgili ratlarda yapılan bir çalışmada (9) yüksek oranda bakırın, beyin dokusunda reaktif oksijen türlerini artırdığı, malondialdehit (MDA) düzeyini yükselttiği, süper oksit dismutaz (SOD) düzeyini azalttığı ve redükte glutatyonu (GSH) tükettiği bildirilmiştir.
1.3. Krisin
Normal biyolojik sistem içerisinde reaktif oksijen türleri oluşabilmektedir. Lipidler, proteinler, DNA gibi moleküller çeşitli etkenlerle hasara uğrayabilmektedir. Metabolizmada bu hasarları önleyici endojen ve eksojen kaynaklı antioksidanlara ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak antioksidanlar yetersiz olursa oksidatif hasar meydana gelmektedir. Antioksidanların birçoğu yaygın olarak kullandığımız gıdalarda bulunmaktadır. Bunlar; bazı vitaminler, flavonoidler, polifenoller ve diğer bileşikleri kapsamaktadır (22). Flavonoidlerin antioksidan özelliklerinin yanında bazı hastalıkları koruma etkilerinin olduğu belirlenmiş ve son yıllarda bu konuda yapılan çalışmalar artmıştır. Sayıları 4000’in üzerinde olduğu tahmin edilmektedir (22,23).
Flavonoidler vitaminlere benzer özellik gösterirler. Vitamin E bilindiği üzere antioksidan bir yapıya sahiptir. Ancak flavonoidler daha fazla hidrofilik yapıda oldukları için membranın polar yüzüne yakın şekilde lokalize olmaktadırlar ve sulu peroksil radikallerini kolayca yakalayarak lipit peroksil radikallerine vitamin E den daha hızlı şekilde etki etmektedirler. Böylece metabolizmaya flavonoid alımı vitamin E gibi antioksidanların harcanmasını da engellemiş olacaktır (24). Flanavoidlerin antioksidan özelliklerden başka bazı enzimleri inhibe edebilme özellikleri de bulunmaktadır. Yine flanavoidlerin antitümör, antiviral, antiinflamatuvar, antitrombotik, vazodilatasyon ve antiallerjik etki mekanizmaları bulunmaktadır (22,25).
Krisin, güçlü bir antioksidan özelliğe sahip flavonoiddir. Son zamanlarda fito kimyasalların serbest radikalleri temizleme ve oksidatif stresi inhibe etme güçleri bilim adamlarının ilgisini çekmiştir. Çin ve Doğu Asya Ülkelerinde
bitkisel tedavide yaygın olarak kullanılan krisin; bal, çiçek ve propolisde bulunan bir flavanoiddir (26). Krisin flavonoidlerin alt gruplarından olan bir flavon yapısındadır.
Krisin (27).
Flavanoidler, iz elementlerle veya radikallerle şelat yaparak antioksidan özellik göstermektedirler (28-30). Ayrıca doymamış yağ asitlerini hücre membranında oksidantlara karşı askorbat gibi korudukları bildirilmiştir (31). Krisinin antioksidan, antikanser, antiinflamatuar etkileriyle pek çok biyolojik aktivite ve farmakolojik etki gösterdiği bildirilmektedir (26,32). Krisinin reprodüktif sistem üzerine de etkili olduğu bildirilmiştir. Testesteronu östrojene dönüştüren aromataz enzimini inhibe ederek testesteron oranını artırdığı belirlenmiştir. Ayrıca krisinin oksidatif stres ve apoptotik doku hasarının etkisini düşürücü etkiye sahip olduğu belirlenmiştir (33).
1.4. Fluniksin Meglumin
Fluniksin meglumin (FM; 3 pridin karboksilik asit) non-steroidal antiinflamatuvar ilaçlar (NSAi) grubunda yer alan analjezik anttiinflamatuvar, antipiretik ve antiprostoglandin etkilere sahip ilaçtır. NSAi ilaçlar içerisinde en güçlü etkiye sahiptir. FM araşidonik asitten prostoglandinlerin sentezlenmesinde
gostermektedir. Prostoglandinler çeşitli fizyolojik ve patolojik olayların (ağrı, yangı, romatoid artrit, çeşitli muskoskeletal bozukluklar gibi) oluşumunda rol oynayan, tüm vücut hücrelerinde sentezlenebilen bir otokoiddir (34). FM veteriner hekimlikte endotokseminin tedavisinde sıklıkla kullanılmaktadır (35-37). FM gibi bazı anti-inflamatuar ilaçların antitoksemi mekanizması siklooksijenaz (COX) inhibisyonundan bağımsız etkileri de mevcuttur (38). Son yıllardaki bazı araştırmalar NSAID’ların serbest radikallerle savaşma kapasitesinin olduğunu ve vücutta güçlü antioksidanlar olarak etki ettiğini ileri sürmektedir (39). NSAID’ler lokal ve merkezi olarak ağrı kesici özellikleriyle opioidlerle sinerjik etkileşime sahiptirler. Ağrı kesici, ateş düşürücü ve yangı giderici olarak veteriner hekimlikte; atlarda; osteoartrit, laminit kolit, endotoksemi, pnömoni, sığırda mastit tedavisinde ve laboratuvar hayvanlarında (kobay, rat, fare, hamster, gerbil) operasyon sonrasında kullanılmaktadır. Aspirin gibi NSAi ilaçların sinovyal sıvının viskozitesini azalttığı ve eklem dejenerasyonunda rol oynayan serbest radikallerin (oksijen, hidroksil OH- ve hidrojen peroksit H2O2) oluşumunu da azalttığı belirtilmektedir(34).
FM`nin meydana getirdiği en önemli yan etkiler arasında; nefrotoksitite, platelet agregasyonunu önlenmesi ile gastrointestinal kanamalar olduğu bildirilmiştir. FM kullanımıyla maymun ve ratlarda aneminin şekillendiği ve yine ratlarda uygulanan FM`nin gastrointestinal sistemde belirgin patolojik değişimlere neden olduğuna ait çalışma bulguları da kaydedilmiştir. FM kullanımında, her ne kadar ilacın fare, rat ve tavşanlarda sorunsuz bir şekilde kullanılabileceği vurgulanmış olsa da, çalışmada alyuvar sayılarında azalma ile akyuvar sayılarındaki artış dikkat çekici nitelik taşımaktadır. Bu kapsamda FM`nin
kullanımının sonrasında kan parametrelerindeki değişimlerin kontrol altında tutulması gerektiği sonucuna varılmıştır (40).
1.5. Serbest Radikaller
Besinlerin oksijen kullanılarak enerjiye dönüşümü sırasında meydana gelen atom, molekül veya bir veya daha fazla eşleşmemiş elektronlara serbest radikaller denir. Hücrelerin hayati fonksiyonları için oksijen molekülleri vazgeçilmez olmakla birlikte, metabolizma sırasında serbest radikal kaynağı olarak bilinen ve son derece reaktif, stabil olmayan, reaktif oksijen türlerine (metabolitleri) dönüşür. Reaktif oksijen metabolitleri, karbonhidrat, lipit, protein moleküllerine ve DNA gibi hücre bileşenlerine zarar verir (41-43).
Serbest radikal zincir reaksiyonları genellikle, moleküllerden hidrojenin uzaklaştırılmasıyla başlamaktadır. Serbest radikaller, pozitif yüklü, negatif yüklü ya da nötral olabilirler. Üç farklı mekanizma ile hücreye zarar verebilirler. Birinci mekanizma membran stabilizasyonunu ortadan kaldırıp hücre ve doku bozulmalarına yol açarak, ikinci mekanizma disülfit bağı oluşturarak ve son olarak hidroksil radikali, peroksinitrit ve nitrojen oksit gibi reaktif nitrojen türleri ile DNA hasarına yol açarak hücreye zarar verebilmektedirler (44). Her ne kadar serbest radikal reaksiyonları, bağışıklık sistemi hücrelerinden nötrofil, makrofaj gibi hücrelerin savunma mekanizması için gerekliyse de, fazla üretilmesi doku hasarı ve hücre ölümüne neden olmaktadır (45).
1.6. Antioksidan Savunma Sistemleri
ROS’ların oluşumunu ve meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar “antioksidan savunma
Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek veya ROS’ları toplayarak lipit peroksidasyonunu inhibe ederler. Antioksidanlar, endojen kaynaklı (doğal) ve eksojen kaynaklı antioksidanlar olmak üzere başlıca iki ana gruba ayrılabildiği gibi serbest radikalin meydana gelişini önleyenler ve mevcut olanları etkisiz hale getirenler şeklinde veya enzim ve enzim olmayanlar (vitamin C, vitamin E ve redükte glutatyon (GSH)) şeklinde de sınıflandırılırlar. Antioksidanlar hücrelerin hem sıvı hem de membran kısmında bulunabilirler (46,47).
1.6.1. Malondialdehid (MDA)
Membranda bulunan (fosfolipit, glikolipit, gliserit ve sterol yapısında yer alan) çoklu doymamış yağ asitlerinin, serbest oksijen radikalleri ile peroksit, alkol, aldehit, hidroksi yağ asidi, etan ve pentan gibi farklı ürünlere yıkılması reaksiyonuna lipit peroksidasyon denir. Lipit hidroperoksitlerinin yıkımı ile oluşan ve biyolojik aktivitesi olan aldehitler hücre düzeyinde metabolize olurlar ya da başlangıçtaki etki alanlarından diffuze olup hücrenin diğer kısımlarına hasarı yayarlar (48,49). Lipid peroksidasyonun en önemli ürünü MDA’dır. MDA üç ya da daha fazla çift bağ içeren doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonu ile meydana gelir. Hücre membranlarından iyon alış-verişine etki ederek membrandaki bileşiklerin çapraz bağlanmasına ve iyon geçirgenliğinin ve enzim aktivitesinin değişimi gibi olumsuz sonuçlara neden olur. Bu nedenle MDA, DNA’nın nitrojen bazları ile reaksiyona girebilir ve hücre kültürleri için genotoksik ve karsinojenik etki sergiler (50-53).
1.6.2. Katalaz (CAT)
Katalaz; H2O2’i oksijen ve suya parçalayan 4 tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Peroksidaz aktivitesine sahip oluşuna ek olarak bu enzim bir molekül H2O2’i elektron verici bir substrat olarak, diğerini de oksidan veya elektron alıcısı olarak kullanabilir (54).
CAT
2H2O2 2H2O + O2
Dokulardaki CAT aktivitesi çok büyük değişiklikler göstermektedir. Karaciğer, böbrek ve eritrositlerde en yüksek aktiviteye, beyin, kalp, akciğer ve bağ dokusunda ise daha düşük aktiviteye sahiptir (55). Dokularda başlıca mitokondri ve peroksizomlarda olmak üzere partiküllere bağlı şekilde bulunurken, eritrositlerde çözünebilir durumda bulunmaktadır. Asetaldehit, etanol gibi hidrojen veren substratların oksidasyonunda da rol almaktadır (peroksidatif etki). CAT’ın indirgeyici aktivitesi büyük molekül1ü lipit hidroperoksitlerine etki etmezken, H2O2 ve metil, etil hidroperoksitleri gibi küçük moleküllere karşı etkilidir. Birçok hastalıkta, örneğin kanser, Down sendromu ve anemide serum CAT aktivitesinin değiştiği bildirilmiştir (56,57).
1.6.3. Super Oksit Dismutaz (SOD)
Süperoksit dismutaz (SOD) süperoksit serbest radikalinin (O2⋅−
) hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen antioksidan enzimdir (58). Tüm aerobik hücreler SOD içerir. Hem sitozol, hem de mitokondrilerde bulunan bu enzim süperoksit radikallerini etkisizleştirerek, hücreleri süperoksit
yükselmesi ile SOD aktivitesi artar. Enzim fagosite edilmiş bakterilerin intraselüler olarak öldürülmesinde rol oynar ve granülosit fonksiyonu için önemlidir. İçeriğindeki metal iyonuna göre sitozolik dimerik Cu, Zn-SOD ve mitokondriyal tetramerik Mn-SOD olarak adlandırılır (59).
1.6.4. Redükte Glutatyon (GSH)
İndirgenmiş glutatyon (GSH) içerdiği tiyol grubu aracılığı ile hücre içinde redoks potansiyeli yüksek bir ortam sağlayarak, hücreyi oksidatif hasarlara karşı korur. Glutatyon peroksidaz (GPx) enziminin kofaktörlüğünü yaparak, H2O2’i metabolize eder (60).
2. GEREÇ ve YÖNTEM 2.1. GEREÇ
2.1.1. Hayvan Materyali
Çalışmada Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırmalar Merkezi (FÜDAM)’nden temin edilen 6-8 haftalık 200-250 gram ağırlığında 36 adet erkek Sprague-Dawley ırkı ratlar kullanıldı. Deneysel uygulamalar boyunca laboratuvar hayvanları bakım ve kullanım şartlarına (24±3℃) uygun olarak özel kafeslerde bakılmıştır. Beslenmelerinde standart rat pelet yemi kullanıldı ve su ad libitum sağlandı. Ratlar her grupta 6 hayvan olacak şekilde 6 gruba ayrıldı ve uygulama 21 gün sürdü. Ratlar yem tüketimi tespiti için ayrı ayrı kafeslerde barındırıldı. Deney hayvanlarının seçimi ve yapılan uygulamalar için Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu Başkanlığı’ndan etik kurul onayı alınmıştır (08.01.2014 / 15).
2.1.2. Yem
Denemede kullanılan standart rat pelet yemi FÜDAM’dan temin edilmiştir. Yem ve su hayvanlara ad libitum olarak verilmiştir. Kullanılan yemin besin madde bileşimi Tablo 1’de sunulmuştur.
Tablo 1: Kullanılan yemin besin madde bileşimi
Besin madde içeriği % oranı Besin madde içeriği % oranı
Kuru madde1 92.5 Ham yağ1 3
Ham kül1 7.4 Ca2 1
Ham protein1 23.5 P2 0.9
Ham selüloz1 6 Metabolik enerji (kcal, kg)2 2650
1: Analiz yoluyla belirlenmiştir. 2: Hesap yoluyla belirlenmiştir.
2.2. YÖNTEM
2.2.1. Deneme Düzeni
Araştırma, her birinde 6’şar adet rat bulunan kontrol ve 5 deneme grubundan oluşturuldu. Ratların ferdi olarak canlı ağırlıkları belirlendi ve homojen ağırlık dağılımı sağlanarak bireysel olarak standart rat kafeslerinde barındırıldı. Her biri 6 tekerrürden oluşan 6 gruba ayrıldı. Her grupta 6, her tekrar
grubunda ise 1 rat yer aldı. Araştırma grupları aşağıdaki gibi oluşturuldu:
1.Grup: Kontrol grubu (Kontrol); Bakır Sülfat, Krisin ve Fluniksin uygulaması
yapılmayan grup.
2.Grup: Bakır grubu (Cu); 500 mg/kg CA dozunda Bakır sülfat gavajla
uygulanan,
3.Grup: Fluniksin grubu (FM); 2.2 mg/kg CA dozunda fluniksin meglumin ip
olarak verilen,
4.Grup: Krisin grubu (Kr); 50 mg/kg CA dozunda Krisin gavajla uygulanan, 5.Grup: Bakır + Fluniksin grubu (Cu+FM); 500 mg/kg CA dozunda Bakır sülfat
(gavajla) + 2.2 mg/kg CA fluniksin meglumin ip olarak verilen,
6.Grup: Bakır + Krisin grubu (Cu+Kr); 500 mg/kg CA dozunda Bakır sülfat
(gavajla) + 50 mg/kg CA dozunda Krisin gavajla verilen grup.
Araştırmada kullanılan bakır sülfat (61,62), fluniksin meglumin (63) ve krisin (33) dozları önceki çalışmalar baz alınarak yapılmıştır. Araştırma süresince her gün guruplara ait uygulamalar yapılmış ve son uygulamadan 24 saat sonra hayvanlar dekapite edilmiştir.
2.2.2. Işıklandırma
Denemede tüm gruplara araştırma süresince her gün laboratuar hayvanlarının bakım ve kullanım şartlarına uygun olarak 12 saat aydınlık, daha sonrasında 12 saat karanlık olacak şekilde ışıklandırma programı uygulandı.
2.2.3. Grupların Yem Tüketiminin (YT) Belirlenmesi
Grupların yem tüketimleri tartılarak verilmiş ve her grubun ortalama YT 7., 14. ve 21. günlerde verilen yemlerden artan yemler çıkarılarak hesaplandı.
2.2.4. Canlı Ağırlık ve Canlı Ağırlık Değişimlerinin Belirlenmesi
Denemenin başlangıcında ratların, ferdi olarak canlı ağırlıkları belirlendi ve ortalama canlı ağırlıkları eşit olacak şekilde gruplara ayrıldı. Denemenin 7., 14. ve 21. günlerinde ratların yine ferdi olarak canlı ağırlık tartımları yapılarak canlı ağırlıkları belirlenip, yine aynı günlerdeki canlı ağırlık değişimleri tespit edildi.
2.2.5. Ölüm Oranının Belirlenmesi
Tüm gruplar her gün uygulamalar esnasında kontrol edilmiş ve gruplarda herhangi bir ölüme rastlanmamıştır.
2.2.6. Analitik İşlemler
2.2.6.1. Yem Örneklerinin Analizleri
Yem örneklerinin kuru madde, ham kül, ham protein (Kjeldahl metodu), ham yağ (eter ekstraksiyon) analizleri AOAC (64)’a göre, ham selüloz düzeyi ise Crampton and Maynard (65)’a göre belirlendi.
2.2.6.2. Kan ve Doku Analizleri
Deneme sonunda ratlar dekapite edilerek kan örnekleri alındı ve biyokimyasal analizler yapılması için uygun şekilde saklandı. Ayrıca laparotomi
belirlemek ve histopatolojik değerlendirmeler için) ayrıldı. Serumda yangı parametrelerinden TNF-α düzeyi, karaciğer dokusunda Kaspas 3 aktivitesi ve histopatolojik parametreler incelendi.
2.2.6.2.1. Kan Analizleri
Tüplere alınan kan örneklerinin serumları çıkarıldı. Serumda kortizol, glikoz, albümin, kreatinin, globulin, total protein, üre, ALT, AST, total kolesterol, trigliserit, HDL, VLDL ve LDL analizleri hizmet alımı şeklinde, Fırat Üniversitesi Hastanesi Merkezi Laboratuvarı’nda yaptırıldı.
2.2.6.2.2. Doku Analizleri
Laparotomi yapılarak alınan karaciğer ve böbrek dokuları analizler yapılıncaya kadar -20℃’de muhafaza edildi.
2.2.6.2.2.1. Lipit Peroksidasyon (MDA) Düzeyinin Tayini
Doku MDA düzeyleri spektrofotometrik olarak Ohkawa et al. (66) tarafından önerilen metoda göre yapıldı. Aerobik şartlar altında ve pH 3.5’te doku homojenatının kaynar su banyosunda inkübasyonu sonucu lipit peroksidasyonunun sekonder ürünü olan MDA’nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile oluşturduğu pembe renkli kompleks 532 nm’de spektrofotometrik olarak ölçüldü.
2.2.6.2.2.2. Katalaz (CAT) Aktivitesi Tayini
CAT aktivitesi spektrofotometrik yönteme göre belirlenmiştir (55). H2O2’in CAT tarafından yıkım hızı 240 nm dalga boyunda ışığı absorbe etmesinden yararlanılarak spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. 240 nm’de köre karşı ayarlandıktan sonra 30 saniye içindeki absorbans farkı ölçülmek suretiyle CAT aktivitesi hesaplanmıştır.
2.2.6.2.2.3. Redükte Glutatyon (GSH) Tayini
GSH aktivitesi Ellman (67) metodu ile tayin edilmiştir. 5,5’-ditiyo-bis (2-nitrobenzoikasit) (DTNB), sülfidril bileşikleri tarafından redükte edilmiş bir disülfid bileşiğidir. Örnek ile DTNB’nin oluşturduğu sarı renkli kompleksin renk şiddeti ortamdaki GSH konsantrasyonu ile doğru orantılıdır, 412 nm’de spektrofotometrik olarak değerlendirilmiştir.
2.2.6.2.2.4. Doku SOD Tayini
SOD enzim değerleri Sun et al. (68)’nın modifiye ettiği metotla belirlendi. Bu metodun prensibi nitroblue tetrazolium (NBT)’un süperoksit üreticisi olan ksantin-ksantinoksidaz sistemi tarafından indirgenmesi esasına dayanarak 560 nm’de spektrofotometrik olarak ölçüldü.
2.2.6.2.2.5. TNF-α Analizi
Plazma TNF-α düzeyleri ticari bir firmadan sağlanan ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kitleri kullanılarak ölçülmüştür (Catalog No: E-EL-R0019). Ölçümler İnönü Üniversitesi Eczacılık Fakültesi laboratuvarında yapılmıştır.
2.2.6.2.2.6. Histopatolojik Değerlendirmeler
Histopatolojik değerlendirmeler için, her hayvana ait karaciğer ve böbrek dokuları alınarak tamponlu formaldehit doku tespit solüsyonuna bırakıldı. Bu solüsyonda dokular 24-30 saat süreyle tespit edildikten sonra 12-24 saat kadar akarsuda yıkamaya bırakıldı. Daha sonra % 70, 80, 96-I, 96-II, 100-I ve 100-II’lik alkol serilerinden geçirilen dokular ksilol-I, ksilol-II ve ksilol-III serilerinden de geçirilerek 45℃’lik etüvde ksilol-parafin karışımında 1 gece bırakıldı. Bunu
hazırlandı. Hazırlanan parafin bloklardan kızaklı mikrotomda 5 μm kalınlığında poli-L-lizin kaplı ve 1/4’ü tıraşlanmış lamlara seri kesitler alındı. Bu kesitlere 24 saat ya da daha uzun süreyle oda ısısında kurutma yapıldı. Kesitler, rutin histolojik incelemeler için hematoksilen-eozin (H&E) boyama yöntemine göre boyanarak ışık mikroskobunda incelendi.
Karaciğer ve böbrek dokularında apoptozise uğrayan hücreleri belirlemek için immunohistokimyasal analiz yöntemi olan kaspaz metodu kullanıldı. Boyama işlemine başlamadan önce, kesitler 37℃’lik etüvde 1 gece, 60℃’lik etüvde ise 15-20 dakika bekletildi. Daha sonra 2 kez, 15’er dakika ksilol solüsyonlarında deparafinizasyon uygulandı. % 100, 96, 80 ve 70’lik alkol serilerinde 5’er dakika rehidratasyon işlemi yapıldı. Kesitler önce distile suda çalkalandı ve arkasından antijen retrieval prosedürünü uygulamak üzere sitrat buffer solüsyonuna (pH 7.6) alındı. Mikrodalgada 20 dakika kaynatıldıktan sonra çıkarılan kesitler oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika soğutuldu. Sonrasında 3 kez, 5’er dakika phosphate-buffered saline (PBS) solüsyonunda yıkandı. Kesitler kurulanarak dokuların etrafı immun kalemle çizildikten sonra endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için % 3’lük H2O2’de (200 ml methanole 6 ml H2PO2 eklenerek) 5 dakika bekletilerek akabinde 3 kez, 5’er dakika PBS solüsyonunda yıkandı. Ardından kesitler Ultra V blok ile 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildikten sonra direkt primer antikor uygulamasına geçildi. Kesitler, primer antikor olarak rabbit poliklonal antibody aktif kaspaz-3 (Thermo Scientific, CPP32, Ab-4, UK) ile 37℃’lik etüvde 1 saat süreyle nemli ve karanlık ortamda (humidified chamber) inkübe edildi. Primer antikor inkübasyonundan sonra PBS solüsyonunda 3 kez, 5’er dakika yıkanan kesitlere akabinde biotinylated goat anti-polivalent ile 30
dakika oda sıcaklığında sekonder antikor inkübasyonu yapıldı. Ardından PBS solüsyonunda 3 kez, 5’er dakika yıkanan kesitler streptavidin peroksidaz ile 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. PBS solüsyonunda 3 kez, 5’er dakika yıkanan kesitler kurulanarak 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) kromojen ve substrat (Thermo Scientific, UltraVision Detection System Anti-Polyvalent, HRP/DAB, UK) ile 5-15 dakika muamele edildi. Sonrasında kesitler 5 dakika distile suda yıkandı ve zemin boyaması için zıt boya olarak Mayer’s hematoksilende 30 saniye boyama yapıldı. Son olarak akarsuda 5 dakika yıkanan kesitler alkol ve ksilol serilerinden geçirilerek aqueous mounting medium ile kapatıldı.
İmmunohistokimyasal olarak karaciğer ve böbrek dokularındaki aktif kaspaz-3 aktiviteleri binoküler başlıklı fotomikroskop özelliğine sahip ışık mikroskobunda (Olympus BX- 51, Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, JAPAN) incelendi ve fotoğrafları çekildi. Doku kesitlerindeki kaspaz-3 pozitif hücreler kahverengi boyanma gösterdi ve boyanma yoğunluğuna bakılarak (-; boyanma yok, +; zayıf, ++; orta derecede , +++; şiddetli) değerlendirildi.
2.2.6.3. İstatistik Analizler:
İstatistiksel analiz için SPSS 21 paket programından yararlanıldı (69). Değerlendirmede verilere One-way Anova testi uygulandı, gruplar arasındaki önemliliğin belirlenmesinde ise Duncan çoklu karşılaştırma testi uygulandı. Sonuçların istatistiksel olarak değerlendirmesinde önemlilik, p<0.05 esasına göre ele alındı.
3. BULGULAR 3.1. Grupların Yem Tüketimi Değerleri
Araştırma gruplarının canlı ağırlık, canlı ağırlık değişimi ve yem tüketimi sonuçları Tablo 2’de sunulmuştur. Elde edilen veriler incelendiğinde canlı ağırlık değerleri bakımından yapılan ölçümlerin tamamında gruplar arasında önemli bir fark oluşmadığı, çalışma boyunca Cu grubundaki ratların canlı ağırlık değişimi miktarı diğer gruplardan rakamsal olarak düşük olduğu ve bu durumun 15-21. ve 1-21. gününlerde istatistiksel olarak önem kazandığı tespit edildi (p<0.01).
Araştırmanın YT değerleri incelendiğinde, denemenin her döneminde Cu grubunun YT’nin diğer grupların YT’nden istatistiksel olarak düştüğü görüldü. En yüksek YT’nin 15-21. günlerde Kontrol grubunda (22.92 g) ve en düşük YT’nin ise 15-21. günlerde Cu grubunda (16.83 g) olduğu belirlendi (p<0.01).
3.2. Gruplarının Canlı Ağırlık Ortalamaları
Araştırma gruplarının canlı ağırlık ortalamaları Tablo 2’de sunulmuştur. Cu verilen grupların canlı ağırlıklarında diğer gruplardan daha düşük bir artış gözlenirken, Kontrol, Fluniksin ve Krisin gruplarının Cu’lı gruplara göre canlı ağırlığı rakamsal olarak iyileştirdiği belirlendi.
3.3. Gruplarının Canlı Ağırlık Değişimleri
Çalışmanın toplamında ve 15-21. günlerinde Cu verilen grubun canlı ağırlık değişimi diğer gruplardan önemli derecede düşük olduğu tespit edildi (p<0.01). Araştırmanın genelinde (1-21. gün) Kontrol ile Krisin gruplarının canlı ağırlık değişimleri benzerlik gösterdiği belirlendi (p<0.01). Araştırma gruplarının dönemlere göre canlı ağırlık değişimleri Tablo 2’de sunulmuştur.
Tablo 2: Deneme gruplarının performans parametreleri üzerine etkileri
Kontrol Cu FM Krisin Cu+FM Cu+Krisin P
Canlı Ağırlık (g/hyv)
Başlangıç 251±13.4 249.5±16.8 249±14.3 249.5±17 248.8±14.9 250.5±8.3 ÖD 7. gün 275.4±14 265.3±15.7 271.3±17.6 272.7±15.5 266.7±14.3 269.4±8.3 ÖD 14. gün 291.5±12.7 274.9±17.6 286.6±16.4 288.5±14.5 277.5±13.7 280.8±4.3 ÖD 21. gün 312.8±13.9 285.4±17.9 306.7±16.4 309±13.8 302.7±15.2 300.4±4.5 ÖD
Canlı Ağırlık Değişimi (g/hyv/gün) 1-7 4.07±0.35 2.64±0.5 3.72±0.59 3.86±0.36 2.98±0.69 3.15±0.42 ÖD 8-14 2.29±0.37 1.37±0.32 2.18±0.24 2.26±0.42 1.54±0.55 1.62±0.58 ÖD 15-21 3.04±0.32a 1.5±0.12b 2.89±0.17a 2.93±0.25a 2.73±0.14a 2.80±0.09a ** 1-21 3.09±0.07a 1.79±0.21b 2.89±0.16ab 2.97±0.26a 2.26±0.33ab 2.49±0.19ab ** Yem Tüketimi (g/hyv/gün) 1-7 22.74±1.46 19.93±1.08 22.56±0.85 22.68±0.67 20.40±1.83 21.78±1.06 ÖD 8-14 23.33±0.29a 17.41±1.15c 22.56±0.53a 22.92±0.67a 19.2±0.63bc 19.80±0.79b ** 15-21 22.92±0.84a 16.83±1.37c 22.38±1.06ab 22.44±1.05ab 18.66±0.55bc 18.54±2.17bc ** 1-21 22.99±0.64a 18.06±0.90c 22.50±0.48a 22.68±0.69a 19.42±0,71bc 20.04±1.04ab ** ÖD: İstatistiki olarak önemli değil. **: p<0.01; abc: Aynı satırda farklı harfler taşıyan değerler birbirinden farklı bulunmuştur.
3.4. Grupların Bazı Biyokimyasal Parametre Değerleri
Araştırma gruplarının bazı biyokimyasal parametreleri Tablo 3’de verilmiştir. HDL, LDL, VLDL, total kolesterol, trigliserit, total protein, albümin, kreatinin, globulin ve BUN değerlerinin istatistiksel olarak etkilenmediği belirlendi (p<0.05). Glikoz ve kortizol değerleri diğer gruplardan önemli derecede yüksek olarak Cu grubunda ölçüldü (p<0.05). Yine Cu grubunda AST düzeyi bütün gruplardan anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0.05).
Tablo 3: Deneme gruplarının kan parametreleri üzerine fluniksin ve krisin’in etkileri
Kontrol Cu FM Krisin Cu+FM Cu+Krisin P
Glikoz (mg/dL) 90.75±3.96b 103.66±4.03a 94.20±1.32b 93.80±1.68b 90.60±1.60b 92.80±1.65b * Kortizol (ug/dL) 0.47±0.03c 0.75±0.04a 0.48±0.06c 0.47±0.02c 0.64±0.01b 0.62±0.02b ** HDL (mg/dL) 16.37±0.49 15.98±.029 16.71±0.60 16.46±0.41 15.78±0.69 16.02±0.64 ÖD LDL (mg/dL) 10.00±0.40 11.02±0.21 10.20±0.58 10.51±0.20 10.24±0.30 10.84±0.49 ÖD VLDL (mg/dL) 8.65±0.38 9.96±0.98 8.68±0.13 8.40±0.38 9.08±0.63 9.32±0.24 ÖD Total Kolesterol (mg/dL) 35.02±0.56 36.96±1.16 35.59±0.66 35.37±0.44 35.10±0.96 36.18±0.45 ÖD Trigliserit (mg/dL) 9.32±1.93 49.83±4.93 43.40±0.68 42.00±1.89 45.40±3.18 46.60±1.20 ÖD AST (U/L) 209.75±25.26b 266.33±13.02a 216.00±12.08b 211.40±4.77b 238.60±11.26ab 225.60±8.56b * ALT (U/L) 71.50±1.84c 88.16±2.65a 72.60±2.15bc 73.00±2.72 bc 80.00±3.57b 78.60±1.07bc ** Total Protein (g/dL) 5.18±0.12 5.29±0.09 5.19±0.08 5.22±0.09 5.28±0.11 5.25±0.14 ÖD Albümin (g/dL) 3.30±0.10 3.58±0.05 3.36±0.20 3.34±0.07 3.48±0.13 3.53±0.13 ÖD Kreatinin (mg/dL) 0.28±0.01 0.27±0.02 0.28±0.01 0.31±0.01 0.24±0.06 0.27±0.02 ÖD Globulin (g/dL) 1.88±0.13 1.71±0.08 1.82±0.20 1.88±0.08 1.80±0.21 1.71±0.18 ÖD BUN (mg/dL) 55.25±0.94 59.50±1.23 55.80±1.93 55.90±1.14 57.00±1.14 56.10±1.70 ÖD
GSH, SOD ve CAT Aktiviteleri
Araştırma gruplarının karaciğer (Tablo 4) ve böbrek (Tablo 5) dokularındaki MDA düzeyi ile GSH, SOD ve CAT aktiviteleri aşağıda verimiştir. Veriler incelendiğinde (Tablo 4 ve Tablo 5), her iki dokunun Cu grubundaki MDA düzeylerinin diğer gruplardan önemli derecede yüksek olduğu ve Cu+Krisin ile Cu+Fluniksin grubuplarında krisin ve Fluniksin’in benzer şekilde önemli derecede iyileştirici etki gösterdiği belirlendi (p<0.001).
Tablo 4: Deneme gruplarının karaciğer dokusundaki MDA (µg/ml homojenat) düzeyleri ile GSH (nmol/mg protein) SOD (U/ml) ve CAT (k/g protein) aktiviteleri
Kontrol Cu FM Krisin Cu+FM Cu+Krisin P
Ka ra ciğ er MDA 2.42±0.13c 3.84±0.16a 2.23±0.16c 2.15±0.21c 2.94±0.14b 3.05±0.19b *** GSH 19.07±0.57a 9.80±0.75c 18.45±1.85a 17.82±1.32a 14.48±1.13b 13.90±0.97b *** SOD 0.24±0.01a 0.16±0.01c 0.27±0.02a 0.26±0.02a 0.19±0.01bc 0.20±0.01ab *** CAT 0.77±0.02a 0.18±0.01d 0.73±0.02 ab 0.70±0.03b 0.30±0.01c 0.27±0.01c *** abcd: Aynı satırda farklı harfler taşıyan değerler birbirinden farklı bulunmuştur. ***: P<0.001
Tablo 5: Deneme gruplarının böbrek dokusundaki MDA (µg/ml homojenat) düzeyleri ile GSH (nmol/mg protein). SOD (U/ml) ve CAT (k/g protein) aktiviteleri
Kontrol Cu FM Krisin Cu+FM Cu+Krisin P
Bö bre k MDA 6.06±0.31c 11.23±0.27a 6.71±0.44c 6.69±0.44c 8.51±0.20b 8.64±0.26b *** GSH 25.48±2.39a 14.84±0.86c 22.13±1.59ab 22.36±1.79ab 17.62±1.48bc 15.39±1.91c ** SOD 0.27±0.03a 0.10±0.01c 0.25±0.01a 0.23±0.01a 0.17±0.02b 0.16±0.02b *** CAT 0.68±0.01a 0.14±0.01c 0.62±0.01a 0.65±0.03a 0.30±0.01b 0.25±0.01b *** abc: Aynı satırda farklı harfler taşıyan değerler birbirinden farklı bulunmuştur. **: P<0.01, ***:
krisin guruplarında birbirine benzer olarak en yüksek, Cu+Flu ve Cu+Krisin guruplarında ise yine birbirine benzer olarak Cu gurubundan önemli derecede daha yüksek olduğu görüldü (p<0.001). Karaciğer SOD aktivitesi Cu+Krisin grubunda Cu+Flu grubundan (p<0.001), böbrek GSH aktivitesinde ise Cu+Flu grubunda Cu+Krisin grubundan (p<0.01) önemli derecede daha iyi iyileştirici etki gösterdiği tespit edildi. Karaciğer CAT Aktivitesinde yine Cu+Flu ve Cu+Krisin gruplarında benzer şekilde iyleştirici etki görüldü (p<0.001).
3.6. Grupların Plazma TNF-α Düzeyleri
Grupların plazma TNF-α düzeyleri incelendiğinde (Tablo 6), TNF-α düzeyinin Kontrol, Fluniksin ve Krisin gruplarında benzer şekilde en düşük, Cu grubundaki ise diğer gruplardan önemli derecede yüksek olduğu ve Cu+Krisin ile Cu+Fluniksin grubuplarında krisin ve fluniksin’in benzer şekilde önemli derecede iyileştirici etki gösterdiği belirlendi (p<0.001).
Tablo 6: Deneme gruplarının plazma TNF-α (pg/ml) düzeyleri
Kontrol Cu FM Krisin Cu+FM Cu+Krisin P TNF-α 106.22±2.65c 164.32±5.26a 114.43±3.32c 114.44±3.08c 129.62±3.38b 131.25±2.49b *** abc: Aynı satırda farklı harfler taşıyan değerler birbirinden farklı bulunmuştur. ***: P<0.001
3.7. Grupların Işık Mikroskobik Bulguları 3.7.1. Kontrol Grubu
Karaciğer ve böbrek dokularının yapılan ışık mikroskobik incelemelerinde normal bir morfolojiye sahip oldukları görüldü (Şekil 1, 2). Kaspaz metodu ile boyanan karaciğer ve böbrek kesitleri incelendiğinde ise herhangi bir pozitif boyanmaya rastlanmadı (Şekil 3, 4).
Şekil 1: Kontrol grubu normal karaciğer görünümü, H&E.
Şekil 2: Kontrol grubu normal böbrek görünümü, H&E.
Şekil 3: Kontrol grubu normal karaciğer görünümü, Kaspaz.
Şekil 4: Kontrol grubu normal böbrek görünümü, Kaspaz.
3.7.2. Bakır Grubu
Karaciğerde mikroskobik olarak ilk dikkat çekici bulgu şiddetli sentrilobuler hepatosellüler dejenerasyon ve nekroz idi (Şekil 5). Karyolitik çekirdekli fokal nekroz alanlarının yanı sıra bazı hepatositlerde karyomegali göze çarptı (Şekil 6). Çift çekirdekli hepatosit formasyonları ile mitotik aktivitenin varlığı belirlenirken Kupffer hücrelerinde de proliferasyon dikkati çekti (Şekil 7, 8).
periportal bölgelerde de mononükleer inflamatuar hücre infiltrasyonları gözlendi (Şekil 11). Bazı sentral venlerin çevresinde vakuolizasyonla birlikte yağ dejenerasyonu ve nekroz tespit edildi (Şekil 12). Ayrıca bazı sentral venlerde hiperemi ile beraber dilatasyon belirlenirken (Şekil 13) bazılarında da hiyalin kalıntısı mevcut idi (Şekil 14). Bazı hepatik kord alanlarında disorganizasyon görülürken bazı bölgelerde de hekzagonal karaciğer lobüllerinin kısmi yokluğu gözlendi. Ayrıca bazı portal alanlarda safra kanalı proliferasyonu tespit edildi (Şekil 15).
Böbreklerin ışık mikroskobik incelemesinde korteks bölgesinde bulunan tubuluslardan çoğunlukla proksimal ve daha az olarak distal tubulusların şiddetli dejenerasyonu ve nekroz dikkati çekti (Şekil 16). Proksimal tubulusların epitel hücrelerinde şişme, karyomegali ve karyolizis görüldü (Şekil 17). Bazı proksimal tubuluslarda konjesyonun yanı sıra bazılarının lümeninde epitelyal hücre deskuamasyonu ve hiyalin silindirlerine rastlandı (Şekil 18, 19). Kortekste bulunan bazı glomeruluslarda ise büzüşme ile birlikte konjesyonun varolduğu görülürken bazal membranın da kalınlaştığı göze çarptı. Bowman kapsülünde ise dilatasyon ve dejenerasyon tespit edildi (Şekil 20). Korteksin intersitisyel dokusundaki kan damarlarında ise konjesyon ve fokal mononükleer hücre infiltrasyonları gözlendi (Şekil 21, 22).
Kaspaz metodu ile boyanan karaciğer dokularında hepatositlerde, böbrek dokularında ise çoğunlukla proksimal ve daha az olarak da distal tubuluslarda kontrol grubuna göre şiddetli derecede pozitif reaksiyon gösteren apoptotik hücrelere rastlandı (Şekil 23, 24, 25, 26). Pozitif boyanmanın hem çekirdek hem
Şekil 4: Bakır grubu karaciğerde sentrilobuler hepatosellüler dejenerasyon ve nekrotik hücreler (oklar), H&E.
Şekil 5: Bakır grubu karaciğerde hepatositte karyomegali (kalın ok) ve karyolitik çekirdekli fokal nekroz alanları (ince oklar), H&E.
Şekil 6: Bakır grubu karaciğerde çift çekirdekli hepatositler (oklar), H&E.
Şekil 7: Bakır grubu karaciğerde Kupffer hücrelerinde proliferasyon (oklar), H&E.
Şekil 8: Bakır grubu karaciğerde sinuzoidlerde vazokonjesyon ve dilatasyon (oklar), H&E.
Şekil 9: Bakır grubu karaciğerde sinuzoidlerde vazokonjesyon ve dilatasyon (oklar), H&E.
Şekil 10: Bakır grubu karaciğerde periportal bölgelerde mononükleer inflamatuar hücre infiltrasyonları (oklar), H&E.
Şekil 11: Bakır grubu karaciğerde Vena Sentralis çevresinde
vakuolizasyonla birlikte yağ dejenerasyonu ve nekroz (oklar), H&E.
Şekil 12: Bakır grubu karaciğerde Vena Sentralis’te hiperemi ile beraber dilatasyon (oklar), H&E.
Şekil 13: Bakır grubu karaciğerde Vena Sentralis’te hiyalin kalıntısı (ok), H&E.
Şekil 14: Bakır grubu karaciğerde hepatik kord alanlarında
disorganizasyon (ince oklar) ve portal bölgede safra kanalında proliferasyon (kalın oklar), H&E.
Şekil 15: Bakır grubu böbrek korteksinde tubulusların
dejenerasyonu ve nekrotik hücreler (oklar), H&E.
Şekil 16: Bakır grubu böbrek korteksinde proksimal tubulusların epitel hücrelerinde şişme,
karyomegali (uzun oklar) ve karyolizis (kısa ok), H&E.
Şekil 17: Bakır grubu böbrek korteksinde proksimal tubuluslarda konjesyon (kısa ok) ve epitelyal hücre deskuamasyonu (uzun oklar), H&E.
Şekil 18: Bakır grubu böbrek korteksinde proksimal tubulusta hiyalin silindirleri (ok), H&E.
Şekil 19: Bakır grubu böbrek
korteksindeki glomerulusta büzüşme ile birlikte konjesyon (yıldız), bazal membranda kalınlaşma (oklar), Bowman kapsülünde dilatasyon ve dejenerasyon (kare), H&E.
Şekil 20: Bakır grubu böbrek
korteksinin intersitisyel dokusundaki kan damarlarında konjesyon (oklar), H&E.
Şekil 21: Bakır grubu böbrek
korteksinde fokal mononükleer hücre infiltrasyonları (oklar), H&E.
Şekil 22: Bakır grubu karaciğerde hepatositlerde aktif kaspaz-3 pozitif reaksiyon, Kaspaz.
Şekil 23: Bakır grubu karaciğerde hepatositlerde aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz.
Şekil 24: Bakır grubu böbrek
korteksinde tubulus epitellerinde aktif kaspaz-3 reaksiyon, Kaspaz.
Şekil 25: Bakır grubu böbrek korteksinde tubulus epitellerinde aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz.
3.7.3. Fluniksin Meglümin Grubu
Karaciğer ve böbreklerin mikroskobik değerlendirmeleri sonucunda kontrol grubuna benzer şekilde, normal histolojik görünümlerini korudukları tespit edildi (Şekil 27, 28). Her iki dokuya ait kesitler incelendiğinde kaspaz pozitif olmayan zayıf boyanmaya rastlandı (Şekil 29, 30).
Şekil 26: FM grubu normal karaciğer görünümü, H&E.
Şekil 27: FM grubu normal böbrek görünümü, H&E.
Şekil 28: FM grubu karaciğerde çok az sayıda hepatositte pozitif olmayan aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz.
Şekil 29: FM grubu böbrek
korteksindeki çok az sayıda tubulusta pozitif olmayan aktif kaspaz-3 reaksiyonu (oklar), Kaspaz.
3.7.4. Krisin Grubu
Krisin verilen bu gruba ait karaciğer ve böbrek dokularının mikroskobik olarak kontrol grubu ile aynı morfolojik görünümü sergiledikleri gözlendi (Şekil 31, 32). Kaspaz metodu ile boyanan doku kesitleri incelendiğinde ise herhangi bir pozitif boyanmaya rastlanmadı (Şekil 33, 34).
Şekil 30: Krisin grubu normal karaciğer görünümü, H&E.
Şekil 31: Krisin grubu normal böbrek görünümü, H&E.
Şekil 32: Krisin grubu normal karaciğer görünümü, Kaspaz.
Şekil 33: Krisin grubu normal böbrek görünümü, Kaspaz.
3.7.5. Bakır-Fluniksin Meglümin Grubu
Bakır ile oluşturulan hasara karşı Fluniksin Meglümin uygulanan bu grup karaciğerlerin ışık mikroskobik incelemesinde; bakır grubuna ait karaciğerlerdeki yoğun dejeneratif, nekrotik ve infiltratif değişimlerin yerini hafif şiddette değişikliklerin aldığı saptandı (Şekil 35). Karyolitik çekirdekli fokal nekroz
formasyonları ile mitotik aktiviteye bağlı rejeneratif değişimler gözlendi (Şekil 37). Bakır grubu ile karşılaştırıldığında bu grupta; sinuzoidlerdeki vazokonjesyon ile dilatasyonun, sentral venlerdeki hiperemi ile dilatasyonun (Şekil 38) ve bazı hepatik kord alanlarındaki disorganizasyonun da hafiflediği göze çarptı (Şekil 39).
Böbreklerin ışık mikroskobik değerlendirmesinde, korteks bölgesinde bulunan tubulusların hafif şiddette dejenerasyon ve nekrozu dikkati çekti. Bakır grubu ile karşılaştırıldığında bu grupta; proksimal tubuluslarda gözlenen karyomegali, karyolizis, konjesyon, intraluminal hücre deskuamasyonu ve hiyalin oluşumlarının azaldığı tespit edildi (Şekil 40). Bakır grubundaki glomeruluslarda görülen büzüşme ve konjesyonun bu grupta hafiflediği görülürken bazal membranların da normal görünümde oldukları saptandı (Şekil 41). Korteksin intersitisyel dokusundaki kan damarlarında bulunan konjesyon ve mononükleer hücre infiltrasyonlarının ise azaldığı gözlendi(Şekil 42).
Karaciğer ve böbrek kesitleri immunohistokimyasal açıdan değerlendirildiğinde, kaspaz metodu ile pozitif boyanma gösteren apoptotik hücre yoğunluğunun orta derecede olduğu ve bakır grubuna kıyasla azaldığı görüldü. İmmunoreaktivite gösteren bu hücreler karaciğerde sentrilobuler bölgedeki hepatositler ile böbrekte korteks bölgesindeki proksimal ve distal tubuluslar idi (Şekil 43, 44, 45, 46).
Şekil 34: Bakır-FM grubu karaciğerde hafif derecede dejeneratif, nekrotik ve infiltratif değişiklikler, H&E.
Şekil 35: Bakır-FM grubu karaciğerde hepatositlerde karyomegali (uzun oklar) ve karyolitik çekirdekli fokal nekroz alanları (kısa ok), H&E.
Şekil 36: Bakır-FM grubu
karaciğerde çok sayıda çift çekirdekli hepatosit (oklar), H&E.
Şekil 37: Bakır-FM grubu karaciğerde sinuzoidlerde hafif vazokonjesyon (kalın oklar) ve dilatasyon (uzun ok), Vena
Senralis’te hafif hiperemi (yıldız) ve dilatasyon (kısa ok), H&E.
Şekil 38: Bakır-FM grubu
karaciğerde hepatik kord alanlarında hafiflemiş disorganizasyon, H&E.
Şekil 39: Bakır-FM grubu böbrek korteksindeki proksimal tubulus epitel hücresinde karyomegali (kısa ok) ile proksimal tubulusların lümeninde epitelyal hücre
deskuamasyonu (uzun ok) ve hiyalin oluşumları (kalın ok) H&E.
Şekil 40: Bakır-FM grubu böbrek korteksindeki glomeruluslarda hafif derecede büzüşme ve konjesyon (kısa ok), Bowman kapsülünde hafif dilatasyon (yıldız) ve bazal membranda normal görünüm (uzun ok), H&E.
Şekil 41: Bakır-FM grubu böbrek korteksinin intersitisyel dokusundaki kan damarlarında hafif konjesyon (uzun ok) ve mononükleer hücre infiltrasyonu, H&E.
Şekil 42: Bakır-FM grubu
karaciğerde bazı hepatositlerde aktif kaspaz-3 pozitif reaksiyon, Kaspaz.
Şekil 43: Bakır-FM grubu
karaciğerde birkaç hepatositte aktif kaspaz-3 pozitif reaksiyonu (oklar), Kaspaz.
Şekil 44: Bakır-FM grubu böbrek korteksinde bazı tubulus epitellerinde aktif kaspaz-3 reaksiyon, Kaspaz.
Şekil 45: Bakır-FM grubu böbrek korteksinde birkaç tubulus epitelinde aktif kaspaz-3 reaksiyonu (yıldız) ve pozitif aktif kaspaz- 3 reaksiyonu vermeyen birçok tubulus (kare), Kaspaz.
3.7.6. Bakır-Krisin Grubu
edildi. Bazı bölgelerde hafif derecede dejeneratif ve nekrotik değişiklikler gözlenirken bazı bölgelerde ise yoğun mitotik aktivitelere rastlandı (Şekil 47). Bakır grubuna kıyasla hepatositlerdeki karyomegalinin arttığı dikkati çekerken, sinuzoidlerdeki vazokonjesyon ile dilatasyonun ise azaldığı saptandı (Şekil 48). Yine bakır grubu karaciğerlerin hepatik kord alanlarında gözlenen disorganizasyon ve sentral venlerdeki hiperemi ile dilatasyonun da bu grupta kısmen düzeldiği göze çarptı (Şekil 49).
Bakır grubuna oranla bu grup böbreklerde; dejeneratif ve nekrotik değişikliklerin hafiflediği, infiltratif değişimlerin ise görülmediği tespit edildi. Korteks bölgesinde bulunan proksimal ve distal tubuluslarda birkaç nekrotik hücreye rastlandı (Şekil 50). Proksimal tubuluslarda gözlenen karyomegali, konjesyon, intraluminal hücre deskuamasyonu ve hiyalin silindirlerinin hafiflediği tespit edildi (Şekil 51). Bakır grubundaki glomeruluslarda görülen büzüşme ve konjesyonun bu grupta görülmediği bazal membranların da normal görünümde oldukları saptandı (Şekil 52).
Karaciğer ve böbrek kesitlerindeki pozitif kaspaz immunoreaktivite yoğunluğunun orta derecede olduğu ve bakır grubuna kıyasla azaldığı tespit edildi. Spesifik boyanma gösteren bu hücrelerin karaciğerdeki hepatositler ile böbrek korteksindeki tubuluslar olduğu görüldü (Şekil 53, 54, 55, 56).
Şekil 46: Bakır-Krisin grubu
karaciğerde çok sayıda çift çekirdekli hepatosit ile mitotik figürlü hepatosit (uzun oklar) ve karyolitik çekirdekli birkaç nekrotik hepatosit (kısa oklar), H&E.
Şekil 47: Bakır-Krisin grubu karaciğerde birçok hepatositte karyomegali (oklar) sinuzoidlerde hafif derecede vazokonjesyon ve dilatasyon, H&E.
