T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
RADYASYON ONKOLOJİSİ
ANABİLİM DALI
Tez Yöneticisi Doç. Dr. Cem UZALRADYOTERAPİNİN GELİŞİMİNİ TAMAMLAMIŞ
KEMİK DOKUSUNDA MEYDANA GETİRDİĞİ
HASARLARIN SİTOPROTEKTİF AJANLAR
OLDUKLARI BİLİNEN AMİFOSTİN VE KARNİTİN
İLE ÖNLENMESİNİN SİNTİGRAFİK VE
HİSTOPATOLOJİK
PARAMETRELER İLE DEĞERLENDİRİLMESİ
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Gülden ANGIN
TEŞEKKÜR
Uzmanlık eğitimim süresince engin tecrübe ve mesleki bilgi birikiminden her zaman faydalandığım ABD. Başkanı Doç. Dr. Zafer Koçak’a, araştırma görevlisi olarak çalıştığım süre içinde eğitimime her türlü katkıyı sağlayan ve bu tezin hazırlanması aşamasında hep yanımda olan tez yöneticim Doç. Dr. Cem Uzal’a, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocalarım Yrd. Doç. Dr. Murat Çaloğlu, Ruşen Coşar Alas, Vuslat Yürüt Çaloğlu ve Mert Saynak’a, tezimin hazırlanmasında emeği geçen Nükleer Tıp ABD. Doç. Dr. Gülay Altun’a, Patoloji ABD. Doç. Dr. Şemsi Altaner ile Yrd. Doç. Dr. Ufuk Usta’ya, Radyofizik Uzm. Şule Parlar’a, birlikte çalışmaktan büyük keyif aldığım araştırma görevlisi arkadaşlarıma, fizikçilerimize ve diğer ABD. çalışanlarına sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER
Sayfa
GİRİŞ VE AMAÇ
... 1GENEL BİLGİLER
... 3KEMİK DOKU VE FİZYOLOJİSİ ... 3
RADYASYONUN KEMİK DOKU ÜZERİNE ETKİLERİ ... 9
SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR ... 12
AMİFOSTİN ... 16 KARNİTİN ... 19
GEREÇ VE YÖNTEMLER
... 23BULGULAR
... 28TARTIŞMA
... 42SONUÇLAR
... 50ÖZET
... 52SUMMARY
... 54KAYNAKLAR
... 56EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR
ALC : Acetyl-L-Carnitine (Asetil-L-karnitin)
ALP : Alkaline Phoshatase (Alkalen Fosfataz)
ALT : Alanin Aminotransferaz
AMF : Amifostin
AST : Aspartat Aminotransferaz B. : Biyoradikal
BGO : Background Oranı BM : Biyolojik Molekül
BMD : Bone Mineral Density (Kemik Mineral Yoğunluğu) cGy : Centi-Gray (Santi-Gray)
DEXA : Dual Enerji X-ray Absorbsiometri
DNA : Dezoksiribonükleik asit
DTPA : Dietilen Triamin Pento Asetik Asit
FGF : Fibroblast Growth Faktör GAG : Glikozaminoglikan GH : Growth Hormon
GGTP : Gama Glutamil Transpeptidaz
Gy : Gray
H- : Hidroksil Radikali H2O2 : Hidrojen Peroksit
HDP : 1-Hidroksi Etilen Difosfonat IL-6 : İnterlökin-6
İV : İntravenöz İP : İntraperitoneal İM : İntramuskuler KAR : Karnitin KT : Kemoterapi LD : Letal Doz
mCi : Mili Curie
MDA : Malondialdehit
MDP : Metilen Difosfonat
mRNA : Messenger Ribonükleik Asit
O2- : Süperoksit Anyonu OH- : Hidroksil Radikali OSR : Oksijen Serbest Radikali PDGF : Platelet Derived Growth Factor
PGE2 : Prostaglandin E2 PLC : Propionyl-L-Carnitine (Propionil-L-karnitin) PTH : Parathormon RT : Radyoterapi SC : Subkutan SF : Serum Fizyolojik SH : Sülfhidril
SPECT : Single Photon Emission Computed Tomography
SR : Serbest Radikal Tc-99m : Teknesyum 99m
TGF-ß : Transforming Growth Factor-ß
TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α
TD : Tolerans Dozu WR : Walter Reed
GİRİŞ VE AMAÇ
Radyoterapide (RT) amaç, belirlenmiş olan tümör hacmine ablasyon sağlayacak iyonizan radyasyon dozu uygulanırken, ışın alanında kalan çevre normal dokulara mümkün olan en düşük dozun verilerek hasarı en alt seviyede tutabilmektir (1). RT planlamasında normal dokular, mümkün olduğu kadar ışın alanı dışında bırakılarak korunmaya çalışılır. Normal dokularda RT’ye bağlı oluşan değişiklikler ışın tipine, RT parametrelerine (doz, fraksiyon, toplam süre, ışınlama tekniği vb.), ışınlanan normal doku hacmine, doku ve hücre özelliklerine, radyoduyarlaştırıcı ve radyoprotektör ajanların veya kemoterapötik ilaçların RT ile beraber kullanılıp kullanılmaması gibi bir çok faktöre bağlıdır (2). Modern RT teknikleri (üç boyutlu konformal RT, yoğunluk ayarlı RT vb.) normal dokuları üst düzeyde korumaya olanak sağlasa da, birçok tümörün tedavisinde belli oranda normal dokunun hedef volümün içerisinde yer alması kaçınılmazdır. RT alanı içerisinde kalan normal dokuları tümör kontrolünü azaltmadan radyasyon etkilerinden korumayı amaçlayan ilaçlar, radyoprotektör ajanlar olarak tanımlanır (3).
Radyoprotektörlerin en iyi bilinen grubu sülfidril (SH) bileşikleridir (4). Bu maddelerin koruyucu etkisini, içerdikleri SH gruplarının serbest radikalleri (SR) yakalama özellikleri sağlamaktadır. Bugüne kadar birçok radyoprotektör ajan tanımlanmış olsa da, sülfür içeren aminotiyoller klinik olarak en etkin radyoprotektörler olarak bilinmektedir (3).
Sülfidril içeren bir radyoprotektör ajan olan amifostin, hücre içinde alkalen fosfataz (ALP) tarafından fosforile edilerek aktif metaboliti olan serbest tiyole dönüşen bir ön ilaçtır. Serbest tiyol radyasyonun meydana getirdiği oksijen serbest radikallerini (OSR) bağlayarak etki eder. Amifostinin RT ve kemoterapiye (KT) bağlı normal doku hasarının önlenmesinde
etkili olduğu ve tedavinin doz sınırlayıcı toksik etkilerini azaltarak bazı kanserlerin tedavisini daha etkin kıldığı preklinik çalışmalar ile belirlenmiştir (5,6).
Karnitin, yağ asitlerinin mitokondri membranına taşınmasında, beta oksidasyonunda ve açil-CoA ve açilkarnitin gibi toksik metabolitlerin mitokondri dışına çıkarılmasında taşıyıcı olarak görev yapan doğal bir maddedir. Karnitin, uzun zincirli yağ asitlerinin transformasyonunda gerekli bazı enzimlerin asıl faktörüdür ve OSR’yi temizleyici görev görür (7). Karnitinin terapötik yararları ve tedavinin yan etkilerinden koruyucu etkileri, KT ajanları ve RT ile yapılan rat çalışmaları ile ortaya konulmuştur.
Olgun kemik ve kıkırdak dokuları radyasyona dirençlidir (4). Kemiğe radyasyon hasarının primer sonucu atrofidir ve nekroz ancak 60-70 Gy gibi yüksek dozlardan sonra görülmektedir. Atrofi, vasküler ve sellüler hasar kombinasyonunun sonucudur. Osteoblasttaki bu hasar matriks yapımının azalması ile sonuçlanır (8).
Bu çalışmada, RT’nin gelişimini tamamlamış kemik dokusunda meydana getirdiği hasarların sitoprotektif ajanlar oldukları bilinen amifostin ve karnitin ile önlenmesinin sintigrafik, dansitometrik ve histopatolojik yöntemlerle saptanması amaçlanmış, koruyucu etkinliklerin karşılaştırılması yapılarak, aralarında anlamlı farklılık olup olmadığı araştırılmıştır. Tedavi sonrası kemik dokusunda oluşan RT komplikasyonlarının klinikte geç dönemde görülmesi nedeniyle, istenmeyen etkilerin önlenmesini araştıran çalışmamız RT sonrası 6. ayda gerçekleştirilmiştir.
GENEL BİLGİLER
KEMİK DOKU VE FİZYOLOJİSİ Kemiğin Yapısı
Organizmadaki diğer bağ dokularında olduğu gibi kemik dokusu da hücreler, kollajen lifler ve amorf maddeden oluşmuş, yapısındaki kalsiyumdan ötürü sertleşmiş bir destek dokusudur. Kemikler iskelet sisteminin en önemli yapıtaşıdır (9). Vücudu şekillendirmesinin yanında ağırlığı taşıyan, yaşamsal organları koruyan ve kasların tendonlar ile kemiklere yapışmasıyla hareketi sağlayan sistemin ana unsurudur (10-12). Bununla birlikte kan hücrelerinin yapıldığı kemik iliğini içermesi ve metabolik önemi olan kalsiyum mineralinin deposu olması, kemiğin destek dokusu olmasının yanında metabolizmada da önemli bir rol oynadığını göstermektedir (9).
Gelişmiş kemik dokuda lifler paralel ve belirli aralıklarla, aralarında porlar bırakacak şekilde yerleşmiştir. Morfolojik olarak kemik dokusu yoğun (kompakt) kemik ve süngerimsi (trabeküler) kemik olmak üzere iki grupta değerlendirilir.
Yoğun kemik, kemik dokunun %80’ini oluşturur ve birçok kemiğin dış tabakası yoğun kemikten meydana gelmiştir. Yoğun kemikte, yüzeyin hacme oranı düşüktür. Bu tip kemiklerdeki kemik hücreleri olan osteositler pasiftir. Hücreler lakuna içinde uzanırlar ve besin maddelerini yoğun kemiğin içini kaplayan kanalcıklar aracılığı ile alırlar (10-12). Yoğun bir kemiğin (örneğin femurun diyafizi) mikroskobik incelemesinde, dokunun Havers kanalları etrafında 3-7 μm kalınlıktaki lamellerden, hücrelerden ve sert bir matriksten oluştuğu görülür. Bir Havers kanalı yan dallarla kemik iliği ve periosteumla bağlantı kurar. Bu yan dallara Volkmann kanalları adı verilir. Haversteki damarlar uzunlamasına dizilmiş
olup, yan dallarıyla da komşu damarlarla temastadırlar. Havers kanalı 20-100 μm çapındadır ve 1-2 adet damarsal yapı içerir. Damarlar genellikle kapiller, postkapiller venül veya seyrek olarak arteriol olabilir. Sert bir matrikse sahip olan kemik dokusunda diffüzyon olanağı olmadığından kanal ve kanaliküllerle kemiğin dışından içine kadar ilişki kurulur ve bu şekilde metabolizma için gerekli maddeler damar ve kanaliküllerle hücrelere kadar ulaşır (9) (Şekil 1).
Şekil 1. Kemik dokusundaki kanaliküller içinde osteositin yerleşimi (9)
Süngerimsi kemik ise, içinde boşluklar barındırır ve yüzeyin hacme oranı yüksektir. Yüksek metabolik etkinliğe sahip süngerimsi kemik plakaları üzerinde çok sayıda osteosit yeralır. Süngerimsi kemikte besin maddeleri kemiğin hücre dışı sıvısından trabekülaya sızar, yoğun kemikte ise besin maddeleri kan damarlarının bulunduğu Havers kanalları ile sağlanır (10-12). Süngerimsi kemik yoğun kemiğe benzemekle beraber, trabeküller lamelden yoksundur. Dolayısıyla histolojik preparasyonlarda enine kesitte sirküler lamel dizilişi görülmez. Buna karşılık bol boşluklu trabeküllerden oluşan, adeta petek görünümü veren bir dokusu vardır. Bu boşluklar kemik iliği ile doludur. Özellikle uzun kemiklerin epifizindeki süngerimsi doku basıncın veya kuvvetin geldiği yönde düzenlenmiştir. Böylece yapı çok daha sağlam bir hale gelmektedir (9) (Şekil 2).
Kemikler organik ve inorganik bölümlerden oluşmuştur. Organik kısım kemik dokusunun yaklaşık olarak %30’unu oluşturur (13). Bu yapının büyük bölümü tip I kollajen lifler ile, protein ve glikozaminoglikanlardan (GAG) oluşan temel amorf maddeden yapılmıştır. Kemiğin organizmadaki gerekli işlevlerini tam olarak yerine getirebilmesi, dokudaki organik/inorganik elemanların ve matriksin uyumlu birlikteliğine bağlıdır (9). Kollajen ve kollajen dışı proteinler ile kemik iliği hücreleri, kemiğin organik kısmının
elemanlarıdır. Organik bölümün %98’ini matriks, %2’sini hücreler oluşturur. Bu hücreler temel olarak osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlardır. Matriksin %95’ini tendon ve derinin de temel yapısal proteini olan tip I kollajen oluşturur (14).
Şekil 2. Yoğun ve süngerimsi kemiğin şematik görünümü (9)
Kemiğin %70’ini ise inorganik kısım oluşturur. İnorganik elementlerin başında kalsiyum, fosfat, sitrat, magnezyum gibi maddeler gelir. İnorganik kısmın çoğunluğunu kalsiyum hidroksiapatit (Ca10(PO4)6(OH)2) kristalleri oluşturur (15,16). Kemik doku yüksek kalsiyum ve fosfat içeriği nedeniyle, kalsiyum homeostazında çok önemli bir rol oynar. Kemiğin inorganik bileşiminin yaşa ve cinsiyete bağlı olarak bazı farklılıklar gösterdiği de bilinmektedir (10,11,15,17). Hidroksiapatit kristallerinin kemikteki önemi, kollajenlerle beraber kemik sertliğini ve dayanıklılığını sağlamasıdır. İnorganik maddeler kemiğin kuru ağırlığının yaklaşık %50'sini oluşturmaktadırlar (9). Kemik yüksek inorganik içeriğine rağmen aktif bir dokudur ve çok iyi damarlanmıştır (10,11,17).
Kemiğin dış ve iç yüzeyleri, kemiği oluşturan hücrelerden ve bağ dokusundan oluşan tabakalarla örtülüdür. Dıştakine periosteum, içtekine ise endosteum adı verilir. Temel işlevleri, kemik dokusunun beslenebilmesi, büyüyebilmesi ve onarımı için gerekli olan yeni osteoblastları aralıksız olarak üretmektir.
Uzun kemiklerin gövde bölgesine diafiz, şişkince olan uç kısımlarına da epifiz adı verilir. Epifizler ince bir yoğun kemik tabakasıyla kaplanmış süngerimsi kemikten oluşmuştur. Diafizin ise hemen hemen tamamı yoğun kemikten yapılıdır ve kemik iliği boşluğuna bakan yüzeylerinde çok az süngerimsi kemik vardır (18).
Histolojik inceleme için dekalsifikasyon uygulandığında inorganik tuzların ortadan kalkmasıyla kemik demineralize olur ve yumuşar. Ancak şeklini korur ve mikroskobik yapısı bozulmaz (9).
Kemik Doku Hücreleri
Kemik dokuda yer alan hücreler osteoprogenitör hücreler, osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlardır (18,19).
Osteoprogenitör hücreler, mezenşimal kök hücrelerden kaynaklanır. Periosteumun iç tabakasında, endosteumda, Havers kanallarında ve Volkmann kanallarında bulunurlar. Osteoprogenitor hücreleri mitozla olgun kemik hücrelerine farklılaşmaktadırlar. Bu hücreler kemik büyümesinde, zedelenme veya kırık tamirinde aktif hale gelerek bölünürler ve osteoblast hücrelerine dönüşürler (9). Histolojik olarak konumları, yassı şekilleri, çok az miktarda granüler endoplazmik retikulumları ve az gelişmiş golgi kompleksleri ile tanınırlar (18).
Osteoblastlar, kemik dokusunun yaşamsal hücreleridir. Kemik matriksinin sentezinden, taşınmasından ve mineralizasyonun düzenlenmesinden sorumludurlar (20). Temel görevleri matriks sentezi ile birlikte bölgesel kalsiyum ve fosfor dengesini ayarlamak ve hidroksiapatit kristallerinin oluşumunu sağlamaktır. Osteoblastlar kemik matriksin esas yapısı olan tip I kollajen ile birlikte, kemik matriksin kollajen dışı proteinlerinin yaklaşık %40-50’sini oluşturan osteokalsin ve osteonektin gibi kemik kalitesinden sorumlu proteinlerini de sentezler. Osteoblastlarda sentezlenen diğer proteinler arasında, kollajen fibrillerinin oluşumu ile ilişkili GAG’lar (biglikan ve dekorin) ve integrinle birlikte, bağlanma faktörleri olarak görev alan osteopontin, kemik sialoproteini, fibronektin, vitronektin ve ombospontin de yer almaktadır (21,22). Osteoblastlar prostaglandin E2 (PGE2) ve büyüme faktörleri (TGF-ß, FGF) gibi sitokinleri de sentezlerler ve sekretuvar hücre olarak önemli rol oynarlar. Osteoblastlar parathormon (PTH), D vitamini ve glukokortikoidlerin yanında birçok sitokin (PGE2, IL-6, TNF-α vb.) için reseptörlere sahiptirler. Ayrıca kemik mineralizasyon hızını düzenleyen ALP’de osteoblastların bir başka ürünüdür. ALP’nin kemik mineralizasyonu üzerine etki mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber, genetik olarak yokluğunda kemik mineralizasyonu bozulur. Osteoblastlar değişim göstererek, lakuna içinde bulunan ve kemik yatağı tarafından çevrelenen osteositlere dönüşürler (12,21,23). Osteoblastlar kemik yüzeylerinde epitel hücrelerini andıracak şekilde yan yana dizilirler. Matriks sentezini yapmaya başladıklarında
bazofiliktir. Elektron mikroskobunda golgi ve endoplazmik retikulumları iyi gelişmiş olarak görülür. Lipid damlacıkları ve lizozom benzeri yapılar da sitoplazmada yer alır. Komşu osteoblastlar ile temaslarını sağlayan sitoplazmik uzantıları vardır (9).
Osteositler, kemik dokuda en çok bulunan hücre tipidir (14). Osteoblastlardan kaynaklanan osteositler, matriks lamelleri arasında bulunan lakunalar içine yerleşmişlerdir. Her lakunada sadece bir osteosit vardır. Osteositlerin sitoplazmik uzantıları ince silindirik kanalcıklarla sarılmıştır. Komşu osteositler, sitoplazmik uzantılarının birbirleri arasında yaptıkları hücre bağlantıları ile iletişimi oluşturup, besin maddelerinin hücreden hücreye geçişini sağlarlar. Osteositler ile kan damarları arasındaki bir kısım moleküler değişim, osteositlerin uzantıları ile kemik matriksi arasında bulunan çok az miktardaki ekstrasellüler sıvı aracılığı ile de olur. Bu hücreler kemik matriksinin devamlılığı ile aktif olarak ilgilidirler. Osteositlerin ölümünü takiben matriks rezorbsiyonu görülür (18). Osteositlerin yarı ömrü tahmini 25 yıldır (24). Kemikte yeniden yapılanma için en önemli uyarı kemiğin haraplanmasıdır. Bu tip harabiyet genel olarak fiziksel strese maruz kalan kemik dokusunda görülür. Harabiyet görülen bölgenin tamiri için öncelikle osteoklastların bölgeye gelmesi ve bir rezorbsiyon alanı meydana getirmeleri gerekmektedir. Osteoklastların da osteoblastlar tarafından sitokinler aracılığı ile aktive edildiği bilinmektedir. Osteositlerin bu harabiyetten ilk ve en çok etkilenen hücreler olmaları ve yüzey osteoblastları ile ilişkileri nedeniyle, onarım mekanizmasını tetikleyen hücreler oldukları düşünülmektedir (12,17,23,25).
Kemiğin stres durumu, kemik yapı ve yüklenme arasındaki ilişkiyi yansıtır. Stres tüm kemikte esas yapılanma ve yeniden yapılanmanın kontrolü için uyarı oluşturur. Bu olayda en çok etkilenen hücre grupları osteositler ile yüzeyde yerleşim gösteren osteoblastlardır. Deneysel çalışmalarda osteositlerin bu uyarıya en erken cevap veren hücreler olduğu, stres ile ilişkili olarak osteositlerde glukoz-6-fosfat dehidrogenaz aktivitesi ve mRNA miktarının arttığı gösterilmiştir (17). Ortamdaki PGE2 ve prostoglandin I2’nin, strese bağlı olarak kemik yapılanmasında mediatör rol oynayabileceği düşünülmektedir. Bu olaydaki osteositlerin ve oluşturdukları ağın rolü de tam olarak bilinmemektedir (12,26).
Osteoklastlar, monosit-makrofaj sistemi ile hematopoetik kök hücrelerden köken alırlar. Erişkin osteoklastlar çok nükleuslu, çok sayıda mitokondri, lizozom ve serbest ribozom içeren hücrelerdir (12,27,28). Bu hücreler kemik rezorbsiyonun başladığı bölgelerde, enzimatik olarak açılmış olan Howship lakunası adı verilen boşluklarda bulunurlar (18). Morfolojik olarak en karakteristik özellikleri kıvrımlı hücre kenarları ve parmak şeklinde membran çıkıntılarıdır. Bu şekilleri kemik rezorbsiyon işlevlerini kolaylaştırır (12,20,21,29,30). Aktif osteoklastlarda kemik matriksine bakan yüzey, düzensiz olarak
katlanıp çoğu kez dallanarak, girintili çıkıntılı hale gelen fırçamsı bir kenar oluşturur. Bu yapı, küçük partiküllerin tuzağa düşürülüp enzimatik aktivite ile karşı karşıya getirilmesi için uygun ortamı oluşturur ve aktif rezorbsiyon alanını da genişletir. Osteoklastlar, kemik matriksine hücum eden asid, kollajenaz ve diğer proteolitik enzimleri salgılarlar. Böylece kalsifiye olmuş temel maddeyi serbest hale getirirler ve kemik rezorbsiyonu sırasında meydana gelen artıkların da ortadan kaldırılmasında aktif olarak rol alırlar (18).
Kemik Oluşumu
İntramembranöz ve enkondral olmak üzere 2 tür kemikleşme vardır. Bunlardan intramembranöz kemikleşme bağ dokusunun, enkondral kemikleşme ise kıkırdak dokusunun katılımıyla oluşmaktadır. Kemikleşme hangi türde olursa olsun ilk oluşan kemik dokusu, primer kemik yani olgunlaşmamış kemiktir. Oluşan bu primer kemik kalıcı olmayıp, yerini esas yani olgun lamelli kemik dokuya bırakmaktadır. Kemik yapımı, yıkımı veya rezorbsiyonu uyumlu bir biçimde olmaktadır. Kemik dokusu aktif bir yapıdır, dolayısıyla devamlı olarak yenilenmektedir. Bu yenilenme özellikle mekanik, kimyasal ve hormonal koşullarla yakın ilgilidir (9).
Kemiğin Rejenerasyonu
Organizmada herhangi bir nedenle hasar gören dokular belirli bir oranda kendilerini yenileyebilmektedirler. Kemik dokusu bu onarım işini en iyi yapan dokulardan birisidir. Kemiğin kırılması durumunda, kırık bölgesinde yeni bir kemik dokusu oluşarak bölge tamamen normal hale gelmektedir. Kırık meydana geldiğinde dokunun kan damarları da hasar gördüğünden kanama oluşur ve bu bölgedeki kan pıhtılaşır. Kırık bölgesindeki doku da bozulmuştur ve ortadan kaldırılması gerekmektedir. Ortama gelen nötrofiller ve makrofajlar hasarlı dokuyu ortadan kaldırırlar. Bölgede fibroblastların ve damarların çoğaldığı gözlenir. Bu bölge daha sonra fibröz bir doku yapısı haline gelir ve kırık yeri kıkırdak dokuya dönüşür. Bu yeni dokuya kemik kallusu denir. Bu arada kırık bölgesindeki periosteum ve endosteumun osteoblastları çoğalarak kırık bölgesine gelirler ve burada bir hücre katı oluştururlar. Daha sonra enkondral kemikleşmede olduğu gibi primer kemik oluşmaktadır. Bölgede ayrıca intra-membranöz kemikleşme de olur. Onarım sırasında önce primer kemik dokusu gelişmektedir. Doku daha sonra yavaş yavaş ortadan kalkarken, yerini sekonder yani esas kemik dokuya bırakır. Böylece onarılmış kemik o bölgede tamamen normal şekline kavuşur ve fonksiyonlarını yerine getirir bir duruma gelir (9).
Çeşitli faktörler kemiğin normal büyümesini ve yeniden yapılanmasını etkilerler. Kemik yapımı ve yeniden yapılanmasının düzenlenmesinde mekanik uyarı en önemli mekanizma olarak kabul edilmektedir. Kemikte büyümeyi ve yeniden yapılanmayı kontrol eden mekanizmalar moleküler, hücresel, doku ve organ seviyesinde olabilir. Moleküler seviyedeki kontrol için en çok çalışılan konu kollajen sentezini düzenleyen kollajen genleri olmuştur ve mRNA’nın kodlanması sırasında hormonal kontrolün önemi bilinmektedir. Kollajen sentez ve kompozisyonunda bozukluklar, osteogenezis imperfekta gibi bazı metabolik kemik hastalıklarında gösterilmiştir. Hücresel seviyede kontrol osteoblastik ve osteoklastik proliferasyon, diferansiyasyon ve aktivitenin kontrolü ile mümkündür. Ancak saf olarak osteoklast veya osteoblast populasyonları elde edip bunların in vitro olarak davranışlarını çalışmak zordur. Bu amaçla genellikle osteosit benzeri tümör hücreleri ve doku kültürleri kullanılmaktadır. Etkili faktörlerin fizyolojik konsantrasyonlarından çok, fizyolojik olmayan konsantrasyonları ile çalışma yapıldığından, sonuçlar güvenilir olmamaktadır. Doku seviyesinde kontrol ancak rezorbsiyon ve formasyon olayının kontrolü ile mümkündür. Organ seviyesindeki kontrolde ise bazı hormonların (PTH, GH, tiroid hormonları, cinsiyet hormonları vb.) etkileri ve kemiğe uygulanan mekanik uyarı rol oynamaktadır (31-35).
Kemiğin yeniden yapılanması aktivasyon-rezorbsiyon ve formasyonun yer aldığı bir sırayı takip eder. Kemik rezorbsiyonu matriksin yıkımı ve mineral komponentin çözünmesi, kemik formasyonu ise matriksin sentezi ve mineralizasyonu ile oluşur. Bu etkileşim zinciri sistemik ve lokal olarak salgılanan daha önce adı geçen büyüme faktörleri ile hormonlar tarafından kontrol edilir (17,25,27,36-38).
RADYASYONUN KEMİK DOKU ÜZERİNE ETKİLERİ
İyonizan radyasyon toplam doz, fraksiyon şeması (günlük doz ve toplam tedavi süresi) ve tedavi edilen volüm gibi birbiriyle yakından ilişkili parametrelere bağlı olarak, dokularda farklı etkiler oluşturur. Bir organın normal dokusunda belirli bir hasar meydana getirebilmek için gereken ışın dozu, organın ışınlanan hacmi küçüldükçe artmaktadır. RT’nin normal doku üzerine olan etkilerini belirleyen temel parametreler Şekil 3’te gösterilmiştir (39).
Şekil 3. Radyoterapinin normal dokular üzerine olan etkilerini belirleyen temel parametreler (39)
Radyasyonun etkileri kronolojik olarak 3 safhaya ayrılır:
1. Akut etkiler: RT sırasında ya da 6-8 hafta içinde görülür. Kemik iliği, gastrointestinal, orofaringeal ve özofageal mukoza ve cildin bazal tabakası gibi hücreleri hızlı prolifere olan dokularda görülür. Tolerans dozları (TD) aşılmadığı sürece geri dönüşümlü etkilerdir.
2. Subakut etkiler: RT’den 2-3 ay sonra görülür. Omurilik ışınlaması sonrası demiyelinizasyon sonucu görülen Lhermitt sendromu, beyin ışınlaması sonrası görülen somnolans gibi geçici etkilerdir.
3. Geç etkiler: Bir kaç ay ile birkaç yıl içinde görülen, yavaş gelişen, ağır seyreden ve iyileşmeyen kalıcı yan etkilerdir. Kemik, yumuşak doku, sinir sistemi gibi hücreleri yavaş prolifere olan dokularda görülür. Fibrozis, ülserasyon ve nekroz tipik bulgularıdır.
Akut ya da geç yan etkilerin ortaya çıkış süresini ve şiddetini, hücrelerin kinetik özellikleri (proliferasyon hızları), ışınlanan sağlam doku hacmi, verilen toplam doz ve fraksiyon şeması belirler.
Bu bilgiler ışığında klinik gözlemlere dayanarak çeşitli dokular için tolerans doz tabloları geliştirilmiştir. TD5/5 (minimal TD), tedavi sonrası 5 yıl içerisinde %5’den daha az
ciddi komplikasyon oranına neden olabilecek radyasyon dozu iken TD50/5 %50 oranında
komplikasyona neden olabilecek radyasyon dozudur. Kemik doku için tolerans dozları Tablo 1’de gösterilmiştir (39,40).
Tablo 1. Tedavi parametreleri: Tolerans dozları (40)
Organların metabolik organizasyonları hücresel yapılarına göre seri bağlantılı ve paralel bağlantılı olmak üzere iki gruba ayrılır. Seri bağlantılı bir grupta oluşan hasar distalde
TOPLAM DOZ FRAKSİYON DOZU IŞINLANAN ORGAN HACMİ TOPLAM TEDAVİ SÜRESİ (GÜN)
TD5/5 (TEK DOZ) TD50/5 (FRAKSİYONE DOZ)
fonksiyon kaybına neden olurken, paralel grupta herhangi bir bölümdeki hasar, etkilenmemiş bölüm tarafından telafi edilir (39). KT ve RT’nin etkilerini anlamak için hedef organdaki hücrelerin proliferasyon hızının yanında bu organizasyon da göz önünde bulundurulmalıdır.
Radyasyona bağlı organ hasarının oluşmasında;
1. Organdaki hedef hücrelerin tipi (parankimal, vasküler vb.), 2. Fonksiyonel dağılım (homojen veya heterojen),
3. Fonksiyonel komportmanların yapısal organizasyonu (paralel veya seri bağlantılı olmaları) önemli parametrelerdir (Şekil 4) (40).
Fonksiyonel Dağılım
Homojen Heterojen
Yapısal Organizasyon
Paralel Sağlam Akciğer, Karaciğer, Böbrek
Hasarlanmış Akciğer, Kemik, Beyin
Seri Özefagus , İntestinal dokular
Optik sinir yolağı, Konuşma merkezi
Şekil 4. Radyasyona bağlı organ hasarındaki parametreler (40)
Gelişmiş kemik dokusu yavaş prolifere olan hücrelerden oluştuğu için, radyasyona dirençli bir organdır. Radyasyon hasarının kemikte görülen primer etkisi atrofidir. Kemik hücrelerinin radyasyona cevabı yüksek dozlarda nekroz indüksiyonu, düşük dozlarda ise apopitozis indüksiyonu şeklinde olur. Nekroz ancak 60-70 Gy gibi yüksek dozlarda görülebilir ve iyileşmesi güç olan en önemli kalıcı yan etkidir. Kemikteki radyasyon sonrası atrofik değişiklikler, hücresel ve damarsal hasar kombinasyonunun sonucu olarak oluşur. Osteoblastlardaki hasar sonucu matriks yapımının azalması, primer histopatolojik olaydır. Atrofinin ilk radyografik bulgusu, lokalize osteopenidir ve çoğu kez geç görünür hale gelir. Bunun nedeni demineralizasyonun belirlenmesinde radyografinin göreceli olarak duyarsız olmasıdır (8).
Klinikte uygulanan dozlarda radyasyon, olgun kemik matriksinin osteoindüktif özelliğini bozmaz (41). Bununla birlikte matriksin morfogenetik özelliklerinin
denatürasyonu ve destrüksiyonu kaçınılmazdır (42). Bunun sonucu olarak kemik yapımı ve yenilenmesi düzensizleşir. Kortikal kemiğin belirgin yüzey yapıları ise radyasyondan etkilenmez. Radyasyonun kemik doku üzerine yaptığı hasar esas olarak kapillerdeki aterojenik-antianjiojenik ve kollajen dokudaki fibrojenik etkilerle gerçekleşir (43-46). Bu süreçlerin sonucunda kanlanmanın bozulması, nekroz gelişimini hızlandırır. Histopatolojik olarak osteosit sayısında azalma, osteoblastik aktivitede baskılanma ve vaskülaritede azalma gözlenir (47). Bu etkiler salınan sitokinler aracılığı ile artmaktadır. Ayrıca osteoblastlardan salgılanan anjiojenik büyüme faktöründeki (VEGF) değişimler nedeni ile de anjiojenik yanıtın azaldığı görülmüştür (48). Yüksek dozlarda radyasyonun epifizlerde büyümeyi durdurduğu, fraktürün iyileşmesini geciktirdiği, fibröz birleşmenin insidansını artırdığı ve osteradyonekroza neden olduğu gösterilmiştir. Kemik yapımını önleyen bu özelliği nedeniyle RT terapötik olarak heterotopik kemik formasyonunu (miyozitis ossificans) önlemede kullanılır (47).
SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR
Serbest radikaller (SR), iyonizan radyasyon neticesi meydana gelen iyonların veya uyarılmış atomların biyolojik ortamdaki diğer atom ve moleküllerle kimyasal reaksiyona girmesi sonucu oluşurlar. SR’ler dış yörüngelerinde eşleşmemiş bir elektrona sahip ve genellikle elektriksel açıdan yüksüz atom ya da moleküllerdir. Yaklaşık 10-5 saniye gibi bir ömürleri vardır. SR’ler son derece reaktiftirler, yani diğer atom ya da moleküller ile kolayca reaksiyona girerler. Eşleşmemiş elektronun bir başka radikalin aynı durumundaki elektronu ile eşleşerek ya da bir elektron transferi reaksiyonu yaparak kararlı hale gelme eğilimi vardır. Bu sebeple SR’ler elektron alıcı (oksitleyici) ya da elektron verici (redükleyici) özelliklere sahiptirler (4).
Bu bileşikler organizmanın normal metabolik işleyişi sırasında oluştuğu gibi, çeşitli dış etkenlerin etkisiyle de oluşmaktadır. Radikal oluşumu hücre tiplerine göre değişmekle birlikte, tüm aerobik hücrelerde belirli düzeylerde SR oluşmaktadır. Organizmada O2 türevi
SR’ler yanında karbon ve kükürt merkezli SR’ler de oluşmaktadır (49).
Mitokondrideki elektron transport zinciri reaksiyonları, endoplasmik retikulumdaki karma fonksiyonlu oksidaz sistemi, sitoplazmadaki ksantin oksidaz, dopamin beta hidroksilaz, D-aminoasit oksidaz, ürat oksidaz, prostaglandin sentetaz ve lipooksijenaz gibi enzimlerin etkinliği, peroksizomlarda ve lizozomlardaki metabolik olaylar endojen olarak SR oluşumuna yol açmaktadır. Organizmada SR reaksiyonlarını artıran eksojen kaynaklar
ise, besinsel ve çevresel faktörler (iyonizan radyasyon, hava kirliliği, sigara vb.) ile ilaçlar olmak üzere başlıca üç grupta toplanabilir (50).
Organizmada, SR’in zararlı etkileri oluşmadan etkisizleştirilmelerini sağlayan güçlü bir savunma sistemi bulunmaktadır. SR’in oluşum hızı ile etkisizleştirme hızı dengede olduğu sürece, organizma bu bileşiklerden etkilenmemektedir. Buna karşılık savunma azalır veya bu zararlı bileşiklerin oluşum hızı sistemin savunma gücünü aşarsa, denge bozulmakta ve SR’e bağlı zararlı etkiler ortaya çıkmaktadır. Bu zararlı etkiler şöyle sıralanabilir:
1. Dezoksiribonükleik asitin (DNA) tahrip olması 2. Nükleotit yapılı koenzimlerin yıkımı
3. Tiyollere bağımlı enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının bozulması, hücre ortamının tiyol/disülfit oranının değişmesi
4. Protein ve lipidlerde kovalan bağlara yol açması
5. Enzim aktivitelerinde ve lipid metabolizmasında değişiklikler 6. Mukopolisakkaritlerin yıkımı
7. Proteinlerin parçalanması ve tekrar yapımının artması 8. Lipid peroksidasyonunun ve zar yapısının değişmesi
9. Kollajen ve elastin gibi uzun ömürlü proteinlerdeki oksidoredüksiyon olaylarının bozularak, kapillerlerde aterofibrotik değişikliklerin oluşumu (51).
Radyasyon ve Serbest Radikal Oluşumu
Radyasyonun canlıda oluşturduğu etkileri (radyasyon enerjisinin absorplanması ile, biyolojik etkinin ortaya çıkışı arasındaki sürede birbirini izleyen olaylar zincirini) üç etki kademesinde sıralamak mümkündür.
Radyasyon etkisinin ilk kademesi olan fiziksel kademe, iyonizan radyasyon ile canlı dokuları oluşturan atom ve moleküller arasındaki ilk etkileşimleri kapsar. Bu kademede radyasyon enerjisi maddeye transfer edilir ve bu olay radyasyonu absorplayan maddenin atom ve moleküllerinde iyonlaşma ya da uyarılmalara yol açar. Bu iyonlaşmalar sonucunda oluşan serbest elektronlar, diğer komşu atomlarda da iyonlaşmalara yol açarlar ve böylece zincirleme bir iyonlaşma olayı meydana gelir.
Bu ilk reaksiyonlarda ortaya çıkan yeni ürünler, genellikle kararsızdırlar ve çok kısa bir süre içinde (10-10 saniye) sekonder kimyasal reaksiyonların oluşmasına neden olurlar (52). Bu reaksiyonların meydana geldiği radyasyon etkisinin ikinci kademesi, kimyasal kademe adını alır. Bu kademede hasar görmüş atom ve moleküller diğer hücresel yapılar ile
reaksiyona girerler. Bu reaksiyonlar basit ya da karmaşık zincirleme reaksiyonlar şeklinde gelişebilir ve SR’lerin oluşmasına yol açarlar. SR’ler çok reaktif yapılardır ve hem kendileri ile hem de ortamdaki diğer moleküller ile reaksiyonlara girmeye devam ederler.
Bir organizmada radyasyon etkisi ile oluşan bu tür moleküler değişiklikler, olayın biyolojik kademe ile adlandırılan üçüncü kademesinin başlamasına yol açarlar. Bu kademe boyunca canlıda meydana gelen olaylar, radyasyonun son biyolojik etkisinin ortaya çıkmasına sebep olurlar. Çeşitli hasarlara yol açan enzim reaksiyonları başlar. Bu arada DNA molekülünde de hasarlar oluşur (4).
İyonize edici radyasyonların etkisi ile DNA’da oluşan hasar üç tiptir;
1. Subletal hasar: Tek başına ölümcül değildir ve tamir edilebilir. Ancak çok sayıda olması hücrenin bölünerek çoğalmasını engelleyerek röprodüktif hücre ölümüne neden olabilir.
2. Potansiyel letal hasar: Eğer hücre bölünmesi kısa bir sürede meydana gelirse ölümcül olan ancak bölünme gecikirse tamir edilebilen hasardır.
3. Letal hasar: Hasar tamir edilemediği için hücrenin yaşamsal fonksiyonları etkilenir ve apoptotik hücre ölümüne yol açar.
İlk 2 tipte hasar tek zincir kırıklarında, 3. tipte hasar ise çift zincir kırıklarında daha yüksek oranda görülür.
Radyasyon etkisi ile hücre çekirdeğindeki DNA’nın hasar görmesi, hücresel bölünme yeteneğini ortadan kaldırır. İyonizan radyasyonun DNA üzerine direkt etkisi ile baz değişikliklerine neden olan lezyonlar oluşur. Diğer yandan iyonizan radyasyon tarafından hücre içi sıvıda oluşturulan SR’ler de DNA ile reaksiyona girerek, indirekt yoldan hasarlara neden olur.
Canlılar %70-90 oranında H2O içerdiği için ışınlandıklarında, radyasyon enerjisinin
büyük oranda H2O molekülleri tarafından absorblanması olasılığı çok yüksektir. Radyasyon
etkisi ile H2O molekülleri iyonlaşır ya da uyarılırlar. İyonlaşma ile pozitif yüklü bir iyon
(H2O+) ve hızlı bir serbest elektron (e-) oluşur. Bu olayı izleyen çeşitli reaksiyonlar ile
değişik tipte SR’ler meydana gelir. Serbest elektron bir çok sekonder iyonlaşma olayına yol açarak enerjisini kaybeder ve ortamda su molekülleri ile sarılarak hidrat elektron (e-
aq)
haline geçer. Pozitif yüklü iyon ise, bir hidrojen iyonu (H+) ile bir hidroksil radikali (OH.) oluşturacak şekilde ayrılır. Bu olaylarla birlikte bir hidrojen radikali (H.) de meydana gelir:
e-
aq + H+ Æ H.
OH. ve H. radikalleri sadece suyun iyonlaşması ile gerçekleşen bu reaksiyonlar sonucu oluşmazlar. Aynı zamanda su moleküllerinin uyarılması ve uyarılmış molekülün ayrılması ile de meydana gelebilirler. Oluşan bu radikaller çok reaktiftirler. Aralarında radikal–radikal reaksiyonlar gelişebilir:
H. + H. Æ H2
OH. + OH. Æ H2O2 H· + OH. Æ H2O
Serbest radikaller bu reaksiyonların dışında aynı zamanda diğer su molekülleri ile reaksiyona girebilecekleri gibi, kendi aralarındaki reaksiyonlar sonucu ortaya çıkan ürünler ile de tekrar reaksiyona girebilirler.
Suyun radyolizi ile oluşan radikaller, DNA gibi organik biyolojik moleküller (BM) ile reaksiyona girerek, bunları da radikaller haline dönüştürebilir. Bu reaksiyonlar sonucunda canlıya özgü yeni tür biyoradikaller (B.) oluşur.
Bu reaksiyonların tümü radyasyonun indirekt etkisidir. Burada radyasyon enerjisinin BM’lere transferi direkt olarak değil, ilk kademede su ortamında oluşan SR’ler aracılığı ile olmuştur. Radyasyonun direkt etkisinde ise, radyasyon enerjisini su molekülleri yerine direkt olarak organik BM’lere transfer eder ve B. oluşmasına yol açar. Bu etkiler hücredeki tüm BM’de görülebilirse de, DNA’da tek ve çift zincir kırıklarına yol açarak enzimatik olarak tamir edilmedikleri sürece en önemli biyolojik etkileri oluştururlar.
Kanser tedavisinde eksternal RT için kullanılan X, γ ve elektron ışınları gibi düşük lineer enerji transferi yapan radyasyonların etkisi daha çok indirekt yolla, α partikülleri gibi ağır partikül radyasyonlarının etkisi ise, yüksek lineer enerji transferli ışınlar olmaları nedeniyle, daha çok direkt yolla meydana gelir. O2 molekülünün elektron verici özelliğinden dolayı, indirekt etkide ortamdaki hemoglobin düzeyi ve O2 konsantrasyonu iyonlaşmayı, SR
H2O Æ H2O+ + e-
e- Æ e- aq
oluşumunu, dolayısı ile radyasyonun biyolojik etkisini arttırmaktadır. Ağır partiküller ise direkt yolla reaksiyona neden olduğundan ortamdaki O2 konsantrasyonundan bağımsız olarak
etkilerini gösterirler (4).
Antioksidanlar
Protein, lipid, karbonhidrat ve DNA gibi okside olabilecek BM’in oksidasyonunu önleyen maddelere antioksidan denilir. Antioksidanlar SR’lerin oluşumunu engelleyerek veya ortamdan temizlenmesini sağlayarak etki gösterirler. SR ile antioksidanlar arasındaki dengenin korunması, organizmanın canlılığını sürdürmesi açısından önemlidir.
Radyasyonun tümörde olduğu gibi normal hücrelerde de SR oluşturarak yaptığı hasarı, SR temizleyici ajanlar kullanarak önlemek mümkün olabilir. Aynı mekanizma sitotoksik ajanlarla yapılan KT’nin yan etkilerini azaltmak için de kullanılabilir. Kanser tedavisinde normal dokuları RT ve KT’nin yan etkilerinden korumak, ancak bunu antitümöral etkinliği azaltmadan yapabilmek çok önemlidir. Bu etkiliği sitoprotektif ajanların kullanılması ile sağlamak mümkündür (53).
Klinikte kullanılan amifostin ve karnitin bizim çalışmamızda kullanılan sitoprotektif ajanlar olduğundan aşağıda ayrıntılı şekilde açıklanmışlardır.
AMİFOSTİN
Radyoprotektörlerin en iyi bilinen grubu SH bileşikleridir ve bu maddelerin koruyucu etkisini bu yapı sağlar. Radyoprotektörlerin arasında kimyasal olarak en basit yapılı olanı sisteindir. Sistein, SH içeren doğal bir aminoasittir. Total vücut ışınlamasından önce yüksek dozda sistein verildiğinde koruma sağlandığı saptanmıştır. Buna benzer sonuçlar sistein ile çok yakın benzerlik gösteren ve onun dekarboksilasyonu ile oluşan sisteamin ve sisteaminin bir disülfit türevi olan sistamin ile de elde edilmişlerdir (4). Patt ve ark. (54) 1949 yılında SH içeren aminoasitlerin, sisteinin ve sisteaminin kemiricileri ölümcül radyasyon dozundan koruduğunu göstermişlerdir.
Amifostin (S-(N-(3-aminopropil)-2-aminoetiyol) sisteamin benzeri bir moleküldür. Soğuk savaş döneminde ABD ordusuna bağlı Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü tarafından yürütülen ve askerleri cephedeki nükleer silah kaynaklı radyasyondan korumak amacını taşıyan çalışmaların ürünüdür. Bu program tarafından geliştirilen ve tiyol içeren bileşikler Walter Reed’in kısaltılmasıyla “WR” ön eki ile tanımlanmışlardır. Öngörülen amaçla kullanıma uygun olmadığı anlaşıldıktan sonra amifostin tıbbi araştırmalar için
kullanılmış, RT ve KT’ye bağlı normal doku hasarlarının önlenmesinde etkili olduğu görülmüştür (55-57).
İnaktif bir ön ilaç olan amifostin WR-2721 olarak ta bilinir. Plazma membranında ALP ile defosforile olur ve aktif metaboliti olan WR-1065 formuna dönüşür. Selektif olarak normal dokuları koruma özelliği, normal dokularda tümör hücrelerinden daha çok WR-1065 akümülasyonunun olmasına bağlıdır. Tümörler göreceli olarak hipovaskülerdir ve bunun sonucu olarak hipoksik bir ortama ve düşük interstisyel pH’a sahiptirler. Bunun yanında malign dokularda ALP ekspresyonu azalmıştır. Bunların kombinasyonu sonucu tümör hücrelerinde aktif ilaç akümülasyonu düşük olur. Bu nedenle amifostin normal dokuları tümör dokularına nazaran, hücre içi serbest tiyol konsantrasyonu farklılığı sayesinde, 100 kat kadar daha fazla koruyabilmektedir (58). WR-1065’in oksidasyonu ile en yüksek oranda oluşan metabolit WR-33278 (simetrik disülfid) olup, az miktarda mikst disülfidler de oluşur.
Amifostinin fosfor-sülfür bağının sülfür atomuna proton transferi ile parçalanması ile metafosfat ve WR-1065 oluşur. Bundan sonra H2O’nun devreye girmesi ile metafosfat inorganik fosfata dönüşür:
WR-2721 Æ WR-1065 + Metafosfat Metafosfat + H2O Æ İnorganik fosfat
Maksimum hidroliz pH 4 ve altında oluşur. Amifostin vücut ısısında ve mide pH’sında hızla hidrolize olur. Yarılanma ömrü 30,5 dakikadır. Nötral pH’da, oda ısısında 4 saat bekletilse dahi hidroliz gerçekleşmez.
Amifostinin kimyasal bir özelliği olarak hidrolizi güçlü bir şekilde ısıya bağımlıdır. Bu özellik sayesinde spontan hidroliz ile oluşacak WR-1065 kan, plazma, doku veya doku kültürleri ortamında ölçülebilir. Amifostinin kimyasal yapısı Şekil 5’de gösterilmiştir.
H2N (CH2)3 NH (CH2)2 S PO3H2
Şekil 5. Amifostinin kimyasal yapısı (55,56)
Hayvan deneyleri ve insan çalışmaları göstermiştir ki ALP, pH 7 üzerinde aktiftir. ALP çeşitli doku arteriol endotel hücrelerinde, böbrek proksimal tübülüs hücrelerinde ve ince bağırsak mikrovilluslarında bolca miktarda bulunur. ALP aracılı aktif transport çok hızlı
gerçekleşir. Bunun nedeni, amifostinin plazma proteinlerine bağlanmaması ve metabolizmasının büyük oranda ALP aracılı aktif transporta uğramasıdır (55).
Faz II çalışmalar ile amifostinin tolerabl doz aralığı 740-910 mg/m2 olarak belirlenmiştir (59). Amifostin oral kullanıldığında aktif değildir. 15 dakikalık intravenöz (İV) infüzyon sonrası ortalama maksimum plazma konsantrasyonu 0,1-0,235 mmol/L’dir. İlacın dağılım hacmi 6,44 L, plazma klirensi 2,17 dakikadır.
Farmokokinetik çalışmalar, hastalarda amifostinin plazma kompartmanından hızla temizlendiğini göstermiştir. İnsanlarda İV verilmesini takiben ilk 6 dakikada amifostinin %90’ı metabolize olur. Yapılan çalışmalarda amifostinin α yarı ömrü (dağılım yarı ömrü) <1 dakika; β yarı ömrü (eliminasyon yarı ömrü) = 8.8 dakika olarak saptanmıştır. WR-1065 metaboliti enjeksiyondan 10-30 dakika sonra pik düzeyine ulaşır (55). Bu nedenle, normal dokuların sitoproteksiyonunda optimum yarar sağlanabilmesi için RT ya da KT uygulamasından 20-30 dakika önce amifostin uygulanması gerektiği belirlenmiştir (60).
Serbest tiyol olan WR-1065’in normal hücreyi sitotoksik tedavilerin etkilerinden koruması çeşitli mekanizmalar ile açıklanmıştır. Serbest tiyol, intrasellüler ortamda direkt olarak alkilleyici ajanların veya sisplatinin aktif ürününe bağlandığı gibi, hasarlı hedef moleküllere de H+ vererek hücresel koruma sağlar. Yapısındaki SH atomu sayesinde, KT ajanları ve RT tarafından oluşturulan SR’ler ortadan kaldırılmadığında meydana gelen ve DNA hasarına yol açan, reaktif nükleofilleri yok eder (55,56,61).
Amifostin genel olarak iyi tolere edilir, fakat doz bağımlı kısa süreli geçici yan etkiler olabilir. Bunlar hipotansiyon, bulantı, kusma, hıçkırık, somnolans, infüzyon sırasında metalik tat ve nadiren allerjik reaksiyonlardır (cilt döküntüsü, ateş ve anafilaktik şok) (59). Klinik anlamlı yan etki çoğunlukla hipotansiyondur. Hastaların %60’ında geçici hipotansiyon oluşmaktadır, fakat tedaviye ara verilecek oranda hipotansiyon oluşturması nadirdir (<%5). Bulantı, kusma gibi semptomlar, amifostin öncesi antiemetik rejimlerin uygulanması ile önlenebilir. Geçici hipokalsemi paratiroid hormon sekresyonunun inhibisyonuna bağlıdır ve amifostin tedavisinin nadir görülen bir komplikasyonudur. Klinik olarak anlamlı bir hipokalsemi tek doz amifostin uygulamasını takiben yaygın değildir. Ancak günlük RT ile birlikte birden çok uygulamanın yapıldığı hastalarda periyodik kalsiyum düzeyi izlenmelidir (62).
Çalışmalar subkutan (SC) uygulamada İV uygulamaya göre bulantı, kusma ve hipotansiyon insidansında azalma olduğunu, ateş ve kutanöz reaksiyonların insidansında ise artış olduğunu göstermiştir (63-66).
Hem hücre kültürlerinde hem de tümörlü kemiriciler üzerinde yapılan preklinik çalışmalar sonucunda, amifostinin çeşitli mürin ve insan karsinomu, sarkomu ya da lösemi hücrelerinde koruma yapmaksızın seçici olarak normal dokuları koruduğu gösterilmiştir (63). Günümüzde bu preklinik verilere dayanarak yürütülmekte olan birçok klinik çalışma mevcuttur. Merkezi sinir sistemi dışında amifostinin birçok organ sistemini ve genetik materyali, RT ve KT’nin yol açtığı hasarlardan koruduğu bildirilmektedir. Amifostin tarafından korunduğu bilinen normal dokular böbrek, akciğer, yemek borusu, periferik sinirler, kemik iliği, ince bağırsak, kalın bağırsak, immün sistem, tükrük bezleri, ağız mukozası, kalp ve testistir (58). Ayrıca uzun ve kraniofasial kemiklerin büyümesinde RT’ye bağlı meydana gelen gecikmede amifostinin radyoprotektör etkisi gösterilmiştir. Amifostinin intraperitoneal (İP) olarak verildiği tek ya da fraksiyone dozlarda RT uygulanan 4-5 haftalık ratlarda, RT sonucu görülen büyüme durmasına karşı koruyucu etkisi gösterilmiştir. Osteoblast, endotel ve fibroblast gibi hücrelerin sayısını korumada da etkinliği gözlenmiştir (67)
Amifostinin genişletilmiş klinik kullanım profilleri ise radyoproteksiyon, kemoproteksiyon, kemik iliği stimülasyonu, radyoprevensiyon ve kemoprevensiyondur (55,56).
KARNİTİN
İlk olarak 1905 yılında Frankell tarafından karnitinin biyolojik tayini için yöntem geliştirilmiş ve kas dokusundan elde edildiğinden latince “carnis” kelimesinden yola çıkılarak karnitin adı verilmiştir. 1960’lı yıllarda biyolojik yapısı tam olarak aydınlatılmış ve “3-hydroxy-4-N-trimethyl ammonia butaonate” olduğu gösterilmiştir. Karnitinin fizyolojik formu L(-) izomeri yani levokarnitindir (68). “Propionyl-L-carnitine” (PLC) ve “acetyl-L-carnitine” (ALC), L-karnitinin kısa zincirli esterleridir (7). Karnitinin kimyasal yapısı Şekil 6’da gösterilmiştir.
CH3 HO H O
CH3 N+ CH2 C CH2—C O
CH3
Karnitin vitamin benzeri bir maddedir ve yapısal olarak aminoasitlere benzemektedir. Karnitinin yaklaşık olarak %75’i besinlerden, %25’i endojen olarak sentezlenir (70). Diyetteki başlıca kaynakları et ve süt ürünleridir. İnvivo olarak lizin ve metiyonin esansiyel aminoasitlerinden sentezlenir. Ancak dokulardaki konsantrasyonu besinle alınan miktara bağlı olarak değişir. Sağlıklı bireylerdeki plazmadaki serbest karnitin düzeyi 40-50 µmol/L’dir. Toplam vücut karnitinin %90’ından fazlası iskelet kasında tutulur. Kalan kısımları ise karaciğer, böbrek ve kalp gibi organlardadır. %1’den azı da plazma ve eritrositlerde bulunur (71). Normal plazma konsantrasyonunda, filtre edilen karnitinin %90’dan fazlası böbrek tarafından reabsorbe edilir. Anlamlı metabolik degredasyona uğramaz (70).
İntrasellüler önemli fonksiyonları şunlardır:
1. Uzun zincirli yağ asitlerinin mitokondri membranından içeri tarnsferini gerçekleştirerek mitokondrial yağ asidi oksidasyonunda kofaktör olarak yer alır.
2. Dallı-zincirli α-keto asit oksidasyonunu kolaylaştırır.
3. Karaciğerde, ß-oksidasyon ile kısa zincirli hale gelmiş açil kısmının peroksizomların dışına çıkarılmasını sağlar.
4. Memeli hücrelerinde, açil-CoA/CoA sülfidril oranını ayarlar.
5. Akut metabolik kriz sırasındaki esterifikasyon nedeniyle büyük miktarda artabilen ve potansiyel toksik olan açil-CoA metabolitlerini yakalar (70).
Karnitin karbonhidrat, glukoz ve lipid metabolizmasında rol alan bir amin bileşiğidir. Uzun zincirli yağ asitlerinin dokularda enerji substratı olarak kullanılabilmesi için gereklidir. Yağ asidi, iskelet ve kalp adalesi gibi bir çok sistem için primer enerji kaynağıdır ve karnitin yağ asitlerinin mitokondrial membran içine gişini kolaylaştırarak enerji temininde önemli rol oynar. Enerji üretiminde çok etkili metabolik yol olan ß oksidasyonda rol alan karnitin, özellikle yüksek enerji ihtiyacı olan dokular için önemlidir. Hücre membran stabilizasyonunda, kas kontraktibilitesinde ve kalp fonksiyonlarında etkilidir (72,73). Ayrıca OSR’lerin temizlenmesinde görev alır (7). SR yakalama özelliğinden dolayı aynı zamanda antioksidan olarak etki eden karnitinin vejeteryan tarzı beslenme ile eksikliği görülebilir (74). Karnitin seviyesi yaş ile azalır ve eksikliğinde örneğin kardiyomiyopati ve iskelet kas zayıflığı görülebilir (75,76). Karnitin ve esterleri doğal maddelerdir ve oral uygulama ile de iyi tolere edilebilirler. Karnitinin ilaç formunda oral olarak 1-6 gr’lık dozlarda alınmasından sonra biyoyararlanımı %5-18’dir. Buna karşın besinlerle alınan düşük miktarlardaki karnitinin biyoyararlanımı %75 gibi oldukça yüksek düzeydedir. İV uygulamadan sonra, ilk dağılım volümü yaklaşık olarak 0.2-0.3 L/kg’dır. Karnitin esas olarak renal yoldan atılır (77).
İnsanlarda yüksek dozda karnitin alımına bağlı toksisite bildirilmemiştir. Hayvanlarda ise letal doz (LD50) 19.2 g/kg’dır. Doz çalışmaları ile bir seferde 2 g’dan fazla verilmesinin kan konsantrasyonunu değiştirmediği gösterilmiştir. Karnitin ile yapılan proteksiyon amaçlı çalışmalarda, 100-300 mg/kg/gün doz aralığı kullanılmıştır (78). Karnitin ve esterlerinin bir çok farmakolojik etkilerinin yanında terapötik yararları da gösterilmiştir. Örneğin SR’leri temizleme özellikleri sayesinde, ATP yapımında artış ve mitokondrial fonksiyonlarda düzelme yaptıkları gözlenmiştir (7). ALC, ülser oluşumunda alkolün etkisine karşı koruyucu etkiye sahip olduğu gibi, paklitaksel ve sisplatin KT’si ile oluşan nörotoksisiteye karşı koruyucu etkiye sahiptir (79,80).
Uzun süreli diyaliz uygulamalarından sonra plazma ve doku karnitin düzeylerinin anlamlı ölçüde azaldığı bugün iyi bilinmektedir. Bunun temel nedeninin karnitinin diyalizle uzaklaştırılması olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de hemodiyalizden hemen sonra plazma karnitin düzeyi %75 civarında azalmaktadır. Bu azalma öncelikle karaciğerden, az miktarlarda ise kaslardan geçiş ile kompanse edilir. Karnitinin kaslardan plazmaya geçişi oldukça yavaş olmasına rağmen, karaciğerden damar içine geçişi daha kolaydır. Bu nedenlerle plazma karnitin seviyeleri doku düzeylerini yansıtmaktan uzaktır (81). Yapılan bir çalışmada, hemodiyalize başladıktan 1 ay sonra plazma karnitinin normal seviyenin %30’u civarlarına indiği, 1 yıl sonra ise yine normalin %40 altına indiği gösterilmiştir (82). Hemodiyaliz hastalarında karnitinin İV verilmesinin diyaliz sırasında hipotansiyonu azalttığı, miyokardı koruduğu, anemi oluşumunu engellediği, kas gücü ve egzersiz kapasitesini olumlu etkilediği bildirilmektedir (83). Karnitinin üroloji literatüründe, özellikle sperm hareketliliğini arttırması ile ilgili olarak infertilitede kullanımı bildirilmiş olup, libidoyu arttırdığı, cinsel disfonksiyonlarda düzelme sağladığı ve testosteron düzeyini de arttırabileceği belirtilmektedir. Ancak karnitinin testosteron düzeyine etkisi olmadığını belirten çalışmalar da mevcuttur (84,85,86). Yaşa bağlı kemik kaybı osteoblast aktivitesinin azalması ile karakterizedir. Enerji üretiminde azalmaya bağlı olabilir. Karnitin derivelerinin yaşa bağlı kemik kaybını azalttığı ve osteoblast aktivitesini arttırdığı gösterilmiştir. Karnitin türevlerinin insan osteoblast proliferasyon ve diferansiyasyonuna pozitif etkisi gösterilmiştir. Bazı çalışmalar kemikte major yakıt maddesinin glukoz olduğunu gösterse de, yeni çalışmalar osteoblastik hücrelerde yağ asidi oksidasyonu sayesinde enerji ihtiyacının %40-80’inin sağlandığını göstermiştir (87).
Radyasyon sırasında vücutta ortaya çıkan OSR lipidler, proteinler ve nükleik asitler üzerinde hasarlara neden olur. Hücre membrandaki lipid komponentin peroksidasyonunun, özellikle radyasyon hasarına duyarlı olduğu bildirilmiştir. Ek olarak membran lipid
peroksidasyonu, radyasyona bağlı hücre ölümü ile ilişkilidir. Bu etki membran transportu akıcılığındaki ve bazı membran enzimlerinin aktivitelerindeki değişime bağlıdır (74). Bunun yanında radyasyonun, plazma total antioksidan kapasitesinde belirgin bir azalmaya neden olduğu gösterilmiştir. Tüm vücut ışınlamasının antioksidan kapasitede azalmaya ve oksidatif streste artışa neden olduğu bilinmektedir (88). Karnitinin, radyasyonun sebep olduğu SR’ler ile oluşan hücresel hasarda modülatör bir rol oynadığı düşünülmektedir (74). Hamsterlerde tüm vücut ışınlaması sonuçlarını inceleyen bir çalışmada, anlamlı olarak karaciğer ve plazma malondialdehid (MDA) seviyeleri ile karaciğer glutatyon seviyelerinde azalma olduğu ve bu etkilerin karnitin ile tersine çevrildiği gösterilmiştir. Tüm vücut RT’si uygulanan ratlarda, akciğer ve karaciğer dokularında yükselen MDA, plazmada yükselen karaciğer enzimleri (ALT, AST ve GGTP) ile trigliserid ve kolesterol seviyelerinde karnitin ile anlamlı azalma olduğu da gösterilmiştir. Bu sonuçların ALC’nin antioksidan etkileri sayesinde membran permeabilitesini koruyarak oluşturduğu bildirilmiştir (7).
Ratlar üzerinde yapılan başka bir çalışmada 5 fraksiyonda toplam biyolojik eşdeğer doz 60 Gy olacak şekilde tüm beyin ışınlanması yapılmış ve her fraksiyondan önce 100 mg/kg/gün İP karnitin uygulamasının RT’ye bağlı oluşan koklea hasarını önlemedeki etkisine bakılarak, bu hasarı düzeltebildiği gösterilmiştir (89).
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Bu çalışma 2006-2008 yılları arasında Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi (TÜTF) Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı, Nükleer Tıp Anabilim Dalı ve Patoloji Anabilim Dalı tarafından Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarında gerçekleştirilmiştir. Çalışmamız TÜTF Etik Kurulu (TÜTFEK) tarafından TÜTFEK-2006/126 protokolü ile 13/07/2006 tarihinde onaylanmış ve Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Merkezi tarafından 796 proje protokolü ile 07/12/2006 tarihinde desteklenmiştir.
ÇALIŞMA GRUPLARI VE DENEY
Çalışmada ortalama ağırlıkları 265 g olan, 24 haftalık, Wistar Albino cinsi 70 adet erkek rat kullanıldı. Ratlar TÜTF Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarından sağlandı. Tüm ratlar, TÜTF Deney Hayvanları Laboratuarı’nda, 5’erli kafeslerde, %50-60 nem oranı, 22+/-1 0C sıcaklıkta, 12 saat gece ve 12 saat gündüz ışık periyodu olan ortamda saklandı, günlük temizlikleri yapıldı. Ratların tümüne %20 protein içeren yem ve su verildi. Çalışma süresince haftalık ağırlık takibi yapıldı. Çalışmada 10’ar ratlık 4 ve 15’er ratlık 2 olmak üzere toplam 6 grup oluşturuldu.
Grup I : Amifostin ardından RT (AMF+RT) uygulanan deney grubu (15 rat) Grup II : Karnitin ardından RT (KAR+RT) uygulanan deney grubu (15 rat) Grup III : Yalnız karnitin (KAR) uygulanan kontrol grubu (10 rat)
Grup IV : Yalnız serum fizyolojik (SF) verilen kontrol grubu (10 rat) Grup V : Yalnız amifostin (AMF) uygulanan kontrol grubu (10 rat) Grup VI : Yalnız RT uygulanan kontrol grubu (10 rat)
Çalışmada kontrol ve deney grubundaki tüm hayvanlar gruplarına göre numaralandırıldı. Grup I’ deki ratlara RT’den 30 dakika önce 200 mg/kg dozunda amifostin İP ve grup II’ deki ratlara da yine RT’den 30 dakika önce 300 mg/kg karnitin İP olarak verildi. Grup I, II ve VI’ daki ratlara sağ femur başını içeren tek ön alandan anestezi altında RT uygulandı. Aynı tarihte kontrol gruplarından grup III’ teki ratlara 300 mg/kg karnitin İP, grup IV’ teki ratlara 300 mg/kg SF ve grup V’ teki ratlara 200 mg/kg amifostin İP olarak verildi. Ratlar 6 ay süre ile izleme alındı. İzlem boyunca haftalık ağırlık ve genel durum takibine devam edildi. Altıncı ay sonunda tüm gruplara anestezi altında Tc-99m MDP (metilen difosfonat) kemik sintigrafisi ve Dual Enerji X-ray Absorbsiometri (DEXA) ile kemik yoğunluk ölçümü yapıldı. Deney sonunda ratlar anestezi altında sakrifiye edildi. Ratların alt batın ve pelvis bölgesi açıldı. Sağ hemipelvis ve sağ femur, femur başı ile çıkartıldı. Histopatolojik inceleme için formalin içine konuldu.
ANESTEZİ YÖNTEMİ
Deneklere 50-60 mg/kg intramuskuler (İM) Ketamin (Ketasol, Richter Pharma AG, Avusturya) ve 5-10 mg/kg İM Xylazine (Rompun, Bayer Türk Kimya San. Ltd. Şti., Türkiye) uygulaması ile anestezi yapıldı.
RADYOTERAPİ UYGULAMASI
Her bir rat, anestezi sağlandıktan sonra pron pozisyonda sabitlendi. Simülatör (Simics 2, Mecaserto SA, Fransa) kullanılarak sağ femur ve femur başını içeren 2x2 cm ebatında tek ön alan simüle edildi. Simüle edilen ilk hayvanın alan görüntülenmesi ve fizik planlaması için röntgen filmi çekildi (Şekil 7). Elde edilen röntgen filmi ile diğer ratların simülasyonu kontrol edildi. Femurun ön-arka kalınlığı cetvelle ölçülerek 3 cm kalınlık saptandı. Kaynak-cilt mesafesi 100 cm olmak üzere 1.5 cm yarı kalınlığında doz hesaplanarak belirlenen alana lineer akseleratör (2100 C/D, Varian Medical Systems, ABD) cihazı ile 6 MV-X ışın kullanılarak tek fraksiyonda 300 cGy/dk doz hızında 20 Gy ışın uygulandı. Grup I’ deki ratlara RT’den 30 dakika önce 200 mg/kg dozunda amifostin İP ve grup II’ deki ratlara da RT’den 30 dakika önce 300 mg/kg karnitin İP olarak uygulandı.
Şekil 7. Pron pozisyonda simülasyon filmi GÖRÜNTÜLEME TETKİKLERİ Kemik Sintigrafisi
Çalışma zamanı: Tüm ratlara RT sonrası 6. ayda sakrifikasyonun hemen öncesinde
olmak üzere anestezi altında kemik sintigrafisi gerçekleştirildi.
Kullanılan kit ve radyofarmasötik: Tc-99m MDP kullanılmıştır. Günümüzde kemik
sintigrafisinde difosfonatlar kullanılmaktadır. İnvivo olarak fosfanatlar fosfat bileşiklerinden daha stabildir, çünkü fosfatlar fosfataz enzimince kolayca parçalanırken fosfanatlar parçalanmaz. Difosfonatlar kemik görüntülemesinde pirofosfat ise myokard infarktı görüntülemesinde kullanılır. En sık kullanılan difosfonatlar Tc-99m MDP ve Tc-99m HDP (1-hidroksi etilen difosfonat)’tır. Bütün Tc-99m difosfonat bileşikleri zayıf şelattırlar ve zamanla degrade olurlar. İV yolla uygulanan Tc-99m MDP’nin çoğu idrar yolu ile, az bir kısmı ise gastrointestinal yol ile atılır. Enjeksiyondan yaklaşık olarak 2 saat sonra kemik dokuya maksimum seviyede geçer.
Görüntüleme: Ratlara 5 mCi dozunda Tc-99m MDP İV enjeksiyondan yaklaşık 2
saat sonra genel anestezi altında posterior pozisyonda, maksimum “zoom”larda (en büyük büyütmede), tek başlı gama kamera (Philips, Eindhoven the Netherlans) kullanılarak 5 dakika olacak şekilde statik görüntüler alındı. Alınan bu görüntüler üzerinden kantitatif analizler yapıldı. Kemik ve yumuşak doku bölgelerinde eş büyüklükte düzenli ilgi alanları çizilerek kemik “background” oranı (BGO, geri plan) = kemik/geri plan oranı olarak hesaplandı.
Dinamik Böbrek Sintigrafisi
Böbreklerin perfüzyon, ekstraksiyon, filtrasyon ve ekskresyon fonksiyonlarının
değerlendirilmesinde Tc-99m DTPA (dietilen triamin pento asetik asit) kullanılır. Kemik fonksiyonlarının değerlendirilmesinde kullanılan MDP’nin asıl atılım yolu üriner sistemdir. Böbrek yetmezliğinde Tc-99m MDP’nin atılımı yavaşlayacağından MDP’nin yumuşak dokudan ve kemikten temizlenmesi zaman alır. Kemik/geri plan oranı artar. Böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi amacıyla Tc-99m DTPA kullanılmış ve böbrek fonksiyonları ayrıca değerlendirilmiştir.
Kemik Dansitometresi
Çalışma zamanı: Tüm ratlara RT sonrası 6. ayda sakrifikasyonun hemen öncesinde
olmak üzere bölgesel kemik mineral yoğunluğu (BMD) ölçümü gerçekleştirildi.
Ölçüm: Genel anestezi altında DEXA sistemi (Hologic QDR 4500, Hologic Inc.,
ABD) ile, deney hayvanlarında tüm vücut tarama modu kullanılarak tüm vücut kemik mineral ölçümü yapıldı.
Her bir DEXA tetkikinden, tüm vücut kemik mineral içeriği ve kemik mineral yoğunluğu hesaplandı. Bölgesel ilgi alanı uygulaması ile sağ femur ve sol femurun bölgesel kemik mineral yoğunlukları belirlendi.
Dual Enerji X-ray Absorbsiometri, günümüzde en yaygın kullanılan kemik dansitometre yöntemidir. DEXA’da bir X-ışını tüpü enerji kaynağı olarak kullanılır. Sistem genellikle 70 ve 140 keV olmak üzere iki farklı seviyede enerji çıkışı sağlar. Kemik ve yumuşak dokular arasında attenüasyon düşük enerjiler için daha fazladır. Her iki enerjinin attenüasyon profilleri bilgisayar aracılığı ile formüllere girilir ve kemik komponenti için sonuç hesaplanır. Hastanın maruz kaldığı radyasyon dozu vertebra grafisinin 1/1000’i kadardır. Standart DEXA çalışması lomber vertebra ve proksimal femur ölçümlerini kapsar. Proksimal femur değerlendirilmesinde femur boynu, trokanter ve Ward üçgeni bölgesinden kemik mineral yoğunluğu belirlenir.
HİSTOPATOLOJİK İNCELEME
Dokular %10 formaldehit solusyonunda 24 saat bekletildikten sonra uygun yerlerden kesit alınarak %10’luk formik asit solüsyonuna konuldu. Buradan alınan kesitler çeşme suyunda yıkanarak doku takibine alındı. Bir gece süren doku takibi sonrasında parafin bloklara gömüldü. Parafin bloklardan 5 mikron kalınlığında kesit alındı ve
Hematoksilen-Eozin boyası ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi. Fibrozis aşağıdaki Tablo 2’ye göre derecelendirilerek rapor edilmiştir.
Tablo 2. Fibrozis dereceleri (90)
Derece
0 Gösterilebilir bir retikülin lifi bulunmaz
1 Seyrek, ince, tek tek dağılmış lifler, inceliflerin oluşturduğu ağ şeklindeki odaklar 2 İnce lifsel ağ örgüsü kesitin tamamında izlenir. Ancak kalın lifler bulunmaz. 3 Derece 2’deki gibi diffüz lif ağı bulunur. Bu lif ağında dağınık olarak kaba liflere
de rastlanır. Ancak trikrom boyalarında matür kollajen life rastlanmaz.
4 Diffüz, genellikle kalın-kaba lif örgüsü bulunur. Bu liflerde kollajenizasyon da mevcuttur.
İSTATİSTİKSEL ANALİZ
Veriler kodlanarak bilgisayara girildikten sonra, istatistik analizleri SPSS 9.0 programı kullanılarak yapıldı. Gruplar arasındaki farkın istatistiksel önemlilik derecesini belirlemek için Kruskall-Wallis testi kullanıldı. P değerinin 0.05’in altında olması durumunda gruplar arasındaki fark anlamlı kabul edildi. İkili gruplar arasında yapılan karşılaştırmalarda ise Mann-Whitney U Testi kullanıldı. P değerinin 0.05’in altında olması durumunda iki değer arasındaki fark anlamlı kabul edildi. BMD ölçümlerinde gruplar arasındaki farkı belirlemek için ANOVA testi kullanıldı. P değerinin 0.05’in altında olması durumunda gruplar arasındaki fark anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Çalışma başlangıcında hayvanlara gruplarına göre RT ve radyoprotektör ilaç uygulandı. Sonrasında hayvanlar kilo takibine alındı. 6 aylık takip sonrası sintigrafi ve DEXA çekimini takiben hayvanlar sakrifiye edildi. Çalışma yalnız SF verilen kontrol grubunda 9 hayvan, yalnız RT yapılan grupta 6 hayvan, yalnız KAR uygulanan kontrol grubunda 9 hayvan, yalnız AMF uygulanan kontrol grubunda 10 hayvan, AMF+RT uygulanan deney grubunda 12 hayvan ve KAR+RT uygulanan deney grubunda 14 hayvan sakrifiye edilmesi ile tamamlandı. AMF+RT grubundan 3 hayvan sintigrafi ve DEXA çekiminden önce anesteziden öldü ve 1 tanesi hemen sakrifiye edildi. Bir hayvan sintigrafi çekimi sonrası DEXA çekimi yapılamadan öldü. KAR+RT grubundan 1 hayvan 7. haftada öldü. Yalnız KAR grubundan, 1 hayvan ise son hafta sintigrafi ve DEXA çekimi öncesi anesteziden öldüğü için hemen sakrifiye edildi. Bir hayvan 3. haftada öldü. SF grubundan 1 hayvan 3. haftada öldü. Sadece AMF grubundan 1 hayvan son hafta sintigrafi ve DEXA çekimi öncesi anesteziden öldü ve hemen sakrifiye edildi. Yalnız RT grubundan 1 hayvan 4. haftada, 1 hayvan 17. haftada, 1 hayvan 18. haftada, 1 hayvan sintigrafi çekimi sonrası DEXA çekimi yapılamadan öldü. Aynı gruptan 2 hayvan DEXA sonrası sintigrafi çekimi yapılamadan öldü ve bunlar da hemen sakrifiye edildi. Çekimler öncesi veya sırasında ölen hayvanlar son haftada oldukları için histopatolojik olarak kronik etkilerin değerlendirilmesi için sakrifiye edildiler.
Kemik Sintigrafisi Sonuçları
Altıncı ayda yapılan kemik sintigrafisinin sonucu, ışınlanan sağ femur için tüm gruplar karşılaştırıldığında, kemiğin metabolik aktivitesini gösteren kemik BGO değeri istatistiksel
olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p=0.032). Işınlanmayan sol femur için ise tüm gruplar karşılaştırıldığında anlamlılık bulunamamıştır (p=0.074) (Tablo 3).
Tablo 3. Grupların sintigrafik değerlerinin ortalaması
Serum fizyolojik ve yalnız RT uygulanan grup karşılaştırıldığında; RT grubunda ışınlanan sağ femur BGO değeri istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p=0.01). Üstelik RT grubundaki ışınlanmayan sol femurların BGO değerleri de SF grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p=0.004).
Amifostin+RT ve RT grupları karşılaştırıldığında; amifostin verilen grupta ışınlanan sağ femur BGO değeri istatistiksel olarak anlamlı düşük bulunmuştur (p=0.004). AMF+RT grubu ile SF karşılaştırıldığında ise sağ femur BGO’da istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır, yani amifostin RT uygulanmasına rağmen, sağ femurdaki BGO değerini kontrol grubu değerlerine yaklaştırmıştır. AMF+RT ile SF grubunun ışınlanmayan sol femurları karşılaştırıldığında, BGO’da istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. AMF+RT grubundaki ışınlanmayan sol femurların BGO değerleri, yalnız RT grubunun sol femurları ile karşılaştırıldığında da istatistiksel anlamlı olarak düşük bulunmuştur (p=0.019). Böylece amifostinin yalnız ışınlanan sağ femurlarda değil, ışınlanmadığı halde BGO değerleri yüksek çıkan sol femurlardaki olumsuz etkileri de kontrol seviyelerine çektiği görülmüştür.
BGO
GRUP SOL FEMUR SAĞ FEMUR
SF 3.10+1.10 3.38+1.21 RT 7.73+3.77 19.1+13.09 AMF+RT 4.08+1.84 3.67+2.12 KAR+RT 6.61+9.69 4.67+3.54 AMF 3.51+2.08 3.87+2.88 KAR 6.08+5.71 4.46+5.71
Karnitin+RT ve SF grupları karşılaştırıldığında sağ femur BGO’da istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. KAR+RT ve RT grupları karşılaştırıldığında sağ femur BGO, KAR+RT grubunda istatistiksel olarak anlamlı düşük görülmüştür (p=0.01). KAR+RT grubundaki ışınlanmayan sol femurların BGO değerleri, yalnız RT grubunun sol femurları ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak sınırda anlamlılık bulunmuştur (p=0.056). Karnitinin de kemik metabolizmasını koruduğu böylece gösterilmiştir. AMF+RT grubu ile KAR+RT grubu karşılaştırıldığında sağ femur BGO’da istatistiksel olarak anlamlı farklılık izlenmemiştir. Sonuç olarak, hem amifostin hem de karnitinin kemik metabolizmasını koruduğu ve bu etkinin iki ilaç arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermediği belirlenmiştir.
Tüm grupların BGO değerleri Tablo 4’de gösterilmiştir. RT uygulanmayan AMF grubunun her iki femurdaki BGO değerleri SF ile benzer kalırken, yalnız KAR grubunun da her iki femurdaki BGO değerleri SF ile benzer kalmıştır. KAR grubunun ışınlanan sağ femur BGO değeri RT grubundan istatistiksel olarak anlamlı düşük kalırken (p=0.045), sol femur BGO değerlerinde, anlamlı fark bulunmamıştır. KAR ile KAR+RT grupları karşılaştırıldığında, hem ışınlanan sağ femur hem de ışınlanmayan sol femur BGO değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark belirlenmemiştir.
Tüm ratların böbrek fonksiyonları normal sınırlarda bulunmuştur.
Tablo 4. Tüm ratların sintigrafik değerleri
GRUP RAT NO SOL FEMUR SAĞ FEMUR
SF 1 3.52 3.14 2 2.95 4.94 3 4.74 2.31 4 2.24 4.96 5 4.90 2.16 6 2.35 4.85 7 2.69 3.26 8 1.63 2.58 9 2.91 2.25 SF: Serum fizyolojik.
Tablo 4 (devam). Tüm ratların sintigrafik değerleri
GRUP RAT NO SOL FEMUR SAĞ FEMUR
RT 2 7.14 28.77 3 4.52 27.27 8 14.27 30.04 9 6.38 4.86 10 6.38 4.86 AMF+RT 1 3.93 3.7 2 7.81 8.57 3 5.46 3.72 4 6.49 1.55 5 1.71 2.49 6 4.02 2.52 7 4.15 4.13 9 1.84 2.25 11 4.21 7.19 12 2.21 3.45 13 4.29 2.15 15 2.91 2.42 KAR+RT 1 8.63 6.5 2 4.84 16.17 4 5.55 5.06 5 2.41 2.48 6 2.59 2.10 7 2.84 4.81 8 1.93 3.44 9 5.27 4.70 10 39.64 2.47 11 5.53 2.57 12 2.55 4.24 13 2.16 3.24 14 5.42 4.96 15 3.24 2.76
Tablo 4 (devam). Tüm ratların sintigrafik değerleri
GRUP RAT NO SOL FEMUR SAĞ FEMUR
AMF 1 2.34 1.92 2 8.76 11.17 3 2.84 3.69 4 2.41 2.69 5 3.79 3.72 6 3.12 4.68 7 2.44 2.69 8 1.91 2.41 10 4.00 1.86 KAR 1 3.45 3.76 3 2.79 5.66 4 5.44 3.99 5 19.2 7.74 6 4.46 4.57 7 8.67 5.46 8 1.75 1.68 10 2.90 2.87
AMF: Amifostin; KAR: Karnitin.
DEXA Sonuçları
Altıncı ayda yapılan kemik dansitometresinin sonuçları tüm gruplar için karşılaştırıldığında, sağ femur ve tüm vücut BMD değerleri istatistiksel olarak anlamlı düşük bulunmuştur (Tablo 5). Lokal RT tüm vücut BMD değerinde de değişiklik oluşturmuştur.
Tablo 5. Tüm gruplar içinde dansitometre değerlerinin anlamlılığı
TÜM GRUPLARDA P değeri
TÜM VÜCUT BMD 0,017
SOL FEMUR BMD 0,138
