Başlık: IMMUNOELECTROPHORESIS ÜZERİNDE ARAŞTIRMALARYazar(lar):ERTÜRK, ÖmerCilt: 10 Sayı: 1 DOI: 10.1501/Vetfak_0000001965 Yayın Tarihi: 1963 PDF

A.Ü. Veteriner Fakültesi Bakteriyoloji ve Salgınlar Kürsüsü Ord. Prof. Dr. Süreyya Aygün

IMMUNOELECTROPHORESIS ÜZERİNDE

ARAŞTIRMALAR

Ömer Ertürk*

Kesin biyolojik, kimyasal veya terapötik aktivitelerle serum komponent-lerinin meydana çıkarılması neticesi insan serumunun karekterinin ve serum . fraksiyonlarının incelenmesi büyük önem kazanmıştır. Her ne kadar,

elektro-foretik metodla elde edilen bir fraksiyon incelenebilirse de, yapılan fiziksel veya kimyasal analizler sonucunda elektrofores ile elde edilen bu fraksiyonun hete-regen olduğu anlaşılmıştır. Tüm serum veya serum fraksiyonunda önemli kantitede mevcut serum komponentlerini tek bir matodla veya biIine~ metod-ların kombinasyonu ile meydana çıkarmak ve karar vermek zordur. Bundan başka genelolarak kabul edilmiştir ki, analitik bir metod ve bilhassa elektro-foresis bir preparasyonun homogen olup olmama özelliğini meydana çıkar-maya kafi değildir (49).

Antikorların kendi homolog antijenlerine karşı yüksek bir spesifitesi olması dolayısiyle son zamanlarda immlino-kemikal analizler önceleri insan ve diğer nevi serumların fraksiyonlarını meyana çıkarmak ve bunların homo-, gen olma özelliklerinin derecesini tespit eetmek ve sonra bağzı

organik'bozuk-luklar ve ~astalıkları' meydana çıkarmak için kullanılmaya başlanmıştır. Bu nokta gözönünde tutularak, bakteriyoloji laboratuvarlarında yeni izok edilen bir ~ikrobun idantifikasyonu yapılırken immunoelektroforez metodundan faydal~nabilmek ve dolayısiyle bu metodun diagnosda bir yardımcı metod ola rak kullanılıp kullanılamıyacağını meydana çıkarmak için bu çalışma yapılmıştır.

Literatür Bilgi

Son zamanlarda spesifik presipitatların analizleri gerek sıvı vasatlarda

(4,14, 15,i6), gerekse katı vasatlarda (2,i4,3°) araştırıcılar tarafından yapılmıştır. Katı vasatta elektroforez ile kombine edilen analitik bir metod Gordol1 ve ar-kadaşları tarafından (8), modifiye edilmiş Ouchterlo'!J metodu ile (30) jellerde yapılan immunokemikal analizler araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (8,9.48).

ımmunoelectrophoresis

Bu çalışmalarda ilk olarak tüm serum komponentleri veya bir serum fraksiyonu bir kapta bulunan agar jelinde elektrofor~z ile yaydırılmış, bundan sonra in-san serumu antijenleri ile immunize edilmiş her hangi bir hayvan serumundaki antikorlar elektroforetik migrasY9nlara paralel olan kanallardan jel içinde yayıl-masına mü sade edilmiştir. Antikor kendisinin spesifik antijeni ile karşılaştığı ve birleştiği zaman beyaz bir hat teşkil etmek üzere karşılıklı olarak presipit olmuş-lardır. Antijen yüksek bir konsantrasyonda olmak üzere jel içinde ayrı bir mın-tıkaya konmuş, bu mıntıkadan antijen ra dial bir şekilde jele nüfuz etmiştir. Bu antijenin antikoru da antijene doğru nüfuz etmeye başlamış, spesifik pres ipi-tat bunun için ark biçiminde teşekkül etmiştir. Williams (46) bu tekniği difteri toksin ve anti toksin solusyonlarında husule gelecek "reaksiyonu incelemek için tatbik etmiştir. Bundan başka bu teknik serum proteinlerinin sivri sinekler tarafından hazmedilmesinde (47), yumurta antijenlerinin karekterini belirtmek için de kullanılmıştır. (I 7,i8, 19)' Williams ve arkadaşı (49) yaptıkları araştırma sonucunda, immunoelektroforetik metodun insan serumunda mevcut olan

bir çok antijenlerin meydana çıkarılmasını ve bunların tayinine imkan sağlıa-dığını anlamışlar, hiper immun beygir serumu ile en az i6 adet mühim mad-deleri ortaya koymuşlardır. Araştırıcılar, serumdaki protein maddelerinin c:lektroforez ile yalnız çeşitlerinin meydana çıkarılmasiyle kalmayıp, bunları gözle görünür bir hale getirmekle her birinin ayrı ayrı mobiliteleri hakkında da hüküm verilebile~eği kanaatına varmışlardır. Yine araştırıcılara göre, immu-noelektroforetik metod normal antijen mikstürlerini, patolojik antijenleri ve bu antijenlerin diğer modifikasyonlarını incelemek için kıymetli bir metod olarak tatbik edilebilir ve bundan başka bu metod

bu

gibi mikstürlerin frak-siyonlarını kontrol etmek için de bilhassa önemlidir.

'

Young ve arkadaşı (53) çeşitli patolojik kondisyon~ar gösteren 160 vakada insanların plasma proteinlerinin elektroforetik analizlerini yapmışlardır. Bu çalışmalarında vak'aların

%

83 ünde albumin konsantrasyonunun normale nazaran düşük olduğunu tesbit etm!şler ve bu düşüşün fena beslenme ve neph-rose vakalarında daha göze çarpacak şekilde olduğunu görmüşlerdir. Araş-tırmanın yapıldığı patolojik bozuklukar arsında lymphatic leukemia, kronik hepatitis, lymphatic hastalıklar, nephrose, . kemik ve mafsal bozuklukları, hepatik portal siros mevcuttur. Bundan başka Wurder(y (50) multiple myeloma, C/eve ve arkadaşı (5) akut poliartiritisde, Seheidegger, (42) Seheiffarth ve arkaşı (44) macroglobulinemia Waldenström hastalıklarının incelenmesi ve dolayısiyle diagnozunda immunoelektroforetik metodla gayet iyi sonuçlar aldıklarını bildirmişlerdir.

Stephen ve arkadaşı (43) yaptıkları araştırma sonucunda elektroforez me-todunu insektlerde gerek indivi,duel ve gerekse toplum varyasyonlarının pro-tein analizlerinde geniş olarak tatbik edilebileceği kanaatına varmışlardır. Grabar (I 3) insan serumu ile hiper immunize edilmiş bir beygirin serumu ile

Ö. Ertürk

yaptığı immunoelektroforez denemesinde normal bir serumda 2i adet spe-sifik presipitin arkı meydana getirmenin müınkün olabileceğini tespit etmiştir.

Komarkova ve arkadaşı (20) kendilerinde hyperparathyroidism bulunan beş hastada immunoelektroforesis ile denemeler yapmışlardır. Bu denemelerinde, hastaların serumlarını normal insan serumları ile mukayese etmişler, hastala-rın serumunda beta -1- globulin sahasında anomaliler görüldüğünü, adeno-ma'nın operasyonundan sonra protein spektrumunun normale döndüğünü tespit etmişlerdir. Osserman (34) esas teknikte yaptığı modifikasyon ile, yaptığı araştırmada yalnız serum gibi kompleks bir mikstürdeki immunoelektrofores neticesi husule gelen her bir arkı idantifiye etmekle kalmamış, ayni zamanda protein solusyonlarında az derecede bulunan maddeleri meydana çıkarmaya ve. idantifiye etmeye, serum ve idrar gibi iki biyolojik sıvıda çeşitli hastalık-ların çeşitli devrelerindeki protein maddelerinin birbirileri ile mukayese im-kanlarının sağlanabileceğini göstermiştir. Tei/elbat/m ve arkadaşlarının (45) Hodkin hastalığı, malignant lymphomas, akut leukemi, kronik lymphocytic leukemia, myeloproliferativ bozukluklar ve multiple myeloma'ya yakalanmış 99 adet insan serumunu ekeltroforetik ve serolojik tekniklerle incelemişler, tatbik edilen tedavi sonucunda husule ge"len önemli değişiklikleri de araştır-mışlardır.

Le Bot/vier (2 i) Polio virusunun D ve C.antijenlerinin kesin tabiat ve özel-liklerini, agarda husule glen erimeyen presipitatlarını, birbirlerinin antikor-larını absorbe edemeyişlerini, bağışıklık verme bakımından birbirinden farklı hususiyetlerini incelemiştir. F. Jacox (7) normal rat'ların serumunda pres ipi-tasyonu müteakip elekrofores ile separe edilen yeni bir karektere sahip bir protein izole etmiştir. Ayni karaktere sahip bir protein insan ve tavşan serum-larında aynı elektroforetik emetodla bulunamamıştır. 1905 yılında Bechold (I) tarafından jelde antijen- antikor reaksiyonunun meydana gelişinin basit olarak gösterilmesinden ve bu reaksiyondan Nicolle ve arkadaşlarının (23) faydalan-masından sonra bir çok yıllar geçmiş ve bu mühim metod Ot/din (25) tarafın-dan tüplerde basİt difüsyonun teşekkülü için pratik ve kesin olarak immuno-loji sahasında bir yardımcı olarak inkişaf -ettirilmiştir. Bu araştırıcı çeşitli za-manlarda (26,27,33) bu teknik ile bir serumda en az dokuz antijenik uns~ru meydana çıkarmaya muvaffak olmuştur. Yine ayni ~raştırıcı tarafından (3 I) bu antijen nevileri en az i6 ya yükseltilmiştir. Son zamanlarda esas prensip olan metodda çeşitli modifikasyonlar yapılmıştır. Bunlar arasında Ot/ch/erlony (28,29) ve Elek (6) tarafından yapılan agarda çift difüsyon tekniği Oakley ve-Ft/lthorpe

(32) tarafından yapılan tüplerde çift difüsyon tekniği vardır. Pot/lik (35) Ouch-terlony metodunu 1952 yılında difteri to~oidinin antijenik unsurlarını ince-lemek için filtre kağıdındaki elektroforesis tekniği ile birleştirmiştir. Bundan sonra b~ immunoelektroforetik metod, protein mikstürlerinin saf veya karışık-lığını meydana çıkarmak, bu hususda bir karar vermek için çok kuvvetli bir metod halinde inkişaf etmiştir (37).

immunoelectrophoresis

Crabar ve Williams (9, ıo) normal, insan serumunda' mevcut antijenik unsurları immunoelektrofores ile incelemeleri sırasında filtre kağıdı yerine agar-jel kuııanmışlar ve böyle serumlarda ı6 adet individuel antijenik unsuru meydana çıkarmaya muvaffak olmuşlardır.

, Son zamanlarda nişasta jelde elektrofo!es Smithies tarafından inkişaf etti-rilmiştir (40). Bu araştırıcı immunolojik incdemeler üzerinde durmadan nor-mal insan serumlarında ı7 adet serum proteini unsurunu meydana çıkarmıştır. Yine ayni araştırıcının metodda yaptığı bağzı değişikliklersayesinde (41) in-celenen protein unsurlarının adedi 2 i e yükselmiş ve bunlar üzerinde daha geniş bilgi elde edilmiştir. Nişasta jelindeki elektrofores meotdu ile Ouchter-lony tekniğinin kombinasyonu immunoelektroforesis sahasında ileriye doğru bir adım atılmasını sağlamıştır.

,/

Nairn ve arkadaşları (24) tavşanlarda domuz böbreğinin homogenize edilmiş cortex kısmına karşı anti serum hazırlıyadık immunoelektrofores me-todundan faydalanarak incelemeler yapmışlardır. Araştırıcılar bu incele-melerini renin maddesi üzerine de tatbik etmişlerdir. Araştırıcılara göre, renin preparatlarının saf olup olmadığını kontrol etmek için bu anti serumlarla ya-pılan jel-difüsyon tekniği basit ve ekonomik bir metodur.

,

,

Barrett ve arkadaşları (3) çalışmaları sonucunda, insan serumunda düşük konsantrasyonda bulunan gamma globulinlerin meydana çıkarılması için diğer metodların kullanılamamasına karşılık immunolojik metodlarla bu aşağı konsantrasyondaki gamma globulinleri meydana çıkarmanın mümkün olduğunu bildirmektedirler.

Polding ve arkadaşları (39) epidemiyolojik müşahedeleri neticesi sığır ve-bası virusu ile köpekleri n gençlik hastalığı virusu arasındaki münasebeti ileri sürmüşlerdir. Bu araştırıcılara göre daimı olarak sığır vebası virusu bulunan bir yerde bulundurulan köpeklerde hiç bir zaman gençlik hastalığı yakası gö-rülmemiştir. Yapılan ilk denemeler de bu hipotezi desteklemiştir. Yüksek dozda sığır vebası virusu verilen köpekler, kontrollarda klasik hastalık semp-tomları husule geldiği halde, sığır vebası virusu verilen köpeklere gençlik has-talığı virusu verildiği zaman hastalığa yakalanmamışlardır. Coret ve arkadaş-ları (12), Poulik (38) biyolojik olarak yaptıkları denemelerle bunu destekle-mişlerdir. Mansi (22) Köpeklerin gençlik hastalığı virusunun antijen özelliğini incelemek için jel-difüsyon tekniğini başarı ile tatbik etmiş ve bundan hemen sonra da White

(5

ı) aynı tekniği sığır vebası virusunu incelemek için kullan-mıştır. Yine White ve arkadaşlarının (52) jel-difüsyon tekniği ile sığır vebası virusu ile köpekleri n gençlik hastalığı virusu arasında tam olmayan fakat ya-kın bir antijenik münasebet olduğunu meydana çıkarmaları bu konu üzerin-deki bundan önceki buluşları desteklemiştir.

Ö. Ertürk,

MATERYAL

ve

METOD

Araştı;mamızın giriş bölümünde maksat ve gayesini açıkladığımız bu çalışma Amerika Birleşik Devletlerinin Orcgon State Üniversitesinin Veteri-ner Departmanında yapılmıştır. Aşağıda da belirtildiği gibi, çalışma için lü-zumlu materyal çeşitli müesseselerden tedarik edilmiştir.

i) Hidrolize edilmiş patates nişastası.

Bu madde (Connaught Medical Research Laboratories, University of Toronto, Toronto, Canada.) dan getirtilmiştir.

2) Elektrofores cihazı.

Üniversitenin Entomoloji departmanında bulunan ve (Buchler Instru-ments, INe. Fort Lee, N.]., U.S.A.) dan getirtilmiş cihazdan istifade edilmiştir. 3) Nişasta jelinde husule gelen deliklere solusyonları doldurmak için özel ince pipetler.

4) Cihazın elektrod kutuları içindeki buffer solusyonları ile irtibatı sağlı-yan ve (Buchler Isntruments, INe.) den temin edilen özel pamuklu kumaş. 5) Elektrofores için yüksek voltajlı elektrik ceryanı (Laboratuvarda mev-cur özel cihazdan faydalanılmıştır.)

6) Jeli hazırlamak ve aynı zamanda elektrod kutuları için bu ffer solusyonu (Laboratuvarda hazırlanmıştır.)

7) Elektrofores işlemi bittikten sonra jeli uzunluğuna kesrnek için yine Buchler Instruments'den temin edilen jel kesme cihazı.

8) Elektroforetik analizi gözle görülebilir bir hale getirmek için boya maWülü ve boyama kutuları (Buchler Instruments'den temin edilmiştir.) ,

9) Streptococcus Agalactiae ve staphylococcus albus mikroplarının puri-fiye proteinlerini ihtiva eden emülsiyonlar (Üniversitenin Mikrobiyoloji depart-manından temin edilmiştir.)

ıo) Bu emülsiyonlara karşı tavşanlarda hazırlanmış antiserum.

i i) Jel boyandıktan sonra jeli yıkama mahlülü (laboratuvarda hazırlan-mıştır).

Jelin Hazırlanması :

Jel Smithies metodu ile hazırlanmıştır (40) Bunun için ~8 gr. nişaşta, 48 gr. üre ve 100cc', bu ffer solusyonu nispetinde olmak üzere arzu edilen miktar-larda bu maddelerden alındı. Jel için kullanacağımız buffer solusyonu da 1,54.

gr. H3B03, 0.40 gr. Na OH bir litreolmak üzere hazırlandı ve PH sı 8,3 ola-rak ayarlandı. Nişasta tartıldıktan sonra bir erlenmayere kondu. Bu nişastayı sıvı

imm Ilnoelectrophoresis

haline getirmek için total buffer solusyonunun tahminen ,üçte biri, içerisinde nişaşta bulunan erlenmeyere döküldü ve bir mekanik karıştırıcı ile bu nişasta homogen bir hale getirildi. nu ~rada geriye kalmış olan buffer solusyonu ısı-tılarak kaynatıldı ve birden bu solusyon homogen hale gelmiş olan nişasta mahlülünün bulunduğu erlerımeyer içine döküldü ve erlenmeyer içindeki mahlülün jel haline geldiği görüldü. Bundan sonra erlanmeyer kaynamakta olan su banyosu içersine ~ondu ve 5-10 dakika müddetle karıştırıcı ile tekrar karıştırılmaya başlandı. Bu müddet içersinde erlenmeyer içindeki jel sıvı haline geldi. Karıştırma esnasında. bir spatül vasıtası ilc jelin erlenmeyerin cidarına yapışarak kurumamasına dikkat edildi. Bundan sonra erlenmeyer su banyo-sundan çıkarıldı ve erlenmeyerin dış cıdarına cam kalemi ile solusyonun sevi-yesi işaretlendi ve erlemeyer tekrar su banyosuna konarak karıştırılmaya de-vam edildi. Su banyosunda ilk ısıtmaya başlanılan andan itibaren 40 dakika geçtikten sonra erlenmeyer su banyosundan çıkarıldı ve solusyonun aşağı inen seviyesi dolayısiyle dış cidara işaretlenen seviyeye kadar kaynar su ilave edildi. Erlenmeyer tekrar su banyosuna konarak bir kaç dakika karıştırıldı. Bundan sonra üre ilave edilerek 5-10 dakika tekrar karıştırıldı. Bu müddet sonunda üre ibivesi dolayısiyle viskositenin azaldığı görüldü. Bundan sonra jel başka bir erlenmeyere tel süzgeçten süzüldü. 10dakika müddede su banyo-sunda karıştırılmadan bırakıldı. Jelin sathına doğru yükselen hava habbecik-leri alındı. Bu suretle jel elektrofores cihazındaki kaba dökülmeye hazır vazi-yete getirilmiş oldu.

Tav/anlarda lmmun Sert/m Hazırlaııması :

İmmunoe1ektrofores çalışmalarında içersinde analizi yapılacak protein solusyonuna karşı yüksek titrede precipitin antikoru ihtiva eden immun serum-lar kullanılmaktadır. Biz de bu çalışmamızda yukarıd} adı geçen mikrop emül-siyonlarına karşı immun serum hazırlamak için her bir mikrop emülsiyonu için altı tavşan kullandık. Altışar tavşan olarak iki gruba ayrılmış olan tavşanlar birinci gruptaki altı tavşandan her birine intravenöz olarak 0.1 cc den başlamak ve i cc ye kadar yükselmek üzere streptococcus Agalactiae mikrobunun pu-rifiye protein emülsiyonundan 'dört enjeksiyon yapıldı. İkinci gruptaki altı tavşana da yine intravenöz olarak staphyplococcus albus mikrobunun puri-fiye protein emülsiyonundan ayni dozda 9ört enjeksiyon yapıldı. Her iki gruba ait tavşanların her birinden enjeksiyonlar sonunda yeter miktarda kan alınarak hangi tavşanda daha yüksek tİtrede antikor mevcut olduğu araştırıldı. En yük-sek titre de antikor veren tavşanlara son bir defa i cc homolog antigen verile-rek 4 gün sonra hayvanlar kesilerek kanları toplandı ve serumları ayrıldı.

Elektrofores Cihazm11l Elektrofores Amelryesi için Hazırlanması :

Elektrofores cihazının içersine jel dökülecek plastik kabı düz bir masa üzerine konarak düzgün bir seviyede durması sağlandı. Bu arada, jel kaba

Ü. Ertürk

döküldükten sonra donduğu zaman analizleri yapılacak protein solusyonlarını' koymak için jelde delik husule getirecek ve plastik kab ın alt tarafından yerleş-tirilecek olan ve jelde müteaddit delik açmak için üzerinde madeni Çıklntılar olan kısım plastik kabın altına güzelce yerleştirildi. Bundan sonra hazırladı-ğımız jel hava kabarcığı husule getirmemeye dikkat ederek plastik kaba yavaş yavaş döküldü. Dökülen jel kabın seviyesini aldıktan sonra üzeri düzgün ve pürüzsüz bir camla kapatıldı ve kabın dört köşesinden cam kapağın jdi iyice ta~zik etmesi için özel vidalarla sıkıştırıldı. Bu esnada en çok dikkat edilecek nokta jelin sathında hava kabarcıklarının husule gelmemesine dikkat etmektir. Aksi taktirde jelden muntazam bir şekilde ceryan akımı olamıyacağı için elek-trofores işlemi de arzu edilen şekilde olmaz. İki saat oda derecesinde bırakılıp jel soğuduktan s~nra jel üzerindeki cam kapak vidalar sökülerek yavaşca kal-dırıldı ve ayni zamanda jdde emülsiyonları koymak için delik açan ve plastik ka,!Jın alt tararından yerleştirilen kısım da yavaşca çekilerek çıkarıldı ve yerinde husule gelen çukurluğa sıvı halinde vazelin dökülerek donduruldu. Bundan sonra jelin sathında husule gelen ufak çukurlara analizini yapacağımız puri-fiye mikrop proteini emülsiyonları özel ince pipetlerle jelin sathına taş mı yacak şekilde dolduruldu ve küçük çukurların üzerine tnayi vazelin dökülerek don-duruldu ve bu suretle üzerleri kapatılmış oldu. Sıvı vazelin donduktan sonra içinde donmuş jel bulunan plastik kap dik olarak elektrofores cihazına yer-leştirildi. Elektrodlara işaretli seviyeye kadar buffer solusyonu koriduktan sonra jelin aşağı ve yukarı kısımlarında buffer solusyonu ile olan irtibatı özel pamuklu kumaş ile temin edilir. Bu pamuklu kumaşlar elektrofores işlemi bittikten sonra önce musluk suyu, sonra destile su ve en sonra da buffer solu s-yonu ile iyice yıkandıktan sonra, tekrar ikinci bir elektrofores işlemi için kul-lanılabilir. Jeli havi plastik k,ap elektrofotes cihazına dik olarak yerleştirilirken şakul1 olmasına dikkat edilir. Çünki tam şakül1 olarak yerleştirilmezse elektro-foretik migrasyonda bozukluklar husule gelebilir. Bundan sonra plastik kap cihaza iyice tespit edilir. Elektrodlardaki buffer solusyonlarının pH farkının 0.2 den fazla olmamasına dikkat ~dilir. Çünki bunlar arasındaki büyük pH farkı elektrofores inigrasyonu üzerine fena tesir eder. Her iki elektroddaki buffer solusyonları bir çok defalar tekrar kullanılabilir. Bununla beraber anod ve katod kutularındaki buffer solusyonlarını kullanmadan önce birbirile karış-tırılması lazımdır. Buffer solusyonunu havi kutulardan herhangi birine pro-tein karışacak ôlursa buffer solusyonları artık kullanılmaz atılır.

Bu şekilde jel hazırlandıktan sonra hava ceryanı olmayan bir yerde, oda derecesinde 5 volt /cm hesabile 12-16 saat müddetle elektrik ceryaru geçirildi. Bıu müddet sonunda elektrik ceryanı .kesilerek jel cihazdan çıkardıldı, ayni firmanın yaptığı özel jel kesme aletile 3-4 milimetre kalınlığında olmak üzere jel iki parça halinde uzunlamasına kesildi.

Immunoelectrophoresis

lmmun ve Kontrol Serumların Kullamlması :

Elektrofores ameliyesi bittikten sonra jelin uzunlamasına kısmının orta-sından, yukarı ve aşağı kısımlarına olmak üzere birkaç milimetre genişliğinde jilet bıçağı ile mikrob proteinlerinin migrasyonlarına paralel olarak iki oluk açıldı. Bu olukların migrasyonlara olan mesafesi denemelerde çeşitli olarak tutulmuş ve homolog antijen-antikor reaksiyonlarında teşekkül eden presipi-tasyon arkları arasında bir fark olup olmadığı araştırılmıştır. B.u oluklardan je-lin yukarı kısmında olana, mikrob emülsiyonlarına karşı tavşanlarda hazırlan-mış homolog anti tavşan serumu, jelin alt kısmındaki oluğa da normal tavşan serumu konarak 3-4 saat difüsyona bırakılmıştır.

felin Boyanma ve Yıkanması :

Bundan sonra kesilen jel tabakaları özel kutularda, (I g. amido black 90occ M

i

ıo acetic asid ve sodyum asetat halinde hazırlanmış asetat buffer ve ve 100 cc saf gliserin içinde eritilir.) hazırlanmış boya solusyonunda 5 saat müddetle bırakıldı. Sonra jel, (20 cc acetic asid ve i5o cc saf gliserinin destile su ile i litreye tamamlanır.) hazırlanmış yıkama solusyonu ile tamamile renksiz kalıncaya kadar yıkandı.

SONUÇLAR

Yukarıda açıklanaı:ı. denemelerden elde edilen sonuçlar şunlardır:

i) Gerek streptococcus Agalactiae ve gerekse Staphylococcus albus mikroplarının puri£iye proteinlerinin migrasyon sahası ile, bu sahaya çeşitli mesafelerde paralel olarak açılan oluklara konan yukarıda adı geçen mikrop-lara karşı, tavşanlarda hazırlanmış anti serumlar arasında, aşağıda şematize edilen presipitasyon arkları husule gelmiştir. Husule. gelen bu arkların kon-santrasyonu homogen serum ile protein migrasyonu arasındaki mesafe ile değişmektedir." Aradaki mesafe ne kadar dar ise husule gelen presipitasyon arkının konsantrasyonu o kadar fazlalaşmış, aradaki mesafe ne kadar geniş olursa konsantrasyonda o kadar az olmuştur. Migrasyona z cm. mesafeden sonra açılan oluklara konan homogen serum ile protein migrasyonu arasında artık gözle fark edilir bir konsantrasyonda presipitasyon arkı husule gelmemiş, buna mukabil ~lgrasyon ile homogen serum olukları arasındaki mesafe i cm den itibaren azaldıkça kuvvetli konsantrasyonda presipitasyon arkları husule gelmiştir.

z) Jelin alt kısmında her iki nevi mikrobun puri£iye proteinlerinin mig-rasyon sahası ile, bu sahaya çeşitli mesafelerde paralel olarak açılan oluklara konan normal tavşan' serumu ile, hiç bir presipitasyon arkı husule gelmediği

ö. Ertürk .,..

i

t l' Homo'leo

purifi~e

Protein mig"Qs~ol1lal""l Şekil: ı

Presipitasyon arklarının husule gelişinin şematik olarak açıklanması.

1----

'j

r--

•....

----i

i i i i

O

i i i i

,i

B

i

A

i

B

t

i ,i 1 i

'O

i i i i i i

,

1 i i L.______

-

i

_{L_}

-- __ J

Şekil

2.

İmmuno e1ektrofores analizler için kullanılacak plastik kabın hazırlanması. A = Plastik kab, = Filtre kağıdı veya özel kumaş.

Şekil;

3

İmmuno-e1ektrofores analizler için kullanılan cihazın şeması:

A = Plastik kab. = Filtre kağıdı. = Jel. D = Plastik kab ın iki ucunda jel ile doldurulan kısım. E Elektradlar içerisindeki buffer solusyonu. F = Elektrod vazifesini

Immunoelectrophoresis

görüldü. Kontrolu tamamlamak için yapılan denemelerde i cm. den çok daha yakın açılan pralel oluklarla migrasyon sahası arasında yine hiç bir presipitas-yon arkı husule gelmediği tespit edildi.

3) Diğer bir kontrololmak üzt:re başka bir deneme ile, bizim çalış-mamız da kullandığımız purifiye mikrop proteinlerinden başka protein mig-rasyonlarına karşı, yine çeşitli mesafelerde paralelolmak üzere açılan oluklara konulan, denemelerimizd~ kullandığımız mikrop proteinlerine karşı tavşan-larda hazırladığımız anti serumlar arasında en yakın mesafelerde bile hiç bir presipitasyon arkları husule gelmemiştir'. Bu sonuçlar bize, jelde husule gelen çeşitli presipitasyon arklarının spesifik olduğu kanaatını vermiştir.

MÜNAKAŞA

çalışmamızın başında da açıklandığı gibi, tüm serum veya serum frak-siyonunda önemli kantitede mevcut serum kompenentlerini tek bir metodla veya bilinen metodların kombinasyonu ile meydana çıkarmak ve karar vermek zordur. Yine araştırmalar göstermiştir ki, analitik bir metod ve bilhassa elek-troforesis, bir preparasyonun homogen olupolmadığını meydana çıkarmaya kafi değildir. Çalışmamı~!n gayesi açıklanırken, antikorların kendi homolog antijenlerine karşı yüksek bir spesifitesi olması dolayısile son zamanlarda im-muno-kemikal analizler, başlangıçta insan ve diğer nevi serumların fraksiyon-larını meydana çıkarmak, ve bunların homogen özelliklerinin derecesini tes-pit etmek, ve sonra organik bozukluk ve hastalıkları meydana çıkarmak için kullanılmaya başlandığı belirtilmişti. Spesifik presipitat'ların analizleri gaye-sine dayanan çalışmamızın sonuçları ile bizden önce yapılan çalışmaların (4,15 16,i7,2,14,3°,8,3 1,9,10,48) sonuçları birbirini desteklemekte bu analizlerin özelliklerini meydana çıkarmaktadır. Bu çalışmalar ve bu çalışmalara ilave olarak (47,i8,20,49, 53,43, 13,7,i,23,25,26,27,32,28,29,6,33,35,38,9,1 i,40,4i, 37, 38,3) yapılan diğer çalışmalar ekseriyetle çeşitli serum proteinlerinin fraksi-yonları üzerinde yapılmış ve homogen antijen-antikor münasebetlerinin özel-liği üzerinde müsbet sonuçlar elde edilmiştir. Immunoelektrofores'in serum-lar üzerinde yapılan bu tatbikatından başka, organizmada husule gelen' çeşitli patolojik prosesleri meydana çıkarmak için yine aynı metodlardan faydalanı-larak yapılan çalışmalar da mevcuttur. Bu çalışmalarda(53,50,5,42,44,19,34,45, 21,24,36,12,39,22,51,52) gerek insan ve gerekse hayvanlarda çeşitli hastalık-larda organizmada husule gelen patolojik bozuklukları organizmaya ait çeşitli materyal üzerinde yapılan immuno-Iektroforetik metodla meydana çıkarmaya çalışılmış ve homogen antijenantikor reaksiyonun immunoelektrofores me-todundaki spesifitesi çeşitli vakalarda gösterilmiştir.

Yukarıda da açıklandığı gibi, bizim çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlar-la, bizden önce yapılan çalışmaların sonuçları birbirini tutmakta ve

immuno-O. Ertürk

elektroforez çalışmalarındaki sonuçların özelliğini ortaya koymaktadır. Çalış-mamızın orijinalitesi şu şekilde açıklanabilir. Elimizde geçen literatürIere nazaran, bu çalışmamızdan önce yapılan çalışmalarda laboratuvarıarda diag-nosa yardım edebilecek ve daha derin araştırmaları sağlıyabilecek, hastalık etkenlerinin purifiye proteinlerini ihtiva eden emülsiyonları ile immunoelek-troforetik bir çalışma bu güne kadar yapılmamıştır. Çalışmamızın orijinalitesi kanaatımızca buradadır.

ÖZET

ı) StreptoCGccus Agalactia~ ve Staphylococcus albus mikroplarının pu-rifiye proteinlerini ihtiva eden emülsiyonlar ayrı ayrı olmak üzere tavşanlara intravenöz yolla inokule edilerek bu emilsiyonların her birine karşı tavşan-lardan antiserum elde edildi.

2) İmmunoelektroforetik muayene elektrofores cihazı tekniğine gö~e hazırlandı.

3) .Streptococcus Agalactiae ve staphylococcus albus mikroplarının her birinin purifiye proteinlerinin migrasyon sahası ile, bu sahaya çeşitli mesafe-lerde paralel olarak açılan oluklara konan tavşanlarda hazırlanmış anti serum-lar arasında prasipitasyon arJ<:larıhusule gelmiştir.

4) Husule gelen bu arkların konsantrasyonu homogen serum ile protein migrasyonu arasındaki mesafe ile değişmiştir.

5) Anti tavşan serumu yerine normal tavşan serumu konduğu zaman hiç bir zaman presipitasyon arkı husule gelmemiştir.

6) Denemelerde kullanılan purifiye mikrop proteinleri emülsiyonları yerine başka protein emülsiyonları, denemelerimizde kullandığımız mikrop emülsiyonlarına karşi tavşanlarda hazırlanan anti tavşan serumları' ile karşı-laştırıldığında yine hiç bir zaman presipitasyon arkı husule gelmemiştir.

7) Bu sonuçlar, elektrofores cihazında hazırlanan jelde husule gelen çe-şitli presipitasyon arklarının spesifik olduğu inancını sağlamıştır.

SUMMARY

i) Two different emulsions containing the purified proteins of Strepto-coccus Aga1actiae and StaphyloStrepto-coccus albus have been injected separetely in rabbits by intravenous route and for each emulsion anti sera have been prepared from rabbits.

2) The apparatus for electrophoresis in gel has been prepared according to its technique for Immunoelectroforetic analysis.

imm unoclectrop horesis

3) On migration area of purified proteins of two diffcrent kind microbes the preeipitation ares have been produeed between this migration area and homegen anti rabbit sera prepared against two different microbes proteins. These sera have becn- put as paralel to migration area.

4) The caneentration of these preeipitation ares have been ehanged ae-carding to distanee between the protein mig ration area and homogen anti rabbit sera.

5) When the normal rabbit sera have been used instcad of homogen anti rabbit sera, th~ preeipitation ares have been not produeed

G) When the other purified mierobe's proteins emulsions have been used instead of emulsions used inour experiments, the preeipitation ares also have been not' produeed between the anti rabbit sera prepared in experiments and migration area.

7) These results gave us the satisfaetion that the different preeipititation ares in gel prepared in eleetrophoretie apparatusu are speeific.

LİTERATÜR

i - Bechold, H.: (19°5: 2, Tsehr. Physio!. Chem. 52: 1,)P. 185-189' 2 - Burtin ,P. (1954): Bu!!. Joe. Chim. Bio!., 3G: pp. 1021.

3 - Barret Beach, Ann Wood etal. (19Go): Jour. of La/;. aııd Clinica! Med. vo!. 55, No. 4, pp. G05-G15.

4 - Cohn, M., ct aL.(1950): Jour. Immuııo!., 64: pp. 3Rı. 5 - Cleve, H., and Hartmann, F'(1957): Kfin.,Wchschr.35:S.334.

G - Elek, L. (1949): Brit. J. EX/Jer. Path. 30: pp. 417-412.

7 - F. Jacox, Ralph. (1959): Jot/r. of Exper. Med. vo!. iıo, No. 3,pp. 341-353. 8 - Gürdon, A, H. ct aL.(1950): Chem. Comm., XV: ı.

9 - Grabar, P., and Williams, C. A. Jr. (1953): Biochim. Biopiijs. Actil, LO: pp. 193

LO - Grabar. P., and Williams, C.A.Jr. (1955): Biochim. ijiophys. Acta, ın press.

i i - Grabar, P. and Williams, C.A.Jr. (1955): İ/;id. 17: pp. 67-71. 12 - Goret, P., et aL.(1958): Bu!!. Acad. Vet. H., 31: 6, pp. 163.

i3 - Grabar, P. (1958): Academic Press, New york.

14 - Grabar, P., and Lapresle, C. (1962): Compt. Rend. ii coııgr. Intem. BiochifJl. Paris, pp. 390'

i

Ö. Ertürk

15 - Jager, B. V., et aL.(1948): four. Bio/. Chem., 176: PP.'1177. 16 - Jager, B. V., and Gubber, c.J.J. (1952): Immuno/., 69: pp. 31i. .17 - Kabat, E.A.,and Murray, J.P. (1950): four. Bio/. Chem., 182: pp. 1251.

18 - Kaminski, M., and Durrieux, J. (1954): Bul!. Soc. Chim: Bio/., 36: pp .• ~°37.

19 - Kaminski, M. (1954): Biochim. Biophys',Acta, 13: pp, 216.

20 - Komarkova, A., Korinek, J. (1959): four. of Lab. and Clinica/ Med. vol. 54, No. 5, pp. 7°7-71 i.

21 - Le Bouvier, G.L. (1959): The Brit. four. of Exper. Path. vol. XL. pp.

452-463'

r

22 - Mansi, W. (1957): fo/Ir. Comp. Path. 67: pp. 297-303'

23 - Nicoııe, M., E. et aL. (1920), : Ann. Inst. Pasteur, 34: pp. 194-201. 2,4 - Nairn, R.C.et ai. (19Go): The Brit. four. of Exper. Path. vol. XLI, NO.3,

pp. 214-221.

25 - Oudin, J. (1946): Compt. Rent. Acad. Sac. 222: pp. 115-119. 26 - Oudin, J. (1946): 7th. Cocg. of Bio/. Chem. (Liege), pp. ıO-ıl.

2'7 - Oudin, J. (1947): Bul!, Soc. Chim. Bio/. 29: pp. 14°-146. 28 - Ouchterlony, O. (1949): Archi-Chemie 26

B,

i: pp. 43-49.

29 - Ouchterlony, O.

(I

949): Acta, Path. et Microbio/. Seandina\', 26: pp. 5°7-511.

3° - Oucterlony, 0"(1953): ~cta, Path. et Microbio/. Scandinav. 33: pp.2p. 31 - Oudin, J. (1949): Compt. Ren/. Acad. Sac. 228: pp. 189°.

32 - Oakley, C.L.and A.J.Fulthorpe. (1953): four. Path. and Bact. 65: pp. 49-55. _

33 - Oudin, J. (1953): Ann. Inst. Pasteur, 85: pp. 336-34°.

34 - Osserman, Elliot F. (1959): four. of InllJltuno/. vol. 84, pp. 93-97. 35 - Pou1ik, M.D. (1952): Cmıad. foıır. M. Sci. 30: pp. 417-421.

36 - Polding, J. B. and Simpson, R. M. (1957): Vet. Rec. 69: 4, pp. 582. 37 - foulik, M.D. and O. Smithies. (1958): Biochem. Jour. 68: pp. 636-644. 38 ..,. Poulik, M.D. (1959): four. of Immuno/. 82: pp. 502-515.

39 - Polding, J.B. et aL.(1959): Vet. Rec. 71, 5, pp. 643.. 40 - Smithies, O. (1955): Biohem. Jour. 61: pp, 629-638.

iIDmunoelectrop horesi"

42 - Scheidegger, L. (1956): Semaine Hop. Paris, 3C. pp. 2II9.

43 - Stephen W.P. and A.L.Steinhauer. (1957): Ph.J1siol.Zool. 30: pp.

114-ÜO.

44 - Scheiffarth, F. and Götze, H. (1958): Aerztliche Wchsch.13: pp. 751. 45 - Teitelbaum i. Jacobo et aL.(1959): Jour of Lab. and Clinical Med. vol.

53,.No. 4, pp'. 535-552

46 - Williams, C.A.Jr. (I953): Proc. VI Intern. Congr. Microbiol. Rome, in press.

47 - Williams, C.A.Jr. (1953): Proc. XIV Intmı. Congr. Zool. Copenhagen, in press.

48 - Williams, C.A.Jr. (1954): Ph. D. Thesis, Tutgers University ..

49 - William~, C.A.,}r. aıid Grabar, P. (1955): Jour. ImmuIJol. vol. 74, pp.

158-168.

50 - Wunderly, Ch. (1957): Experieııtia, 13: pp. 421. 51 - White, G.(1958): Nattlre, London, 181, pp. 14°9'

52 - White, G. et ai. (1961): Immunol. vol. LV, No. 3, pp. 2°3-2°5.

53 - Young, KG. and R.V. Webber. (1953): Canadiaıı Jour. Med. Sci. 31:

pp.

45-63'