• Sonuç bulunamadı

Türkiye doğal florasında yetişen papaver cinsi oxytona seksiyonuna ait gen havuzunun ISSR tekniği ile genetik karakterizasyonu

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Türkiye doğal florasında yetişen papaver cinsi oxytona seksiyonuna ait gen havuzunun ISSR tekniği ile genetik karakterizasyonu"

Copied!
67
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TÜRKİYE DOĞAL FLORASINDA YETİŞEN

Papaver CİNSİ Oxytona SEKSİYONUNA AİT

GEN HAVUZUNUN ISSR TEKNİĞİ İLE GENETİK KARAKTERİZASYONU

Tuğba GÜRKÖK

Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı

Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ

2009 Her hakkı saklıdır

(2)

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS TEZİ

TÜRKİYE DOĞAL FLORASINDA YETİŞEN

Papaver CİNSİ Oxytona SEKSİYONUNA

AİT GEN HAVUZUNUN ISSR TEKNİĞİ İLE

GENETİK KARAKTERİZASYONU

Tuğba GÜRKÖK

TOKAT 2009

(3)

Başkan: Doç. Dr. Şaban TEKİN İmza: Üye: Doç. Dr. İsa GÖKÇE İmza : Üye: Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ İmza:

Yukarıdaki sonucu onaylarım

Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü

(4)

Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak

kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

(5)

Yüksek Lisans Tezi

TÜRKİYE DOĞAL FLORASINDA YETİŞEN Papaver CİNSİ Oxytona SEKSİYONUNA AİT GEN HAVUZUNUN ISSR TEKNİĞİ İLE GENETİK KARAKTERİZASYONU

Tuğba GÜRKÖK

Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Yrd. Doç. Dr. İskender Parmaksız

Papaver L. cinsi tıbbi öneme sahip alkaloitleri içermesinden dolayı ticari öneme sahiptir. Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan Papaver bracteatum (2n=14), P. orientale (2n=28) ve P. pseudo-orientale (2n=42) türleri ülkemiz doğal florasında bulunmaktadır. Oxytona

seksiyonu morfin alkaloiti içermemsine karşın kodein, oxymorfin ve oxykodon’u da içine alan opiate analjeziklerine dönüşebilen tebain kaynağı olarak kullanılmaktadır. Her ne kadar bu üç türün morfolojik ve biyokimyasal özellikleri belirlense de bu özellikler intersipesifik hibridizasyon ve çevresel faktörlerden etkilendiğinden dolayı birbirlerinden ayrılması oldukça güçtür ve karışıklıklar yaşanmaktadır. Bu karışıklıkların giderilmesinde moleküler metotlardan yararlanılmaktadır. Bu çalışma da üç türe ait farklı bölgelerden toplanmış 180 bitki örneğinde ISSR tekniği ile moleküler karakterizasyon yapılmıştır. 20 ISSR primeri kullanılmıştır. Çalışma sonucunda 180 bitkide polimorfizm oranı %96,97 olup toplam 82 bant oluşturmuş 80 polimorfik bant vermiştir. Ortalama genetik mesafe 0.35, Shannon indeksi 0.50 dir. En az bant sayısı 3 (AT10) en fazla bant sayısı ise 5 (AT19 ve AT3) dir.

2009, 54 sayfa

Anahtar Sözcükler: Papaver, Oxytona, P. bracteatum, P. orientale, P. pseudo-orientale, ISSR,

genotiplendirme

(6)

Ms Thesis

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF GENE POOL OF Papaver GENUS Oxytona SECTION GROWN in WILD FLORA OF TURKEY BY ISSR TECHNIQUE

Tuğba GÜRKÖK

Gaziosmanpaşa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology

Supervisor: Asst. Prof. Dr. İskender Parmaksız

Genus Papaver L. has a commercial importance for high alkaloid containing. P. bracteatum (2n=14), P. orientale (2n=28), P. Pseudo-orientale (2n=42) species of Oxytona section in

Papaver genus were found widely in native flora of Turkey. Although section Oxytona

species does not contain morphine alkaloid they are used for the source of tebaine alkaloid which can turn to opiate analgesics like codeine, oxymorphine and oxycodon. Eventhough the morphologic and biochemical traits of 3 species determined, because these traits effected from interspesific hybridizations and environmental conditions, the identification of the plant populations of Oxytona section are located in different regions is in turmoil. To resolve this confusion, some important morphological characters, tebaine content, chromosome number and molecular results were associated. In this study 20 ISSR primers have been studied on 180 populations collected from different regions of Turkey. Total 82 bands were obtained of which 80 were polymorphic. Average genetic distance was found to be 0,35, and Shannon index is 0,50. The least number of bands belonging to primer AT10 is 3 and the highest is 5 belonging to primers AT19 and AT3.

2009, 54 pages

Key words: Papaver, Oxytona, P. bracteatum, P. orientale, P. pseudo-orientale, ISSR,

phylogenetic relation.

(7)

ve bana gerekli imkan ve koşulları sağlayan, her koşulda yanımda olan Danışman Hocam Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ’a, çalışmalarım süresince maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen değerli bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER’e, bana daima odasının ve laboratuarının kapılarını açık tutan ve beni her konuda destekleyen Doç. Dr. İsa GÖKÇE’ye, çalışmalarım sırasında katkılarda bulunan Doç. Dr. Şaban TEKİN’e ve manevi desteğini hiç esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. İbrahim TÜRKEKUL’a, laboratuar çalışmalarımda emekleri geçen değerli arkadaşlarım Gülşen BOZTEPE’ ye, Elif KAYMAK’ a ve İsmail BENLİ’ ye, yardımını esirgemeyen ve sıkıntılarıma katlanan arkadaşım Seval ŞAHİN ve ailesine, son olarak hayatım boyunca benim dertlerimle dertlenen, sevincimle sevinen aileme en içten teşekkürlerimi sunuyorum.

Tuğba GÜRKÖK

(8)

ÖZET i ABSTRACT ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ iv SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ viii ÇİZELGELER DİZİNİ ix 1. GİRİŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ 3

2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri 3

2.1.1 Oxytona seksiyonun Genel Özellikleri 3

2.2. Genetik Markörler 4

2.2.1. Genetik Markörlerin Kullanım Alanları 5

2.2.2. Genetik Markör Çeşitleri 6

2.2.2.1. Morfolojik Markörler 6

2.2.2.2. Protein markörleri 7

2.3. DNA Markörleri 7

2.3.1. Hibridizasyona Dayalı DNA (RFLP) Markörleri 8

2.3.2. PCR’a Dayalı DNA Markörleri 9

2.3.3. Mikrosatelitler 11

2.3.3.1 SSR (Basit Dizi Tekrarları) 12

2.3.3.2. SAMPL Markörleri 13

2.3.3.3. ISSR (Basit İç Dizi Tekrarları) 13 24

(9)

3.2.Yöntem 24 3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuar Çalışmaları İçin Hazırlanması 25

3.2.2. DNA İzolasyonu 25

3.2.3. PCR Uygulaması 26

3.2.4. Çalışmada Kullanılan ISSR Primerleri 27

3.2.5. Elektroforez İşlemi 28

3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi 28

3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi 28

4. BULGULAR 29 5. TARTIŞMA VE SONUÇ 43 5.1. Sonuç 46 KAYNAKLAR 48 ÖZGEÇMİŞ 54 v

(10)

bp Base pair (baz çifti =bç) kb kilo base

mM milimolar

ng nanogram

rpm Revolutions per minute (dakikadaki devir)

µg mikrogram

µl mikrolitre µM mikromolar UV Ultraviole

Kısaltmalar Açıklama

AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi AUZF Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi cDNA Komplementer deoksiribonukleik asid

CAPS

The cleaved amplified polymorphic sequence (Kesilip Çoğaltılmış Polimorfik Diziler)

dNTP deoksinükleotidtrifosfat DNA deoksiribonükleik asid EDTA Ethilendiamintetraasetik asid

ISSR Inter Simple Sequence Repeats (Basit İç Dizi Tekrarları) MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Moleküler Evrim

Genetik Analizi)

PCR Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PAGE Polyacrilamide Gel Electrophoresis (Poliakrilamid Jel

Elektroforezi)

POPGENE Population Genetic Analysis (Populasyon Genetik Analizi ) RAPD Randomly Amplified Polymorfic DNA (Rastgele Çoğaltılmış

Polimorfik DNA)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Kesilmiş Parçaların Uzunluk Polimorfizmi)

(11)

SDS Sodyumdodesilsülfat

SSR Simple Sequence Repeat (Basit Dizi Tekrarı) STS Sequence target site (Dizisi Etiketlenmiş Bölge) Taq Thermus aquaticus

TBE Tris/borat/EDTA (Buffer) TE Tris/EDTA (Buffer)

Tris Tris(hidroksimetil) aminometan

(12)

Şekil 4.1. ISSR AT3 primerinin %2 agaroz jel görüntüsü 29 Şekil 4.2. ISSR AT10 primerinin %2 agaroz jel görüntüsü 29 Şekil 4.3. ISSR primerlerinin oluşturduğu, filogenetik ilişkiyi gösteren dendogram 30

(13)

Çizelge 2.1. Bazı bitki türlerinde mikrosatelit tabanlı markörlerin uygulanması 16 Çizelge 2.2. Mikrosatelit tabanlı markörlerin temel özelliklerinin bir

karşılaştırması 17

Çizelge 3.1. Oxytona seksiyonuna ait Papaver türlerinin toplandıkları bölgeler 24

Çizelge 3.2. PCR mix bileşenlerinin konsantrasyonları ve miktarları 26

Çizelge 3.3. PCR protokolü 26

Çizelge 3.4. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri 27 Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik

özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi 31

(14)

öğelerdir. İklim şartlarının değişimi göz önüne alındığında bitki ve hayvan nesillerinin risk altında olduğu gözlenmektedir. Bitki popülasyonlarındaki riskler tüm ekosistemleri etkileyeceğinden bitki gen kaynakları daha da önemli hale gelmektedir.

Yüksek bitkilerin genomları, büyük ve kompleks bir organizasyona sahiptir. DNA analizlerinde moleküler metotların kullanımı bu karmaşık genomların incelenmesinde ki yaklaşımlardan biridir. Moleküler markörlerin biyoloji çalışmalarına girmesi genetik çeşitliliğin çalışılması ve türler arasındaki akrabalığın belirlenmesi için yeni fırsatlar sağlar. Moleküler DNA markörlerinin kullanımı, detaylı kromozom haritalanması, genlerin tanımlanması ve klonlanması, yeni bitki kültürlerinin oluşturulmasında oldukça ümit vaat etmektedir.

Son yıllarda bitki genom çalışmaları bu alanda devrim niteliğindedir. Bitki genom analizlerinde kullanılan moleküler markörler bu devrimde önemli birer araç haline gelmişlerdir. Taksonomi, filogeni, ekoloji, genetik mühendisliği ve ıslah çalışmalarında rutin olarak uygulanmaktadır.

DNA markör terimi bireyler arasındaki genetik çeşitliliğe ait bir terimdir. DNA markör testlerinden basit özelliklerle elde edilen genotip bilgisinin kullanımı oldukça kolaydır. Bu gibi özellikler sıklıkla bir tek gen ve bu özelliğin fenotipini tamamen gösterebilen bir gen tarafından kontrol edilmektedirler.

Ülkemiz coğrafik konumu nedeniyle canlı çeşitliliği bakımından oldukça zengindir. Sebebi ise iklim farklılıkları, topografik çeşitlilikler, jeolojik çeşitlilikler, deniz, göl, akarsu gibi değişik su ortamı çeşitlilikleri, yükseklik farklılıkları ve ekolojik farklılıklardır (Atalay 1994; Çelik 2003). Dünyada Papaver cinsine ait yaklaşık 110 türün (Kapoor, 1997) 50 taksonunun ülkemizde bulunduğu bildirilmiştir (Güner ve ark., 2000). Papaver cinsi Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan 3 türün (Papaver

(15)

bracteatum, P. pseudo-orientale ve P. orientale) ülkemiz doğal florasında bulunduğu

ifade edilmektedir.

Bu tez çalışmasının amacı ülkemiz doğal florasındaki değişik bölgelere ait Papaver cinsi Oxytona seksiyonu içerisinde yer alan 3 türe ait toplam 180 tek bitki üzerinde ISSR yöntemiyle genetik karakterizasyon araştırması yapmaktır. Çalışmamız sonucunda elde edilen veriler; Oxytona seksiyonu ile ilgili yapılacak olan daha kapsamlı moleküler çalışmalara ve ülke ekonomisine katkı sağlayacaktır.

(16)

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri

Papaveraceae familyasına ait türler genellikle Kuzey Yarımkürenin ılıman ve subtropik

bölgelerinde yayılış göstermektedir. Bu familyada 28 cins ve yaklaşık 250 tür vardır. Ülkemizde bu familyaya ait 5 cins bulunmaktadır (Seçmen ve ark., 1995).

2.1.1. Oxytona Seksiyonun Genel Özellikleri (Syn: Macrantha)

Bu seksiyondaki türler çok yıllık kalıcı kazık köklü otsu bitkilerdir. Temel kromozom sayısı n=7’ dir (Goldblatt, 1974). Oxytona seksiyonu Papaver cinsine ait olup, çok yıllık türleri içermektedir. Yayılım olarak Orta ve Doğu Türkiye, Kuzey ve Kuzey batı İran, Kafkas ve Trans Kafkas bölgelerinde bulunmaktadır. Bu familyaya ait monograflar Fedde (1909) ve Medwedev (1918) ile başlamış en son Goldblatt (1974) tarafından yapılmıştır.

Papaver bracteatum Lindl., Coll. Bot., t. 23 (1821)

Syn : P. lasiothrix Fedde.

Oxytona seksiyonunun en büyük bitkisidir. Aynı lokalitede her zaman var olan önemli

taksonomik özellikleri ile uniformdur. Somatik kromozom sayısı 2n=14’dür (Goldblatt, 1974).

Erzurum Kop dağı. Bayburt Aşkale arası 2050–2100 m. Kars, Kayseri Erciyes dağı, Sivas, Ulaş, Erzincan Karadağ 1960 m. Van, Çatak, Ağrı, Büyük Ağrı dağı, Niğde, Pertek 2000 m (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).

Papaver orientale L., Sp. Pl. 508 (2753). Ic. Bot. Mag., 2: t. 57 (1794).

Syn: P. paucifoliatum (Trautv) Fedde; P. orientale var. paucifoliatum Trautv.; P.

(17)

Kuzey batı İran ve kuzey doğu Türkiye’de yayılış gösteren ince narin bitkidir. P.

orientale 1800 m’nin genelde üzerinde bulunmasına rağmen bazen altında da Türkiye

ve İran’da bulunabilmektedir. P. bracteatum’a göre daha nemli ve sulu alanlarda, açık dağ eğimlerinde ve güneşi az alan kuytularda bulunmaktadır. Somatik kromozom sayısı 2n=28’dir (Golldblatt, 1974).

Orta ve Doğu Anadolu, Ağrı, Erzurum, Erzincan, Kars, Kayseri, Sivas, Tunceli ve Van çevresi (Cullen, 1965; Golldblatt, 1974).

Papaver pseudo-orientale (Fedde) Medw.

Syn: P. intermedium DC.; P. bracteatum var. pseudo-orinale Fedde.

Genel olarak İran ve Türkiye’nin nemli yerlerinde bulunmaktadır. Literatürde yaygın olduğu bildirilmektedir. Bu tür arazide kendini belirgin bir şekilde göstermektedir. Bitkide diğer iki türe kıyasla değişiklik vardır. Somatik kromozom numarası 2n=42’dir (Golldblatt, 1974).

Çoruh, Erzincan, Erzurum, Muş, Ağrı, van, Niğde, Hakkâri çevresinde dağılım göstermektedir (Golldblatt, 1974).

2.2. Genetik Markörler

Kalıtım şekilleri, morfolojik, biyokimyasal ve DNA düzeyinde izlenebilen karakterlere genetik markörler denir. Bu karakterlerin markör (işaret) olarak isimlendirilmesinin nedeni, çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin genetiği hakkında, dolaylı da olsa, bilgi sağlamalarıdır. Moleküler markörler DNA’nın aktif bölgelerinden veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden geliştirilebilmektedirler (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

(18)

2.2.1. Genetik Markörlerin Kullanım Alanları a-Genetik Haritaların Hazırlanması

Genetik markörlerin en önemli kullanım alanı genetik haritaların hazırlanmasıdır. Genetik haritalar bir haritalama popülasyonunda çok sayıda markörün analiz edilerek bağlantı ilişkilerinin bulunması ile hazırlanır (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

b-Genetik Parmak İzi (Fingerprinting) Analizi

Parmak izi analizi genetik materyallerin birbiriyle benzerlik veya farklılıklarının saptanması amacını güder. DNA parmak izi terimi, genomik DNA fragmentlerinin elektroforetik ayırımından sonra çok lokuslu problar tarafından oluşturulan ve barkoduna benzeyen DNA fragment örneklerini tanımlamak üzere ilk kez 1985 yılında Alec Jeffrey tarafından ortaya atılmıştır. Ortaya çıkan örnekler, incelenen bireye özgüdür.

Son zamanlarda, DNA parmak izini/profilini çıkarma, tek bir lokusu saptamak için kullanılan birkaç sistemin birlikte kullanımını belirtmek üzere ve genomları çeşitli yönlerden araştırmak için çok amaçlı araçlar olarak kullanılmaktadır. Örneğin, genetik çeşitliliğin karakterizasyonu, genom parmak izinin çıkarılması, genom haritalaması, gen lokalizasyonu, genom evriminin analizi, populasyon genetiği, taksonomi, ıslah ve teşhis gibi (Sümer S., 2009).

Parmak izi analizinde aynı anda genomun pek çok yerine dair bilgi sağlayan markörler yaygın olarak kullanılmaktadır. Parmak izi analizi ayrıca çeşit teşhisinde de kullanılır (Smith ve Helenjaris, 1996).

c-Doğrudan Gen Etiketlenmesi

Bitki ıslahında kullanılan yeni karakterler çoğu zaman az bilinen genotiplerden gelmektedir. Burada bitki ıslahçısının istediği, bütünüyle tamamlanmış bir genetik

(19)

harita hazırlamadan karakteri etiketleyecek bir markör bulmaktır. Islah çalışmalarının ileri safhalarında veya başka ıslah programlarında, fenotip sınıflarına ayrılması güç olan karakter yerine, kolayca gözlenebilen marköre bakılarak seçim yapılır. Kullanılan markörlerin DNA markörü olması durumunda seçim bitki henüz fide devresinde iken yapılır. İstenen birkaç bitki seçilirken diğerleri atılır (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

d-Genlerin Klonlanması

Haritayı temel alan klonlama yöntemi doğal olarak oluşan mutasyonları kullanmaktır. Genetik bağlantı analizi bir genin bir genomun %0,1veya daha az aralıklı bir bölgesinde yerinin belirlenmesinde ve daha sonra geni içeren DNA kısmının fiziksel haritalama yöntemiyle klonlanmasında kullanılmaktadır (Paterson, 1996b). Bu bölgeden çıkarılan diziler, çeşitli yollarla izole edilmekte ve son olarak hedef gen mutant tamamlanması gibi bazı yöntemlerle tanımlanmaktadır. Haritayı temel alan klonlama yöntemi tamamen haritalara bağımlı olan tek yöntem olmasına rağmen, genetik haritalama birçok gen izolasyonu stratejilerinin ana unsurlarından birisidir (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

2.2.2. Genetik Markör Çeşitleri 2.2.2.1. Morfolojik Markörler

Bitki genetik haritalarının oluşturulmasında kullanılan markör sistemlerinden biri olan fenotipik markörler, yaprak veya çiçek morfolojisini etkileyen özellikler ile bitki boyu ve pigment biyosentezi gibi birçok özelliklerdir. Fenotipik markörlere dayalı genetik haritalar "klasik haritalar" olarak isimlendirilmektedir (Koornneef, 1990).

2.2.2.2. Protein Markörleri

Morfolojik karakterlerin çevreden etkilenmelerini ortadan kaldırmak için geliştirilen protein markörleri, doğrudan gen ürünleri oldukları için çok önemli üstünlüklere sahiptirler. Eşbaskın (ko-dominant) markör oluşları ve birim başına maliyetlerinin

(20)

düşük olması kullanım alanlarını artırmıştır. Ancak üzerinde çalışılacak lokus sayısının azlığı ve varyasyon oranının düşük oluşu bu tekniğin kullanımını sınırlamaktadır (Parmaksız, 2004).

2.3. DNA Markörleri

DNA markörleri birçok farklı mutasyon sınıflarının bir sonucu olarak ortaya çıkarlar. Bunun en basit örneği iki genotipi birbirinden ayıran tek bir nükleotidin yer değişmesi kadar küçük bir farklılıktır (Paterson, 1996).

Tek bir bazın yer değiştirerek bir enzimin kesim noktasını değiştirmesi, DNA parçasının uzunluğunu değiştirerek ilgili gözlem metodunda direkt olarak bir bireyin genotipini temsil eden farklı bir markör ortaya çıkarır. PCR metodunu temel alan gözlemlerde PCR primerinin bağlanacağı bölgedeki bir bazdaki değişiklik de aynı şekilde bir etkiye sahiptir (Yıldırım, 2001).

Yüksek yapılı bitkilerin genomları oldukça karmaşık ve büyüktür. Bu genomların DNA analizlerinde moleküler metotların kullanımı farklı yaklaşımlardan biridir. Moleküler DNA markörleri mutasyonları PCR tabanlı tekniklerle belirlenebilen tüm genoma yayılmış polimorfik nükleotid dizileridir.

İdeal DNA Markörlerinin Özellikleri : • Yüksek oranda polimorfik yapı

• Kodominant kalıtım (diploid organizmaların homozigot ve heterozigotluğunun saptanması)

• Genomda sık bulunması

• Seçici nötral davranış (herhangi bir organizmanın DNA dizisinin çevresel koşullara ya da işletim uygulamalarına karşı nötr olması)

• Kolay elde edilebilirlik • Kolay ve hızlı çalışma • Yüksek verim

(21)

DNA polimorfizmini değerlendirmek üzere moleküler markörlerin çeşitli tipleri kullanılır. Bunlar genel olarak iki sınıfa ayrılır:

a) Hibridizasyon temelli markörler b) PCR temelli markörler

a) Hibridizasyon temelli markörlerde DNA profilleri, restriksiyon enzimi ile kesilmiş DNA’nın, orijini ya da dizisi bilinen bir DNA fragmenti olan işaretlenmiş bir prob ile hibridizasyonuyla görünür hale gelmektedir.

b) PCR temelli markörler, belirli bir DNA dizisinin ya da bölgesinin özgül olarak hazırlanmış ya da rastgele seçilmiş oligonükleotit dizileri (primer) ve ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimi yardımı ile in vitro olarak çoğaltılmasını içerir. Çoğaltılmış olan fragmentler elektroforetik olarak ayrılır ve bant örnekleri, boyama ve otoradyografi gibi çeşitli yöntemlerle saptanır.

2.3.1. Hibridizasyona Dayalı DNA (RFLP) Markörleri

Bu markörler çeşitli şekillerde etiketlenmiş bir DNA parçasının (prob DNA) araştırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı dizilişteki DNA’ya melezlenebilmesini baz almaktadır. Bu teknik RFLP analizi ile çok yaygın bir kullanım alanı bulmuştur.

RFLP analizi dokulardan izole edilen genomik DNA’nın nükleik asit dizilişlerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak kesilmesi ve prob DNA nın melezlendiği DNA etrafındaki farklı kesim yapılarının saptanması esasına dayanır. Genomik DNA nın kesimi tipik olarak 4–6 nükleotid tanıyan enzimlerce yapılır. Kesim sonrasında DNA bir jel destek sistemi içinde elektroforeze tabi tutulduğunda taşıdığı negatif yüklerden dolayı pozitif yöne doğru hareket edecektir. DNA’ nın bu hareketi kütlesinin logaritması ile ters orantılıdır. Kesilen parçalar elektroforez sonucunda jel içinde büyüklüklerine göre sıralanırlar. Bu sıralama sonrası DNA jel ortamdan daha kullanışlı olan naylon filtrelere tek iplik halinde southern transfer metoduyla transfer edilir (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

(22)

2.3.2. PCR’a Dayalı DNA Markörleri

AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi):

Restriksiyon enzimleri ile kesilmiş DNA fragmentlarının seçici amplifikasyonu temeline dayanır. Çoklu bantlar, tesadüfî bölgelerde DNA markörleri içeren amplifikasyon reaksiyonunda oluşturulur. DNA analizleri, her örnekten 50 ile 100 bant elde edilecek şekilde sonuçlanır. AFLP analizleri ile heterozigot ve homozigot bireyler arasındaki farklılık tespit edilebilmektedir (Parmaksız, 2004).

RAPD (Rastgele Artırılmış Polimofik DNA):

RAPD (Rastgele Arttırılmış Polimorfik DNA, Randomly Amplified Polimorphic DNAs) ilk defa 1990’ da rastgele seçilmiş primerlerin kullanıldığı ve Polimeraz Zincir Reksiyonu’ nu (PCR) temel alan bir teknik olarak ortaya çıkmıştır (Williams ve ark., 1990).

RAPD yönteminin temel prensibi ilgili olan türe ait genomik DNA üzerinde rastgele seçilmiş, tek bir 9–10 bp oligonükleotidin, düşük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak bağlanarak PCR ile çoğaltma yapmasıdır. Tekniğin devamında elde edilen çoğaltma ürünü radyoaktif olmayan standart jel elektroforezinde yürütülür ve çoğaltma ürünleri bantlar halinde gözlemlenerek incelenir. Bantların varlığı veya yokluğuyla sonuçlar değerlendirilmektedir (Williams ve ark., 1990; Welsh ve McClelland, 1990).

SCAR Markörleri ( Belirlenmiş ve Çoğaltılmış Polimorfik Diziler):

Bireysel RAPD parçalarından köken alan PCR tabanlı markörlerdir ancak uzun, özel primerlerin kullanımıyla tanımlanırlar. Spesifik SCAR markörlerini elde etmek için RAPD veya ISSR parçaları jelden kesilir, klonlanır ve dizi analizi yapılır. Dizi analizinden sonra genellikle 20–25 baz uzunluğundaki parçaların terminal bölgeleri için SCAR primerleri seçilir. Bu markörler marul (Keselsi ve ark. 1993), domates (Deng ve ark. 1997) ve buğday (Laroche ve ark. 2000) da çeşitli hastalıklara karşı direnç genlerinin tanımlanması ve haritalanmasında başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Gostimsky ve ark. 2005).

(23)

CAPS Markörleri ( Kesilip Çoğaltılmış Polimorfik Diziler):

CAPS metodu STS grubuna aittir. Primerler bilinen bir DNA dizisine bağlı olarak sentezlenirler. CAPS metodu random-replicon metotlar üzerine özellikle ko-dominant kalıtım ve yüksek güvenirlilik avantajlarına sahiptir. Buna ek olarak, CAPS markörlerinin kullanımı genetik ve fiziksel kromozom haritaları arasındaki uygunluğu belirlemeyi mümkün kılar çünkü verilen tipin yerinin fiziksel pozisyonları genetik analizlerinin kullanımından önce genellikle bilinir. Bu metot DNA kalıbının miktarına duyarlı değildir ve ucuzdur (Gostimsky ve ark. 2005).

SRAP Markörler (Sequence-related amplified polymorphism):

SRAP; patates, pirinç, kıvırcık, kereviz gibi pek çok üründe başarıyla kullanılmış yeni, basit ve güvenilir PCR-tabanlı marker sistemidir( Li ve Quiros,2004). Pek çok yayın SRAP marker sisteminin genetik çeşitlilik analizlerinde,kültürlerin tanımlanmasında ve filogenetik çalışmalarda çok etkili bir araç olduğunu göstermiştir (Ferriol ve ark., 2003). Feriol ve ark. (2003) SRAP markörler tarafından verilen bilginin morfolojik çeşitlilik ve morfotiplerin evrimsel geçmişi ile AFLP markörlerinden daha uygun olduğunu bildirmiştir.

SRAP, bitkilerde genetik farklılık çalışmaları için son dönemlerde geliştirilmiş bir moleküler markör sistemidir (Li ve Quiros, 2001). ISSR’dan farklı olarak SRAP tekniği primer dizilerinin kendine has dizaynını kullanarak genomdaki kodlanmış dizileri hedefler ve bir kısım ko-dominant markörlerin tanımlanmasında sonuçlanır. SRAP primerleri, 17 veya 18 nükleotid uzunluğundadır. 13 veya 14 bazlık bir öz dizi ve bunun içinde 5’ ucunda spesifik olmayan 10 veya 11 nükleotidden oluşur, bu diziyi forward primerde CCGG ve reverse primerde AATT izler (Li ve Quiros, 2001). SRAP markörleri genetik farklılığı belirlemek (Ferriol ve ark., 2003) ve aynı zamanda gen işaretleme ve genom haritalanması (Li ve Quiros, 2001) için kullanışlı bir yöntem olarak tanımlanmıştır.

(24)

2.3.3. Mikrosatelitler

Mikrosatelitler hem prokaryot (Gur-Arie, R. ve ark.,) hem ökaryotlarda bulunan tekrarlı DNA dizileridir. Genellikle tekrarlayan 2–6 bp uzunluğunda tüm genoma rast gele dağılmış dizilerdir (türlerde ve kromozomlarda dağılımı çeşitlidir) ve çok korunmuş dizilerce çevrilmiştir (Chambers ve MacAvoy, 2000).

Mikrosatelitler hem kodlanan hemde kodlanmayan bölgelerde bulunmasına rağmen bunların frekansı transkribe edilen yerlerde daha yüksektir, özellikle UTR (Untranslated Regions) lerde (Morgante ve ark., 2002, Hongtrakul ve ark.,1998, Panaud ve ark.,1995). Kodlanan ve kodlanmayan bölgelerdeki mikrosatelitlerin dizilişinde değişiklik olabilir. Metzgar ve ark. (2000) 7 ökaryotik hatlar için 3 ve 6 nükleotid tekrarların hem kodlanan hem de kodlanmayan bölgelerde olduğunu, ancak diğer tekrarlı dizilerin frekansı kodlanan bölgelerde kodlanmayan bölgelere göre daha düşük bulmuştur. Bu bulgular, kodlanan ve kodlanmayan mikrosatelit frekanslarından, kodlanan bölgelerdeki çerçeve kayması mutasyonlarına karşı spesifik seleksiyondan doğan farklılıkları ortaya koymaktadır ve nontriplet tekrarlarındaki uzunluk değişimlerinden kaynaklanmaktadır. Morgante ve ark. (2002), mikrosatelitlerin frekansının genom boyutuyla ters orantılı olduğunu ancak tekrarlı olmayan DNA da sabit kaldığını belirtmiştir. Mikrosatelitler tekrarlayan nükleotidlerin kısa serilerini (8 nükleotide kadar) içeren bölgelerde ortaya çıkar. Bu çeşitliliği ortaya çıkaran iki muhtemel mekanizma vardır: DNA replikasyon kaymasını takiben sıra dışı bir mutasyon oranıyla ilişkili olan yüksek etkinlikte bir yanlış eşleşme tamir mekanizması (nesil başına 10¯6- 10¯²).

Mikrosatelitler çok basit bir şekilde dizilebilirler, örneğin 2 veya daha fazla tekrarlı dizileri içerir –(N1N2…..Nx)- veya daha karmaşık bir yapıya, (CA)n(GT)n veya (dC-dA)n(dG-dT)n, sahip olabilirler. Kusurlu veya bileşik olarak isimlendirilen mikrosatelitler pek çok kez tekrar eden dizilerin arasında boşluklara sahiptir, örneğin (GA)n(N)n(CT)n. Bitkilerdeki en sık mikrosatelitler dinükleotid motiflerden oluşmuştur, genellikle (AT)n ve (GT)n, hayvanlarda ise (AC)n tekrarları yaygındır (Morgante ve ark., 2002, Panaud ve ark., 1995). Trinükleotidler de ise, TAT tekrarları yaygındır. Mikrosatelitlerin bazı çeşitleri belli bitki gruplarına spesifiktir ve daha çok

(25)

bulunur, örneğin CCG/CGG tekrarları diğer tahıl veya dikotiledon bitkilere göre pirinçte daha bol bulunur (Morgante ve Olivieri, 1993).

Yıllar önce tekrarlayan DNA çöp DNA olarak isimlendiriliyordu çünkü herhangi bir fonksiyonu olmadığı düşünülüyordu. Bugün ise bitki DNA larındaki mikrosatelitlerin görevleri hala bilinmemesine rağmen araştırmacılar için önemli bir araç haline gelmiştir çünkü bütün canlı organizmaların genomlarında bulunan, yüksek seviyede allelik çeşitlilik, ko-dominant kalıtımı ve genotipleme, haritalama ya da genlerin pozisyonel klonlanmasında kullanılan mükemmel moleküler markörlerdir (Rafalski ve Tingey, 1993).

2.3.3.1. SSR (Basit Dizi Tekrarları):

SSR markörleri 1–4 arasında tekrarlanan nükleotid motifleri içerir (Braaten ve ark., 1988, Vergnoud 1989). Bu bölgeler "mikrosatellit" olarak adlandırılır (Litt ve Luty 1989) ve PCR (Saiki ve ark., 1988) da bireysel olarak amplifiye olurlar. (GT)

n veya (CT)

n gibi birbiri arkasına tekrar eden 2 den 10 a kadar tekrarlı olabilen dizinlerdir.

Bitki nükleer DNA’sında tekrarlanan basit dizi motiflerinin (örneğin CACACA...) varlığı Delseny ve ark. (1983) tarafından kanıtlanmıştır. Mikrosatelit olarak da adlandırılan basit dizi tekrarlarının, sonradan bitki genomu ve organel genomu içeren çoğu organizmalarda bolca bulunduğu görülmüştür (Lagercrantz ve ark. 1993, Wang ve ark. 1994). Bu diziler, bitki genetiğinin araştırılması için uygun olan genetik varyasyonun büyük bir kaynağını oluşturmaktadır (Tautz ve ark. 1986).

SSR metodu, tekrarlanan dizilerin iki yanına bağlanan primerlerin bu bölgeleri PCR’la çoğaltması ve agaroz jel, poliakrilamid jel aracılığı ile büyüklüklerine göre ayrılması üzerine kuruludur.

(26)

2.3.3.2. SAMPL Markörleri:

Diğer bir mikrosattelit tabanlı markör sistemi olan SAMPL AFLP tekniğinin modifiye edilmiş şeklidir [Morgante ve Vogel, 1994, Vos ve ark., 1995]. Genomik DNA nın iki endonükleaz tarafından kesilmesi sonucu oluşan parçaların adaptörlerle bağlanması ve sentetik adaptörlere bağlı olarak tasarlanan primerleri kullanarak preamplifiye edilmesidir.

SAMPL analizleri mikrosatelitlerin katlanan dizileriyle ilgili ön bilgi gerektirmediğinden dolayı ve çoklu orana sahip olduğundan dolayı bilinen en etkili moleküler markörlerden biri olarak düşünülmektedir (Vos, 1995).

Şimdiye kadar, SAMPL markör sistemleri sadece bir kısım bitki türüne uygulanmıştır örneğin havuç (Vivek ve Simon, 1999), arpa (Bolibok ve Rakoczy-Trojanowska, 2003), buğday (Roy ve ark., 2002), marul (Witsenboer ve ark., 1997), konifer (Paglia ve Morgante, 1998), börülce (De Simone ve ark., 1997). Bu bitkilerde genetik çeşitlilik, genotip tanımlanması, gen işaretlenmesi, bağlantı haritalarını da içeren çalışmalarda başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Trojanowska ve Bolıbok, 2004).

2.3.3.3 ISSR Markörler (Basit İç Dizi Tekrarları):

Mikrosatelitler genellikle az çok tüm genoma yayılmışlardır. Bununla birlikte, bu dizileri bol miktarda içeren bölgeler bulunmuştur ve “SSR hot spots” olarak isimlendirilmiştir (Zietkiewicz ve ark., 1994). Böyle bölgeler ISSR markör kaynakları olarak işlev görebilirler (Trojanowska ve Bolıbok, 2004).

ISSR teknolojisi ters düzenlenmiş yakın aralıklı mikrosatelitlerin arasındaki bölgelerin (100–300 bç) amplifikasyonuna dayanmaktadır (Zietkiewicz ve ark., 1994). Bu bölgelerin amplifikasyonu için kullanılan 16-18 bç uzunluğunda tek primerleri içeren çok sayıda basit dizi tekrarları herhangi bir SSR motifi ve 5’ veya 3’ ucuna bağlanmış tesadüfi seçilmiş nükleotidlere dayanabilir. Ayrıca bağlanmamış primerler de

(27)

kullanılmaktadır (Bornet ve ark., 2002). PCR ürünleri belirsiz SSR bölgeleridir. ISSR lar genellikle bir reaksiyonda 25–50 ürün çoğaltabilirler. Basmati ve non Basmati pirinç çeşitleri arasındaki genetik akrabalığı bulan Nagaraju ve ark. (2002) tarafından gösterildiği gibi oluşan bantların sayısı motifin tekrarlayan biriminin nükleotid sayısı ile ters orantılı olabilir. Bu metodun en büyük avantajı genomik kütüphanelerin yapım aşaması pahalı değildir ve çok fazla zaman gerektirmez. ISSR markörleri daha çok dominant kalıtım gösterirler; eğer mikrosatelitlerde primerlerin bağlanma bölgeleri arasındaki mesafe değişmişse nadiren ko-dominant kalıtım gösterirler. ISSR markörleri özellikle filogenetik çalışmalar, genetik çeşitliliğinin değerlendirilmesi ve kültürlerin tanımlanması çalışmaları için uygundur. ISSR markörlerin kolaylığı onları gen işaretleme için de öncül kılar (Trojanowska ve Bolıbok, 2004).

ISSR markörleri somaklonal varyasyonu görüntülemek için de oldukça kullanışlıdır (Rostiana ve ark., 1999). Leroy ve Leon (2000) karnabahar bitkisinin hipokotilden türeyen kallus ve yaprakları arasındaki farklılıkların belirlenmesi için ISSR tekniğinin kullanımını tanımlamışlardır. (GACA)4 ve (GATA)4 primerlerini kullanarak kallus dokularındaki polimorfik bantları bulmuşlardır. Dizisi belirlenen bantlardan bir tanesi

Arabidopsis thaliana bitkisinin hücre proliferasyonunun düzenlenmesiyle ilgili olan

protein kinazı kodlayan geni ile yüksek benzerlik göstermiştir. Yazarlar ISSR tekniğinin

in vitro kültürlerin erken dönemlerindeki genetik kararsızlığın bulunması için

kullanılabilecek bir araç olduğunu öne sürmüşlerdir (Trojanowska ve Bolıbok, 2004).

ISSR markörlerinin diğer bir yararı genomlardaki SSR miktarını ve dağılımını çalışmayı mümkün kılmasıdır. Belirli bir mikrosatelit tekrarı ile ISSR primeri tarafından oluşturulan bantlar belirli bir genomdaki motifin oransal frekansını yansıtabilir. Bu yaklaşım Eucalyptus grandis bitkisinde mikrosatelitlerce zengin bölgelere erişim için ISSR tekniğini kullanan Van der Nest ve ark. (2000) tarafından bildirilmiştir. Tipik ISSR rastgele primerlerini kullanarak mikrosatelitlerce zengin bölgelerin amplifikasyonunu PCR ürünlerinin klonlanması ve dizi analizi izler. Bu da mono-,di-,tri, hekza ve nona nükleotid tekrarlarını amplifiye eden SSR primerlerinin dizaynını mümkün kılar (Trojanowska ve Bolıbok, 2004).

(28)

ISSR markörlerinin oldukça bilgi verici olduğu düşünülmektedir. Pirinçte AFLP markörlerine göre ISSR tekniği daha fazla polimorfik bant üretmiştir (Blair ve ark. 1999). Dolayısıyla ISSR markörleri varyeteler arasındaki çeşitliliği belirlemek için daha uygundur ve AFLP den daha düşük benzerlik göstermiştir. Nagaoka ve Ogihara (1997) , Korbin ve ark. (2002), genetik çeşitliliğin belirlenmesinde buğdayda, meyvelerde (çilek, elma, Ribes türlerinde ISSR markörlerinin RAPD markörlerinden daha bilgi verici olduğu hükmüne varmışlardır (Trojanowska ve Bolıbok, 2004). Bazı bitki türlerinde mikrosatelit tabanlı markörlerin uygulanması çizelge 2.1. de,. Mikrosatelit tabanlı markörlerin temel özelliklerinin bir karşılaştırması Çizelge 2.2 de gösterilmiştir.

Son yıllarda, SSR tabanlı markörlerin kullanımı belirgin bir şekilde artmıştır. Sebepleri ise:

1. Allelik varyasyonlarının yüksek seviyede olması ve ko-dominant karakter taşımalarından dolayı maliyetin düşmesi

2. PCR uygulandığından dolayı çok düşük miktarlarda dokuya ihtiyaç duyulması 3. Özellikle ISSR markörlerinin diğer moleküler markörlere göre daha hızlı

uygulanabilmesi

4. Bir tür için geliştirilen primerlerin akraba türlerde de aynı bölgeyi çoğaltabilmesidir (Trojanowska ve Bolıbok, 2004).

(29)

Markör tipi Bitki türleri Uygulama Referanslar SSR kış arpası -bağlantı haritaları, çeşitlilik analizleri Hackauf ve Wehling, 2002

buğday -bağlantı haritaları Röder ve ark.,1998

-çeşitlilik analizleri Röder ve ark.,1995

patates -filogenetik ve parmak izi analizleri Ashkenazi ve ark., 2001

-bağlantı haritaları Milbourne ve ark.,1998

pirinç -bağlantı haritaları Vivek ve Simon, 1999 -allelik çeşitlilik analizi Panaud ve ark.,1995 -allel varyasyonları analizi Cho ve ark.,2000 çavdar -bağlantı haritaları, allel varyasyonları

analizi Becker ve Heun, 1995

-gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Russel ve ark. 1997 ayçiçeği -bağlantı haritaları Tang ve ark.,2002

mısır -bağlantı haritaları, allel varyasyonları

analizi Taramino ve Tingey, 1996 ISSR buğday -gen işaretleme Ammiraju ve ark. ,2001 -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Nagaoka ve ark., 1997

pirinç -gen işaretleme Agaki ve ark., 1996 -parmakizi analizi Blair ve ark., 1999 -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Nagaraju ve ark.,2002

patates -gen işaretleme Marczewski ve ark.,2002

-gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Bornet ve ark., 2002

domates -gen işaretleme Levin ve ark., 2000

nohut -gen işaretleme Ratnaparkhe ve ark., 1998

karnabahar -somoklonal varyasyonun belirlenmesi Leroy ve Leon, 2000 at turpu -somoklonal varyasyonun belirlenmesi Rostiana ve ark.,1999 çilek, elma ve

Ribes türleri

-gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Korbin ve ark.,2002 fasülye -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Galvan ve ark., 2003 fıstık -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi,

filo-genetik analizler, kültürlerin tanımlanması Raina ve ark.,2001 limon -kültürlerin tanımlanması Fang ve Roose, 1997 SAMPL marul -bağlantı haritaları, Witsenboer ve ark.,1997 -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi

Norveç ladini -bağlantı haritaları Paglia ve Morgante, 1998

havuç -bağlantı haritaları Vivek ve Simon, 1999

buğday -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi, gen

işaretleme Roy ve ark., 2002

börülce -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Tosti ve Negri, 2002 tatlı patates -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Tseng ve ark., 2002

kış arpası -gen çeşitliliğinin değerlendirmesi Bolibok ve Rakoczy Trojanowska, 2003

(30)

Çizelge 2.2. Mikrosatelit tabanlı markörlerin temel özelliklerinin bir karşılaştırması

Özellik Markör tipi

SSR ISSR SAMPL

Bulunma miktarı yüksek yüksek orta/yüksek

Lokus özgüllüğü evet hayır hayır

Polimorfizm yapısı Tekrarların uzunluğundaki

değişmeler/ motif sayısı Baz değişiklikleri (insersiyonlar, delesyonlar) SSR tekrarlarının uzunluğu ve motif sayısı

Baz değişimleri (insersiyonlar, delesyonlar) SSR tekrarlarının uzunluğu ve motif sayısı

Polimorfizm seviyesi yüksek/çok yüksek yüksek/orta yüksek

Kalıtım şekli ko-dominant dominant

/ko-dominant ko-dominant /dominant

Üretkenlik yüksek yüksek/orta yüksek

Dizi bilgisi evet hayır hayır

gereksinimi Teknik gereksinim

orta/düşük (kütüphane yapımı ve ayıklanması hariç)

düşük/orta orta

Tutar orta düşük orta

İşçilik yüksek (kütüphane yapımında ve ayıklanmasında iş gücü

kaybı)

düşük orta

Zaman genellikle zaman alan kütüphane inşa aşaması ve ayıklama gerekir

düşük orta

Temel uygulamalar bağlantı haritaları, genetik çeşitlilik çalısmaları, gen işaretleme identification of cultivars, filogenetik çalışmalar genetik çeşitlilik çalısmaları, bağlantı haritalaması Temel avantajlar yüksek polimorfizm seviyesi

(26 allel’e kadar), ko-dominant kalıtım modu, çok

yüksek üretgenlik

multilokus ve

reaksiyon başına yüksek polimorfik patern üretimi , teknik kolaylığı, düşük ücret

Reaksiyon başına bilgi çok sayıda verici bantların amplifikasyonu, yüksek üretkenlik

Jones ve ark. (1997), Genetik çeşitliliğin değişen çevre koşullarına karşı popülasyonların sabitliği için önemli bir faktör olduğunu bildirmişlerdir. Özellikle ISSR markörlerinin türler içinde çok değişken ve daha uzun primerler kullanıldığı için yüksek bağlanma sıcaklığına sahip dolayısıyla RAPD markörlerine göre daha avantajlı olduğunu belirtmişlerdir.

(31)

Miller ve Spooner (1999), Jiménez ve ark. (2005), Moleküler markörlerin zor bitki kompleksleri içindeki kardeş türleri ve türlerin sınırlarını belirlemek için güçlü veriler sağladıklarını belirtmişlerdir.

Gitzendanner ve Soltis (2000), Bitki türlerinin dağılımına göre genetik çeşitliliğin belirlenmesinin genellikle çok gerçekçi olmadığını, çünkü bazı endemik türlerin daha yaygın olan diğer cinslerle karşılaştırıldığında eşit ya da daha yüksek çeşitlilik gösterdiğini belirtmişlerdir.

Bornet ve Branchard (2001), ISSR metodunun AFLP tekniğinden daha ekonomik olduğunu ve SSR daki gibi diziyle ilgili ön bilgi ve klonlama yöntemi gerektirmediğini bildirmişlerdir.

Qian ve ark. (2001), Çeşitli moleküler markörler arasında RAPD ve ISSR markörleri genomdaki hedef diziler ile ilgili ön bilgiye ihtiyaç duymadığından dolayı popüler ve diğer tekniklerle karşılaştırıldığında bu iki tekniğin basit ve hızlı olduğunu bildirmişlerdir. Teorik olarak, ISSR markörlerinin üretkenlik ve polimorfizm bakımından RAPD tekniğine göre daha üstün olduğunu düşünmüşlerdir.

Carolan (2002), Papaver cinsi Oxytona seksiyonuna ait türlerden Papaver bracteatum’ a ait in vitro kültür hatlarında gelişen ve olgunlaşmış bitkilerden gelişen kallus kültürlerinde AFLP ile genetik varyasyonu araştırmıştır. Rejenere bitkiler morfolojik ve fitokimyasal olarak ana bitkilerden değişiklik göstermişlerdir. Papaver bracteatum’ da bulunan dominant alkaloitlerden tebain, olgunlaşmış hatlardan gelişen bitkilerin kapsüllerinde rastlanamamıştır. Bundan dolayı genetik uniform yapı bozulmuştur. Onun yerine Papaver pseudo-orientale’ de bulunan izotebain bulunmuştur. AFLP tekniği ile

Oxytona seksiyonu soyağacı ilişkisinde 3 tür olarak ayırt edilmektedir. Fakat in vitro

çalışılan bitkiler Papaver pseudo-orientale’ ye benzemektedir. Fitokimyasal ve kromozom sayısı çalışmaları tohumların hibrit olduğunu göstermekte olup, in vitro çalışmaların somaklonal varyasyon olmayıp genetik üniform kaybı tohumdan kaynaklanmaktadır. AFLP parmakizi analizi metot olarak Oxytona’ ya ait türleri ayırmak ve alloploidiyi bulmak için kolaylık sağladığını bildirmiştir. AFLP tahıllarda ve

(32)

diğer bitkilerde klonal varyasyonu bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır (Mackill ve ark., 1996; Paul ve ark., 1997; Waugh ve ark., 1997; Hodkinson ve ark., 2002).

Phyllostachys gibi birçok yüksek bitkide kullanılmıştır.

Budak ve ark. (2004), Buchloe dactyloides (manda çimi) bitkisinin tohum ve vejetatif biyotipleri ile yaptıkları çalışmada; 30 farklı primer kullanarak biyotipler arasındaki farklılıkları SSR, ISSR, SRAP ve RAPD yöntemi kullanarak belirlemişlerdir. Buna göre; ortalama genetik benzerlik SSR’ da 0.52, ISSR’de 0.51, SRAP’ de 0.62 ve RAPD’ de 0.57 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca bu (ISSR, SSR, RAPD ve SRAP) 4 farklı markör tekniği de kendi aralarında karşılaştırıldığında RAPD ve SRAP indekslerinde yüksek korelasyon r: 0.73, RAPD ve SSR arasında r: 0.24 ve ISSR ve SSR arasında r: 0.63 olduğunu belirtmişlerdir. Bu verilerin yakın akraba çeşitlerde genetik benzerliği ifade etmede güvenle kullanılabileceğini bildirmişlerdir.

Dangi ve ark. (2004), Çeşitli ülkelerde yayılış gösteren Trigonella foenum-graecum a

ait 17 aksesyon ve Trigonella caerulea a ait 9 aksesyon RAPD ve ISSR markörleri

kullanılarak analiz edilmiştir. Genetik çeşitlilik parametreleri ISSR, RAPD ve ISSR+RAPD ile tüm türler için hesaplanmıştır. Bu çalışmada Trigonella bitkisinin genetik çeşitliliği ve muhtemel orjin veya çeşitlilik merkezi tartışılmıştır. Kullanılan 100 primerden 40 tanesi amplifikasyon vermiştir. Ayrıca 17 T. foenum-graecum aksesyonunda sadece 14 ISSR primeri intraspesifik varyasyon belirlenmiştir.

Carolan ve ark. (2006), ITS ribozomal DNA çalışmalarında Papaver cinsi ve cinse ait seksiyonların üzerinde yapmış oldukları çalışmada tek atadan geliştiklerini ifade etmişlerdir. Buna göre; morfolojik karakterlerin yeterli ayıraç olamayacağı vurgulanmıştır. Meconidium, Oxytona ve Pilosa seksiyonları morfolojik olarak heterojendir ve bu grup için sintiplerin tanımlanması zordur. Genomik ve floresans in situ hibridizasyon çalışmaları sonucu diploid P. bracteatum’un hexaploid P.

(33)

Gupta ve ark. (2007), Tıbbi ve süs bitkisi olarak kullanılan Catharanthus roseus bitkisinin genetik bağlantı haritası RAPD, ISSR ve EST-SSR moleküler markörleri kullanılarak ortaya çıkarılmıştır.

Liu ve ark. (2008), 35 adet seçkin geç çiçeklenen turp kültürünün tanımlanması ve genetik çeşitliliğinin analiz edilmesi için RAPD, ISSR ve SRAP moleküler marker sistemleri uygulanmıştır. 35 RAPD, 22 ISSR ve 17 SRAP primeri kombinasyonu ile polimorfik bantların oranları sırasıyla 85.44%, 85,2% ve 85.41% ; genotip çiftleri arasındaki ortalama genetik benzerlik katsayısı da sırasıyla 0.781, 0.787 ve 0.764 olarak saptanmıştır.

Hızlı ve kesin kültür tanımlanması, yeni seçkin kültürlerin kayıt edilmesi, belgelenmesi ve üretici haklarının korunması için temel olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte pek çok zirai özelliğin fenotipinin nicel olarak kalıtım gösterdiğini ve kültürlerin tanımlanmasını nispeten öznel yapan ve sıklıkla benzer kültürlerin farklılıklarını karmaşıklaştıran çevreden kolayca etkilendiğini belirtmişlerdir. Moleküler markörlerle parmak izi analizinin, genomik DNA çeşitliliğine dayandığını ve analizlerin kusursuz, nesnel olmasını ve kültürlerin hızlı tanımlanmasını sağladığını söylemişlerdir. Seçkin kültür geliştirilmesi için germplasm genetik çeşitliliğinin moleküler karakterizasyonun önemli olduğunu belirtmişlerdir.

Fu ve ark. (2008), Yaygın olarak süs bitkisi şeklinde üretilen Caryophyllaceae familyasının üyelerinden Dianthus chinensis, Dianthus barbatus ve Dianthus superbus ile ilgili yakın genetik akrabalık bilgilerinin üretim programlarını kolaylaştırabileceğini söylemişlerdir. SRAP, ISSR ve morfolojik özellik ölçümlerini karşılaştırmışlardır. Toplam 24 aksesyon üzerinde toplam 38 ISSR primeri çalışılmıştır ancak 10 tanesi yorumlanabilir bant vermiştir. Polimorfizm oranı % 95,65 olarak bulunmuştur.

Moleküler markörlerin, genetik farklılığın değerlendirilmesi için morfolojinin ölçümü üzerine belirlenen pek çok avantajları olduğunu belirtmişlerdir. Markör destekli seçimler bitki gelişiminin çok erken dönemlerinde üretim programlarını görüntülemek için kullanıldığını ve gelişme koşullarından bağımsız olduğunu belirtmişlerdir.

(34)

Wang ve ark. (2009), Çin’in Tibet bölgesinden 45 yakın akraba yabani arpa ile Orta doğunun farklı ülkelerinden alınan 45 yabani arpa türü SSR ve ISSR markörleri ile çalışılmıştır. 10 ISSR primeri kullanılmış toplamda 93 bant oluşmuştur. Bant uzunlukları 200 ila 2000 bp arasında değişmektedir. Tibet’te ki yabani arpaların genetik çeşitliliğinin Orta doğudaki arpalardan daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Yapılan analizlerin sonucunda kültüre alınmış arpanın gen merkezinin Tibet Platosu olduğu belirtilmiştir.

Yuan ve ark. (2009), Çin’de bilinen bir tıbbi bitki olan Saussurea involucrate Kar. et Kir. bitkisinin doku kültürü çalışmalarının bütün evrelerindeki genetik niteliklerini kontrol etmek amacıyla, RAPD ve ISSR markörleri kullanarak DNA polimorfizmlerini ve genetik çeşitliliklerini bulmuşlardır. 11 çeşit bitki materyali üzerinde genetik çeşitlilik belirlemişlerdir. ISSR analizlerinde toplam 14 primer kullanılmış, polimorfik bantların oranı % 33 ve primer başına düşen ortalama polimorfizm 2.71’dir. Kümeleme analizlerindeki genetik benzerlik ortalaması 0.885’dir. ISSR markörleri ile yapılan analizlerde adventif sürgün rejenerasyonları arasında göze çarpan farklılıklar bulmuşlardır. Dolayısıyla RAPD ve ISSR markörlerinin genetik varyasyonların ve niteliklerin belirlenmesinde önemli araçlar olduğunu belirtmişlerdir. Bütün markörler arasında RAPD ve ISSR markörleri duyarlılıkları, basitlikleri ve ucuz olmalarından dolayı en fazla tercih edilen markörler olduğunu belirtmişlerdir.

Crema ve ark. (2009), Primula apennina Widmer (Primulaceae) ile yaptıkları çalışmada 6 popülasyon arasındaki ve içindeki genetik çeşitliliği belirlemişlerdir. Bu analizlerin P. apennina bitkisinde zayıf ancak önemli genetik yapı gösterdiğini ve gen akışının populasyonların farklılaşmasında homojenize edici bir güç gibi davrandığını belirtmişlerdir. Bu çalışmada ISSR tekniğini kullanmalarının sebebi olarak: (1) türler içindeki toplam genetik çeşitliliğin miktarını belirleme (2) popülasyon içinde ve arasında genetik çeşitliliğin dağılımını belirleme (3) etkin koruma programları için öneriler olarak sıralamışlardır.

(35)

Carrasco ve ark. (2009), papaya ile yapmış oldukları çalışmada 7 ISSR primerini 333 kültür örneğinde çalışmışlardır. 114 tane banttan 63 tanesi polimorfik bulmuşlardır. Gruplar arasında genetik çeşitliliği % 65 olarak belirlemişlerdir. Çıkan sonuçlara göre bir gen havuzundaki genetik çeşitliliğe göre ulusal bir üretim programına başlanabileceğini belirtmişlerdir.

Thimmappaiah ve ark. (2009), 100 mahun cevizi aksesyonunda RAPD ve ISSR markörlerini kullanarak genetik çeşitlilik belirlenmiştir. Seçilen 10 ISSR primerinin toplam 67 bant oluşturduğu ve bunlardan 58 tanesinin (% 86,6) polimorfik olduğu belirlenmiştir. Uygulanan markörlerin germplasm kaynaklarının yönetiminde çok kullanışlı olduğunu belirtmişlerdir.

Wang ve ark. (2009), Genetik çeşitliliğin değerlendirilmesinin gelecekteki germplasm korunumunu kolaylaştırdığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada ISSR parmak izi tekniği kullanılarak 50 adet C. goeringii kültürünün genetik çeşitliliği değerlendirilmiştir. 25 ISSR primeri kullanılarak 224 ISSR bandı oluşmuş ve polimorfizm oranı % 93,75 bulunmuştur. C. goeringii kültürlerinin genetik akrabalıklarının belirlenmesinde ISSR tekniğinin güçlü bir yöntem olduğunu göstermişlerdir.

Jiménez ve ark. (2009), İspanya’da koruma altına alınan Pseudonarcissi seksiyonuna ait

Narcissus (N. alcaracensis, N. bugei, N. enemeritoi, N. longispathus, N. nevadensis, N. segurensis, ve N. yepesii) aksesyonlarının morfolojileri çok benzer olduğu için coğrafik

orjinleri bilinmeden ayırt etmenin çok zor olduğunu söylemişlerdir. ISSR ve ITS teknikleri kullanılarak genetik çeşitliliklerini belirlemişlerdir. 6 ISSR primeri 228 bireyde uygulanmıştır. Bant uzunluğu 320 ile 2250 arasında değişmiş olup polimorfizm oranını % 86,40 olarak bulmuşlardır.

Huang ve ark. (2009), 22 Astragalus adsurgens aksesyonu için toplam 12 primer kullanmışlardır ve sonucunda 116 bant oluşmuştur. (AC)n motifine dayalı primerlerin daha yüksek oranda polimorfizm gösterdiğini belirtmişlerdir. ISSR tekniğinde hesaplanan MI değerinin RAPD tekniğindekinin iki katı olmasından dolayı ISSR tekniğinin A. adsurgens de ilk tercih edilecek markör olduğunu söylemişlerdir.

(36)

Farés ve ark. (2009), Güney Tunus’ta bulunan bazı fıstık kültür ağaçlarının morfolojik ve kimyasal markörlerle desteklenen ISSR moleküler markörleriyle tanımlanması ve karakterizasyonu yapılmıştır. 15 bitkiye 13 ISSR primeri uygulanmış ve toplam 26 polimorfik bant oluşmuştur.

Morfolojik çeşitlilik analizleri iklimsel faktörler tarafından etkilendiğinden dolayı vitamin içeriği ve moleküler analizler çeşitliliğin anlaşılmasının mümkün olacağını belirtmişlerdir. Ayrıca bu çalışma fıstık germplasmlarının moleküler polimorfizmini ve filogenetik akrabalıklarını bulmak için ISSR markörlerinin uygun ve bilgi verici olduğunu ortaya koymuştur.

(37)

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Materyal

Materyal olarak kullanılan örnekler; Türkiye’nin çeşitli yerlerinden toplanmış, Oxytona seksiyonu içerisindeki Papaver türlerine ait bitkilerdir. Bu bitkiler TÜBİTAK projesi kapsamında GOP Üniversitesi deneme tarlasında yetiştirilmiştir (bkz Çizelge 3.1.). Her bir bitkiden üç sırada beşer bitki olacak şekilde 15 adet bitki deneme tarlasında yetiştirilmiştir. Araştırma materyali olarak kullanılan 180 adet bitkiden DNA izolasyonu amacıyla genç taze yapraklar alınmıştır.

Çizelge 3.1. Oxytona seksiyonuna ait Papaver türlerinin toplandıkları bölgeler

Toplandığı Bölge Bitki Kod

Numarası

Bitki Adedi

Sivas / Yıldız Dağı 1 ve 5 arası 5

Sivas / Tecer Dağı 6 ve 10 arası 4

Erzincan-Refahiye ilçe sınırı / Sakaltutan, Değirmendere

Köprüsü 11 ve 20 arası 9

Tunceli / Ovacık Mercan Vadisi 21 ve 70 arası 23

Niğde / Fesleğen Köyü Göksun Yaylası 71 ve 277 arası 135 Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi 23–99–149 4

3.2. Yöntem

Araştırmamızda kullanılan ISSR tekniği DNA izolasyonu, PCR uygulaması ve PCR ürünlerinin Agaroz Jel ortamında yürütülerek jel görüntüleme sisteminde görüntülenmesi işlemlerini içermektedir.

(38)

3.2.1. Bitki Örneklerinin Laboratuar Çalışmaları İçin Hazırlanması

Moleküler analizlerde kullanılacak DNA materyalini izole etmek amacıyla bitkilerin genç yaprakları ilkbahar döneminde toplanmıştır. Bitkilerden toplanan yapraklar kuru buz içerisinde laboratuara getirilerek -80 oC ye konulmuştur. Birkaç gün bekletildikten sonra sıvı azot ile beraber havanda dövülerek toz haline getirilmiştir. Toz haline getirilen bitki örnekleri DNA izolasyonu yapılana kadar -80 oC de bekletilmiştir.

3.2.2. DNA İzolasyonu

DNA izolasyonu için Fermentas marka Genomic DNA Purification DNA izolasyon kiti kullanılmıştır. DNA izolasyon işlemi şu basamaklardan oluşmaktadır.

• 50–100 mg öğütülmüş bitki örneği üzerine 400 µl lizis (parçalayıcı) solüsyonu eklenmiştir.

• 5 dakika 65 oC de inkübe edilmiştir.

• Üzerine 600 ml kloroform eklenmiş ve 3-5 kez alt üst edilmiştir. • 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiştir.

• Üst tarafta kalan kısım yeni bir tüpe alınmıştır.

• 800 ml seyreltilmiş yoğunlaştırıcı solüsyonu (precipitation solution) eklenmiştir.

• 1–2 dakika karıştırılmıştır.

• 2 dakika 10000 rpm de santrifüj edilmiştir. • Üst tarafta kalan kısım atılmıştır.

• Tüpün dibinde kalan DNA pelleti 100 ml NaCI solüsyonu ile çözülmüştür. • 300 ml soğuk etanol eklenmiştir.

• 10 dakika -20 oC de inkübe edilmiştir.

• 4 dakika santrifüj edilmiş ve üstte kalan kısım atılmıştır.

% 70’lik soğuk etanol ile DNA peleti yıkanmıştır. DNA peleti 100 ml TE (Tris –EDTA Buffer) içinde çözdürülmüştür.

(39)

3.2.3. PCR Uygulaması

PCR işlemi için Apollo Instrumentation ATC401 cihazı kullanılmıştır. PCR mix içerisine aşağıda belirtilen hacimlerde ve konsatrasyonlarda PCR bileşenleri katılmıştır.

Çizelge 3.2. PCR bileşenlerinin konsantrasyonları ve miktarları

PCR öğeleri Final Konsantrasyon Kullanılan Miktar (µl)

Su 14,75

10x Buffer Mg free (BIOBASIC) 1X 2,5

20 mM MgSO4 (BIOBASIC) 2.8 mM 3,75

10 mM dNTP (Vivantis) 0.3 mM 1

primer 0.4µM 0,8

Taq DNA polimeraz (BIOBASIC) 0.2U 0,2

DNA 20 ng 2

Toplam 25

Hazırlanan PCR mix için uygulanan PCR protokolü şöyledir;

Çizelge 3.3. PCR protokolü

Sıcaklık (oC) Süre (sn) Döngü Sayısı

Ön denatürasyon 94 300 1 Denatürasyon 94 30 Bağlanma 42-63 60 Uzatma 72 75 40 Son uzatma 72 600 1 4 Bekleme

(40)

3.2.4. Çalışmada Kullanılan ISSR Primerleri

Çalışmada baz dizileri aşağıda belirtilen 20 adet ISSR primeri kullanılmıştır.

Çizelge 3.4. Kullanılan primerlerin isimleri ve baz dizileri

Primer TM Primerlere ait baz dizileri (5'-3')

AT1 49,90 GAGAGAGAGAGAGAGACC AT2 48,56 AGAGAGAGAGAGAGAGTC AT3 48,48 TCTCTCTCTCTCTCTCG AT4 45,66 CTCTCTCTCTCTCTCTT AT5 46,79 GAGAGAGAGAGAGAGAC AT6 48,15 AGAGAGAGAGAGAGAGG AT7 49,63 CTCCTCCTCCTCCTC AT8 51,53 AGAGTTGGTACGTCTTGATC AT9 64,10 CACCACCACCACCACCACCACT AT10 42,51 GTGTGTGTGTGTAC AT11 50,91 CTCCTCCTCCTCGC AT12 60,60 ACCACCACCACCACCACC AT13 62,15 AGCAGCAGCAGCAGCAGC AT14 47,36 GACAGACAGACAGACA AT15 47,37 ACTGACTGACTGACTG AT16 47,03 AGTCAGTCAGTCAGTC AT17 58,08 GTCGTCGTCGTCGTCGTC AT18 28,02 ATTATTATTATTATTATT AT19 49,90 CTCTCTCTCTCTCTCTCTG AT20 51,78 AGAGAGAGAGAGAGAGAGC

(41)

3.2.5. Elektroforez İşlemi

PCR ürünlerini elektroforez etmek için % 2’lik agaroz jel hazırlanmıştır. DNA’nın boyanması için etidium bromür kullanılmıştır. 25µl PCR ürünü üzerine 3µl yükleme solüsyonu eklenerek, elektroforez tankına yerleştirilen jel üzerine yüklenmiş ve 120 voltta ortalama 2,5 saat yürütülmüştür.

3.2.6. DNA Bantlarının Görüntülenmesi

Elektroforez uygulaması bittikten sonra KODAK Gel Logic 200 jel görüntüleme cihazı kullanılarak U.V. ışık altında resimler alınarak değerlendirilme yapılmıştır.

3.2.7. DNA Bantlarının Değerlendirilmesi

ISSR bantları 1 ve 0 olarak kayıt edilmiş olup, ‘1’ bandın varlığını ‘0’ ise bandın yokluğunu göstermektedir. Materyaller arasındaki genetik mesafe POPGENE32 versiyon 1.32 (Population Genetic Analysis) ve MEGA 4.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) programları ile analiz edilmiştir.

(42)

4. BULGULAR

ISSR çalışmasında Oxytona seksiyonuna ait türlerde 20 primer çalışılmıştır (bkz Şekil 4.1. ve Şekil 4.2.) . Çalışılan primerlerin tamamı polimorfiktir. 20 ISSR primeri toplam 82 bant oluşturmuş olup 80 tanesi polimorfiktir. En az bant veren AT10 primeri 3 bant, en çok bant veren AT19 ve AT3 primeri 5 bant vermiştir. Verilere göre en yakın genetik mesafe 0, en uzak 1 dir. Genetik mesafesi 0 olan bitkiler dışında en yakın genetik mesafe 0,09 dur ve bu mesafe 90 çift bitki arasında görülmektedir. 15 çift bitki arasında ise genetik mesafe en uzaktır (bkz Şekil 4.3. ve Çizelge 4.1.). Ortalama genetik mesafe 0,35, Shannon indeksi 0,50 dir. Polimorfizim oranı ise % 96,97dir.

Şekil 4.1. ISSR AT3 primerinin %2 agaroz jel görüntüsü

(43)

23 1D 1 1 1 D 2 5C 10 1D 12 4A 12 3D 19 4D 22 9B 20 2B 12 8A 14 6A 14 4D 18 7A 11 F 60 E 15 1A 18 F 31 C 226 B 168B 20184B1B 157D 200B 135E 69E 140A 118D 156A 72E 120A 126A 189B 230B 212B 7F 154A 235B 223D 156A 197B 208E 99D 179B 97D 157A 5F 142A 191B 74C 99A 35C 10F 132A 9F 160A 2F 104D 44C 192B 1B 198B 148A 19F 102D 6F 1F 23 2B 20 7B 13 0D 18 0B 20 5B 19 9B 12 1A 67E 70E 22 2B 236 B 5 1C 2 18 B 11 5A 36 C 15 3 A 1 3 1 D 1 4 F 12 1 D 7 0 D 7 3 E 3 9 C 2 0 4 D 2 2 1 B 1 3 7 A 1 9 4 B 5 7 E 1 1 6 A 1 4 8 D 1 8 1 D 16 3B 17 E 13 4A 15 F 10 2A 21 5B 20 4D 12 5A 11 9A 41 C 14 7D 34 C 30 C 18 D 20 0D 20 3B 226B 201B 231B 186B 135A 29C 206B 159 A 184B 155D 111A 162B 130A 75E 199D 83F 16F 125D 238B 23C 68E 217B 136A 133A 165B 148A 149A 3F 12F 113A 167B109A 8F 239B107A 147A119D 123A190D 204B134A 103A38C 145A 27779DB 24511B8A82D 22 4B 16 9AB 21 6B47C 14 4A 24 0B40C 12 8D190B 1 67B71F 213 B 21 2D 5 0C 2 3 4B 1 9 6B 1 0 7 D 1 9 5 B 0 5 10 15 20 25

Şekil 4.3. ISSR primerlerinin oluşturduğu, bitkiler arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren dendogram

(44)

Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi

Grup No Bitki Sırası Kromozom sayısı Toplanan Bölge Tomurcuk

Görünümü Brakte Kaolin Petal Petal Rengi

Petal Leke Durumu

Tebain Mik. (%)

231 D 42 NİĞDE Yarı dik 5 Kiremit kırmızı Ortada - 111 D 42 NİĞDE Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,092

25 C 28 TUNCELİ Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada 2,504 101 D 28 NIGDE Dik 5 6 Kiremit kırmızı Ortada - 124 A 42 NİĞDE Yarı dik 1 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,057 123 D 28 NİĞDE Yarı Dik 1 3 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,089 194 D NİĞDE Yarı Dik 6 Kiremit kırmızı Ortada

A1

229 B 42 NİĞDE

202 B 28 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 128 A 42 NİĞDE Dik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,086 146 A 42 NİĞDE

A2

144 D NİĞDE Dik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada

187 A NİĞDE

11 F 42 ERZİNCAN Dik 5 1 6 Kiremit kırmızı Tabana kadar 2,006 60 E 28 TUNCELİ Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada

151 A 42 NİĞDE Eğik 3 2 11 Kiremit kırmızı Ortada 0,173 18 F 42 ERZİNCAN Dik 4 2 6 kırmızı Koyu Ortada - A3

31 C 42 TUNCELİ

A4 226 B 42 NİĞDE Eğik 6 Kiremit kırmızı Ortada - 168 B 42 NİĞDE

204 B 42 NİĞDE Eğik 4 Kiremit kırmızı Ortada - A5

181 B 42 NİĞDE Eğik 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar

157 D 42 NİĞDE Dik 4 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,344 200 B 28 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada 2,829 A6

(45)

Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi (devamı)

69 E 42 TUNCELİ Dik 4 Kiremit kırmızı Yok -

140 A NİĞDE

118 D 42 NİĞDE Dik 2 2 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,081 A6

156 A 28 NİĞDE Eğik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,24

72 E NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada

120 A 28 NİĞDE Eğik 4 Kiremit kırmızı Ortada 126 A 42 NİĞDE Dik 6 Kiremit kırmızı Ortada

189 B NİĞDE

A7

230 B 42 NİĞDE Yarı dik 6 Kiremit kırmızı Ortada 212 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Yok

7 F 28 TECER SİVAS Dik 4 1 6 kırmızı Koyu Tabana kadar 2,074 154 A 28 NİĞDE Eğik 4 1 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,275 235 B 42 NİĞDE

223 D NİĞDE

A8

156 A 28 NİĞDE Eğik 3 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,24 197 B 42 NİĞDE Yarı dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 208 E 42 NİĞDE Yarı dik 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,068

99 D 14 AUZF Dik 5 1 6 kırmızı Koyu Ortada 1,06 179 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Yok 0,006 A9

97 D 42 NİĞDE

157 A 42 NİĞDE Eğik 3 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,17 5 F 42 YILDIZ SİVAS-

142 A NİĞDE

191 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada -

74 C NİĞDE

99 A 14 AUZF Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada 1,533 35 C 28 TUNCELİ Eğik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 10 F 42 TECER SİVAS Dik 4 2 6 kırmızı Koyu Tabana kadar 1,982 A10

132 A 28 Niğde Eğik 5 Kiremit kırmızı Ortada - 9 F 42 TECER SİVAS Dik 5 1 6 kırmızı Koyu Ortada 1,53 160 A 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,233

2 F 42 YILDIZ SİVAS

104 D 14 NİĞDE Dik 4 2 6 kırmızı Koyu Ortada - A11

(46)

Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi (devamı)

192 B 42 NİĞDE Yarı Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,06 1 B YILDIZ SİVAS

198 B 28 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada

148 A 42 NİĞDE Dik 1 1 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar 0,205 19 F 42-28 ERZİNCAN Dik 5 1 6 kırmızı Koyu Ortada -

102 D 28 NİĞDE

6 F TECER SİVAS Dik 6 kırmızı Koyu Ortada 1 F 42 TECER SİVAS Dik 4 1 6 kırmızı Koyu Ortada A12

232 B 42 NİĞDE

207 B 42 NİĞDE Dik 6 Kiremit kırmızı Ortada - 130 D 42 NİĞDE Dik 6 Kiremit kırmızı Ortada

180 B NİĞDE

A13

205 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Yok -

199 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 121 A 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 67 E 28 TUNCELİ Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada 1,196 70 E 42 TUNCELİ Dik 1 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,395

222 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Yok -

A14

236 B 42 NİĞDE Dik 6 kırmızı Koyu Ortada 0,061 51 C 28 TUNCELİ

218 B 42 NİĞDE Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,01 115 A 28 NİĞDE Eğik 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,061

36 C 28 TUNCELİ Eğik 13 Kiremit kırmızı Ortada 0,057 A15

153 A 28 NİĞDE

131 D NİĞDE

14 F 28 ERZİNCAN Dik 3 2 5 kırmızı Koyu Tabana kadar - 121 D 42 NİĞDE Dik 2 6 Kiremit kırmızı Ortada -

70 D TUNCELİ Yarı dik 4 Kiremit kırmızı Yok

73 E NİĞDE

39 C 28 TUNCELİ Eğik 6 Kiremit kırmızı Ortada - A16

204 D 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,058 B1 221 B 42 NİĞDE Dik 6 Kiremit kırmızı Ortada az -

137 A 28 NİĞDE B2

(47)

Çizelge 4.1. Moleküler özelliklerin kromozom sayısı, önemli morfolojik özellikler ve tebain içerikleriyle birlikte gösterilmesi (devamı)

57 E 42 TUNCELİ Yarı Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 116 A 28 NİĞDE Eğik 6 Kiremit kırmızı Ortada - 148 D 42 NIGDE Dik 1 6 Kiremit kırmızı Tabana kadar 3,164 B2

181 D 42 NİĞDE Eğik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 163 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar -

17 E 42 ERZİNCAN B3

134 A 42 NİĞDE

B4 15 F 42 ERZİNCAN Eğik 4 1 6 Koyu kırmızı Tabana kadar 1,534

102 A 28 NIGDE Dik Koyu kırmızı Ortada -

215 B 42 NIGDE Yarı dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 204 D 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada 0,058

125 A 28 NİĞDE Dik 7 Kiremit kırmızı -

119 A 42 NIGDE Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada - 41 C 42 TUNCELİ-OVACIK

147 D 28 NİĞDE Eğik 6 Kiremit kırmızı Ortada

34 C 28 TUNCELİ Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 30 C 42 TUNCELİ Dik 5 6 Koyu kırmızı Ortada - 118 D 42 NİĞDE Dik 2 2 6 Kiremit kırmızı Ortada -

200 D 28 NİĞDE Eğik 4 Kiremit kırmızı -

B5

203 B 42 NİĞDE Yarı dik 5 Kiremit kırmızı Ortada 0,088 226 B 42 NIGDE Eğik 6 Kiremit kırmızı Ortada - 201 B 28 NİĞDE Yarı Dik 5 Kiremit kırmızı Ortada çok az 3,047 231 B 42 NİĞDE Yarı dik 4 Kiremit kırmızı Ortada -

186 B 42 NİGDE Yarı dik 4 Kiremit kırmızı -

B6

135 A 28 NİĞDE Eğik 3 6 Kiremit kırmızı Ortada - 29 C 28 TUNCELİ Dik 6 6 Koyu kırmızı Tabana kadar 1,27 206 B 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Tabana kadar - 159 A 28 NİĞDE Eğik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 184 B 42 NİĞDE Yar dik 7 Kiremit kırmızı Ortada - B7

155 D 42 NİĞDE Dik 4 Kiremit kırmızı Ortada - 111 A 42 NİĞDE Dik 6 Kiremit kırmızı Ortada 0,092 162 B 42 NİĞDE Dik 2 6 Kiremit kırmızı Ortada - 130 A 28 NİĞDE Eğik 4 6 Kiremit kırmızı Ortada - B8

Referanslar

Benzer Belgeler

“The European Society for Clinical Nutrition and Metabolism (ESPEN)” tarama amacı ile toplum için Malnütrisyon Üniversal Tarama Aracı [Malnutriti- on Universal Screening

We have addressed a single machine scheduling problem where job processing times and tool usage can be controlled by selecting the appropriate machining conditions; our objective

Evliya Çelebi’s Seyahatnâme, in contrast, was unknown in the capital; and when the work was brought to Istanbul in the middle of the eighteenth century it was deposited in the

şişmanlık ve bunun zemin hazırladığı hastalıklar önemli halk sağlığı sorunlarındandır. Bazı kaynaklar besin ögelerini "besin elementi" terimi ile de

Çocuk çalıştayı temaları, yerel yönetimlerle ilişkili olarak çocuk, oyun ve spor; çocuk, eği- tim ve bilim; çocuk ve yapılı çevre; çocuk ve doğa; çocuk, kültür ve

Belediyenin Bünyesinde (Tablo XII); 120 KWA kesintisiz güç kaynağı ve önünde 15KWA’lık güç kaynaklarıyla desteklenen mevcut sistem odası, veri tabanı sunucuları, 2

Adli-tlbbi oJguJarda, koku§ma buJgulan bulunan cesetlerin kamnda alkol saptandlgmda, belirlenen bu etanol seviyesinin ki§inin ya§arken alml§ oldugu alkol miktarma ml, yoksa

Düşünen Adam The Journal of Psychiatry and Neurological Sciences, Volume 26, Number 3, September 2013 Wilson Hastalığına Bağlı.. Kişilik