T.C. PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
ANATOMİ ANABİLİM DALI
SIÇANLARDA STREPTOZOTOSİN İLE
OLUŞTURULAN DENEYSEL DİYABETİN
UZAYSAL ÖĞRENME VE HIPPOCAMPUS NÖRON
SAYISINA ETKİSİ
UZMANLIK TEZİ
DR. GÖKŞİN NİLÜFER YONGUÇ
TEZ DANIŞMANI
DOÇ.DR. MEHMET BÜLENT ÖZDEMİR
DENİZLİ-2009
T.C. PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
ANATOMİ ANABİLİM DALI
SIÇANLARDA STREPTOZOTOSİN İLE
OLUŞTURULAN DENEYSEL DİYABETİN
UZAYSAL ÖĞRENME VE HIPPOCAMPUS NÖRON
SAYISINA ETKİSİ
UZMANLIK TEZİ
DR. GÖKŞİN NİLÜFER YONGUÇ
TEZ DANIŞMANI
DOÇ.DR. MEHMET BÜLENT ÖZDEMİR
DENİZLİ-2009
TEŞEKKÜR
Başta tez danışmanım Sayın Doç.Dr. Mehmet Bülent Özdemir olmak üzere eğitimime sonsuz katkıları bulunan Anatomi Anabilim Dalı Başkanı Sayın Doç.Dr. Esat Adıgüzel’e ve Anatomi Anabilim Dalı öğretim üyesi Sayın Doç.Dr. Ilgaz Akdoğan’a; tez çalışmam boyunca yardımlarını esirgemeyen Yrd.Doç.Dr. Melike Şahiner’e; Fizyoloji Anabilimdalı doktora öğrencisi Raziye Kurşunluoğlu’na; Nöroloji Uzmanı Dr. Çağdaş Erdoğan’a, Deneysel Araştırma Biriminde görevli Veteriner Hekimi Barbaros Şahin’e teşekkürlerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER
Sayfa no
GİRİŞ VE AMAÇ
1
GENEL BİLGİLER
3
ÖĞRENME VE BELLEK TANIMI, SINIFLANDIRILMASI
3
Eksplisit bellek
4
Eksplisit belleğin depolanması
6
Eksplisit belleğin süreçleri
6
Eksplisit belleğin zamansal parametrelere göre sınıflandırılması
7
Limbik sistem
8
FORMATIO HIPPOCAMPALIS9
Gyrus dentatus10
Subikuler kompleks10
Entorhinal korteks10
Hippocampus11
Hippocampus’un histolojisi12
Hippocampus’un embriyolojik gelişimi
13
HIPPOCAMPUS VE EKSPLİSİT BELLEK
13
HIPPOCAMPUS’UN UZAYSAL ÖĞRENMEDEKİ ROLÜ
18
DIABETES MELLITUS
19
YÜKSEK GLUKOZUN İNDÜKLEDİĞİ OKSİDATİF VE
NİTROSATİF STRES
22
APOPİTOZİS VE YÜKSEK GLUKOZUN YOL AÇTIĞI HÜCRE
HASARI İLE İLİŞKİSİ
24
DİYABET OLUŞTURULMASINDA KULLANILAN HAYVAN
MODELLERİ
27
STREPTOZOTOSİN İLE OLUŞTURULAN DİYABET
28
STEREOLOJİ
32
OPTİK PARÇALAMA YÖNTEMİNİN PRENSİPLERİ
33
GEREÇ VE YÖNTEM
38
DENEY HAYVANLARI
38
SIÇANLARDA STREPTOZOTOSİN İLE DENEYSEL DİYABET
OLUŞTURULMASI
38
SU TANKI TESTİ PROTOKOLÜ
39
BEYİN KESİTLERİNİN ALINMASI VE HAZIRLANMASI
42
OPTİK PARÇALAMA YÖNTEMİNE GÖRE HÜCRE SAYIMI44
İSTATİSTİKSEL YÖNTEMLER
50
BULGULAR
51
SIÇANLARDA DİYABET BULGULARI
51
SU TANKI TESTİ BULGULARI
55
SAĞ HIPPOCAMPUS CA1 VE CA2-CA3 ALANLARI STRATUM
PYRAMIDALE TABAKASINDA NÖRON SAYIM BULGULARI
64
TARTIŞMA
81
SONUÇLAR
94
ÖZET
95
YABANCI DİL ÖZETİ
97
TABLOLAR ÇİZELGESİ
Sayfa no Tablo 1 Deneysel diyabet oluşturulmasında kullanılan hayvan
modelleri
30
Tablo 2 Deney grupları
39
Tablo 3 Su tankı testi protokolünün tablosu
41
Tablo 4 D grubu-1 numaralı sıçanın sağ hippocampus CA2-CA3stratum pyramidale alanındaki toplam nöron sayısının bulunması sırasında gözlenen Hata Katsayısı hesaplanması
49
Tablo 5 Sıçanların ağırlıkları, kan glukoz düzeyleri ve diyabet semptomları
53
Tablo 6 K, S ve D gruplarının su tankı testinin 1-5. günlerindeki EL değerleri
56
Tablo 7 K, S ve D gruplarının su tankı testinin 1-5. günlerindeki PL değerleri
58
Tablo 8 K, S ve D gruplarının su tankı testinin 1-5. günlerdeki V değerleri
60
Tablo 9 K, S ve D gruplarının EL, PL ve V verilerinin gruplar arasındaki farklılığının değerlendirilmesindeki p değerleri
61
Tablo 10 K, S ve D gruplarının EL ve PL verilerinin ikili karşılaştırmalardaki p değerleri
61
Tablo 11 Su tankı testinin PT uygulamasının verileri
62
Tablo 12 PT uygulamasında GDEL, GDPL, GD frekans ve PLTfrekans verilerinin K, S ve D grupları arasındaki farklılığının değerlendirilmesindeki p değerleri.
64
Tablo 13 K grubu sıçanların sağ hippocampus CA1 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ve toplam nöron sayısı hesaplanmasında kullanılan parametreler
65
Tablo 14 S grubu sıçanların sağ hippocampus CA1 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ve toplam nöron sayısı hesaplanmasında kullanılan parametreler
Tablo 15 D grubu sıçanların sağ hippocampus CA1 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ve toplam nöron sayısı hesaplanmasında kullanılan parametreler
67
Tablo 16 K grubu sıçanların sağ hippocampus CA2-CA3 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ve toplam nöron sayısı hesaplanmasında kullanılan parametreler
68
Tablo 17 S grubu sıçanların sağ hippocampus CA2-CA3 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ve toplam nöron sayısı hesaplanmasında kullanılan parametreler
69
Tablo 18 D grubu sıçanların sağ hippocampus CA2-CA3 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ve toplam nöron sayısı hesaplanmasında kullanılan parametreler
70
Tablo 19: K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA1 alanları stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ortalamaları
71
Tablo 20 K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA2-CA3 alanı stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ortalamaları
73
Tablo 21 K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA1-CA2-CA3 alanları stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayıları ortalamaları
74
Tablo 22 K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA1, CA2-CA3 ve CA1-CA2-CA3 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayılarının, gruplar arasındaki farklılığının değerlendirmesindeki p değerleri
75
Tablo 23 K, S ve D gruplarının, sağ hippocampus CA1, CA2-CA3 ve CA1-CA2-CA3 alanlarının stratum pyramidale tabakalarındaki toplam nöron sayılarının ikili karşılaştırmalardaki p değerleri
ŞEKİLLER ÇİZELGESİ
Sayfa no Şekil 1 Uzun süreli belleğin sınıflandırılması ve ilgili beyin bölümleri
4
Şekil 2 Belleğin depolanmasında görevli olan medial temporal lobyapıları
5
Şekil 3 Formatio Hippocampalis’in organizasyonu
5
Şekil 4 Limbik sistem
9
Şekil 5 İki sinir hücresi arasındaki normal sinaptik geçiş
15
Şekil 6 Sinaptik plastisitenin bir formu olan hipokampal Long TermPotentiation oluşumu
16
Şekil 7 Sinaptik plastisitenin bir formu olan hipokampal Long Term Potentiation’un erken ve geç fazlarının sinaptik modeli
17
Şekil 8 Yüksek glukozun indüklediği oksidatif ve nitrosatif stresin olası yolaklarını gösteren şematik diyagram
23
Şekil 9 Yüksek glukozun indüklediği apopitozis mekanizması
27
Şekil 10 Tarafsız sayım çerçevesinin şematize edilmiş görünümü36
Şekil 11 Öğrenme testinde kullanılan su tankının özellikleri40
Şekil 12 Deney planı
42
Şekil 13 Çalışmada kullanılan tarafsız sayım çerçevesi ve ölçüleri
50
Şekil 14 K, S ve D gruplarının başlangıç ağırlıklarının (0.gün) ve 7.hafta sonundaki ağırlıklarının ortalamalarının grafiği
54
Şekil 15 K, S ve D gruplarının 0. gün, diyabet oluşturulmasından sonraki 3. gün ve 10. gün ölçülen kan glukoz düzeylerinin ortalamalarının grafiği
54
Şekil 16 K, S ve D gruplarının su tankı testinin 1-5. günlerindeki EL değerlerinin grafiği
56
Şekil 17 K, S ve D gruplarının su tankı testinin 1-5. günlerindeki PL değerlerinin grafiği
58
Şekil 18 K, S ve D gruplarının su tankı testinin 1-5. günlerindeki V değerlerinin grafiği
Şekil 19 K, S ve D gruplarının PT uygulamasının GDEL verileri
63
Şekil 20 K, S ve D gruplarının PT uygulamasının GDPL verileri63
Şekil 21 K, S ve D gruplarının PT uygulamasının GD frekans verileri63
Şekil 22 K, S ve D gruplarının PT uygulamasının PLT frekans verileri64
Şekil 23 K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA1 alanları stratumpyramidale tabakalarının ortalama nöron sayıları
72
Şekil 24 K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA2-CA3 alanları stratum pyramidale tabakalarının ortalama nöron sayıları
73
Şekil 25 K, S ve D gruplarının sağ hippocampus CA1-CA2-CA3 alanlarının ortalama nöron sayıları
74
Şekil 26 K, S ve D gruplarından rasgele seçilen birer sıçanın su tankı testinde 1-5. günlerindeki deneme bloklarında ve 6. gündeki PT uygulamasındaki şematik görünümleri
76
Şekil 27 6. gün yapılan bir PT uygulamasının görüntüleri
77
Şekil 28 Uzaysal öğrenmenin görüldüğü bir denemenin görüntüleri78
Şekil 29 Hippocampus kesitinde CA1, CA2 ve CA3 alanlarınıngörünümü
79
Şekil 30 Hippocampus kesitinde CA1, CA2-CA3 geçişinin görünümü
79
Şekil 31 K, S ve D grubundaki sıçanların sağ hippocampus kesitlerininCA1 ve CA2-CA3 alanların x4, x10, x40, x100 objektif büyütmelerindeki görüntüleri
KISALTMALAR ÇİZELGESİ
AGEs Advanced glycation end products Akt proteine-serine/threonine kinase AMP Adenozin 5’-monofosfat
AMPA α-amino-3-hidroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid AÖO Alan örnekleme oranı
ASC Associated speck-like protein
ASK1 Apopitosis signal regulating kinase-1 ATP Adenozin trifosfat
B Batı
BDNF Beyin kaynaklı nörotrofik faktör
BH Bcl-2 homolog
CA Cornu ammonis
Camp Siklik adenozin 5’-monofosfat Camp kinaz Camp bağımlı protein kinaz
CO2 Karbon dioksid
CO3⎯ Karbonat
D grubu Diyabet grubu
D Doğu
DM Diabetes Mellitus
DNA Deoksiribonükleik asid
EL Escape latency; deneğin platforma ulaşması için geçen zaman ERK Extracellular signal-regulated kinase
IAPs Apoptozis proteinlerinin inhibitörleri IDDM Insulin Dependent Diabetes Mellitus
G Güney
GB Güney batı
GAPDH Glyceraldehyde phosphate dehidrogenase
GD Güney doğu
GDEL Güney doğu escape latency GD frekans Güney doğu frekans
GDPL Güney doğu path length GK sıçanlar Goto Kakizaki sıçanlar
gr Gram GTP Guanozin trifosfat h Disektör yüksekliği H&E Hematoxylin-Eosin HK Hata katsayısı H2O2 Hidrojen peroksid
IGF-I Insulin-like growth factor-I
ip Intraperitoneal
iv Intravenöz
JNK c-Jun-NH2–terminal kinaz
K grubu Kontrol grubu
KB Kuzey batı
KD Kuzey doğu
KaÖO Kalınlık örnekleme oranı KeÖO Kesit örnekleme oranı KGD Kan glukoz düzeyleri
LTD Long Term Depression
LTP Long Term Potentiation
m Metre
µm Mikrometre
MDA Malondialdehid
MAPK Mitojenler tarafından aktive edilen protein kinazlar N(toplam) Toplam nöron sayısı
NADH Nikotinamid adenin dinükleotid NADPH Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat NIDDM Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus NMDA N-methyl-D-aspartate
NO Nitrik oksit
NOS Nitrik oksit sentaz NO2⎯ Nitrojen dioksit
OGTT Oral glukoz tolerans testi
OLETF Otsuka Long-Evans Tolushima Fatty ONOO⎯ Peroksinitrit
ONOCOO⎯ Nitroperoksikarbonat
ORT Ortalama
PKC Protein kinaz C
PL Path length; deneğin platforma ulaşmak için kullandığı yol uzunluğu
PARP Poly(ADP)-ribose polymerase PI-3-kinase Phosphatidylinositide 3-kinase
PKC Protein kinaz C
PLT Platform frekans
PT Probe trial
Q⎯ Disektör partikül sayısı
∑Q⎯ Toplam disektör partikül sayısı
RNA Ribonükleik asid
S grubu Sham grubu
SD Standart sapma
SH Standart hata
sn Saniye
SOR Serbest oksijen radikalleri tort Ortalama kesit kalınlığı
tPA Doku plazminojen aktivatörü V Velocity; deneğin hızı
GİRİŞ VE AMAÇ
Diabetes Mellitus (DM) yüksek kan şekeri veya hiperglisemi ile karakterize bir grup metabolik bozuklukları kapsayan sistemik bir hastalıktır. Genel olarak günümüzde tip 1 DM ve tip 2 DM olarak iki alt sınıfa ayrılmıştır. Bundan başka diğer spesifik DM tipleri bu sınıflamaya eklenebilir.
Dünya Sağlık Örgütü’nün 2000 yılı verilerine göre, dünya genelinde en az yüz yetmiş bir milyon DM hastası bulunmaktadır. DM insidansı hızla artmakta ve bu rakamın 2030 yılında iki katına ulaşacağı tahmin edilmektedir (1). 1997 yılında yapılan araştırma sonuçlarına göre Türkiye’de yaklaşık üç milyon altı yüz bin DM hastası bulunduğu, fakat bunların 1 milyon 200 bininin teşhisinin henüz yapılmadığı bildirilmektedir (2).
Dünya nüfüsunun önemli bir bölümünü etkileyen bu sistemik hastalık, özellikle meydana getirdiği yaygın komplikasyonlar nedeni ile hastaların yaşamını olumsuz etkilemektedir. Nöropati, nefropati, retinopati diyabetin iyi bilinen komplikasyonlarıdır. Son yıllarda diyabetin santral sinir sisteminde yol açtığı nörolojik komplikasyonlar üzerine çalışmalar artmıştır. DM’ un, demans için bir risk faktörü oluşturduğu, hippocampal sinaptik plastisiteyi etkilediği, öğrenme ve hafızada yetersizliklere yol açtığı bilimsel çalışmalarla gösterilmiştir (3-8).
Hippocampus’un öğrenme ve bellek oluşumunda rol aldığı bilinmektedir. İnsanlarda ve hayvanlarda hippocampus lezyonları, bilgilerin kısa süreli bellekten uzun süreli belleğe aktarılmasında çeşitli sorunlara yol açar ve böylece yeni bilgilerin depolanması engellenmiş olur (9).
DM’un hippocampus, öğrenme ve belleğe etkileri ile ilgili deneysel çalışmalar yayınlamış olmasına rağmen hippocampus pyramidal nöron sayısı üzerine etkisi ve nöron sayısının öğrenme ile olan ilişkisine dair henüz bir çalışma yayınlanmamıştır.
Bu çalışma, deneysel olarak diyabet oluşturulmuş sıçanlarda su tankı testi ile uzaysal öğrenme-belleği değerlendirmek ve hippocampus pyramidal nöron sayısındaki değişiklikleri stereolojik yöntemlerden Optik Parçalama Yöntemi ile ortaya koymak üzere planlanmıştır.
GENEL BİLGİLER
ÖĞRENME VE BELLEK TANIMI, SINIFLANDIRILMASI
Canlı davranışı genler ve çevre arasındaki etkileşimin bir sonucudur. Canlılarda çevre, öğrenme ve bellek mekanizmalarını etkileyerek davranışı değiştirebilir. Öğrenme, çevre hakkında bilgi edinmeye verilen isim iken; bellek bu bilginin kayıt edildiği, saklandığı ve geri çağrıldığı bir mekanizmadır. Canlılarda yaşamsal olan pek çok davranış öğrenilmiş davranışlardır.
Epileptik nöbetlerin tedavisi için yapılan cerrahi operasyonlarda, formatio hippocampalis, amygdala ve temporal korteksin multimodal asosiasyon alanları bilateral olarak çıkartıldıktan sonra hastaların nöbetlerinin sıklığının azaldığı ve ilaçla kontrolü sağlandığı, fakat hastaların yeni kalıcı bellek parçaları oluşturma yeteneğini kaybettiği saptanmıştır. Bu tür hastaların şartlanma, alışkanlık ya da sensitizasyon gibi öğrenmenin refleksif olarak gerçekleştirildiği durumlarda bilgiyi edinebildikleri ve saklayabildikleri gösterilmiştir (10,11). Yine cerrahi veya hastalık nedeniyle limbik assosiasyon alanlarında şiddetli hasarları olan hastalar da benzer bellek defektlerini göstermektedirler.
Bu verilere dayanarak iki tip belleğin olduğu ileri sürülmüştür (Şekil 1). Bunlardan birisi implisit (nondekleratif, örtük, ifade edilemeyen) bellektir. Refleksif motor ve algısal becerileri içerir. Bilinçsiz olarak geri çağırılabilir. Diğer bellek tipi ise eksplisit (dekleratif, açık, ifade edilebilir) bellektir. İmplisit bellek rijittir ve bilginin kazanıldığı orjinal uyarımın varlığı geri çağırma için gereklidir. Eksplisit bellek oldukça esnektir ve pek çok parçanın assosiyasyonunu gerektirir (10,11).
Eksplisit bellek
Eksplisit bellek episodik (olaylar ve kişisel tecrübelerle ilgili bellek) ve semantik (gerçekler ile ilgili bellek) bellek olarak sınıflandırılabilir. Bununla birlikte iki tip eksplisit bellek te bilinçli olarak ve açık bir şekilde ifade edilebilir.Örneğin; ‘geçen yaz anneannemi yazlık evinde ziyaret ettim’ (episodik bellek) veya ‘metal sudan daha ağırdır’ (semantik bellek).
Uzun Süreli Bellek
Eksplisit bellek
(declarative, açık bellek)
İmplisit bellek (nondeclarative, örtük bellek) Semantik bellek (gerçekler) ( Episodik bellek (olaylar) Hazırlama
(priming) Prosedürel (yetenekler, huy ve gelenekler) Assosiyatif öğrenme; basit ve klasik koşullanma Nonassosiyatif öğrenme, alışkanlık ve sensitizasyon Hippocampus-
Medial temporal lob Neokorteks Striatum
Emosyonel cevaplar Refleks yollar İskeletsel, kassal cevaplar Amigdala Cerebellum
Şekil 1: Uzun süreli belleğin sınıflandırılması ve ilgili beyin bölümleri (11)
Eksplisit bellek görsel, işitsel ve somatik bilgilerin sentez edildiği pek çok assosiasyon korteksinin (prefrontal, limbik ve parieto-occipital-temporal korteksler) bir veya daha fazlasında işleyen süreçler ile kazanılır. Bilgi buralardan parahipokampal ve perirhinal kortekslere ve sonra entorhinal kortekse, gyrus dentatus’a, hippocampus’a, subiculum’a ve tekrar entorhinal kortekse aktarılır. Bilgi
entorhinal korteksten tekrar parahipokampal ve perirhinal kortekslere ve son olarak neokorteksin assosiasyon alanlarına döner (Şekil 2 ve Şekil 3) (11).
Şekil 2: Belleğin depolanmasında görevli olan medial temporal lob yapıları (11. kaynaktan değiştirilmeden alınmıştır)
Parahipokampal korteks Hippocampus-CA1 Subiculum Hippocampus-CA3 Entorhinal korteks Perforant yolak Perirhinal korteks Assosiasyon alanları (frontal, temporal ve parietal korteks) Gyrus dentatus Yosunsu lifler yolağı Schaffer kollateral yolağı
Eksplisit belleğin depolanması
Episodik ve semantik belleğin uzun süreli depolanması, başlangıçta duyusal bilginin işleme tutulduğu korteksin bir veya daha fazla assosiasyon alanlarında meydana gelir. Hippocampus uzun süreli bellek için geçici bir istasyondur. Yüzü görülen bir insanla ilgili bilgilerin depolanmasını sağlayan görsel assosiasyon alanındaki yüzler ile ilgili olan hücreler diğer alanlarla bağlantılar yaparlar. Böylece hippocampus aynı zamanda bir kişi hakkında geniş olarak işlenmiş belleğin çeşitli komponentlerini de bir arada tutmaya yarar.
Hippocampus uzun süreli belleğin ilk basamağıdır da denilebilir. Daha sonra bilgiyi neokorteks’in depolama sistemlerine transfer eder. Assosiasyon alanlarında lezyonu olan hastalar yüzleri, yerleri, nesneleri tanımada güçlük çekerler. Farklı assosiasyon alanlarında lezyonları olan hastalar hem semantic hem de episodic bellekte spesifik bozulmalar gösterirler (11).
Eksplisit
belleğin süreçleri
Eksplisit bellek birbiriyle ilişkili fakat birbirinden ayrı dört sürecin sonucu meydana gelir; kodlama, pekiştirme, depolama, geri çağırma.
1) Kodlama; Yeni edinilen bilginin farkına varıldığı (duyu organları aracılığı ile algılanması) ve işlendiği bir süreçtir. Kodlamanın süresi ve doğası yeni öğrenilen bilginin daha sonra ne kadar iyi hatırlanabileceğini belirler. Belleğin kalıcı olması ve iyi hatırlanılabilmesi için bilgi düzgün olarak kodlanmalıdır. Bunu gerçekleştirebilmek için bilgiye dikkatin verilmesi, daha önceden edinilmiş bellek ile sistematik ve anlamlı olarak ilişkilendirilmesi gerekir.
2) Pekiştirme; Yeni edinilmiş ve hala labil olan bilginin uzun süreli saklanması için daha stabil hale gelmesine neden olan bir süreçtir. Belleği uzun süre saklamak için gen ekspresyonunu, yeni proteinlerin sentezini içeren yapısal değişikliklerin meydana geldiği bir süreçtir (11).
Kısa süre önce edinilmiş bilgi, assosiasyon korteksi’nde kodlanır ve anlamlılık açısından değerlendirildiği daha ileri assosiasyonlara maruz bırakıldığı, daha önce oluşmuş bilgi ile entegre edildiği ve pekiştirilmesine yol açacak uyarılarla işlendiği limbik sisteme aktarılır (10).
3) Depolama; Belleğin uzun süre bekletildiği mekanizmaları ve yerleri içeren bir süreçtir. Uzun süreli belleğin önemli bir özelliği sınırsız bir kapasiteye sahip olmasıdır. Buna karşın kısa süreli belleğin kapasitesi çok sınırlıdır (11). Bilgi assosiasyon korteksi boyunca depolanır. Limbik sistemin bileşenleri (hippocampus ve entorhinal korteks gibi ) depolama ve belki de geri çağırma sırasında bu bilgiyi birleştirme (bağlama) için gereklidir. Sol hemisferin temel olarak sözel ve genel bilgiyi (semantik bellek), sağ hemisferin ise temel olarak sözel olmayan veya otobiyografik bilgiyi (episodik bellek) depolaması şeklinde bir hemisferik asimetrinin bulunduğundan söz edilmektedir (10).
4) Geri çağırma; Depolanmış bilginin geri çağırılmasına ve kullanılmasını sağlayan bir süreçtir. Geri çağırma farklı yerlerde depolanmış birbirinden farklı tür bilgileri bir araya getirebilmeyi içerir.
Bilgi en etkin olarak edinildiği ortam ile aynı ortamda ve aynı işaretlerin varlığında geri çağırılabilir. Bilgi depolandıktan sonra geri çağırılan bilgi orijinal olarak saklanmış bilginin tam bir kopyası değildir. Geçmiş tecrübeler beyinin geçmişteki durumu tekrar oluşturabilmesi için kullanılır (11).
Bilginin geri çağırılmasının prefrontal ve temporal korteksin anterior bölümlerinden kaynaklanan bazı tetikleyici mekanizmalara bağlı olduğu düşünülmektedir (10).
Eksplisit belleğin zamansal parametrelere göre sınıflandırılması
Hering ve Ebbighaus kısa süreli bellek ve uzun süreli belleği birbirinden ayırmıştır. Atkinson ve Shiffrin’in daha ileri bölümlemesi ise şöyledir:
1. Çok kısa süreli bellek (ikonik bellek) 2. Kısa süreli bellek (çalışma belleği)
Çok kısa süreli bellek, milisaniyeleri kapsayan bir süreçtir (örn; retinanın koni ve çubuklarında bir fotopigmentin kaybolması).
Kısa süreli bellek (çalışma belleği) özellikle Bradley’in ‘çalışma belleği’ kavramını ortaya atmasından sonra, bilim dünyasının daha fazla ilgisini çekmiştir. Çalışma belleği bilginin aktif biçimde çevrim içi tutulması ve manüplasyonuna karşılık gelir ve depolanmış bilginin geri çağrım için hazırlanmasını da içerir. Bilgi birçok kortikal alana dağılmıştır. Ancak bilgiyi güncel tutan yapıların daha çok pariyetal ve dorsolateral prefrontal korteks’te yer aldığı düşünülmektedir.
Uzun süreli bellek ise bilginin dakikalar ile on yıllar arasındaki süreyi kapsayacak şekilde çevrim dışı tutulmasına karşılık gelir (10).
Limbik sistem
Öğrenme ve bellek limbik sistem de dahil olmak üzere santral sinir sisteminin pek çok bölgesini ilgilendirilen kompleks yapılardır. Limbik sistem ilk olarak 1937 yılında Papez tarfından tanımlanmıştır ve Papez Döngüsü olarak adlandırılmıştır (12). Papez tarif ettiği döngünün daha çok emosyonların analizinde rol aldığını düşünüyordu. Daha sonra yapılan arştırmalar bu yapının bilginin uzun süreli belleğe aktarılmasında önemli rol oynadığını göstermiştir (10). Bu döngüye göre, bilgi cingulum aracılığı ile gyrus cinguli’den formatio hippocampalis’e buradan forniks aracılığı ile corpus mamillare’ye (hypothalamus’un bir bölümü), corpus mamillare’den tractus mamillothalamicus araclığı ile nuclei anteriores thalami’ye, nuclei anteriores thalami’den gyrus cinguli’ye, gyrus cinguli’den cingulum aracılığı ile tekrar formatio hippocampalis’e aktarılır (13).
Limbik sistem konsepti daha sonra Paul Mac Lean tarafından hypothalamus’un bölümlerini, area septalis’i, nucleus accumbens’i (striatum’un bir parçası) ve orbitofrontal korteks gibi neokortikal alanları ve özellikle amygdala’yı da içerecek şekilde daha da genişletilmiştir (Şekil 4) (13).
Limbik sistemde özellikle de Papez Dögüsü’nde yer alan yapıların iki taraflı olarak hasarı ağır bellek bozukluğu ile sonuçlanır (10).
Assosiasyon korteksi Prefrontal korteks Gyrus cinguli Nuclei anteriores thalami Corpus mamillare Hypothalamus Formatio hippocampalis Amygdala
Şekil 4: Limbik sistem (13)
Papez tarafından tanımlanan döngü kalın oklarla gösterilmiş, ince oklar ise daha sonra tanımlanan bağlantıları göstermektedir. Amygdala’yı limbik yapılara bağlayan yolak gösterilmiştir. Formatio hippocampalis ve assosiasyon korteksi arasındaki karşılıklı bağlantılar gösterilmektedir (13).
FORMATIO HIPPOCAMPALIS
Formatio hippocampalis hippocampus, gyrus dentatus, subiculer complex (subiculum, presubiculum ve parasubiculum) ve entorhinal korteks’ten oluşur (14).
Gyrus dentatus
Formatio Hippocampalis’i oluşturan yapılarından birisi olan gyrus detatus insanda alt tarafında subiculum, üst tarfında ise medialde fimbria ve fornix ile daha lateralde ise hippocampus ile ilişkilidir. Dıştan içe doğru polimorfik tabaka, granüler hücre tabakası ve moleküler tabaka’dan oluşan üç tabakalı bir korteks yapısıdır. Esas hücre tipi granüler hücrelerdir ve gyrus dentatus’un afferent projeksiyonunun büyük bir bölümünü alırlar (temel olarak entorhinal korteks’ten) ve unipolar dendritleri moleküler tabakaya kadar uzanır (14).
Gyrus dentatus’un hilus’u atnalı şeklindeki granüler hücre tabakasının kolları arasında uzanan geniş ve dağınık şekilde yayılmış polimorfik hücrelerden oluşan hilal biçimli alandır. Hilus, Lorente de No tarafından tanımlanan hippocampus CA4 alanına uyar (15,16).
Subikuler kompleks
Subiculer kompleks’in subiculum, presubiculum ve parasubiculum olmak üzere üç bölümü vardır (13). Subiculum’un bir ucu hippocampus ile komşudur (17). Diğer ucu ise presubiculum ile devamlıdır. Subiculum komşu hippocampus bölümü (CA1) ile hemen hemen aynı boyutta pyramidal hücreler içerir. Bu hücreler dağınık olarak bulunurlar bu nedenle CA1’dekilere göre yoğunlukları daha az olacak şekilde paketlenmişlerdir (15). CA1/subiculum sınırı temel olarak pyramidal hücre tabakasının birden genişlemesi ile ayırt edilir (17).
Entorhinal korteks
Entorhinal korteks (Broadman’ın 28. alanı) rostralde amygdala’nın ön sınırına kadar uzanır. Kaudalde hippocampal alanların bir kısmı ile örtüşür. Entorhinal korteks’in daha primitif düzeyleri (amygdala’ nın alt kısımı) bulbus olfactorius’tan afferent lifler alırken daha kaudaldeki alanları genel olarak primer olfaktor impulslar almaz. Amygdala’dan, prepriform korteks’ten, temporal ve frontal lobun assosiasyon
alanlarından afferent lifler alır. Altı tabakalıdır fakat diğer neokortikal alanlardan tamamen farklıdır (14, 18).
Hippocampus
Hippocampus subiculum ve gyrus parahippocampalis’in medialinde, ventriculus lateralis’in cornu inferius’u boyunca kıvrılmış bir kabarıklık oluşturacak şekilde uzanır. Deniz atına benzemesi nedeniyle hippocampus (deniz atı) denilmiştir (14). Hippocampus koç boynuzuna benzediği için cornu ammonis (CA)’de denilmektedir (18).
Hippocampus insanda yaklaşık beş santimetre uzunluğundadır. Ön ucu geniştir ve burada kenarında bir veya üç yüzeysel oluk bulunabilir. Bu oluklar pençe benzeri görünüme neden olduğu için ön ucuna pes hippocampi denilir. Hippocampus’un kesiti C harfi şeklindedir. Ventrikül boşluğuna bakan yüzü konvekstir ve ependim hücreleri ile kaplıdır. Altında hippocampus’da bulunan sinir hücrelerinin aksonları alveus’u oluşturur. Bu lifler hippocampus’un medial kenarına doğru uzanarak, bir kenar şeklinde olan fimbria hippocampi’yi oluştururlar. Gyrus dentatus ve hippocampus arasında bulunan fimbria hippocampi arkada crus fornicis olarak uzanır (14, 19)
Hippocampus’un yoğun olarak paketlenmiş ince pyramidal hücre tabakası belirgin olarak iki alana ayrılabilir; geniş hücreli proksimal alan ve küçük hücreli distal alan. Cajal bu iki alanı sırasıyla regio superior (üst bölge) ve regio inferior (alt bölge) olarak tanımlamıştır. En sık kullanılan ve kabul gören ise Lorento de No’nun hippocampus’u üç alana ayırarak (CA1, CA2 ve CA3) yaptığı isimlendirmedir. Bu isimlendirmeye göre hippocampus’un CA3 ve CA2 alanı Cajal’ın geniş hücreli regio inferior’unun karşılğı iken; CA1 alanı küçük hücreli regio superior’unun karşılığıdır (15,17).
CA3, gyrus dentatus’un hilus’una komşudur. CA1, subiculum ile komşudur. CA2, Lorento de No’ nun tanımladığı gibi CA3 ve CA1 arasında bulunan sınırlı bir hücresel alandır. CA1 ile CA2-CA3 arasındaki sınır hücre organizasyondaki ve
boyutundaki keskin değişim ile tanımlanır (14-16). CA2 alanı genellikle CA3’e ait olarak kabul edilmektedir çünkü klasik boyama yöntemleri ile boyanmış kesitlerde bu iki alan arasındaki sınır belirgin değildir (20).
Hippocampus’un histolojisi
Hippocampus üç tabakalı bir archicortex yapısıdır. Bir pyramidal hücre tabakası ile bu tabakanın üstünde ve altındaki pleksiform tabakalardan oluşur (14).
Hippocampus’un tabakaları içinde laminer bir organizasyon tanımlanmıştır ve bu tanımlama sık olarak kullanılmaktadır (14). Genel olarak hippocampus’un bütün alanlarında laminer organizasyon benzerdir (17). Bu tanımlamaya göre ventriküler yüzeyden başlayarak şu yapılar bulunur (14).
1. Alveus; Subiculer ve hippocampal pyramidal hücre aksonlarını içerir. Bu aksonlar fornix’in fimbria’sı üzerinde bir araya gelirler.
2. Stratum oriens; Temel olarak pyramidal hücrelerin bazal dendritlerini ve birkaç internöron içerir.
3. Stratum pyramidalis; Hippocampus’un temel hücre tipi olan pyramidal hücre tabakası olarak adlandırılır.
4. Stratum lucidum; Gyrus dentatus’tan gelen ve CA3’te bulunan pyramidal hücrelerin proximal dendritleri ile sinaps yapan yosunsu liflerin aksonlarını içerir. CA1 ve CA2’de bulunmaz. Hücresiz bir tabakadır. Stratum lucidum’un distal ucunda yosunsu liflerin temporale doğru kıvrıldığı yerde bir miktar kalınlaşma olur. Bu ‘end bulb’ CA3 ile CA2 arasındaki sınırı belirler
5. Stratum radiatum; CA3’te stratum lucidum’un, CA1 ve CA2’de stratum pyramidale’nin hemen altında bulunur. Stratum radiatum, CA3’teki pyramidal hücreler ile yine CA3’te bulunan pyramidal hücreler arasındaki assosiasyonel bağlantıların ve CA3’teki pyramidal hücreler ile CA1’deki pyramidal hücreler arasındaki bağlantılar olan Schaffer kollateralleri’nin bulunduğu yerdir.
6. Stratum lacunosum moleculare; Bu tabakada entorhinal korteks’ten gelen perforant yolağın lifleri hem ilerler hem de sonlanırlar. Ayrıca diğer bölgelerden (thalamus’un nucleus reuniens’i gibi) gelen afferent lifler de bu tabakada sonlanır (14,17).
Hippocampus’un embriyolojik gelişimi
Limbik lob korteks’in ilk olarak farklılaşan bölümüdür. Başlangıçta hemisferin medial ve inferior’unda hemen hemen sirküler bir bant görünümündedir. Aşağıda ve önde, tractus olfactorius’un sapının bağlandığı yerde piriform alanın bir bölümünü oluşturur. Fissura choroidea’nın kavisinin dış tarafındaki parça formatio hippocampalis’i oluşturur. Bu alana korteksin nöral progenitörleri göç ederler ve prolifere olurlar. Böylece hemisferin duvarı kalınlaşır ve ventrikülün medial tarafına projekte olan bir kabarıklık oluşur. Bu kabarıklığın adı hippocampus’tur. İlk başta hemisferin medial duvarı üzerinde görülür yavaş yavaş geriye doğru gider ve piriform alanla yan yana olduğu polus temporalis bölgesine doğru kıvrılır. Hemisferin medial yüzünde yüzeysel bir oluk formatio hippocampalis’i baştan başa geçer. Bu oluğun adı sulcus hippocampalis’tir.
Hippocampus’taki hücrelerin efferent lifleri medial kenarı boyunca bir araya gelirler ve fissura choroidea’nın hemen üzerinde ileri doğru yönelirler. Bu efferent hipokampal lifler fimbria’yı ve fornix’i oluştururlar. Daha sonra iki hippocampus lamina terminalis’in üst bölümünde fornix’ten fornix’e geçen lifler aracılığıyla birbirleriyle bağlantı kurarlar. Bu lifler commissura hippocampi’yi oluştururlar (21).
HIPPOCAMPUS VE EKSPLİSİT BELLEK
Öğrenmenin hücresel modelleri yeni bellek oluşumları için nöron’larda bazı değişiklikler olduğunu var saymaktadır. Nöron’un uyarılara karşı oluşturduğu cevabını değiştirebilmesine ‘nöronal plastisite’ denir. Başka bir deyişle sinir sisteminin gelişimsel ve çevresel durumlara olduğu kadar diğer faktörlerin de değişmesiyle ortaya çıkan yeni durumlara yapısal organizasyonunu adapte etmesidir. Aynı olayın nöronlar arasındaki sinapslarda meydana gelen formuna ise ‘sinaptik plastisite’ denir.
Medial temporal lob sisteminin önemli bir komponenti olan hippocampus eksplisit bellek oluşumunda görevlidir. Hücresel düzeyde öğrenme ve bellek mekanizmalarının araştırıldığı çalışmalarda sinaptik plastisitenin iki formu olan
hippocampal Long Term Potentiation (LTP) ve Long Term Depression (LTD) çok dikkat çekmektedir (5).
Hippocampus’un 3 ana yolağı vardır;
1. Perforant yolak; Entorhinal korteks’ten gyrus dentatus’un granüler hücrelerine projekte olan lifler tarafından oluşturulur.
2. Yosunsu lifler yolağı; Gyrus dentatus’taki granüler hücrelerin hippocampus’un CA3 alanındaki pyramidal hücrelerine projekte olan aksonlarını içerir.
3. Schaffer kollateral yolağı; Hippocampus’un CA3 alanındaki pyramidal hücrelerinin CA1 alanındaki pyramidal hücrelerinde sonlanan eksitatör kollaterallerini içerir (22).
İlk olarak 1973’te Bliss ve Lomo bu yolaklardan herhangi birisinden kalkan yüksek frekanslı bir stimulusun, hedef hippocampus hücresinin eksitatör postsinaptik potansiyelinde saatlerce hatta günlerce devam eden amplitüd artışına neden olduğunu göstermiştirlerdir. Yani hippocampus’taki yolların yüksek frekanslı uyarılması sinaptik etkinlikte uzun süreli bir artışa neden olur. Sinaptik etkinlikteki bu artışa LTP denir (22, 23). Başka bir deyişle LTP sinaptik yolakların elektriksel stimülasyonuna bağlı olarak sinaptik şiddettin değişmesidir.
Daha sonra LTP’nin çeşitli neokortikal alanlar da dahil olmak üzere beyinin diğer bölgelerinde de oluştuğu gösterilmiştir. Fakat en sık olarak hippocampus’ta çalışılmıştır (23). LTP’nin uzun süre saklanabilen bellek oluşumlarına uygun zamansal özellikler gösteren ilk ve tek sinaptik plastisite örneği olması nedeniyle bellekte rolü olduğu düşünülmektedir.
LTP oluşumunun erken ve geç olmak üzere iki fazı bulunmaktadır;
1. LTP’nin erken fazı; bir ile üç saat arası devam eder. Bu fazda yeni protein sentezi bulunmaz.
2. LTP’nin geç fazı; en az yirmi dört saat sürer. Yeni protein ve RNA sentezi meydana gelir (22).
Normal, düşük frekanslı sinaptik geçiş (bazal aktivite) sırasında presinaptik membrandan salınan glutamat hem N-methyl-D-aspartate (NMDA) hem de α-amino-3-hidroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid (AMPA) reseptörlerine etki eder. İstirahat halindeki membran potansiyelinde NMDA reseptörlerinin kanalları Mg+2 blokajı nedeniyle kapalıdır. Bu durumda AMPA reseptörlerinin kanalları üzerinden hücre içine Na+ ve K+ akışı olur (Şekil 5) (22).
Şekil 5: İki sinir hücresi arasındaki normal sinaptik geçiş (23 nolu kaynaktan değiştirilmeden alınmıştır)
LTP oluşumuna neden olan yüksek frekanslı uyarıya bağlı olarak postsinaptik membran AMPA reseptör kanallarının aktivitesi aracılığı ile depolarize olur ve NMDA reseptör kanalındaki Mg+2 blokajı kalkar. NMDA reseptör kanalından hücre içine Ca+2 akışı gerçekleşir. Postsinaptik uçtaki Ca+2 artışı LTP oluşumuna neden olan Ca+2 bağımlı kinazları (Ca+2/kalmodulin kinaz ve protein kinaz C (PKC)) ve tirozin kinaz Fyn’i aktive eder. Aktive olan Ca+2/kalmodulin kinaz, AMPA reseptör kanallarını fosforile ederek, kanalların glutamat’a olan hassasiyetini arttırır aynı şekilde normal durumda sessiz olan bazı AMPA reseptörlerini de aktive eder. Bu değişiklikler postsinaptik LTP’nin sürdürülmesine katkı sağlarlar.
LTP oluştuktan sonra tam olarak bilinmeyen mekanizmalarla postsinaptik hücreden, presinaptik uçta etki oluşturan bazı geri dönen haberci moleküller salınır. Farmakolojik ve genetik çalışmalar bu geri dönen habercilerden bir tanesinin hücreden hücreye geçebilen bir gaz olan nitrik oksit (NO) olduğunu göstermektedir.
Bu moleküller presinaptik uçta glutamat salınımını arttırırlar ve hala uyarı geliyormuş gibi aynı uyarı için glutamat salgısı devam eder. Yani LTP bir kez oluştuğu takdirde kendi kendini devam ettirmektedir (Şekil 6) (22,23).
Şekil 6: Sinaptik plastisitenin bir formu olan hipokampal Long Term Potentiation oluşumu (23 nolu kaynaktan değiştirilmeden alınmıştır)
Hücre içi kalsiyum konsantrasyonlarının sürekli artması adenil siklaz’ı aktive eder. Adenil siklaz cAMP miktarını arttırarak, cAMP bağımlı protein kinazı (cAMP kinaz) aktive eder. Aktive olan cAMP kinaz hücre çekirdeğine girer ve CREB proteinini fosforile eder. CREB’de hedef genleri aktive ederek yapısal değişikliğe neden olan protein sentezini başlatır. Yeni sinaps oluşumunda rol alan doku plazminojen aktivatörü (tPA) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) sentezlenir. Bu sentez sırasında bazı transkripsiyon faktörleri (C/EBPbeta gibi)
Şekil 7: Sinaptik plastisitenin bir formu olan hipokampal Long Term Potentiation’un erken ve geç fazlarının sinaptik modeli (23 nolu kaynaktan değiştirilmeden alınmıştır)
Diğer bir sinaptik plastisite formu olan LTD ise uzamış düşük frekanslı aktivitenin sinaptik şiddette kalıcı azalmaya neden olmasıdır. Sinaptik sensivitede azalma meydana gelir. LTP’nin zıttıdır. İlk olarak hippocampus’ta gösterilmiştir. Daha sonra gyrus dentatus’ta, çeşitli kortikal alanlarda ve cerebellum’da çalışılmıştır (23).
Streptozotosin (stz) ile diyabet oluşturulan sıçanların hippocampus kesitlerinden yapılan kayıtlarda, kontrol grubuna göre, yüksek frekanslı stimulusun
LTP oluşumunu azalttığı, düşük frekenslı stimulusun ise LTD oluşumunu arttırdığı gösterilmiştir (5,7,24).
HIPPOCAMPUS’UN UZAYSAL ÖĞRENMEDEKİ ROLÜ
Sıçanlar, fareler ve güvercinler gibi çeşitli hayvan türlerinin tabiatlarında davranışlarını düzenleme ve idare etmede uzaysal bilgiyi kullanma eğilimleri vardır. Hippocampus ve ilgili yapıların (entorhinal korteks, subiculum gibi) uzaysal bilgiyi kullanmayı gerektiren öğrenme ve bellek testlerindeki rolü pek çok çalışmada araştırılmıştır. Hippocampus lezyonlarının hayvanlarda ve insanlarda spontan dikkati, uzaysal öğrenmeyi ve uzaysal bellek kullanımını bozduğu gösterilmiştir. Hippocampus hayvanların davranışlarını düzenlemeleri ve kontrol etmeleri için uzaysal bilgiyi kullanmalarında önemli rol oynar (25).
1971 yılında John O’Keefe ve John Dostrovsky deneysel çalışmalar sırasında hippocampus’un hayvanın hareketiyle ilgili olarak meydana gelen kognitif bir harita içerdiğini göstermişlerdir. Spesifik bir ortamda hayvanın lokalizasyonu pyramidal hücrelerin birbirlerinden ayrı olarak uyarılmasıyla kodlanmaktadır (22).
Hippocampus’ta bulunan her bir pyramidal hücre hayvanın ortamdaki pozisyonunu kodlayan potansiyel ‘place cell’lerdir. Bu hücrelerin ortamda kodladıkları alanlar da ‘place field’ olarak adlandırılmaktadır. Hayvan ortamda hareket etmeye başladığında farklı place cell’ler uyarılır. Örneğin; hayvanın başı alanın kuzeyine girdiğinde sadece bir hücre uyarılır. Böylece hayvanın nerede olduğu hippocampal place cell’lerin bir bölümünün uyarılmasıyla belirlenir.
Hayvan yeni bir ortama girdiği zaman bir ‘place field’ oluşturmayı düşünür. Bu ‘place field’’ler dakikalar içinde biçimlenir ve haftalarca, aylarca sabit kalır.
Aynı ‘place cell’’ler farklı ortamlarda farklı bilgiler için yani birden fazla uzaysal harita oluşturulmasında kullanılabilirler. Böylece hippocampus uzaysal bilginin primer komponent olarak kullanıldığı davranışlarda ‘kognitif harita’ görevi görür (22,25,26).
Normal insanların beyinlerinde yapılan fonksiyonel görüntülemelerde sağ hippocampus’ta kelimeler, nesneler, kişiler için olan belleğe göre uzaysal bellekte daha yoğun hippocampal aktivite gözlemlenmiştir. Kelimeler, nesneler, kişiler için olan bellek dominant hemisfer’de bulunan sol hippocampus’ta daha yoğun aktiviteye neden olmuştur. Bu fizyolojik bulgular, sağ hippocampus lezyonlarının uzaysal oryantasyon sorunlarına yol açarken, sol hippocampus lezyonlarının sözel bellek defektlerine yol açmasını desteklemektedir (11,26,27).
Hippocampus uzaysal belleğin oluşturulmasında ve yön öğrenilmesinde, etraftaki nesnelerin referans alınarak kognitif haritanın oluşturulmasında (allocentric kognitif map) önemli, belki de esas role sahip olmakla birlikte uzaysal öğrenmenin diğer elemanları muhtemelen diğer beyin yapıları tarafından sağlanmaktadır. Bu yapılar kısa süreli bellek (çalışma belleği) için frontal lob, uzaysal oryantasyon, dikkat ve insanın veya deneğin kendini referans alarak (egocentric, body-related mapping) oluşturduğu haritalama için parietal korteksdir. Uzaysal belleğin işlevinin bu yapıların hepsinin yüksek seviyedeki organizasyonuna bağlı olduğu düşünülmektedir (27).
DIABETES MELLITUS
DM, ortak özelliği hiperglisemi olan bir grup metabolik hastalıktır. DM’un sınıflandırılmasında son olarak, hiperglisemiye yol açan patojenik süreç temel alınarak yapılan sınıflama kullanılmaktadır. Buna göre tip 1 DM; Insulin Dependent Diabetes Mellitus’un (IDDM), tip 2 DM; Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus’un (NIDDM) yerini almıştır. Tip 1DM insülin yetersizliği ve ketoasidoz eğilimi ile tanımlanmaktadır. Tip 2 DM çeşitli derecelerde insülin rezistansı ve bozulmuş insülin sekresyonu ve aşırı hepatik glukoz üretimi ile tanımlanan heterojen bir grup bozukluktur. Diğer özel DM tipleri ise genetik defekte, ekzokrin pankreas hastalıklarına, endokrinopatilere, ilaçlara ve gebeliğe bağlı olarak gelişmektedir (28).
Genel olarak DM tanısı üç şekilde konulabilmektedir:
1. Diyabet semptomları ve rasgele plazma glukoz konsantrasyonu ≥200mg/dL (≥11.1mmol/l). Rasgele kelimesi ile günün herhangi bir zamanı, diyabetin klasik semptomları ile poliüri, polidipsi ve açıklanamayan kilo kaybı kastedilmektedir.
2. Açlık plazma glukozu ≥126mg/dL (≥7mmol/L). Açlık, en az 8 saat süren gıda alımının olmadığı süreyi belirtmektedir.
3. 75 gr oral glukoz tolerans testi’nin (OGTT) 2. saatinde plazma glukozu ≥200mg/dl olması (29,30).
Diabetes Mellitus’un epidemiyolojisi
2000 yılında Dünya Sağlık Örgütü’ nün verilerine göre, dünya genelinde en az yüz yetmiş bir milyon DM hastası bulunmaktadır. DM insidansı hızla artmakta ve bu rakamın 2030 yılında iki katına ulaşacağı tahmin edilmektedir (1). Tüm diyabet olgularının %90-95’i tip 2 diyabetlidir ancak hiperglisemi derece derece geliştiği ve sıklıkla hipergliseminin klasik semptomlarına yol açmadığı için toplumda etkilenmiş bireylerin % 50’ sinden fazlasının tanı almadığı tahmin edilmektedir. Bu nedenle net insidanstan söz edilememektedir ve prevelansa yönelik çalışmaların daha güvenilir olduğu kabul edilmektedir. Tip 1 DM tüm dünyada ve tüm toplumlarda görülebilmektedir (2,31).
Diabetes Mellitus’un etyopatogenezi
Tip 1 DM: Tip I diyabet pankreatik β hücrelerinin otoimmün destrüksiyonu ile karakterizedir ve insülin defektine yol açar. Neticede bu hastaların hayatlarını devam ettirebilmeleri için insülin tedavisi gereklidir ve tedavinin kesilmesi ketoasidoza yol açar. Tanı sırasında hastaların % 85-90’ında insüline veya pankreas adacık hücre bileşenlerine karşı otoantikorlar tesbit edilebilir.
Tip 2 DM: Tip 2 diyabet insülin resistansı ve relatif insülin defekti ile karakterizedir. Tedaviler insülin rezistansını azaltmaya (diet, egsersiz, ilaç tedavisi gibi) ve endojen insülin salınımını artırmaya yöneliktir. İnsülin tedavisi kesilse bile hastalar ketoasidoza meyilli değillerdir, çünkü az da olsa insülin üretimi vardır. Patogenez, insülin reseptörüne veya onun intraselüler sinyal yolaklarındaki defekte bağlı ilerleyici insülin direncine ve β hücrelerinin kaybına bağlıdır (31).
Diabetes Mellitus’un kliniği
Klasik semptomlar poliüri, polidipsi, kas kaybı, kilo kaybı, polifaji halsizlik, artmış enfeksiyon riski ve görme bulanıklığıdır. Hastadan özellikle kilo, egzersiz, etanol kullanımı, DM için aile öyküsü ve kardiyovasküler risk faktörlerinin sorgulandığı tam bir öykü alınmasına dikkat edilmelidir (28).
Diabetes Mellitus’un komplikasyonları
Diyabette görülen komplikasyonlar akut ve kronik olarak 2 grupta incelenebilir. Akut komplikasyonlar genellikle metabolik (ketoasidoz, nonketotik koma, asidoz gibi) kökenlidir. Kronik komplikasyonları kendi içerisinde DM’ye özgün olan (retinopati, nefropati, nöropati vb.) ve özgün olmayan (infeksiyon, vasküler hastalıklar vb.) şeklinde ayırmak mümkündür.
Diyabetin her iki formu da gözleri, böbrekleri, kalbi, kan damarlarını ve sinirleri etkileyen kronik komplikasyonlarla ilişkilidir. Bu komplikasyonların ortaya çıkışı diyabetin süresi ve metobolik kontrolün kalitesiyle ilişkilidir ve kısmen insülin tedavisi ile önlenebilir (31).
Diyabetik Ensefalopati;
DM nörofizyolojik ve nöroradyolojik değişikliklerle paralel yavaş ilerleyen, klinik olarak önemli kognitif değişikliklerle karakterizedir. Tip 1 ve tip 2 diyabet hastaları pek çok nörofizyolojik testte performans bozuklukları göstermektedir.
Tip 1 diyabetik hastalar öğrenme ve bellekte, problem çözmede, mental ve motor hızda bozulmalar gösterebilirler. Bu bozulmalar genellikle hafiftir fakat bazen ciddi olabilir.
Tip 2 diyabetik hastalarda yapılan nörofizyolojik çalışmaların sonucunda kompleks bilgi süreçlerinde ve sözel bellekte hafif kognitif bozukluklar gösterdikleri bildirilmiştir (31).
YÜKSEK GLUKOZUN YOL AÇTIĞI OKSİDATİF VE
NİTROSATİF STRES
Yüksek glukoz, birçok hücre tipinde oksidatif ve nitrosatif strese yol açar. Hücrenin yüksek glukoz konsantrasyonuna tesbit edilebilen ilk cevaplarından birisi reaktif oksijen ve nitrojen radikallerinin üretilmesidir. Yüksek glukoz mitokondrial elektron transport zinciri aracılığı ile süperoksid üretimine neden olur. Elektron transport zincirinin kompleks 3’te kesilmesine yol açar bu da moleküler oksijenin koenzim Q tarafından süperoksit anyonuna oksidasyonunun artmasına neden olur. Böylece normalde iyi çalışan glukoz metobolizması, hiperglisemi gibi stres durumlarında, aşırı serbest radikal üretimine ve oksidatif strese neden olur (Şekil 8).
Oksidatif ve nitrosatif stresin kombinasyonu çeşitli hücre tiplerinin apoptozisine ve nekrozuna yol açar. Süperoksit ve nitrik oksit’in birlikte üretimi, peroksinitrit (ONOO⎯) üretimine yol açar. ONOO⎯’in protonlanması, hidroksil radikali oluşturmak üzere ayrışabilen peroksinitröz asid oluşumuna sebep olur. ONOO⎯’in, karbon dioksid (CO2) ile oksidasyonu sonucu yarı ömrü bilinmeyen bir
ara ürün olan nitrosoperoksikarbonat (ONOCOO⎯) oluşur. Bu kısa ömürlü radikalin ayrışması ile oksidasyon ve nitrasyon reaksiyonlarına neden olan nitrojen dioksit (NO2⎯) ve karbonat (CO3⎯) anyonları oluşur (32).
ONOO⎯, lipid peroksidasyonuna neden olur ayrıca direkt olarak nokta mutasyonu, çift sarmallı yapının kırılması gibi oksidatif deoksiribonükleik asid (DNA) hasarına neden olur.
Yüksek glukozun indüklediği oksidatif stresin diğer bir kaynağı polyol pathway’idir. Burada glukoz, aldoz redüktaz aracılığı ile sorbitol’e indirgenir ve bunun için nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) kullanılır. Sorbitol daha sonra sorbitol dehidrogenaz ile fruktoza çevrilir ve bu arada nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) üretilir. NADPH’ın kullanılması hücre için esansiyel bir antioksidan olan ve NADPH’a bağımlı olarak üretilen indirgenmiş glutatyon oluşumunu bozar. İndirgenmiş glutatyon’un bulunmaması DNA hasarına neden olmaktadır.
Glukoz, reactive dicarbonyls glyoxal, methylglyoxal ve 3-deoxyglucosone oluşturmak için oto-oksidasyona veya ayrışıma uğrayabilir. Bunlar daha sonra advanced glycation end products (AGEs) oluşturmak üzere reaksiyona girerler bu da hücre ölümüne yol açmaktadır. Çeşitli çalışmalarda AGEs’in nefropati, nöropati ve mikrovasküler hastalığı içeren diyabetik patofizyolojinin mediatörleri olduğu kabul edilmektedir (32).
Şekil 8: Yüksek glukozun indüklediği oksidatif ve nitrosatif stresin olası yolaklarını gösteren şematik diyagram (32 nolu kaynaktan değiştirilmeden alınmıştır)
Polyol ve heksozamin yolaklarının ürünleri ve NADPH oksidaz gibi enzimlerin aktivitesi oksidatif hasara neden olurlar. Glukozun mitokondrial süperoksid üretimini ve daha sonra nitrik oksid sentaz (NOS) aktivasyonunu etkilemesi güçlü bir oksidan olan peroxynitrite oluşumuna neden olur. Perxynitrite daha sonra karbonat (CO3- ) anyonu ve nitrojen dioksid (NO2-) oluşturmak üzere ayrışır.
Glukozun oto oksidasyonu ve dekompozisyonu, hücresel proteinlerin ve lipidlerin hasarına neden olan AGEs oluşumuna yol açar (32).
APOPİTOZİS VE YÜKSEK GLUKOZUN YOL AÇTIĞI
HÜCRE HASARI İLE İLİŞKİSİ
Akut hasardan sonra tesadüfi olarak meydana gelen hücre ölümünden farklı olarak programlanmış hücre ölümü, apopitozis olarak bilinen farklı morfolojik değişiklikler ile karakterize aktif bir süreçtir. Kaspazlar (caspase) çeşitli uyarılar sonucu indüklenen apopitozisi hem regüle eden hem de apopitozisi meydana getiren bir proteaz ailesidir. Kaspazların ana hedefi aktive olduğunda DNA’nın parçalanmasından sorumlu olan bir DNAaz inhibitörüdür. Kaspazlar hücre çekirdeğinin membranınına bağlanarak DNA’nın ve yapısal proteinlerin parçalanmasına, hücre iskeletinin bozulmasına ve hücrenin parçalanmasına neden olurlar.
Kaspazlar prekürsör olarak sentezlenirler ve diğer kaspazlar tarafından katalizlenen proteolitik ayrılma ile aktif hale gelirler. Caspase-9 memeli hücrelerinde apopitozisin başlamasında anahtar role sahiptir. DNA hasarı, growth faktör yokluğu gibi hücre ölümünü tetikleyen pek çok stimulus mitokondri hasarına ve normalde mitokondri membranında buluna cytochrome c’nin stoplazmaya salınmasına neden olur. Stoplazmada cytochrome c, Apaf-1’e bağlanır ve apoptosome olarak adlandırılan Apaf-1/caspase-9 kompleksinin oluşmasına neden olur. Bu yapı içinde aktive edilen caspase-9 hücre ölümüyle sonuçlanan özllikle caspase-3 gibi diğer kaspazları aktive eder (33).
Mitokondrial apopitozis, sistein proteazlarının aktivitelerini direkt veya indirekt olarak aktive veya inhibe eden proteinler tarafından düzenlenir. Apopitozis düzenleyici bu proteinlerin homoloji gösteren birkaç tanesi bcl-2 ailesi olarak adlandırılırlar (32). Bcl-2 ailesi üyeleri mitokondrial bütünlüğü ve cytochrome c salınımını düzenlerler. Apopitozisi inhibe eden Bcl-2 ailesi üyeleri (Bcl-2’nin kendisi gibi) cytochrome c salınımını önlerlerken hücre ölümüne neden olan Bcl-2 ailesi üyeleri mitokondrial membran hasarını, cytochrome c salınımını ve kaspaz aktivasyonunu indükleyerek etki gösterirler (33).
Bulundurdukları Bcl-2 homolog (BH) alanlarının tipleri ve sayılarına göre tanımlanırlar. Çok sayıda BH alanları içeren ve pro-apoptotic proteinler olan Bax ve Bak; birkaç adet BH alan içeren ve anti-apoptotic etkili olan Bcl-2, Bcl-w, Bcl-XL ve Mcl-1; bir adet BH alanı içeren Bim, Bad ve Bid ve olmak üzere üç gruba ayrılırlar. Sadece tek BH alan içeren proteinler Bcl-2’nin anti-apoptotic aktivitelerini direkt bağlanarak ve Bax-homo oligomer formasyonunu inhibe etmesini önleyerek inhibe ederler.
Bax 25-kDa ağırlığında bir proteindir ve mitokondrial membran permeabilitesini arttırarak cytochrome c salınımına ve Apaf-1 ile birlikte apoptosome oluşumuna neden olur (32). Apaf-1/caspase-9 kompleksi apoptosome olarak adlandırılır ki bu yapı içinde caspase-9 aktive edilmektedir. Aktive caspase-9 özellikle caspase-3 gibi diğer efektör kaspazları aktive eder ve devam eden süreçte hücre ölümü meydana gelir (33).
Bu mekanizmaların bir kısmı veya hepsi çalışılan hücre veya doku tipine bağlı olarak yüksek glukozun indüklediği apopitozis ile ilgilidir. Yüksek glukozun indüklediği apopitozis ve oksidatif stres arasındaki ilişki de aynı derecede karmaşıktır (32).
Yüksek glukoz konsantrasyonları ya direkt olarak ya da apopitosis signal regulating kinase-1 (ASK1) aracılığı ile c-Jun-NH2–terminal kinase (JNK) ve p38
gibi Bax oligomerizasyonuna ve mitokondriden cytochrome c salınımına neden olan ve hücresel strese cevap olarak aktive olan, mitogen activated protein kinase’ları (MAPK) aktive eder. Bunu apoptosome formasyonu, caspase-9 ve caspase-3 aktivasyonu takip eder. İlaveten, artmış mitokondrial dış zar permeabilitesi kaspaz kaskadını genişleten bazı apopitozis regulatörlerinin salınımına neden olur. Yüksek glukozun indüklediği apopitozise Smac/DIABLO’nun katkısı (apoptozis proteinlerinin inhibitörlerinin (IAPs) antagonisti) burada belirtilmektedir fakat henüz kanıtlanmamıştır. Yüksek glukozun indüklediği oksidatif stres DNA hasarına neden olur ve kısmen associated speck-like protein (ASC) aracılığı ile p53-ilişkili mekanizmalarla apoptosisi indükleyebilir. Yüksek glukoz, kalsiyum bağımlı bir proteaz olan calpain’i aktive eder. Calpain kaspaz bağımlı ve bağımsız mekanizmalar
ile apopitozisi başlatabilir. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) gibi growth factor’ler yüksek glukoz indüklü apopitozisi önleyebilir ve Ras/Raf–MEK/ERK veya phosphatidylinositide 3-kinase (PI-3-kinase) ve proteine-serine/threonine kinase (Akt) (PI 3-kinase/Akt) yolağı üzerinden etki göstermekte oldukları görülmektedir. IGF-I’in aktive ettiği Akt veya ERK, pro-apoptotic protein Bad’ı fosforilleyebilir Bad fosforillenince Bax oligomerizasyonunu arttıramaz (Şekil 9) (32).
MAPK’lar çeşitli growth faktörlere ve diğer sinyalci moleküllere cevaben aktive olan protein-serine/threonine kinase’lar olarak adlandırılan bir protein ailesidir. Ökaryotik hücrelerde geniş kapsamlı stimuluslara cevaben sinyal iletiminde rol oynayarak hücre yaşamını, proliferasyonunu ve apopitozisini kontrol ederler (32,33). Memeli hücrelerinde en iyi karakterize edilmiş MAPK’lar extracellular signal-regulated kinase (ERK) ailesidir. ERK aktivasyonu, growth faktörler tarafından indüklenen hücre proliferasyonununda anahtar role sahiptir (32,33).
ERK aktivasyonu, Ras diye adlandırılan, guanozin trifosfat (GTP) bağlayıcı protein aracılığı ile growth faktör reseptörlerine bağlanan iki protein kinaz aracılığı ile gerçekleşir. Ras aktivasyonu, Raf protein-serine/threonine kinase aktivasyonuna neden olur. Bu da MEK olarak adlandırılan ikincil protein kinazı fosforile ve aktive eder. MEK, ERK ailesinin elemanlarını fosforilleyerek aktive eden bir protein kinazdır. ERK aktive olunca diğer protein kinazları ve tanskripsiyon faktörlerini de içeren çeşitli hedefleri fosforillemektedir (33).
p38 MAPK ve JNK’lar, ERK ailesindendirler ve hücresel strese cevap olarak aktive olurlar (33).
Şekil 9: Yüksek glukozun indüklediği apopitozis mekanizması (32 nolu kaynaktan değiştirilmeden alınmıştır)
DİYABET OLUŞTURULMASINDA KULLANILAN
HAYVAN MODELLERİ
Diyabet oluşturulmasında kullanılan hayvan modelleri, genetik predispozisyona bağlı olarak spontan diyabet gelişen ve deneysel prosedürler ile diyabet oluşturulan hayvan modelleri olarak ikiye ayrılabilir (Tablo 1) (34).
1.Genetik predispozisyona bağlı spontan diyabet gelişen hayvan
modelleri
BB/Wor Sıçanlar ve Non Obese Diyabetik (NOD) Fareler
BB/Wor sıçanlar ve Non Obese Diyabetik (NOD) farelerde, pankreas β hücrelerinin immün sistem aracılığı ile yıkımına bağlı spontan olarak diyabet gelişir. Yaşamalarını sürdürebilmeleri için insülin tedavisi gereklidir. NOD fareler
ketoasidozise BB/Wor sıçanlar’dan daha az meyillidirler. Bu iki model insanlardaki tip 1 DM’a uyar.
Zucker sıçanlar ve db/db fareler
Zucker sıçanlar farklı cinslerden gelirler. Zucker fa/fa sıçanların fa geninde otozomal resesif mutasyon vardır. Bu gen leptin reseptörünü kodlar. Hayvanlar hiperfajik, hiperlipidemik ve obezdirler. Aynı zamanda periferal insülin direnci, hiperinsülinemi ve bozulmuş glukoz toleransı gösterirler. Hiperglisemi genellikle orta şiddettedir. Diyabetik Zucker sıçan (ZDF/DRT-fa) hiperglisemi için inbred bir fa/fa sıçan alt cinsidir.
db/db farelerin, diyabet (db) geninde otosomal resesif mutasyon vardır. Farelerde bu gen, leptin reseptörünü kodlayan gendir. Bu nedenle bu farelerin özellikleri, fa/fa sıçanların özellikleri ile tam olarak benzerdir.
Zucker, db/db modelleri bazı açılardan tam olarak tip 2 DM’yi taklit etmelerine rağmen her birinin altında yatan genetik bozukluk, tip 2 DM hastalarındaki primer bozukluğu karşılamaz. Otsuka Long-Evans Tolushima Fatty ( OLETF) sıçanlar, Goto Kakizaki (GK) sıçanlar ve Akita fareler genetik predispozisyona bağlı olarak spontan diyabet gelişen diğer hayvan modelleridir (31,34).
2.Deneysel yöntemler ile diyabet oluşturulan hayvan modelleri
Deneysel diyabet oluşturulması için pankreatektomi, virüslere maruziyet ve pankreas β hücrelerine sitotoksik ajanların uygulanması gibi çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan en sık kullanılanı pankreas β hücrelerine spesifik olan streptozotosin uygulamasıdır (31,34).
STREPTOZOTOSİN İLE OLUŞTURULAN DİYABET
Diyabetin patofizyolojisinin ve komplikasyonlarının araştırıldığı çalışmalarda intravenöz veya intraperitoneal olarak streptozotosin uygulanması çok sık kullanılmaktadır (31). Streptozotosin glukoz anoloğu olan glucosamine-nitrosourea
(2-deoxy-2-[3-methyl-e-nitrosourido]-D-glucopyranose) bileşiğidir. İlk kez 1960 yılında Streptomyces achromogenes’den antibiyotik olarak elde edilmiştir. Spesifik olarak pankreatik β hücrelerine hasar verici etkisi nedeniyle diyabetojenik etki gösterir (35).
Streptozotosin, pankreas’ın Langerhans adacık hücrelerinden insülin üreten β hücrelerinde yüksek miktarda bulunan GLUT-2 glukoz taşıyıcısı aracılığı ile hücre içine alınır. Streptozotosin’in toksik etkisi nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) seviyelerini azaltması, hücre içinde serbest radikal oluşumunu arttırması ve DNA çift sarmalında kırılmalara yol açması aracılığı ile ortaya çıkar. Langerhans adacık hücrelerinden insülin üreten β hücreleri fazla miktarda GLUT-2 glukoz taşıyıcısı eksprese etmelerinin yanında düşük miktarda NAD içermeleri nedeniyle de streptozotosin’e oldukça duyarlıdırlar.
Streptozotosin intraserebroventriküler uygulanmasından sonra beyinde direkt toksik etkilidir. Fakat kan-beyin bariyeri’nde GLUT-2 glukoz taşıyıcıları yoktur. Bu nedenle streptozotosin’in sistemik uygulanmasından sonra beyine geçişi ve beyinde direkt etkisi yoktur (34,36).
Streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanların özellikleri
Streptozotosin diyabet modelinin yararları, iyi karakterize edilmiş olması ve hangi yaşta verilirse verilsin diyabet oluşturmasıdır.
Streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanlar hipoinsülinemiktir, fakat hayatlarını devam ettirebilmeleri için insülin tedavisi gerekmez. Kan glukoz seviyeleri 20-25 mmol/L düzeyindedir (normali; 5 mmol/L).
Diyabetik insanlarda olduğu gibi streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanlarda da göz, böbrek, kalp ve sinir sisteminde organ hasarları görülür (34).
Streptozotosin ile oluşturulan diyabetin kognüsyon ve sinaptik
plastisiteye etkisi
Streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanlarda ortaya çıkan kognüsyon ve hipokampal sinaptik plastisitedeki değişiklikler bildirilmiştir. Bu hayvanların relatif olarak kolay davranış testlerinde (pasif kaçınma testi gibi) gösterdikleri performans etkilenmemiş iken daha kompleks testlerdeki (su tankı testi gibi) performansları bozulmuştur. Performans bozukluğunun düzeyi diyabetin süresine ve hipergliseminin şiddetine bağlıdır ve insülin tedavisi ile önlenebilir, fakat tam anlamda bir düzelme sağlanamaz.
Streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanlarda uzaysal öğrenme testleri ve LTP’de gözlemlenen değişiklikler arsındaki ilişki pek çok çalışmada bildirilmiştir. Streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanlardan diyabet oluşturulmasından altı hafta sonra elde edilen hippocampus kesitlerinde LTP oluşumunun bozulduğu gösterilmiştir. Başka bir çalışmada streptozotosin ile diyabet oluşturulan sıçanlarda diyabet oluşturulmasından sonraki altıncı ve sekizinci haftalarda AMPA reseptörleri’nin glutamat affinitesinin azaldığı fakat NMDA reseptörlerinin glutamat affinitesinin değişmediği gözlemlenmiştir. Fakat NMDA reseptörlerinin NR2B komponentinin (bu komponentin LTP oluşumunu kolaylaştırdığı düşünülmektedir) sentezinin belirgin olarak azaldığı gösterilmiştir (31).
Tablo 1: Deneysel diyabet oluşturulmasında kullanılan hayvan modelleri (34)
Model Diyabet mekanizması Glukoz İnsülin
Stz diyabeti β hücre toksisitesi ↑↑ ↓↓ BB/Wor sıçan β hücre oto immunitesi ↑↑ ↓↓↓ NOD mouse β hücre oto immunitesi ↑↑ ↓↓↓ Zucker fa/fa sıçan Defektif leptin reseptörü =/↑ ↑↑ Diyabetik Zucker sıçan Hiperglisemi için inbred fa/fa sıçan ↑↑ ↑↑ Db/db fare Defektif leptin reseptörü =; yaşla↑↑ ↑↑; yaşla↓ GK sıçan Glukoz intoleransı için inbred ↑ ↑ OLETF sıçan Defektif CCK-A reseptörü =; yaşla↑ ↑; yaşla↓ Akita fare Proinsülin’in yanlış kıvrılması, β hücre
destrüksiyonu ↑
↑; yaşla↑↑ ↓; yaşla↓↓
SU TANKI TESTİ
Yaklaşık 25 yıl önce Morris tarafından, laboratuar ortamında uzaysal öğrenme ve belleği değerlendirmek için su tankı modeli tanımlanmıştır (37). Zaman içinde davranışsal nörobilimde en sık kullanılan modellerden biri olmuştur. Araştırmacılar pek çok farklı uygulamada Morris su tankı testinin pek çok farklı tiplerini kullanmaktadırlar. Model, su ile doldurulmuş geniş bir havuz ve havuz içinde bulunan bir platformdan oluşmaktadır. Denemeler süresince hayvanlar görünür yada saklı yerleştirilen platformu bularak havuzdan kaçmayı öğrenirler. Yıllar içinde Morris’in tanımladığı test için “Morris yüzme havuzu”, “Morris maze”, “water maze”, “Morris su tankı” gibi çeşitli adlandırmalar yapılmıştır. Bu çalışmada ise testin adı ‘su tankı testi’ olarak kullanılmıştır. Genel olarak su tankı testinin alternatif öğrenme ve bellek testlerine göre daha az karmaşık ve protokollerinin daha az zahmetli olduğu kabul edilmektedir. Su tankı testi göreceli olarak daha basit bir test olmasına rağmen zaman içinde uzaysal öğrenme ve belleğin değerlendirilmesinde ‘altın standart’ olmuştur (37,38).
Su tankı testi hayvanların başka bir kaçma yolu olmadığı varsayımıyla, hoşlanmadıkları bir ortamda kaçış yolu aramalarına bağlı olan bir testtir. Sıçanlar da doğal yüzücüler olmalarına rağmen sudan da kaçmak isterler ve bunun için çaba harcarlar (39). Hayvanların suya daldırılması ve tuzağa düştüklerini hissetmeleri testin ilk aşamalarında bazı hayvanlar için uyum problemi yaratabilir (37,38). Ancak yapılan denemeler bu problemin deneme blokları ilerledikçe ortadan kalktığını göstermektedir.
Su tankı yüzen hayvanın görebileceği şekilde duvarlarında işaretler bulunan bir odaya yerleştirilir. Test süresince her gün tekrarlanan deneme bloklarında (acquisition blokları) hayvanlar önce su yüzeyinin üzerinde daha sonra, uygulanan protokole göre, su düzeyinin altında olacak şekilde gizlenmiş platformun yerini saptayarak sudan kaçmayı öğrenirler. Deneme bloklarından sonra öğrenmenin test edildiği prob trial denilen bir kez tekrarlanan bir uygulama daha yapılır. Bu uygulamada platform havuzdan kaldırılır ve hayvan belirli bir süre havuzda serbest olarak yüzdürülür. Platformun bulunduğu kadranda geçen süre, platformun
bulunduğu alandan geçme sayıları gibi verilerle hayvanın uzaysal öğrenmesinin doğruluğu değerlendirilir.
Denemeler boyunca hayvanlar saklı platformu bulmak için temel olarak üç strateji geliştirirler; kendisini platforma götüren öğrenilmiş ardışık hareketleri kullanabilir, kendisini referans alarak (platformun kendisine göre sürekli sağında olması gibi) platforma ulaşabilir veya ortamdaki işaretlerin şekli, görünüşü hakkındaki bilgilerini kullanarak platforma göç eder. Hayvanlar öğrenilmiş ardışık hareketler ile ve kendilerini referans alarak platformu bulmaları ihtimallerinden dolayı her denemede farklı başlangıç pozisyonlarından bırakılırlar.
Su tankı testinin kuru ortamda yapılan öğrenme testlerine göre bir avantajı da hayvanların kokuyu takip ederek yol alma ihtimalini en aza indirmesidir. Su tankı testinin izlenmesi verilerin kamera yardımı ile kaydedilerek bilgisayar ortamına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Bu yolla deneysel yan tutma önlenmektedir.
Araştırmacılar tarafından su tankı testi sıçanlardaki hippocampal lezyonların etkilerine özel sensitivitesi olan bir yöntem olarak gösterilmektedir (37,38). Hippocampus hasarı olan sıçanların su tankı testinde performanslarının bozulduğu pek çok çalışmada gösterilmiştir (37-41).
STEREOLOJİ
Stereoloji temel olarak kesitlerden yapılan incelemeler ile üç boyutlu mikroskopik yapılar hakkında sayısal bilgi edinmeyi sağlayan basit ve etkin yöntemler ile ilgili bir bilim dalıdır (42). Bu yöntemler ile beyinde toplam nöron sayısı, sinaps yoğunluğu ve hacim hesaplaması yapılabildiği gibi pek çok histolojik yapı da değerlendirilebilmektedir (43,44). İki boyutlu kesitler üç boyutlu yapılar hakkında sadece istatistiksel olarak sayısal bilgi verirler. Bu istatistiksel bilginin doğru veya tarafsız olması için kesitler ile ve kesitlerin elde ediliş biçimi ile ilgili olarak dikkat edilmesi gereken bazı detaylar bulunmaktadır (42).
