Turk Noro~irurji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Tannover: Slqan C6 Gliom Modeli: Manyetik Resonans De GorullWLeme
Sl~an
C6 Gliom Modeli: Manyetik Resonans ile Goriintiileme
C6 Rat Glioma
Model: Magnetic
Resonance
Imaging
NECMETTiNTANRIOVER,ZiYAAKAR, MUSTAFA UZAN,AYHANBiLiR, HA YDAR DURAK, RE$iT CANBEYLi, CENGiz KUDA Y,
lstanbul Universitesi, Cerrahpa~a TIP Fakultesi, Noro~irurji Anabilim Dah (NT, ZA, MU,CK), lstanbul Universitesi, lstanbul TIP Fakultesi, Histoloji ve Embriyoloji ABD(AB), lstanbul Universitesi, Cerrahpa~a TIP Fakultesi, Patoloji
Anabilim Dah (HD), Bogazi<;iUnivesitesi, Psikobiyoloji Laboratuan (RC)
Geli~ Tarihi: 30.3.2001 ~ Kabul Tarihi: 26.4.2001
Ozet: <;:ah~mamIzdaWistar sl<;anlannda olu~turulan SI<;an C6 gliom modeli histopatolojik ve nororadyolojik olarak incelendi. Aym zamanda bu tumor modelinde sl<;anlann klinik bulgulan ve ya~am surelerinin ortaya konmasl ama<;landl. <;:ah~mada SI<;anC6 gliom modelinde klinikte uyguladlglmlz 1.5 Tesla (T) Manyetik Resonans GoruntUleme (MRG) i<;inmmor inokulasyonu sohraSI en uygun zaman ve verilerin ortaya konmaSI ama<;landl. C6 gliom hucreleri laboratuarlarda hazIrlandlktan soma, 16 Wistar SI<;ammnsag hemisferlerine stereotaksi yardIml ile inokUle edildi. Tumor olu~umunu dogrulamak amaCI ile tumor inokUlasyonunu takiben 7 ile 9. gunler arasmda toplam 9 sl<;ana1.5 T MRG sistemi kullamlarak, diz koilleri ile goruntUleme yaplldl. 1x106C6 gliom hucresi inokUle edilen turn SI<;an beyinlerinde histopatolojik de-gerlendirmelerde malign gliom olu~umuna rastlandl. MRG ile degerlendirilen turn sl<;anbeyinlerinde sag hemisferde anaormal sinyal degi~ikliklerine rastlandl. Lezyonlann uygulanan hemotoksilen-eosin boyasmda MRG gorunmleri ile korelasyon gosterdigi gozlendi ve histopatolojik tam olarak malign gliom olduklan dogrulandl. lntraserebral C6 malign gliom modeli olu~turulan 16 SI<;ani<;inortalama ya~am suresi 29 gun olarak tespit edildi. SI<;anC6 gliom modelinde literamrden farkh olarak 1.5 T MRG sisterni ile en iyi goruntUyli diz koili kullanarak, kesit kalmhklanm 3mm olarak aldlglm1Zda elde ettik. Sonu<;olarak sl<;anlann kullamldlgl in vivo gliom modellerinde MRG, tumor olu~umunun dogrulanmasma olanak saglamakta ve mm or buylime h1ZIve tedaviye cevabm ortaya konmasmda onemli roller oynayabilmektedir.
Anahtar kelimeler. Deneysel MRG, SI<;anC6 gliom modeli,
Abstract: Experimental animal models are needed to highlight molecular and cellular characteristics of glial tumors, since the etiology and molecular genetics have not been delineated in these neoplasms. Our aim was to demonstrate the formation of C6 rat glioma model in Wistar rats through histopathological and neuroradiological examinations, and also to evaluate clinical findings and surveys of these rats. We wished to delineate the optimal time period and data for magnetic resonance imaging (MRI) in this particular tumor model. C6 glioma cells were implanted with the aid of stereotactic guidance into the brain of 16 Wistar rats. Magnetic resonance images, through 1.5 tesla (T) MR system with kneepa coils, were collected from 9 rats, between days 7 to 9 to confirm tumor formation. All rat brains, inoculated with 1x106 C6 glioma cells, demonstrated malignant glioma formation in histopathological examinations. MR images revealed abnormal signal changes in right hemispheres of all the rats examined, and these findings were confirmed as malignant gliomas with hematoxyline-eosine staining. Median survey of 16 rats in C6 glioma model in our study was similar to the literature (29 days). Distinct from the literature, optimal results for C6 rat glioma model in 1.5 T MRI were observed in kneepa coil and with a slice thickness of 3mm. In conclusion, MRI plays a major role in the confirmation of tumor formation and evaluation of tumor growth rate with its response to therapy in in vivo glioma models.
Tiirk Noro$iriirji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 TanY/over: Sl~an C6 Cliom Modeli: Manyetik Resolzans tie Corii/lWlell1e GiRi~
Merkezi sinir sistemi (MSS) maligniteleri, slk rastlamlan maligniteler arasmda bulunmamalanna ragmen, oIiimciil hastahklar slralamasmda eri~kinlerde ii~iincii, pediyatrik ya~ grubunda ise losemiden soma ikinci suada yer almaktadlr (7, 9). Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi gibi tiim agresif tedavi se~eneklerine ragmen maalesef malign gliomlarda 2-yllhk ya~am siiresi ancak %20'lerde kalmaktadu (26).
Malign gliomlarda etyoloji ve genetik alt yapl heniiz tarn olarak a~lklanamadlgmdan, bu tiimorlerin etyo-patogenezinin hiicresel ve molekiiler diizeyde ortaya konabilmesi, kemoterapotiklerin ve diger etkili ajanlann mekanizmalannm anla~llabilmesi i~in deneysel ~ah~malarda birtaklm hayvan modelleri kullamlmaktadlr. Bu ~ekilde yeni tedavi metodlanmn etkinliginin ortaya konulmasl kadar, bu tip invasif neoplasmlann biolojisinin a~lga kavu~turulmasmda hayvanlarda olu~turulan in vivo gliom modelleri onemli bir yer tutmaktadlr. Hayvanlarda gliom olu~turmak i~in kullamlan en etkili kimyasal maddelerin ba~mda alkalizan ajanlar gelmektedir (5, 6).
Laboratuarlar i~in uygun olan kii~iik hayvanlarda uygulanabilen, gliom modelleri, malign gliomlann in vivo ozelliklerini ortaya koymak ve tedaviye cevaplanm belirlemek i~in giiniimiizde slkhkla olu~turulmaktadu. Bunlarm i~inde en fazla kullamlanlan, C6 gliom ve 9L gliosarkom modelleridir (2,6). C6 hiicre kiiltiirleri, metil nitroziireye ardl~lk ~ekilde maruz kalml~ Wistar sl~anlannda olu~an beyin tiimorleri kiiltiirlerinden elde edilmektedir (3).
C6 hiicreleri gliomlann in vivo ozelliklerinin incelenmesinde giiniimiize kadar ba~an ile kullamlml~hr. Bu ozellikler arasmda tiimor hiicre invazyonu 0,5, 13, 14, 19,23), migrasyon (6, 22), ve kan-beyin bariyeri ge~irgenligi sayllabilir (21). Bununla birlikte sl~an C6 gliom modelinde kemoterapi (8,28), radyoterapi (7), gen tedavisi (4) gibi tedavi alternatifleri literatiirde denenmi~tir. Sl~anlarda olu~turulan in vivo C6 ve diger gliom modelleri literatiirde ~e~itli ~ah~malar ile nororadyolojik a~ldan degerlendirilmi~tir 00, 16, 20, 25, 27). Literatiirde sl~an C6 gliom modelinin manyetik resonans goriintiileme (MRG) ile incelendigi bir~ok ~ah~ma olmasma kar~m, bu ~ah~malarda ozel hazlrlanml~ yiiksek tesla (T) MRG cihazlan tercih edilmektedir (11, 12, 15, 18, 29).
Aynca C6 gliom hucre implantasyonu somaSl MRG'nin uygulanacagl ideal zaman dilimi konusunda da tarn bir fikir birligi olu~maml~tlr.
<::ah~mamlzda Wistar sl~anlannda C6 gliom modeli olu~turulmu~ ve bu modelin olu~turulmasl siiresince dikkat edilmesi gereken noktalar gozden ge~irilmi~tir. Hiicre implantasyonu somasl, klinikte uyguladlglmlz 1.5 T MRG ile tiimor olu~umu konfirmasyonu yapIlml~hr. 1.5 T MRG i~in tiimor inokiilasyonu somaSl en uygun zaman ve veriler ara~tlnlml~tlr. Tiimor olu~turulan biitiin denekler sakrifiye edildikten soma histopatolojik olarak incelenmi~, ve MRG tetkikleri ile korelasyonlan ara~tmlml~tIr.
GERE<;LER ve YONTEM
Hiicre Kiiltiirii: Sl~an C6 gliom hiicre kiiltiirii
American Type Culture Collection'dan (ATCC®l 07-CCL) (Rockville, Maryland, USA) saglandlktan soma Hiicre Kiiltiirii Laboratuarlannda ~oziildii. %5 dimetyl sulfoxide ile donmu~ olarak laboratuanmlza gelen hiicreler iki dakika 37°C' de ~oziindiikten soma, buz i~inde bulunan taze hazlrlanml~ %10 Fetal Calf Serumlu ortama ~ok yava~ ahndI. Daha sonra C6 hiicreleri 1500 rpm' de 3 dk. sure ile santrifiij edilerek donma ortammdan kurtanldI. Bu i~lemin sonrasmda hiicreler tekrar serumlu ortam ile 3 dakika YlkandIlar ve 5ml taze hazlrlanml~ ortamda suspansiyon haline getirilerek 25 cm2'lik steril polypropilen kiiltiir ~i~elerine almdI.
H iicreler i~erisinde %10 fetal calf serum, 100 IU penisilin, 100 gr / ml streptomycin, 50 gr / ml gentamisin i~eren Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)- DME-F12 (Gibco Co/BRL, Gaithersburg, MD, USA)' de haftada iki kere pasajlan yapIlarak iiretildi. Hiicreler, inkiibatorde 37C'de, %5 CO2 hava kan~lml ve 1 atmosfer basm~ altmda, doku kiiltiirlerinde tek tabaka olarak biiyiime gosterdi.
C6 glioma hiicrelerinin eksponensiyel biiyiime fazma geldikleri invert mikroskopta gozlemlendikten sonra, hiicreler tripsinize edilerek santrifiij edildi. Siipernatan ahldlktan sonra hiicreler taze hazulanml~ %10 fetal calf serum i~eren DME-F12 medyumu ile tekrar suspansiyon haline getirildi. Hemositometre ile hiicre saYlml ve viabilite oranlan sayIldlktan sonra 200,000 viable hiicrefl..tl olacak ~ekilde hiicre siispansiyonu hazlrlanarak, ~abuk inokiilasyon i~in buz i~inde hayvan laboratuarma ula~tmldl (Tablo 1).
Tiirk Noro~iriirji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Tannover: 5zqan C6 Cliorn Modeli: Manyetik Resonalls De Coriil/fii/erne Tablo 1: Sl<;anC6 gliom hiicre kiiltiirii'niin histoloji laboratuannda hazlrlam;>I
C6 Gliom Hiicre Kiiltiirii
=}
N-nitroso-methyl-urea
ile
olu~turulan
GBM modeli
eks.C6 hucreleri
l
trypsinizasyontripsynize
C6 hucreleri
I
santrifUgasyon + "'" DMEM ile suspansiyonsantrifuj
+resuspansiyon
~ATCC-C6 slC;an gliom hucre
(5% dimetyl-sulfoxide)
azulen C6 hucreler
,%10 FCS + 1500 rpm
santrifUj
sl~an
C gliom hucreleri'DMEM-F12(GibCO
+
hft 2 kez pasaj Co)eksponensiyal faz
~200
konsantrasyon
000 C6
hucrelul
Tiimor inokiilasyonu: <::ah;;mamlzda hayvan
laboratuarlannda yeti;;tirilmi;;, aguhklan 150-230gr arasmda degi;;en, saf, yeti;;kin di;;i 16 ad et Wistar Sl<;an kullamldl. Sl<;anlar gene I anestezi i<;in intraperitoneal ketamine (50mg/kg) uygulamlmasml takiben, prone pozisyonda stereotaksi aletine (Kopf Ins. Tujunga, CA) yerle;;tirildi.
Sl<;anlann ba;;lan %1O'luk povidine iodine ile hazlrlamp, tra;; edildikten soma, midsagital, ortahat scalp insizyonu ile operasyona ba;;landl ve periosteum disseke edildi. Temporal kas serbestle;;tirilerek, 3/0 ipek askl diki;;i ile retrake edildi. Koronal ve lambdoid siitiirler ortaya Konduktan soma, bregma merkez nokta olarak kabul edildi ve her Sl<;ani<;inbu bolgenin koordinatlan kaydedildi. Stereotaktik koordinatlar e;;liginde, bregma'nm 2.2inin anterior - 2.5 mm lateral klsmma di;;<;idrill'i ile burr-hole a<;lldl.Dura'ya ula;;Ildlgmda, her Sl<;an i<;in stereotaksik koordinatlar yeniden
ahndl. .
Bu a;;ama-da buz i<;inde ependorf tiipleri ile steril ;;artlarda getirilen 5 Ill! Sl<;an(1x106C6 gliom hiicresi) olarak hazulanml;; hiicreler 10 ml'lik Hamilton mikro;;mngaSma (Hamilton Co,Reno,NV) 5'er IIIolarak <;ekildi.Dura No 11bistiiri ile a<;Ildlktan soma Hamilton mikro;;mngasl ile 2.5mm derinlige girildi ve tiimor inokiilasyonuna 1 Ill/ dk'hk
enjeksiyon hlZl ile ba;;landl ($ekil I). 5dk'hk siire i<;inde tamamlanan tiimor inokiilasyonunun ardmdan, retrograd tiimor ta;;mmasml engellemek ve difiizyona zaman tammak amaCl ile igne 5dk siire ile aym yerde blrakIldl. Daha soma 1-2 dk i<;inde Hamilton mikro;;mngasl geri <;ekildi,yara yeri saline ile irrige edilip temizlendikten soma, kemik defekt steril bone-wax ile kapatIldl. Saline ile tekrar irrigasyonu takiben, cilt-altl ve cilt tek tabaka halinde 3/0 serbest ipek ile kapahhp operasyona son verildi.
MRG uygulamasl: Toplam 9 sl<;ana tiimor inokiilasyonunu takiben 7 ile 9. giinler arasmda MR goriintiileme yapIldl (3 sl<;an/ giin). MRG tetkikleri General Electric 1.5 tesla MRG sistemi (GE,Waukesha, Wisconsin, USA) ile kneepa - (diz) coil'i kullamlarak ger<;ekle;;tirildi. Tiim sl<;anlarda oncelikle T2-aguhkh koronal sekanslar ahndl. En iyi goriintiileme'nin efektif echo time (TE) 85 msec ve repetititon time (TR) 5 sec oldugunda ahndlgl gozlendi.
Sekanslarda field of view (FOV) 12x12 veya 8x8, matrix 256x256/4 NE X, kesit kahnhklan ise 3mm olarak ahndl. Sl<;anlardii;;iik dozda anestetik ajanm (ketamine- 30mg/kg) intraperitoneal uygulammml takiben, tahta bir platformda prone pozisyonda micropore Haster yardlml ile hareketsiz halde MRG cihazma ahndl ve her Sl<;an i<;in T2 aguhkh
Turk Noro~irurji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Ta/mover: Slqan C6 Gliom Modeli: Manyetik Resonans De Goriilltiileme
$ekill: Sl<;anlargenel anestezi altmda, prone pozisyonda stereotaksi aletine yerle~tirilip, 10ml'lik Hamilton mikro~mngasl ile tiimor inokiilasyonu 1 Jll/ dk olarak ger<;ekle~tirildi
sekanslarda (5000/85) koronal kesit goriintiilemeleri yapIldl.
ilk bir haftadan itibaren norolojik bulgu vermeye ba$layan slGanlardan, koronal T2-aguhkh MR kesitleri alman tiim deneklerde goriintiilemede anormal sinyal degi$iklikleri tespit edildi.
Gozlem ve Dekapitasyon: SlGanlar implantasyonun ilk giiniinden itibaren giinliik aktivitelerinin ve genel durumlarmm takibi amaClile gozlem altma ahndl, iiG giinde bir aglrhk takipleri yaplldl. Gozlemler ya$am siireleri aGlsmdan miimkiin oldugunca objektif yapIlmasma Gah$lldl. YapIlan degerlendirmeler sonrasmda etraflan ile ilgileri kesilen, kendi kendine beslenemeyen ve dl$ardan verilen uyancllara yamt vermeyen slGanlar
genel anestezi altmda sakrifiye edildi. Her SlGaniGin aguhk takipleri, yeni geli$en norolojik bulgular, ve ya$am siireleri kaYlt edildi.
Oekapitasyon sonraSl beyin % 4'liik formalin soliisyonuna almdl, ve histolojik olarak para fin bloklan hazlrlandl. Ardl$lk 10m'luk koronal kesitler hazlrlandl ve her SlGaniGinen az 1 adet hematoxyline-eosin (H&E) boyasl yaplldl. Histopatolojik degerlendirme noropatologlar tarafmdan yapIldl. SlGan beyinlerinden ahnan histolojik kesitlerde, tiimoriin genel ozellikleri degerlendirildi, nekroz alanlan ortaya kondu.
SONU~LAR
Tiimor olu~umu: ~ah$mada kullamlan 16 slGamn tiimiinde (%100), intrakraniall xl06C6 gliom
hiicresi inokiilasyonu sonraSl, glioblastoma multi forme (GBM) ozelliklerine sahip malign gliom olu$umu saptandl. Norolojik ilk bulgular himor implantasyonu sonraSl 6 ve 7. giinlerde sol hemiparezi $eklinde ortaya Glktl. En slkhkla ortaya Glkan norolojik bulgular letarji ve hemiparezi idi (Tablo 2). Sol hemiparezi geli$en 8 SlGan da dahil olmak iizere rum slGanlarda dekapitasyon sonraSl sag serebral hemisferde, frontal bolgede enjeksiyon sahasmda tiimor olu$umu tespit edildi. Bir slGanda muhtemelen tiimoriin subaraknoid mesafeye yaYlhmma ya da korteksten dogrudan uzammma bagh, ekstrakalvarial biiyiime gosteren, ekstraaksiyel intrakraniallezyon goriildii.
Oenekler iGinde9 SlGanatiimor inokiilasyonunu takiben 7 ile 9. giinler arasmda, tiimor olu$umunu dogrulamak amaCl ile General Electric 1.5 tesla MRG sistemi kullamlarak, kneepa coil'inde MRG yaplldl. Tiim slGanlarda T2-aguhkh aksiyel ve koronal kesitler ahndl. Koronal T2-aglrhkh MR kesitleri ahnan 9 slGanda da goriintiilemede anormal sinyal degi$ikliklerine rastlandl. Tiim slGanlarda sag frontal bolgede yer alan hiperintens intraaksiyellezyonlar, tipik olarak enjeksiyon sahasmda gozlendi. MRG'si yapllan 9 SlGamn 5'inde orta hatta sapma ve ventrikiillere belirgin basl gozlendi ($ekiI2a, 2b). MR goriintiilemelerin yapIldlgl giinler arasmda belirgin bir farkhhk saptanmadl. MRG'si yapllan tiim denekler, Gah$ma kriterlerinde dekapite edildikten soma yapllan histopatolojik incelemelerde MRG'deki patolojiler ile yiiksek dereceli tiimorler arasmda anatomik korelasyon gozlendi.
Survey: intraserebral C6 glioma modeli olu$turulan 16 SlGan iGin median survey 29 giin
Turk Noro~irurji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Tannover: Sz(an C6 Gliom Modeli: Manyetik Resonalls ile Goriintiileme Tablo 2: Deneklerin aguhklan, norolojik bulgulan, survey zamanlan daglllml.
Sl<;anlar Noro!. BulSon AglrhkllkAglrhkSurveyZam
Rat 1 hemipar+let1909r200gr39gun
Rat 2 200gr205gr
let31gun
Rat3 hemipar+let200gr1909r35gun
Rat 4 hemipar+let1909r200gr28gun
Rat5 let+ani 01210gr185gr16gun
Rat 6 ani 01205gr1909r16gun
Rat7Rat 8 letani 01185gr200gr1909r22gun1909r13gun
Rat9 200grlet205gr36gun
Rat 10Rat 13Rat16Rat 11Rat 15Rat 12Rat 14 hemipar+lethemipar+lethemipar+let210grhemipar+let210grlet200gr175gr180gr200grhemipar+letlet+ex.axYKL180gr220gr40gun30gun1909r35gun210gr200gr34gun230gr1959r200gr34gun23gun32gun
AGlklamalar Norol. Bul. Norolojik bulgular, Survey zam. Survey zamam, hemipar. hemiparezi,Let. letarji, ani 01. ani olUm, eX.ax. YKL. Ekstraaksiyel yer kaplayan lezyon.
(range 13-40) olarak tespit edildi. Ekstraaksiyel intrakranial lezyon gozlenen sl<;an, son iki gunde geli~en letarji somaSI 23. gunde kaybedildi.
Histopatolojik Bulgular: Turn sl<;anlarda dekapitasyon somas1, beyinler 2 gun %4 formalin
soliisyonunda bekletildi. Oncelikli olarak makroskopik incelemeleri yapIldl. Deneklerin
tamammda enjeksiyonun yapIldlgl sag serebral hemisferde, frontal bolge merkezli etrafmda odem alam olu~turan ve kom~u yapIlara basl yapan yuksek dereceli glial tumor ile uyumlu lezyonlar saptandl ($ekil 3). Daha soma tUrn beyinlerden histolojik olarak parafin bloklan hazulandl. Ardl~lk olarak hazlrlanan 1OIl'Iuk koronal kesitlerden, her Sl<;ani<;in en az 1 adet H&E boyasl uygulandl. <;:ah~madaki
$ekil2a, 2b: Koronal T2-aglrlIklI MR kesitlerinde sag frontal bolgede yer alan hiperintens intraa'ksiyel lezyonlar, orta hatta sapma (ok ba~l) ve ventrikiillere belirgin basl gozlendi.
Turk Noro§irurji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Ta/mover: Szqal1 C6 Gliom Modeli: Mal1yetik Resollalls ile GonizlWleme
$ekil3: Sl<;an beyinlerinden ahnan makropatolojik preparatlarda; lOm 'luk koronal kesitlerde frontal bolge merkezli etrafmda odem ala m olu~turan ve kom~u yapllara basl yapan yuksek dereceli glial tiimor ile uyumlu lezyonlar.
sl<;an beyinlerinden alman tum kesitlerde histopatolojik olarak yuksek dereceli glial tumor tamsml dogrulayan artml~ mitotik aktivite, pleomorfizm ve nekroz alanlan gozlendi ($ekiI4).
TARTI~MA
Beyin himorleri sl<;anlarda spontan olarak olu~abilmektedir (Wistar-albino sl<;anlan i<;in insidans % 1.06) (23). Nitrozure grubuna dahil olan metil- ve etil-nitrosure sistemik olarak sl<;anlara uygulandlgmda hayvanlarda yuksek oranda MSS tumorleri olu~turmaktadlr. Sl<;an MSS' de bu ajanlara duyarhhk onuncu prenatal gunde ba~lamakta, yava~ yava~ artl~ gosterip, maksimum duzeye dogumda ula~maktadlr. Bu nedenle malign gliom olu~turmak i<;inyapllacak alkalizan ajan enjeksiyonu bu evrede,
$ekiI4: Vaskuler endotelyal proliferasyon ile birlikte, artml~ mitotik aktivite, pleomorfizm ve nekroz alanlan gosteren GBM olu~umu (H&E, X200). (Buyuk ok: nekroz alanlan, ku<;uk ok: mitoz, ok ba~l: vaskUler endotelyal proliferasyon)
eri~kinlere oranla 50 kat gu<;lU olarak ya pllabilmektedir.
Sl<;an C6 gliom hiicre kulturleri, N-nitroso-methyl-urea'ya maruz kalml~ ve intrakranial tumor olu~turmu~ sl<;anlardan elde edilmekte olup, GBM modeli i<;in olduk<;a guvenilir bir hiicre kulturudur (5, 6). Her ne kadar ideal Sl<;an tumor modelinin xenograft olarak insan glioma hucreleri i<;ermesi gerekse de, burada kullamlacak sl<;anlann mutlak immunosupresif olmasl gerekmekte ve bu da beraberinde enfeksiyona a~lrl duyarl1l1k gibi problemleri getirmektedir. Aym ~ekilde xenograft Sl<;anmmor modelinde kullamlmasl gereken immun yetersizlik gosteren atimik (nude) sl<;anlarda, normal immun sistemin beyin tumorune cevabl gozlenmemektedir (2). Bizim <;al1~mamlzda olu~turulan malign glial tumorlerde, bu nedenlerden dolaYl, yeterli bir immun sisteme sahip sl<;anlar tercih edilmi~tir. Sl<;anlara ait yuksek dereceli glial tiimorlerin olu~turuldugu rutin deneysel <;ah~malarda kullamlan C6 hucre kulturu, normal bagl~lkhga sahip Sl<;an beyinlerine implantasyonda daha pratik olarak aym sonu<;lan verdiginden, in vivo <;ah~malarda en <;ok tercih edilen Sl<;an gliom modellerinden biri durumundadlr.
Bir in vivo GBM modeli olan C6 gliom h ucreleri, oncelikle ayn hucreler olarak yapay basal membrandan migrasyon gostermekte, ve sekonder olarak tumor olu~turmaktadlr. Buradaki multipl hucre gruplan tumor kitlesinin oncu hucrelerini olu~turmaktadlr. C6 glioma hucreleri kortekse homograft olarak implante edildiginde Sl<;anbeynine kitle olarak invazyon gosterebilecegi gibi, tek tek hucreler ~eklinde de migrasyon gosterebilir (5). Literaturde yapllan <;ah~malarda C6 hucrelerinin beyin yuzeyinde sadece glia limitans'ta yer almadlgl, buna kar~m corpus callosum, subependimal bo~luk, ve perivaskUler bolgenin de tumor hucreleri ile dolu oldugu gozlenmi~tir (5). C6 gliom modelinde yapllan immunohistokimyasal <;ah~malar, bu hucrelerin karakteristik olarak endotelyal basal membrana affinite duydugunu gostermektedir (13). invazyon genellikle mevcut kan damarlan yolu ile, beyin parankimine infiltrasyon ile ger<;ekle~mektedir. C6 gliom hucrelerinde gozlenen bu migrasyon paterni, insanlarda gozlenen malign astrositomlann patolojik preparatlanndaki yaylllma benzemektedir (5, 6).
Literaturde C6 gliomun in vivo geli~imi, yuksek-resolUsyonlu MRG'de dahil olmak uzere, <;e~itli<;ah~malar ile ortaya konmaya <;ah~llml~tlr. Bu <;ah~malarda MRG somaSl sl<;anlar sakrifiye edilip, radyolojinin histopatolojik bulgular ile
Turk Noro§irurji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Ta/lr/over: Slqan C6 Gliom Modeli: Manyetik ReSOlJans ile GorulltUleme kar;nla~tmlmasl yapllml~tIr. Genellikle gozlenen C6
gliom hucrelerinin mmor olu~turma yeteneklerinin a~ikar oldugudur (2, 4). Pu ve ark. C6 hucre enjeksiyonundan bir hafta sonra, MRG tekniklerinde buyiik oranda mmor fokusu tespit etmi~ler ve yapllan histopatolojik degerlehdirmelerde C6 gliom hucrelerinde aktif proliferasyon, mitotik figurler, nekrotik fokuslar, kistik olu~umlar, hemoraji ve neovaskUlarizasyon gormu;;lerdir (24).
Literaturdeki bir<;ok ~ah~mada, C6 gliom hucreleri ile olu~turulan in vivo modellerde sl~anlann ya~am sureleri bir ay civannda bulunmaktadlr (25). <::ah~mamlzda da 1x106 C6 gliom hucresi implante edilen 16 Sl~anm tiimunde GBM ile uyumlu neoplasmlar olu~turuldu. Sl~anlarda gozlenen klinik bulgular ~ekil ve zaman olarak, deneklerin survey zamanlan ile literamrle benzerlik gosterdi (ortalama ya~am suresi 29 gun).
Sl~angliom modelleri ile ge~mi~teyapIlan bir~ok ~ah~mada, kimyasal ve spektrofotometrik analizler i~in, ozel olarak hazIrlanml~, ku~uk MRG cihazlan kullamlml~tIr (16, 20). Bu ku~uk aletler, 7 T'ya kadar alan kuvvetleri ile iyi goruntUler saglamalanna ragmen, yaygm olmadlklarmdan, i~levsellikleri tartI~mahdlr. Buna kar~ln, klinikte son derece yaygm olan mm vucut MRG sistemleri, yuksek T'ye sahip sistemler kadar olmasa da, Sl~an beyin tumorleri modellerinde de ba~an ile kullamlmaktadlr. Johnson ve ark. ilk kez 1987yIlmda, 1.5 TMRG sistemi ile Sl~an beynini goriinmlemi~lerdir (15).Bu tip MRG sistemleri i~inde,Sl~anbeyinleri i~inozel koiller kullamlmaktadlr. Literaturde klinikte kullamlan stand art koiller olan ekstremite, orbita, ku~uk eklem ve hatta kafa koilleri bu tip hayvan modelleri i~in onerilmi~tir.
Son donemlerde difuzyon MRG teknikleri ve fonksiyonel MRG teknikleri ~e~itlisl~an beyin tumorii modellerinde tedaviye cevabm ortaya konmasmda ba~an ile uygulanmaktadlr (11,12).Aynl ~ekilde, sl~an beyin mmorii modellerinde fonksiyonel neovaskuler yapIlanmanm incelenmesinde MRG tetkikleri ile gadolinium ahmmm degerlendirildigi ~ah~malar mevcuttur (29).<::ah~mamlzdabu yontemlerden farkh olarak, 1.5 T MRG ile elde edilen verilerin, dekapitasyon sonraSI tiimorun anatomik lokalizasyonunun korelasyonunu gostermeyi ama~ladlk. Aynca turn sl~anlarda histopatolojik incelemeler ile, MRG'de gozlenen patolojik sinyal degi~ikliklerin yuksek dereceli malign glial tumor oldugunu dogruladlk.
<::ah~mamlzda, nororadyolojik degerlendir-menin ba~lama zamamm, literatur l~lgmda tumor olu~timunun gozlemlendigi donem olan implantasyon
sonrasI7-9. gunler araSIolarak belirledik. Literaturden farkh olarak, deneklerimize uyguladlglmlz el bilegi (wrist) coili yerine, 1.5 T MRG sistemi ile en iyi gorunmyii kneepa - (diz) coil'i kullamlarak elde ettik. En iyi gorunmleme efektif echo time (TE) 85 msec ve repetititon time (TR) 5 sec oldugunda almdl. Yine literamrde onerilen 1mm kesit kahnhklanmn aksine, sekanslarda field of view (FOV) 12x12 veya 8x8,matrix 256x256, kesit kalmhklan ise 3mm olarak almdl.
MRG'si yapllan turn denekler, etrafIan ile ilgileri kesildikten sonra dekapite edildi. MRG'de patoloji gozlenen turn sl~anlarda, yapllan histopatolojik incelemelerde GBM ile uyumlu anatomik korelasyon gozlendi.
Sl~an C6 glioma modelinde 1.5 T MRG sistemi ile uygun degerlendirmenin, en erken birinci haftadan itibaren yapIlabilecegi kamsmdaYlz. Bu teknik suasmda kneepa - (diz) coil'i rahathkla kullamlabilmekte, ve kesit kalmhklan ise 3mm olarak ahndl~nda mmor goriinmlemesi i~in en iyi sonu~ elde edilmektedir.
Sonu~ olarak sl~anlann kullamldlgl in vivo gliom modellerinde, MRG tumor olu~umunun invasif olmayan yontemlerle dogrulanmasma olanak sagladlgmdan son derece avantajhdu. Bu tip ~ah~malarda, mmor buyume hlZI ve tedaviye cevabm ortaya konmasmda MRG'nin geli~en teknoloji ile ileride daha onemli rol oynayacagl kamsmdaYlz.
TE$EKKUR
Bu c;all~mada slc;anlann MRG tetkikleri a~amasmdaki yardlmlan ic;in Metropolitan Florance Nightingale Hastanesi Radyoloji Departmanma ve Radyolog UzmDr. Kutlay Karaman'a, tiimor inokiilasyonu a~amasmda yardlmlarmdan dolaYl Ajda Yllmaz' a ve histopatolojik preparatlann gozden gec;irilmesi ve onerileri nedeni ile noropatolog Prof.Dr.Biige Oz'e te~ekkiir ederiz.
Yazl~ma Adresi: OrNecmettin TANRIOVER P.K. 5 Cerrahpa~a, 34301 Istanbul Tel: 0.212.5876585,
Fax: 0.212.632 0026, uzan@istanbul.edu.tr
KAYNAKLAR
1. Abramovitch R, Oafni H, Smouha E, Benjamin LE, Neeman M. In vivo prediction of vascular susceptibility to vascular susceptibility endothelial growth factor withdrawal: MRI of C6 rat glioma in nude mice. Cancer Res 1:59(19):5012-5916, 1999
2. Barth RP. Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology:the 9L, C6, T9, F98, RG2 (074), RT-2 and
CNS-Turk Noro§irurji Dergisi 11: 170 - 177, 2001 Tannover: Slqan C6 Gliom Modeli: Manyetik Resonalls ile Goruntiileme 1 gliomas. J NeurooncoI36(1);91-102, 1998
3. Benda P, Someda K, Messer J, Sweet WH. Morphological and immunochemical studies of rat glial tumors and clonal strains propagated in culture. J Neurosurg 34:310-323,1971
4. Benedetti S, Bruzzone MG, Polio B, DiMeco F, Magrassi L, Pinolo B, Cirenei N, Colombo MP. Eradication of rat malignant gliomas by retroviral mediated in vivo delivery of the interleukine 4 gene. Cancer Res 59:645-652, 1999
5. BernsteinIT,Goldberg WJ,Laws ER,Conger0,Morreale
V, Weed LR. C6 glioma cell invasion and migration of rat brain after neural homografting: ultrastructure. Neurosurgery 26:622-628, 1990
6. BernsteinIT,Laws ER, Levine KV, Wood LR, Tadvalker
G, Goldberg WJ. C6 glioma-astrocytoma cell and fetal astrocyte migration into artificial basement membrane:a permissive substrate for neural tumors but not fetal astrocytes. Neurosurgery 28:652-658, 1991
7. BlackPMe. Brain turners (I)NEngJMed324:1471-1466, 1991
8. Black P, Han CM, Vender JR, Finkelstein SO. Chemotherapy in experimental brain tumor, part 2: pretreatment with leukotriene C4 prolongs survival. J NeurooncoI36:7-19,1998
9. Boring CC, Squires TS, Tong T, Montgomery S. Cancer statistics CA 1992;41:19, 1992
10. Bruce IN, Falavigna A, Johnson JP, Hell JS, Birch BD, Yoon JT, Wu EX, Fine RL, Parsa AT. Intracerebral clysis in a rat glioma model. Neurosurgery 46(3):683-691,2000 11. Chenevert TL, McKeever PE, Ross BD.Monitoring early
response of experimental brain tumors to therapy using diffusion magnetic resonance imaging. Clin Cancer Res 3(9):1457-66, 1997
12. Chenevert TL, Stegman LD, Taylor JM, Robertson RL, Greenberg HS, Rehemtulla A, Ross BD. Diffusion magnetic resonance imaging: an early surrogate marker of therapeutic efficacy in brain tumors. J Natl Cancer Inst 20;92(24);2029-2036,2000
13. Chicoine MR, Silbergeld DL. Invading C6 glioma cells maintaining tumorigenicity. J Neurosurg 83:665-671, 1995
14. Goldbrunner RH, Bendszus M, Sasaki M, Kraemer T, Plate KH, Roosen K, Tonn Je. Vascular endothelial growth factor driven glioma growth and vascularization in an ortopic rat model monitored by magnetic resonance imaging. Neurosurgery 47 (4), 2000
15. Johnson GA, Thompson MB, Traver BP. Three-dimensional MRI microscopy of the normal rat brain. Magn Reson Med. 4(4):351-365,1987
16. Kim B, Thomas CL, Ross BD. Growth kinetics and treatment response of the intracerebral rat 9L brain tumor model: a quantitative in vivo study using magnetic resonance imaging. Clinical Cancer Research 1:643-650, 1995
17. Kondziolka
0,
Somaza S, Comey C, Lunsford LD, Claassen0,
Pandalai S, Maitz A, Flickinger Je. Radiosurgery and fractionated radiation therapy: comparison of different techniques in an in vivo rat glioma model. J Neurosurg 84:1033-1038,1996 18. Mazurchuk R, Zhou R, Straubinger RM, Chau RI,Grossmann Z. Functional magnetic resonance imaging of a rat brain tumor model:implications for evaluation of turn or microvasculature and therapeutic response. Magn Reson Imaging 17(4):537-548, 1999
19. Nagano N, Sasaki H, Aoyagi M, Hirakawa K. Invasion of experimental rat brain tumor: early morphological changes following microinjection of C6 glioma cells. Acta NeuropathoI86:117-125,1993
20. Nakajima M, Nakasu S, Morikawa S, Inubushi T. Estimation of volume doubling time and cell loss in an experimental rat glioma model in vivo. Acta Neurochir 140:607-613,1998
21. Ohnishi T, Sher PB, Posner JB, Shapino WR. Capillary permeability factor secreted by malignant brain tumor: role in peritumoral brain edema and possible mechanism for anti-edema effect of glucocorticoids. J Neurosurg 72:245-251, 1990
22. Ohnishi T, Matsumura H, Izumoto S, Hiraga S, Hayakawa S. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Res 58:2935-2940, 1998
23. Plunkett RI, Agnieszka L, Tara B. Hormonal effects on GBM in the nude rat model. J Neurosurg, 90:1072-1077, 1999
24. Pu P, Liu X, Liu A, Cui C, Zhang Y. Inhibitory effect of antisense epidermal growth factor receptor RNA on the proliferation of rat C6 glioma cells in vitro and in vivo. J Neurosurg 92:132-139, 2000
25. Raila FA, Bowles AP, Perkins E, Terrell A. Sequential imaging and volumetric analysis of an intracerebral C6 glioma by means of a clinical MRI system. J Neurooncol 43:11-17, 1999
26. Rostomily RC, Berger MC, Keles EG. Radical surgery in the low grade and high grade gliomas. In Yung WKA (ed): Clinical Neurology: International Practice and Research, Cerebral Gliomas Series, pp 345-369,1996 27. Sherburn EW, Wanebo JE, Kim P, Song SK, Chicoine
MR, Woolsey TA. Gliomas in rodent whisker barrel cortex: a new tumor model. J Neurosurg 91:814-821,1999 28. Takeda N, Diksic M. Relationship between drug delivery
and the intra-arterial infusion rate of SarCNU in C6 rat brain tumor model. J NeurooncoI41:235-246, 1999 29. van der Sanden BP, Rozijn TH, Rijken PF, Peters HP,
Heerschap A, van der Kogel AJ, Bovee WM. Noninvasive assessment of the functional neovascula ture in 9L-glioma growing in rat brain by dynamic 1H magnetic resonance imaging of gadolinium uptake. J Cereb Blood Flow Metab 20(5):861-870,2000
AteromatOz olmayan arterial daralmantn stkltkla goriilen sebebleri konjenital hipoplazi, diseksiyon, vasospasm, vaskulopati ve tiimoriin daman sarmast olarak stralanabilir.
