T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
RADYASYON ONKOLOJİSİ
ANABİLİM DALI
Tez YöneticisiYrd. Doç. Dr.Ruşen COŞAR
CİNSİYET FARKININ RADYOTERAPİYE BAĞLI
AKUT AKCİĞER TOKSİSİTE ÜZERİNE ETKİSİNİN
GENETİK PREDİKTÖR OLAN ATAKSİ
TELENJİEKTAZİ MUTASYON, TGF-1 VE SOD2
PANELİ İLE ARAŞTIRILMASI
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Deniz ÇELİK
TEŞEKKÜR
Uzmanlık eğitimim süresince yetişmemde büyük katkı ve emeği geçen, bilgi ve tecrübeleri ile her zaman yol gösterici olan tez yöneticim ve değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Ruşen COŞAR, değerli öğretim üyeleri Prof.Dr. Cem UZAL, Prof. Dr. Zafer KOÇAK, Doç Dr. Murat ÇALOĞLU, Doç. Dr. Vuslat YÜRÜT ÇALOĞLU, Doç. Dr. Mert SAYNAK, Uzm. Dr. Alaattin ÖZEN, Araş. Gör. Suat ÇAKINA, Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan Vet. Dr. Ziya ÇUKUR ve tüm çalışma arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER
GİRİŞ VE AMAÇ
... 1GENEL BİLGİLER
... 2AKCİĞERLERİN ANATOMİSİ ... 2
RADYASYONUN CANLIDAKİ ETKİ MEKANİZMASI VE AŞAMALARI ... 4
RADYOTERAPİYE BAĞLI AKCİĞER TOKSİSİTESİ ... 8
RADYOTERAPİNİN OLUMSUZ ETKİLERİNİN GENETİK PREDİKTÖRLERİ ... 21
GEREÇ VE YÖNTEMLER
... 28BULGULAR
... 40TARTIŞMA
... 46SONUÇLAR
... 51ÖZET
... 52SUMMARY
... 54KAYNAKLAR
... 56EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR
ATM : Ataksi Telenjiektazi Mutasyon DNA : Deoksirübonükleik asit
dNTP : Dinükleotid trifosfat
Gy : Gray
IL : İnterlökin
mRNA : Mesajcı ribonükleik asit RNA : Ribonükleik asit
RT : Radyoterapi
SOD2 : Süperoksit Dismutaz 2 SOR : Serbest oksijen radikalleri
TGF-β : Transforme edici büyüme faktörü-β TGF-1 : Transforme edici büyüme faktörü-β1 TNF-α : Tümör nekroz faktör-α
1
GİRİŞ VE AMAÇ
İyonlaştırıcı radyasyon birçok tümör çeşidinin tedavisinde etkili olup kanserli hastaların %50-60’ında tedavinin önemli bir parçasıdır (1,2). Radyoterapinin amacı, normal dokuyu mümkün olduğunca korurken, tümör dokusuna maksimum dozu vermektir. Radyoterapi dozu artırıldıkça, lokal tümör kontrolünde de buna paralel bir artış elde edilir. Ancak, normal dokudaki komplikasyon riski de bununla birlikte artar. Dolayısıyla tümör kontrolü, bir anlamda normal dokunun radyoterapiye toleransına bağlıdır (2,3). Kanser tedavisinde, her geçen gün yeni gelişmelere paralel olarak hastaların sağkalım süreleri uzamaktadır. Bununla beraber, yeni kemoterapötik ilaçlara ve yeni radyoterapi cihaz ve tekniklerinin gelişmesine rağmen, tedaviye bağlı komplikasyonlar hala yüksek orandadır. Radyoterapi alan hastalarda, tedavi alanında tümörle birlikte, sağlıklı dokuların da bir kısmı ışınlandığından, radyoterapinin çeşitli yan etkileri ortaya çıkmakta ve bu durum kanser hastalarının yaşam kalitesinde bozulmaya neden olabilmektedir (2,3).
Radyoterapiye bağlı gelişen akut ve kronik dönem akciğer toksisitesi de hastaların yaşam kalitesini bozan önemli yan etkilerden biridir. Biz bu çalışmamızda radyoterapiye bağlı gelişen akut akciğer toksisitesinin oluşumunda cinsiyet farkının etkisinin olup olmadığını perditör olarak ataksi telenjiektazi mutasyon (ATM), transforme edici büyüme faktörü-β1 (TGF-1) ve süperoksit dismutaz 2 (SOD2) panelini kullanarak değerlendirmeyi amaçladık.
2
GENEL BİLGİLER
AKCİĞERLERİN ANATOMİSİ
Üst solunum sistemi; burun, paranazal sinüsler, nasofarenks ve larenks’ten oluşur (4). Alt solunum sistemi trakea ve akciğerlerden oluşmaktadır. Solunum sisteminin en önemli organı akciğerlerdir. Göğüs boşluğunda en büyük yeri işgal eden akciğerler, kalbin de bulunduğu mediastinumun her iki yanında yer alırlar. Akciğerler süngerimsi elastik bir yapıya sahiptir. Koni şeklindedirler. Apeks pulmonis denilen bir tepesi, basis pulmonis denilen bir tabanı vardır. Facies costalis, facies mediastinalis, facies diaphragmatica (basis pulmonis) ve facies interlobaris olmak üzere dört yüzü bulunmaktadır (4) (Şekil 1). Sağ akciğer oblik (majör) ve horizontal (minör) fissürlerle ayrılmış üst, orta ve alt loblardan oluşur. Sol akciğer tek fissürle ayrılmış iki lobdan oluşur. Sol üst lobun lingular bölümü sağ taraftaki orta loba uymaktadır. Akciğerlerin hilusu; kan damarları, lenfatik damarlar ve sinirlerin akciğere girdiği ve çıktığı yerdir. Mediastinum ise iki akciğer arasındaki boşluktur ve içerisinde kalp, timus, özofagus, ana damarlar ve lenfatikler bulunmaktadır (5) (Şekil 1).
Akciğerin lenfatikleri pek çok şekilde sınıflandırılır. TNM sistemine göre; anatomik olarak, mediastinal ve intrapulmoner olarak gruplandırılırlar. Mediastinal nodlar süperior ve inferior mediastinal olmak üzere ikiye ayrılır ve sayı ve yerleşime göre ayrıca sınıflandırılır. Süperior mediastinal nodlar; üst mediastinal, üst paratrakeal, pretrakeal ve alt paratrakeal (azigos nodları dahil) nodlardan oluşur. Alt mediastinal nodlar; subkarinal, paraözofajeal (karinanın aşağısı) ve pulmoner ligamandan oluşur. Diğer majör lenf nodu grupları, aortik, subaortik, aortikopulmoner pencere, paraaortik (asendan aortik veya frenik), hiler, intralobar, lobar, segmental ve subsegmental nodlardır (5) (Şekil 2).
3
Şekil 1. Solunum sistemine genel bakış (4)
Şekil 2. Akciğerlerin lenfatikleri (5)
Sağ üst lob lenfleri hiler ve trakeobronşial lenf nodlarına dökülür. Sol üst lobun lenfleri aynı taraf venöz açıyla ve sağ süperior mediastene doğru ilerler. Sağ ve sol alt lob lenfatikleri, inferior mediasten ve subkarinal lenf nodlarına ve buradan da sağ superior mediastene (sol alt lob sol superior mediastene de direne olabilir) direne olur (6) (Şekil 3).
4
Şekil 3. Akciğer lenfatiklerinin drenaj yönü (6)
Akciğerlerin Solunum İşlevi
Solunumun amacı; dokulara ihtiyacı olan oksijeni sağlamak ve karbondioksiti atmaktır. Solunum 4 bölümde incelenebilir:
1. Havanın atmosfer ve akciğer alveolleri arasında içe ve dışa akımı; ventilasyon 2. Alveoller ve alveolleri saran damarlardaki kan arasında oksijen ve karbondioksitin yer değiştirmesi; difüzyon
3. Oksijeni dokulara taşımak ve oluşan karbondioksiti dokulardan uzaklaştırmak için kanda ve vücut sıvılarında oksijen ve karbondioksit taşınması
4. Solunum regülasyonu (7).
RADYASYONUN CANLIDAKİ ETKİ MEKANİZMASI VE AŞAMALARI
İyonlaştırıcı radyasyon birçok tümör çeşidinin tedavisinde etkili olup kanserli hastaların %50-60’ında tedavinin önemli bir parçasıdır (1,2). Tıpta radyoaktif izotoplar ve radyasyon çeşitli hastalıkların tanı ve tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Radyoterapide, yüksek enerjili X ışını kaynakları, partikül akselaratörleri ve Kobalt-60 kaynaklarından elde edilen iyonlaştırıcı radyasyonlar kullanılmaktadır. Bir atom veya molekülden bir elektronun kopmasına neden olan radyasyon tipine iyonlaştırıcı radyasyon adı verilir. İyonlaştırıcı radyasyonlar, X ve gama ( ) gibi elektromagnetik radyasyonlar ve alfa (α), beta (β) partikülleri, elektronlar, protonlar ve nötronlar gibi partiküler radyasyonlar olmak üzere iki gruba ayrılır (8,9).
5
İyonlaştırıcı radyasyonların canlıda biyolojik bir etkiye yol açabilmesi için radyasyonun canlıyı olusturan hücreler ve dokular tarafından absorblanması ve bu enerjinin dokularda dağılması gerekir (8,9). Biyolojik bir sistemde radyasyon etkisi ile oluşan tüm bu olaylar zinciri, eğer radyasyon enerjisinin, örneğin DNA ya da bir enzim molekülü gibi özel bir biyolojik yapı tarafından absorplanması ile başlamışsa, bu etkiye radyasyonun “direkt etkisi” denir. Radyasyonun direkt etkisi biyolojik etkinin bir bölümünden (1/3) sorumludur. Yüklü atom parçacıklarının oluşturduğu etki bu yolladır. Bu biyolojik moleküller içinde bulunduğu ortamın molekülleri tarafından radyasyon enerjisinin absorplanması ile değişikliğe uğrayarak bu olaydan indirekt olarak etkilenirler. Bu etkiye ise radyasyonun “indirekt etkisi” denir (Şekil 4). Biyolojik etki asıl bu indirekt mekanizma ile oluşur. X ve gama ( ) ışınları genellikle indirekt yolla etki ederler (2,3,8,9).
Şekil 4. İyonlaştırıcı radyasyonun direkt ve indirekt etkileri (9)
Radyasyonun canlıda oluşturduğu etkiler ayrıntılı bir şekilde incelendiğinde, radyasyon enerjisinin absorblanması ile biyolojik etkinin ortaya çıkışı arasındaki sürede birbirini izleyen olaylar zinciri fiziksel, kimyasal ve biyolojik kademeler olarak bilinen üç aşamada gerçekleşir. Radyasyon etkisinin ilk aşaması olan fiziksel aşama, iyonlaştırıcı radyasyonlar ile canlı dokuları oluşturan atom ve moleküller arasındaki ilk etkileşimleri içerir.
6
Radyasyon enerjisi maddeye transfer edilir. Çok hızlı bir elektron, 10-18 saniyede DNA molekülünden, 10-14 saniyede de bir hücreden geçebilir. Bu esnada DNA molekülü ya da hücredeki diğer moleküllerde iyonlaşma ve uyarılma (eksitasyon) olayları meydana gelir. Bu iyonlaşmalar sonucunda oluşan serbest elektronlar, diğer komşu atomlarda da iyonlaşmalara yol açarlar ve böylece zincirleme bir iyonlaşma olayı meydana gelir. Bu kademede oluşan yeni ürünler, genellikle son derece kararsızdırlar ve çok kısa bir süre içinde sekonder reaksiyonların oluşmasına yol açarlar (8,9). İkinci aşama olan kimyasal aşamada, radyasyon tarafından hasar görmüş atom ve moleküller diğer hücresel yapılar ile zincirleme reaksiyonlara girerek serbest oksijen radikallerinin oluşmasına yol açarlar. Serbest oksijen radikalleri (SOR) çok reaktif yapılar olduğundan hem kendileri ile hem de ortamdaki diğer moleküllerle reaksiyona girmeye devam ederler (8,9).
İyonlaştırıcı radyasyonun temel etki mekanizması, DNA’da yaptığı hasara bağlı olarak hücre ölümüne yol açmasıdır. DNA’daki ölümcül (letal) hasar DNA molekülünün fırlatılmış bir elektron ile direkt iyonizasyonu sonucu meydana gelebilir. Ortamdaki suyun iyonizasyonuna bağlı olarak gelişen SOR oluşumu DNA’daki ölümcül hasarın asıl sorumlusudur (8,9). Sekonder reaksiyonlar da oluşan SOR’un miktarının artmasına yol açar. DNA’nın yanı sıra lipid ve proteinler de iyonlaştırıcı radyasyona bağlı serbest radikallerden etkilenir. Lipid peroksidasyonunun, hücre membranlarındaki hasarın önemli nedenlerinden biri olduğu ve SOR’a bağlı doku hasarının gelişmesine katkıda bulunan bir diğer faktör olduğu gösterilmiştir (9,10).
Üçüncü aşama; biyolojik aşamadır. Bu süreçte canlıda meydana gelen olaylar, radyasyonun son biyolojik etkisinin ortaya çıkmasına sebep olurlar. Çeşitli hasarlara yol açan enzim reaksiyonları ile başlar. Bu arada DNA moleküllerinde hasarlar oluşmaya devam eder ve bunların bir kısmı onarılabilir. Onarılamayan hasarlar ise hücrenin ölümüne yol açarlar. Eğer ölüm kök hücrelerinde meydana gelirse, ışınlamadan birkaç hafta ya da birkaç ay sonra ortaya çıkan erken doku ölümleri meydana gelir. İnce bağırsak ve kemik iliğinde oluşan hasarlar, bu tip olaylara örnektir. Bunun yanı sıra radyasyon, genetik bozukluklar ve kanser oluşumu gibi geç biyolojik etkilere de neden olabilir (8,9).
İyonlaştırıcı radyasyonların canlıda oluşturduğu etki kademeleri ile bu kademelerde oluşan bozukluklar ve bütün bu olayların meydana gelme süreleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Başlatıcı reaksiyonların tamamen fiziksel nitelikli oldukları bu tabloda da net bir şekilde görülmektedir. Bu canlı bir sistem olabileceği gibi, cansız bir sistem de olabilir. Her iki durumda da olayların gidişatı aynı olmasına rağmen, biyomoleküler ve biyolojik
7
bozuklukların ortaya çıkmasına yol açan kimyasal ve biyolojik olaylar sadece canlı bir sistemde mümkün olabilir. Tablo 2’de memeli hayvanlarda bu kademelerde hangi önemli radyasyon etkilerinin hangi biyolojik organizasyon düzeyinde meydana geldiği gösterilmiştir (8,9).
Tablo 1. Canlıda radyasyon hasarına yol açan olaylar (8,9)
Tablo 2. İyonlaştırıcı radyasyona bağlı görülen bazı radyobiyolojik bozukluklar (8,9)
Radyasyon DNA molekülünde birçok lezyona neden olur ve bu radyasyon hasarının oluşmasındaki kritik noktadır. Bu lezyonlara, tek-sarmal kırıklar, çift-sarmal kırıklar ve DNA-protein çapraz bağları gibi örnekler sıralanabilir. Çift-sarmal kırıklar ve çift-sarmal kırıklar ile ilişkili veya çift-sarmal kırıklarının bir sonucu olarak gelişen kromozom aberasyonları hücre ölümüyle sonuçlanan ana hasarlardır (11). Hem subletal hem de potansiyel olarak letal radyasyon hasarı onarılabilmektedir (12,13). Subletal hasar tamiri hızlı bir süreçtir ve 4-6 saat içinde tamamlanır. Fraksiyone radyoterapide iki ışınlama arası zaman aralığı DNA’ daki
8
radyasyona bağlı çift-sarmal kırıklarının tekrar birleşmesi ve tamirine imkan sağlar. Subletal hasar tamiri, hücre sağkalım eğrisindeki omuzun bir sonraki doz için kompanse edilmesi şeklinde açıklanabilir.
Çevresel faktörlerin hücre bölünmesini birkaç saatliğine önlediği durumlarda potansiyel olarak letal hasar tamiri gerçekleşebilmektedir (Örneğin in vitro olarak büyüyen hücrelerin ışınlama sonrası plato fazda kalması gibi). Işından birkaç saat sonra gerçekleşecek olan DNA replikasyonu sırasında oluşabilecek DNA hasarının tamiri eğer bölünme engellenirse, replikasyon olmadan mümkün olabilecektir. Tamir, hasarlı moleküllerin okside olmuş substratlara elektron aktaran türlerin redüksiyonu ile restorasyonu veya homolog ve non-homolog rekombinant DNA çift-sarmal kırık tamiri, baz hasarının baz eksizyon tamiri ve DNA-protein çapraz bağlarının nükleotid eksizyon tamiri şeklinde gerçekleşmektedir (14,15).
Hem radyasyon hem de kemoterapötikler; prolifere olan hücrelere olmayanlardan daha fazla etkilidir ve sitotoksik etkileri hücrelerin hücre siklusundaki bulundukları fazla ilişkilidir. Radyasyona yanıtın hücre siklusuna bağımlı oluşu ilk defa 30 yıl önce Terasima ve Tolmach tarafından bildirilmiştir (16). Buna göre radyoduyarlılık, hücrenin ışınlandığı sırada içinde bulunduğu hücre siklusuna bağlı olarak değişkenlik göstermektedir ve G2 ve M fazındaki hücreler S fazındaki hücrelerden en az 3 kat daha radyoduyarlıdır (17,18).
RADYOTERAPİYE BAĞLI AKCİĞER TOKSİSİTESİ
Radyoterapiye bağlı toksisitede uygulanan radyoterapi dozu ve ışınlanan hacim önemli rol oynamaktadır. Spinal kord, özefagus, trakea, bronşlar ve sinirler gibi fonksiyonel alt birimleri birbirine seri bağlı dokularda her bir alt birimin önemli rolü vardır. Bu nedenle seri bağlı organların küçük bir noktasının bile yüksek doz alması ciddi yan etkilere neden olabilmektedir. Akciğerler gibi fonksiyonel alt birimleri paralel bağlı organlarda ise her bir alt birimden ziyade ışınlanan hacim daha önemlidir (19). Tablo 3’te normal doku tolerans dozları özetlenmiştir (20). Tüm bu tolerans dozları eş zamanlı uygulanacak kemoterapötik ajanlar ile daha da düşmektedir.
Radyasyona en hassas dokulardan biri akciğer dokusudur. Damarlar ve alveol epiteli radyasyona karşı duyarlı iken kıkırdak dokusu ve plevra dirençlidir (9). Radyasyona bağlı pulmoner toksisite; radyasyon pnömonisi, pulmoner fibrozis ve pulmoner fonksiyonlarda azalma ile karşımıza çıkabilir. Akciğerlerde meydana gelen radyasyon hasarı, ışınlanan akciğer dokusu hacmine, uygulanan toplam doz ve fraksiyon şemasına bağlıdır (21,22).
9
Tablo 3. Radyasyon normal doku tolerans dozları (20).
TD 5/5: Beş yılda %1-5 komplikasyon oluşturan radyasyon dozu, TD 50/5 : Beş yılda %50 komplikasyon
oluşturan radyasyon dozu , Dozlar santigray cinsinden yazılmıştır.
Radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesi sık olup, özellikle belli bir dozun üzerine çıkıldığında uygulanacak radyoterapi dozlarını önemli ölçüde sınırlamaktadır. Akciğer kanseri, meme kanseri, lenfoma ve timoma nedeni ile radyoterapi uygulanan hastaların %30’unda radyoterapiye bağlı akciğer şikayetleri meydana gelir (23). Hodgkin lenfoma, özefagus kanseri ve total vücut ışınlaması sonrası kemik iliği transplantasyonu gibi kombine tedavi modalitelerinin uygulandığı durumlarda da radyoterapiye bağlı pulmoner toksisite sıklıkla görülür (3,24).
İyonlaştırıcı radyasyona bağlı akciğer hasarının mekanizması tam olarak bilinmese de sitokin aktivitesi ve oksidatif strese bağlı olduğuna dair çalışmalar vardır (24,25). SOR’u inhibe eden veya “scavenger” (temizleyici, süpürücü, toplayıcı) etki gösteren antioksidan ilaçlar iyonlaştırıcı radyasyona bağlı normal dokulardaki hasarı azaltabilir (10). İyonlaştırıcı radyasyona bağlı oluşan oksidatif hasarı en aza indirmek için radyasyondan koruyucu ajanlar (radyoprotektörler) üzerinde yapılan çalışmalar son yıllarda giderek yaygınlaşmıştır (9).
Normal dokularda radyoterapiye bağlı gelişen yan etkiler akut, subakut ve geç radyasyon komplikasyonlarıdır. Akciğerde akut/subakut radyasyon hasarı olarak radyasyon pnömonisi; geç radyasyon hasarı olarak da radyasyon fibrozisi, kronik radyasyon pnomonisi, kor pulmonale ve sağ kalp yetmezliği görülebilmektedir (2,3,26,27). Akut faz ve subakut faz tedavi zamanıyla ilişkilidir. Radyasyon pnömonisi bu iki fazda ve genellikle tedavi başlangıcından 3-6 ay sonra; kronik faz ise bir yıl ve sonrasında görülmektedir (9) (Tablo 4).
10
Tablo 4. Radyoterapi sonrası akciğerde meydana gelen akut değişiklikler (28)
Radyasyon pnömonisi akut bir komplikasyondur. Genel kural olarak ortalama akciğer dozu 10-20 Gray (Gy)’in üzerinde ise veya 13 Gy üzerinde doz alan akciğer volumü akciğerin %40’ından fazla ise veya 20 Gy üzerinde doz alan akciğer volumü akciğerin %20-30’undan fazla ise veya 30 Gy üzerinde doz alan volum akciğerin %10-15’inden fazla ise radyasyon pnömonisi gelişme riski artar (29). Standart fraksiyon ve dozlarda (1,5/2 Gy/fraksiyon/gün) tüm akciğere 18-20 Gy uygulandığında en az % 5 olguda radyasyon pnömonisi gözlenmektedir (2,3).
Radyasyon pnömonisi gelişimi radyoterapi dozu, ışınlanan akciğer volümü, fraksiyonasyon şeması ve eş zamanlı kemoterapi uygulanması gibi tedavi ilişkili faktörlere ve önceden var olan akciğer hastalığı, kötü pulmoner kapasite, sigara öyküsü ve bozuk DNA tamir mekanizması ile bozuk büyüme faktör genleri gibi bilinmeyen genetik faktörler gibi hasta ilişkili faktörlere bağlıdır (30-33). Özellikle bazı kemoterapötik ajanlar riskin artmasına sebep olmaktadır. Bu ajanlar aktinomisin-D, doksorubisin, bleomisin, busulfan, siklofosfamid ve interferonlar ve taksan grubu ilaçlardır (29).
“Radyasyon pnömopatisi” terimi akciğer radyoterapisi sonrasında başlayan ve devam eden bir süreci tanımlamaktadır. Bu birbirinden ayrı ve buna rağmen yakın ilişkili iki anormallikten oluşmaktadır (34). Bunlardan birisi akciğer radyoterapisi sonrası 12 hafta içinde oluşan, alveoler hücre harabiyetini ve interstisyel aralığa inflamatuvar hücre birikimini içeren erken inflamatuvar bir reaksiyon olan radyasyon pnömonisidir. İkincisi ise yakın geçmişe kadar irreversibl olarak tanımlanan, temel olarak fibroblast proliferasyonu, kollajen
11
birikimi ve normal akciğer dokusunun harabiyetinden ibaret olan ve geç bir yan etki olan radyasyon fibrozisidir (35).
Radyasyon pnömopatisi süreci hiç şüphesiz en merak uyandırıcı radyobiyolojik fenomenlerden biridir. Akciğer fibrozisine yol açan ya da eşlik eden interstisyel inflamasyon, normal akciğer dokusunun kaybına yol açan proinflamatuvar ve profibrotik sitokinleri içeren kompleks bir süreçtir (36).
Periferal akciğer parankimi respiratuvar bronşioller, alveoler kanallar ve alveollerden oluşmuştur. Alveoler duvar bir bazal membran yoluyla epitelle ilişki kuran endotelle kaplanmıştır. İnteralveoler interstisyel boşluk fibroblastlar, alveoler makrofajlar ve ekstrasellüler matriksten oluşmuştur (37).
İki tip alveoler epitel hücresi vardır. Tip 1 pnömositler; alveoler epitel yüzeyinin %90’ından fazlasını kaplayan squamöz epitel hücreleridir. Hasar oluşurken, ilk etkilenen ve apoptozise ilk giden ve alveoler epiteli yeniden oluşturmak için Tip 2 epitel hücrelerinin proliferasyonunun hızlanmasına yol açan hücreler, Tip 1 pnömositlerdir. Tip 2 pnömositler (granuler pnömositler); sentez yapan ve alveoler yüzeyi kaplayarak yüzey gerilimini düzenleyen pulmoner sürfaktanı sekrete eden küboidal hücrelerdir (38). Tip 2 hücre hiperplazisi alveoler hasar ve onarımının nonspesifik bir belirtecidir. Bu hücreler radyoterapiden sonraki ilk 2-6 hafta boyunca alveoler sürfaktan üretimini arttırarak yanıt verirler (39). Kapiller endoteli oluşturan kapiller hücreler “tight junction”larla birbirlerine sıkıca bağlanmıştır. Gaz transferi intraalveoler havadan tip 1 hücrelere, bazal membrana, endotelyal hücrelere ve son olarak da vasküler boşluğa doğrudur. Bronkovasküler yapılar boyunca bol miktarda bulunan lenfatik endotel, alveoler duvarlarda bulunmamaktadır.
Radyoterapi sonrası erken histopatolojik bulgular “diffüz alveoler hasar” olarak tanımlanır (40). Bu artan vasküler permeabilite ve alveoler boşlukta protein eksüdasyonuna bağlı gelişen alveoler duvar ödemini içerir (41). Damarlarda fokal nekrozla birlikte tromboz ve sonradan intraalveoler hemoraji gelişebilir. İnflamatuvar hücre infiltrasyonu (inflamasyon) belirgindir ve en azından deneysel modellerde günler içinde hızlıca yatışır. Alveoler epitel rejenerasyonu sürecinde Tip 1 pnömosit tükenmesi Tip 2 pnömosit hiperplazisine eşlik eder (42). İntraalveoler boşlukta olduğu gibi interstisyumda da fibroblast proliferasyonu ve artan kollajen birikimi patogenetik mekanizmanın anahtarıdır. Birkaç hafta içinde alveoler septa kalınlaşması ve fibrozis belirgin hale gelir (39). İnsanlarda doğrulanmamış olsa da lökosit infiltrasyonu fibrozis fazına eşlik edebilir (43). Şekil 5’de radyasyon pnömopatisinin şematizasyonu görülmektedir.
12
Şekil 5. Radyasyon pnömopatisinin şematizasyonu (39).
İnterstisyumda normal koşullarda iki tip fibroblast bulunmaktadır. Bunlar epitele paralel yerleşen ve ekstrasellüler matriksin yapısal elementleriyle ve alveoler duvara dik yerleşmiş myofibroblastlarla çok yakından ilişkili olan en yaygın fibroblast tipleridir. Myofibroblastlar kontraksiyon yeteneğine sahiptir (44).
Alveoler makrofajlar alveoler fizyolojide önemli rol oynarlar. Aktive makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler için mitojenik ve kemotaktik özellikli çeşitli sitokinler üretirler, ayrıca fibroblastlar ve endotelyal hücreler üzerinde direkt rol oynarlar. Alveoler duvarın
13
ekstrasellüler matriksi bazal membran ve fibroblastlar ile damarlar arasındaki interstisyel matriksten oluşur. Ekstrasellüler matriks proteoglikanlar, fibronectin, laminin, entactin, Tip 4 ve Tip 7 kollajen içerir (45). Alveoler epitelyal ve endotelyal hücreler sentez yaparlar ve bazal membranı korurlar. Literatürde radyasyon pnömopatisi boyunca ekstrasellüler matriksin miktar ve kalitesinde değişiklikler oluştuğu gösterilmiştir. Tip 1/3/4 kollajen ve fibronectin seviyelerinde yükselme gösterilmiş ve radyoterapi uygulanmasının ardından 8 hafta boyunca bu yükselmenin devam ettiği belirtilmiştir (46). En dramatik yükselme endotel bazal membranının önemli bir komponenti olan Tip 4 kollajende görülür.
Radyasyon pnömonisi değerlendirilmesi güç bir antitedir. Geniş akciğer volümleri ışınlandığında ya da yüksek dozlar uygulandığında (<50 Gy) özellikle de radyoterapi kemoterapiyle kombine edildiğinde semptomların oranı ve şiddeti artar. Erken gelişen radyasyona bağlı akciğer toksisitesi, kortikosteroid ve antibiyotik tedavisiyle kontrol altına alınabilecek, düşük ateş, hafif öksürük ya da hafif dispne gibi nonspesifik respiratuvar semptomlardan ibarettir. Akut pnömoni fazı radyoterapiden sonraki 12 haftalık zaman dilimi içinde oluşur. Akciğere radyoterapi uygulanan hastaların %50-90’ında radyografik ve solunum fonksiyon testi anormallikleri oluşur (39,47).
Akciğeri, mediastinal lenfatikleri ve memesi ışınlanan hastalarda sırasıyla 50, %5-10 ve %1-5 oranında klinik olarak anlamlı semptomatik radyasyon pnömonisi oluşur ve bu hastalardaki en yaygın klinik toksisitelerden biridir. Radyasyon pnömonisi riski verilen dozun sınırlandırılmasına neden olur ve bu nedenle tümör kontrolüne engel olabilir. Hastaların büyük bir bölümü subklinik radyasyon pnömonisi geçirir (örneğin solunum fonksiyon testlerinde bozulma ve/veya radyolojik değişiklikler, bu kronikleşebilir ve hastanın gelecekte oluşabilecek kardiyopulmoner stres ile mücadelesi için rezervini azaltabilir) (48,49).
Tablo 5’te Radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesi için oluşturulmuş değişik gradeleme sistemleri gösterilmiştir
Önerilen doz/volüm sınırları tartışmalıdır çünkü açık ve tutarlı eşik değerler yoktur ve kabul edilebilir risk seviyesi klinik tabloya göre değişkenlik gösterir. Akciğer kanseri için radyoterapi sahaları hedef volüme uygun olarak geniş tutulabilir, doktor ve hastalar sıklıkla önemli ve anlamlı pulmoner riskleri kabul etmek durumunda kalırlar. Ayrıca, hastalar arasında radyoterapi öncesi akciğer fonksiyonları açısından belirgin farklılıklar vardır ve bu semptom gelişimini etkileyebilir ve radyoterapi sonrası tümöre bağlı disfonksiyon gelişebilir.
14
Bu uyarılara rağmen, küratif tedavi edilen küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda eğer radyasyon pnömonisi riskini ≤ %20 sınırında tutmak isteniyorsa V20 ≤ %30-35 ve MLD ≤ 20-23 Gy (konvansiyonel fraksiyonasyonla) sınırı içinde tutmak için ihtiyatlı olunmalıdır. Santral havayollarına ≤ 80 Gy doz uygulanması bronşiyal striktür riskini azalttığı gösterilmiştir (50).
Tablo 5. Radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesi için oluşturulmuş değişik gradeleme sistemleri (50)
Şekil 6’da akciğer kanseri nedeniyle akciğere radyoterapi uygulanan hastada oluşan radyografik değişikliklerin bilgisarlı tomografi görüntüsü verilmiştir.
15
Şekil 6. Akciğer kanseri nedeniyle toraksa uygulanan radyoterapi sonrası radyografik değişikliklerin bilgisayarlı tomografi görüntüleri: A- Grade 1; buzlu-cam görünümü, B- Grade 2; düzensiz konsolidasyon, C- Grade 3; ışınlanan alana uyan daha düzenli ve birleşik konsolidasyon alanı (50)
Akciğer fibrozisi daha önceden ışınlanan alanda sinsice gelişir ve radyoterapi sonrası 1-2 yıl içerisinde tamamiyle yerleşir (39). Klinik olarak bulgular, fibrozis gelişen akciğer parankimi miktarına bağlıdır. Semptomları, şiddetli dispne ve son evrelerinde ortopne, siyanoz, solunum yetmezliği ve cor pulmonale gibi farklı derecede bulgulardan oluşmaktadır. Seppenwoolde ve ark (51) larının yaptığı bir çalışmada nedeni tam olarak ortaya konamamakla birlikte akciğer kanserinde alt lob yerleşimli tümör nedeniyle ışınlanan hastaların radyasyon pnömonisi açısından çok daha yüksek riske sahip olduğu gösterilmiştir.
16
Radyasyon Pnömonisi İçin Predispozan Faktörler
1. Radyasyon dozu: Radyasyon pnömonisi için eşik değer 30 Gy’dir. Ancak burada
radyasyona maruz kalan akciğer volümü çok büyük önem taşımaktadır. Örneğin; tüm akciğerin %25’ine fraksiyone olarak 30 Gy uygulandığında herhangi bir semptom olmayabilir. Ancak aynı doz bütün akciğer alanlarına uygulanırsa fatal olabilir. Yirmidört çalışmadan toplam 1911 hastanın alındığı bir çalışmada 45 Gy altında radyasyon pnömonisi insidansı %6, 55 Gy üzerinde ise %12 olarak bildirilmiştir (52).
2. Işınlanan akciğer volümü: Radyasyona maruz kalan normal akciğer dokusu ne
kadar azsa radyasyon pnömoniside o kadar az olur. Bu açıdan üç boyutlu-konformal RT geleneksel RT yöntemlerine göre iki-dört kat avantaj sağlamaktadır. Ayrıca, akciğerin tabanında alveol sayısı daha fazla olduğu için bu bölgeye RT uygulanması durumunda apekse göre radyasyon pnömonisi daha çok görülmektedir. Eşik volüm, bazal akciğer alanları için %10, apeks için %30-40’tır. Altmış hastanın alındığı bir çalışmada alt akciğer alanları ışınlandığında radyasyon pnömonisi sıklığı %70, üst alanlar için ise %20 olarak bildirilmiştir. 25 Gy doz %30’dan fazla akciğer volümüne verildiğinde radyasyon pnömonisi %38, %30’dan az volüme uygulandığında ise %4 oranında görülmüştür (52).
3. Fraksiyon dozu ve sayısı: Günde iki kez uygulamada bir kez uygulamaya göre
daha az sıklıkta radyasyon pnömonisi görülmektedir. Günde 2.67 Gy dozu tek seferde alanlarda, iki seferde alanlara göre riskin arttığı gösterilmiştir (52).
4. Küçük volüme yüksek doz mu, büyük volüme düşük doz mu?: Çalışmalar 10
Gy altındaki dozları büyük bir akciğer volümüne vermenin daha uygun olacağını düşündürmektedir. Ancak daha yüksek dozlarda bunun tersinin daha uygun olacağı ifade edilmektedir. Elbette ideal olanı mümkünse hem RT dozunu hem de ışınlanan akciğer volümünü sınırlamaktır. Ancak tümör dozunu azaltmanın aynı zamanda tümör kontrolünü de azaltacağı düşünülerek normal akciğerin korunması için gerekli önlemleri almak daha akılcı olacaktır (52).
5. Eş zamanlı kemoterapi uygulaması: Bağımsız bir risk faktörüdür. Bu konuda
özellikle doksorubisin, aktinomisin-D, busulfan, bleomisin, gemcitabine, mitomisin, irinotekan ve taksan grubu ilaçlar suçlanmaktadır. Beş klinik çalışmadan toplam 461 hastanın
17
alındığı bir derlemede üçüncü derece ve üzerinde akciğer toksisitesinin eş zamanlı sisplatinli kemoradyoterapi alanlarda %20, ardışık alanlarda ise %10 oranında görüldüğü bildirilmiştir.
Eş zamanlı RT ve paklitaksel alan hastalarda %70’lere varan ikinci derece ve üzeri akciğer toksisitesi bildirilmiş, ancak bazı çalışmalarda da performans durumunun riski arttırmadığı görülmüştür. İrinotekanla ilgili çalışmalarda irinotekan alanlarda %56, almayanlarda ise %14 radyasyon pnömonisi bildirilmiştir. Dosetaksel ve eş zamanlı konvansiyonel RT alan hastalarda üçüncü derece ve üzeri radyasyon pnömonisi %47, fatal seyreden radyasyon pnömonisi oranı %19 olarak bildirilmiştir (52).
6. Daha önce RT uygulanmış olması: Hodgkin lenfoma nedeniyle daha önce RT
uygulanan hastalarda tekrar RT uygulanması durumunda radyasyon pnömonisi görülme oranının %15, ilk kez uygulananlarda ise %6.4 olduğu bildirilmiştir (52).
7. Önceden kullanılan steroidlerin kesilmesi: Hodgkin lenfoma nedeniyle steroid
kullanan hastalarda steroid kesildikten hemen sonra radyasyon pnömonisi geliştiğinin görülmesi üzerine özellikle yüksek doz steroidlerin hızlı kesilmesi durumunda radyasyon pnömonisini aktive edebileceği tezi ortaya atılmıştır (52).
8. Kötü performans durumu: Performans durumu 1 olanlarda %16, 0 olanlarda ise
%2 oranında radyasyon pnömonisi bildirilmiştir (52).
9. Altta yatan başka akciğer hastalığı varlığı: Altta yatan akciğer hastalığı olanlarda
radyasyon pnömonisi riskinin arttığını gösteren çalışmalar mevcuttur. Bir çalışmada radyasyon pnömonisi gelişen gruptaki hastaların %47.1’inde altta yatan akciğer hastalığı olduğu, %5,3’ünde ise olmadığı görülmüştür. PaO2 80 mmHg’nın altında olanlarda radyasyon
pnömonisi %19, üzerinde olanlarda ise %5 oranında görülmüştür. Bir başka çalışmada da KOAH’lılarda radyasyon pnömonisi riskinin 4,82 kat arttığı gösterilmiştir. Sigarayla ilgili çalışmaların sonuçları çelişkilidir. Bir çalışmada aktif sigara içiminin radyasyon pnömonisinden koruduğu bildirilmiş, bir başka çalışmada ise daha önce sigara içmiş olmanın radyasyon pnömonisi riskini arttırdığı gösterilmiştir. Sigaranın radyasyon pnömonisine etkisine ilişkin daha ileri çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır (52).
18
10. Yaş ve cinsiyet: Yaşla ilgili olarak yapılan bir çalı şmada yaşlılarda radyasyon
pnömonisinin daha yaygın olduğu, ancak daha ciddi olmadığı, diğer bir çalışmada ise bunun tam tersinin olduğu iddia edilmiştir. Bugün için yaş, radyasyon pnömonisinde bağımsız bir risk faktörü olarak kabul edilmemektedir (52).
11. Genetik: Başka herhangi bir risk faktörü olmadığı halde yine de bazı hastalarda
radyasyon pnömonisi görülmesi nedeniyle genetik yapı farklılıklarının da radyasyon pnömonisi gelişiminde etkili olabileceği düşünülmektedir. RT’ye bağlı akciğer hasarında M6P/IGF2R geninin rol oynadığı ve bu genin kaybının radyasyon pnömonisi riskini arttırdığı düşünülmektedir (52).
Tedavi
Hastaların büyük çoğunluğu subklinik ya da hafif semptomlu olduğu için tedavi gerektirmemekte ve kendiliğinden rezolüsyona uğramaktadır. RT portuna uyan alanda hafif değişikliklerin olduğu hastalarda sadece izlem önerilmektedir. Ayrıca, minör semptomların ileride ciddi bir hastalık gelişeceğinin habercisi olmadığı da bilinmelidir (29).
Radyasyon pnömonisi tedavisinin temel taşı sistemik steroidlerdir. Deneysel çalışmalar ve klinik tecrübeler steroidlerin yararını desteklemektedir. Tavşanlarda yapılan bir çalışmada steroidin erken kesildiği grupta mortalitenin daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Hastaların yaklaşık %80’i steroid tedavisine iyi yanıt vermektedir. Steroid dozu konusunda kesin bir görüş olmamakla birlikte 1 mg/kg veya ciddiyetine göre 60-100 mg prednizonla başlanması ve iki haftada bir 10 mg azaltılarak üç-dört ayda kesilmesinin uygun olacağı düşünülmektedir. Hatta dispne ve öksürük düzelinceye kadar başlangıç dozunda devem edilmesi ve düzeldikten sonra doz azaltılmasının uygun olacağı da ileri sürülmektedir. Ayrıca, özelikle lipooksijenazı inhibe eden nonsterid antiinşamatuvar ilaçların steroidlerin etkisine katkıda bulunduğu da bildirilmiştir. Hastalığın ciddiyetine göre istirahat, bronkodilatatör ve oksijen tedavisi de yararlı olmaktadır. Yüksek doz inhale steroidlerle ilgili yeterli çalışma bulunmamakta ve genellikle olgu sunumları şeklinde yayınlar yer almaktadır (29).
Pentoksifilin, metil ksantin türevidir ve TGF-β inhibisyonu yapmaktadır. Ancak henüz penroksifilinin rutin kullanımını destekleyecek yeterli çalışma bulunmamaktadır. Azatioprin ve siklosporin, sistemik steroidleri tolere edemeyenlerde kullanılabilir. Ancak bu konuda da yeterli çalışma bulunmamaktadır (29).
19
Tedaviye bağlı komplikasyonların önlenmesinde modern radyoterapi teknikleri önemli rol oynamaktadır. Stereotaktik radyoterapi, 3-boyutlu konformal radyoterapi, yoğunluk ayarlı radyoterapi ve görüntü kılavuzluğunda radyoterapi gibi daha konformal radyoterapi uygulamaları kritik normal dokuların aldığı dozları sınırlandırmakta büyük avantaj sağlamakta ve böylece tedaviye bağlı komplikasyonlar daha az görülmektedir. Radyoterapi tekniğinin yanında, hastanın eğitimi ve yaşam stilinde yaptığı değişiklikler de (örneğin; sigarayı bırakmak, diyetteki değişiklikler, kilo kontrolü) oldukça önemli rol oynamaktadır (53).
Sonuç olarak, mediastinal tümörler nedeniyle radyoterapi uygulanacak olan hastalarda hastaya ait risk faktörleri ve uygulanacak ek tedaviler göz önüne alınarak en uygun radyoterapi planı ve tekniği seçilmeli, olgular sıkı takip edilmeli ve komplikasyon geliştiği taktirde gerekli tedaviler uygulanmalıdır.
Prognoz
Ciddi radyasyon pnömonisinin mortalitesi %50’ye kadar çıkmaktadır. Meme CA nedeniyle toraksa RT alanlarda radyasyon pnömonisinin mortalitesinin %2-3 olduğu bildirilmiştir (54).
Radyasyon Pnömonisinden Korunma Yöntemleri 1. Yeni radyoterapi teknikleri:
Sürekli hiprefraksiyone akselere radyoterapi: Günde üç fraksiyon (1.5 Gy), 12 günde total 54 Gy uygulamanın riski azalttığı düşünülmektedir. Bir çalışmada sürekli hiprefraksiyone akselere radyoterapi ile semptomatik radyasyon pnömonisi oranı %10 iken konvansiyonel RT ile bu oranın %19 olduğu bildirilmiştir (55).
Üç boyutlu konformal radyoterapi: Daha küçük radyasyon alanı, daha küçük fraksiyon ve tümöre daha yüksek radyasyon imkanı sağlamaktadır. Özellikle 25 Gy ve üzerinde RT alan hastalarda bu yöntemle radyasyona maruz kalan ortalama akciğer volümünün ipsilateral akciğerde %11, karşı akciğerde ise %51 oranında daha az olduğu gösterilmiştir. Bu açıdan üç boyutlu konformal radyoterapi (3D-CRT) geleneksel RT yöntemlerine göre iki-dört kat avantaj sağlamaktadır. Paklitaksel-karboplatinle birlikte 3D-CRT uygulanan 62 hastalık bir çalışmada sadece bir hastada iki derece ve üzeri radyasyon pnömonisi bildirilirken, 18
20
hastanın alındığı ve 92,4-102,9 Gy RT uygulanan hastaların hiçbirinde ikinci derece ve üzeri radyasyon pnömonisi olmadığı saptanmıştır (56).
Yoğunluğu ayarlanmış radyoterapi “Intensity Modulated Radiotherapy”: Burada helikal BT kullanılmaktadır. Konvansiyonel RT’ye göre ışınlanan normal akciğer volümünü %10-20 oranında azaltırken hedef dokuya RT dozunu arttırmaktadır. 3D-CRT ile karşılaştırılan bir çalışmada yoğunluğu ayarlanmış radyoterapi ile radyasyon pnömonisi %7, 3D-CRT ile %13 olarak bildirilmiştir (56). Bu tekniğin kullanımı henüz sınırlıdır ve yeterli çalışma bulunmamaktadır.
“Boost” radyoterapi: Büyük alanlara düşük doz, tümöre yüksek doz RT esasına dayanmaktadır. Konvansiyonel RT’ye üstün olduğunu gösteren çalışmalar bulunmaktadır. Proton RT, karbon-iyon RT gibi yeni yöntemler de bulunmaktadır. Ancak henüz sınırlı kullanımları vardır. 3D-CRT ve yoğunluğu ayarlanmış radyoterapi ile normal akciğere verilen ışın dozu azalmakta ve tümör yanıtı korunmaktadır. Bu tekniklerde hasta immobilize edilmektedir. Ancak akciğer ve göğüs duvarı inspiryum-ekspiryum nedeniyle hareketli dokular oldukları için diğer organlardaki gibi tam bir immobilizasyon sağlanamamakta ve az ya da çok normal akciğer dokusu da RT’ye maruz kalmaktadır. 3D-CRT’de derin inspiryum nefes tutma tekniğiyle bu sorun da aşılmaya çalışılmaktadır (56).
2. Radyoprotektif ilaç tedavisi: Profilaktik amaçla RT’den önce prednizolon ve
azatioprin kullanılan hastalarda etkili olduklarını gösteren çalışmalar kadar herhangi bir etkilerinin olmadığını gösteren çalışmalar da bulunmakta ve rutin kullanılmamaktadırlar.
Amifostin (aminothiol) serbest oksijen radikallerini azaltmakta ve bu yolla radyasyon pnömonisinden korunmada da yararlı olabileceği düşünülmektedir. Amifostinin profilaktik olarak haftada iki-dört kez 500 mg kullanıldığı eski çalışmalarda etkili olduğu bildirilmiştir. Ancak yeni Faz III çalışmalar bu sonucu doğrular nitelikte değildir. Anjiotensin inhibitörü olan ve thiol içeren kaptoprille ilgili olarak yapılan deneysel çalışmalarda radyasyon pmönonisi ve fibrozisinden koruduğu gösterilmiş, ancak retrospektif analizlerde hipertansiyon nedeniyle kaptopril kullanan hastalara bakıldığında radyasyon pnömonisi sıklığını azaltmadığı görülmüştür (57).
21
Pentoksifilinle ilgili olarak yapılan plasebo kontrollü bir çalışmada karbonmonoksit diffüzyon kapasitesini koruduğu görülmüştür. Ancak rutin kullanımını destekleyecek düzeyde çalışma bulunmamaktadır.
Ayrıca, melatonin, karvediol, süperoksit dismutaz, TNF-α inhibitörleri, şutikazon, selektif siklooksijenaz (COX)-2 inhibitörleri gibi çeşitli ilaçlar üzerinde araştırmalar devam etmektedir.
RADYOTERAPİNİN OLUMSUZ ETKİLERİNİN GENETİK
PREDİKTÖRLERİ
Radyasyonun olumsuz/yan etkileri genel olarak radyasyon tedavisine verilen istenmeyen klinik ve fizyolojik yanıtlar olarak tanımlanmaktadır. Klonojenik tümör hücrelerinin yok edilmesi ve bunları çevreleyen normal dokuların hasar görme oranını minimize etme işlemleri arasındaki dengeyi sağlamak adına her iki dalda uğraşan bilim adamları ve klinisyenlerce olumsuz yanıtlara neden olan mekanizmalar üzerinde çalışmalar yapılmaktadır (58-62).
Genetik Faktörler ve Radyosensitivite
Radyoterapi sonrası oluşan normal doku reaksiyonlarının şiddetinin değişkenliğine hasta, tümör veya tedaviyle ilgili, hücresel ve moleküler faktörler etki etmektedir. Yaş, nutrisyonel durum, medikasyon, vücut habitusu ile diyabet veya yakın zamanda geçirilen cerrahi uygulamalar gibi var olan morbiditeler gibi hasta karakteristiklerinin tümü radyasyon toksisitesine katkıda bulunabilir (63). Boyut, histoloji ve tümörün evresi (grade) gibi tümörle ilgili faktörler de radyoterapiyi etkileyebilir. Tedavi edilen volüm, alan boyutu, anatomik prescription point, total doz, fraksiyon başına uygulanan doz ve eşzamanlı kemoterapi uygulaması gibi tedaviyle ilgili parametrelerdeki değişiklikler de yanıt heterojenitesine etki edebilir. Normal dokularda aşırı doz–yanıt ilişkisi nedeniyle, doz uygulamaları arasındaki farklar sonuçlarda değişikliğe yol açabilmektedir (64,65). Buna ek olarak, bireysel genetik farklılıkların da radyasyona verilen olumsuz yanıtlara etkisi olabileceği hipotezi öne sürülmektedir (66-71). Bu teoriyi destekleyen bulgular, meme kanseri hastalarından oluşan bir kohortta radyasyon kaynaklı telenjiektazi oluşumunun insidansı ve zamanını inceleyen bir çalışmadan elde edilmiştir (72). Tek tip radyasyon tedavisine rağmen, bu hasta popülasyonunda geniş aralıkta değerler rapor edilmiştir. Radyoterapi gören hastaları üzerinde daha önce yapılan analizlerle uyumlu olarak, gözlenen farklılıkların yaklaşık %80 ila %90’ muhtemelen bireysel genetik farklılıklardan kaynaklanan deterministik etkilere yorulurken,
22
sadece %10 ila %20’sinin radyasyonun indüklediği hücre ölümünün rastgele yapısıyla dozimetri ve doz yayılımındaki rastgele farklarla ilişkili stokastik olaylarla ilgili olduğu düşünülmektedir (65,73,74).
Normal Doku Radyosensitivitesinde Tahminsel Çözümlemeler Hazırlama Yönündeki Çabalar
Radyoterapi hastalarındaki normal doku hasarının boyutunu hesaplama gücüne sahip in vitro bir radyosensitivite çalışması geliştirmek uzun süreli araştırma gerektirmektedir (75). Sınırlı başarıya rağmen bu hedefi gerçekleştirme çabaları devam etmektedir çünkü radyasyonun istenmeyen etkilerini tahmin edebilmedeki üst düzey duyarlılık radyoterapi protokollerinin bireysel bazda uyarlanıp etkin şekilde uygulanabilmesine olanak sağlayacaktır. Bu şekilde, terapötik indekste önemli ölçüde iyileşme olacağı tahmin edilmektedir (73,76).
İrradyasyon sonrası sonucu öngören ve böylece tedavi yönergesine rehberlik eden bilgileri klinisyene sağlayan sayısız çalışma yapılagelmektedir ama bunların hiç biri güncel uygulamalarda yerini sağlamlaştırmış değildir. Bu çalışmaların başarısını sınırlayan en büyük güçlükler sensitivite ve spesifite, prosedürlerin teknik yükü, çalışmanın yapıldığı hücrelerin yetersiz karakterizasyonu ve normal doku radyobiyolojisinin kompleks yapısı gibi etmenlerdir (77).
Moleküler Yaklaşımlar
Hangi hastanın radyoterapinin olumsuz etkilerine karşı daha hassas olabileceğini öngören bir çalışma yapmak yönündeki birçok ve çeşitli girişimlere rağmen bu güne dek hiçbir çalışma radyoterapi gören hastalarda oluşabilecek yan etkileri doğru ve tutarlı bir şekilde hesaplayabilmiş değil. Fakat moleküler biyolojideki yeni teknolojiler prediktif bir çalışma geliştirmek adına klinik uygulanabilirliği olan yeni stratejiler üretebilir (78). Bireyler arasında, farklı genlerin ekspresyon paternlerini baz alan, radyasyona normal doku sensitivitesinin varyasyonlarını öngörebilecek gen ekspresyon dizilimlerinin kullanımı ile ilgili çalışmalar devam etmektedir (79-84). Bir dizi çalışmada, insan tümörlerinde tedavi öncesi ekspresyon profillemenin gücü ortaya konmasına rağmen normal dokularda radyasyonun indüklediği toksisitenin boyutunu değerlendiren geniş skalalı çalışmalar henüz yapılmamıştır. Buna ek olarak, primer olarak sitokin yanıtlarına odaklanılarak morbiditeyle anlamlı korelasyonlar ortaya konmuştur (85). Başka bir moleküler yaklaşım da, irradyasyon sonrası DNA çift iplik kırılmaları oluşturan DNA bağlayıcı (end-binding) komplekslerinin
23
analizini içermektedir. SF2’ ile ölçüldüğü şekilde hücresel radyosensitivite ile ATM içeren
komplekslerin seviyeleri korelasyon halindedir. Bu yeni moleküler yaklaşımlar umut verici görünse de henüz herhangi birinin klinik uygulanabilirliği olup olmayacağı bilinmemektedir (86).
“Genetic Predictors Of Adverse Radiotherapy Effects” Projesi
Radyasyonun indüklediği komplikasyonları yaşama ihtimali daha yüksek hastaların hangileri olabileceğini hesaplayabilen alternatif bir çalışma geliştirmek adına, klinik radyosensitiviteyle bağlantılı genetik faktörleri tanımlayan bir araştırma programı başlatılmıştır. Genetic Predictors Of Adverse Radiotherapy Effects (Gene-PARE) projesinin amacı, radyosensitiviteyle bağlantılı genetik faktörleri tanımlayarak hangi hastanın radyasyon tedavisi sonrası komplikasyonlar geliştirme ihtimalinin daha yüksek olduğunu öngörebilecek bir sistem geliştirmektir. Bu düşünceden yola çıkarak bu projede, radyasyonun indüklediği normal doku hasarının tahmin edilebilen boyutta olduğu, genel popülasyondan bu bireyleri ayırt edebilme amaçlanmıştır. Radyasyona karşı hassasiyeti yüksek olan bu hastalar için cerrahi tedavi daha uygun olsa da paradoksal şekilde aslında bu hastalar için radyasyon tedavisi en uygun tedavi olabilir çünkü bu hastaların sahip olduğu kanser tiplerinde radyosensitiviteyle bağlantılı benzer sekansta değişimler yaşanabilir. Bu, potansiyel radyoterapi dozu modifikasyonuna işaret edebilir çünkü radyosensitivitesi olan tümörler, genetik olarak farklılığı olmayan aynı tipteki tümörlere oranla teorik olarak daha az tedavi dozuna gerek duyarlar. Tam tersi şekilde, radyosensitiviteyle ilgili genetik değişkenlere sahip olmayan geniş çoğunluktaki hasta popülasyonu için doz artışı mümkündür ve kanserin iyileşme oranı potansiyel olarak daha fazladır.
Ataksi Telenjiektazi Mutasyon Geni ve Klinik Radyosensitivitede Rolü
Genetic Predictors Of Adverse Radiotherapy Effects projesinin ilk yılları boyunca ATM geni ve radyosensitiviteyle bağlantısı üzerindeki incelemelere büyük önem verilmiştir ve bu da radyasyona olumsuz yanıtın prediktörleri olarak ele alınan diğer genetik değişkenlerin incelenmesinin önünü açmıştır (87-90). ATM proteini; hücresel stres yanıtı, hücre siklusu kontrol noktası ve DNA onarımı ile bağlantılı protein kinaz olarak işlev görür. Bu fonksiyonların kaybı azalmış DNA onarımı yeterliliğine ve defektif hücre siklusu kontrol noktası kontrolüne neden olabilir. Fonksiyonu olmayan ATM proteini üreten ve bunun sonrasında iyonize edici radyoterapiye yıkıcı yanıtlar veren hastalar arasındaki klinik bağlantı
24
tanımlanmıştır (91,92). Buna ek olarak, ATM’de mutasyon için heterozigoz olan bireylerden elde edilen hücrelerin, Ataksi telenjiektazi teşhisi konan hastalarla ATM taşıyıcısı olmayan hastalarda görülen radyosensitivitenin seviyesinin arasında bir noktada radyosensitiviteye sahip olduğu gözlemlendi (93-98).
Klinik radyosensitivitede ATM değişkenlerinin rolünü inceleyen ilk çalışmalarda, meme kanseri hastalarında, ATM mutasyon statüsü ve artmış normal doku hasarı arasında pozitif korelasyon saptanmadı. Fakat, tüm bu çalışmalarda protein truncation test kullanıldı ve bu da sadece protein truncation olayına neden olan genetik değişimleri tespit etmekteydi (99-103). Bu raporların ardından, protein truncation’dan ziyade amino asit substitüsyonuyla sonuçlanan yanlış anlam mutasyonunun kanser hastalarında daha yoğun olduğu ve bu yüzden bunların ATM mutasyon durumunu değerlendirmede daha uygun bir DNA alterasyonu türü olduğu konusunda bulgular elde edildi (104-106).
İlave Radyosensitiviteye Aday Çalışma Altındaki Genler
Artık ATM’nin klinik radyosensitivite ile ilişkili bir gen olduğunu kanıtlayan deliller olmasına rağmen yine de olumsuz radyoterapi yanıtından sorumlu tek gen değişiminin bu olmadığı sanılmaktadır. Artmış radyasyon yanıtıyla bağlantılı olduğu düşünülen ilave radyosensitivite aday genleri TGF-1, XRCC1, XRCC3, SOD2, ve hHR2 genlerini içermektedir. TGF-1 ile kodlanan bir protein ola, hücre büyümesi ve immünsupresif aktivitelerin düzenlenmesinden sorumlu, anahtar konumunda olan bir sitokindir. Bu, ayrıca ekstrasellülerr matriks proteinlerinin çökelmesiyle de ilişkilidir ve radyasyonun sebep olduğu fibroziste önemli rol oynamaktadır. XRCC1 proteininin birincil görevi radyasyon nedeniyle oluşan hasarın tamirinde ana çekip çıkarma görevindeki enzimlerin yönlendirmesini sağlamaktır. Fonksiyonel bir XRCC1 proteininin eksikliğini çeken hücreler radyasyona karşı hiper-sensitivite gösterir. Radyasyon nedenli DNA çift zincir kırıklarının recombinant tamirinde XRCC3 gerekir. SOD2, irradyasyoun indüklediği rektif oksijen türlerine karşı önemli bir hücresel antioksidan koruma görevi gören manganez süperoksit dismutazı tanımlar. hHR21, DNA çift zincir kırıkları ve eş kromotid yapışıklıklarının tamirinde, apoptozda gereken mayadaki rad21 in insan homoloğudur (107).
Transforming growth faktör-beta geni:
Radyasyon pnömonisi ve fibrozisinde solübl mediatörler ve sitokinler de önemli rol oynamaktadır. Bunlardan en önemlisi TGF-β’dır. TGF-β, lenfosit ve fibroblastları stimüle
25
eder ve yoğun fibronektin, kollagen üretimi ve fibrozis gelişimine yol açar. RT’den 1-14 gün sonra TGF-β gen ekspresyonu artmakta ve RT süresince de persistan olarak yükselmektedir. Ayrıca, RT bitikten sonra yüksek kalmasının radyasyon pnömonisinin prediktörü olabileceği düşünülmektedir. Ancak unutulmamalıdır ki sitokinler aynı zamanda tümörlerden de salgılanabilmektedir (107)
Superoksid dismutaz geni:
Superoksid dismutaz geni (SOD), süperoksitin hidrojen peroksite dismutasyonunu katalize eden bir metaloenzimdir (108). Süperoksit anyonu nitrik oksit ile reaksiyona girer ve normal durumlarda indirekt olarak vasküler basıncın düzenlenmesinde rol oynar; inflamasyon durumlarında ise toksik nitrojen metabolitlerin oluşmasında yer alır. Böylece, SOD hücre içi ve dışı O2, H2O2 ve nitrojen metabolitlerinin düzenlenmesine katılır (109). Oksijen kullanımı
yüksek olan dokularda SOD aktivitesi fazla, buna karşılık hücre dışı sıvılarda SOD aktivitesi çok düşüktür (110). Ökaryotlarda üç çeşit SOD enzimi bulunmaktadır; hücre sitozolünde bulunan bakır ve çinko içeren homodimer, bakır-çinko süperoksitdismutaz (CuZnSOD=SOD1); mitokondride bulunan ve mangan içeren homotetramer mangan süperoksit dismutaz (MnSOD=SOD2); hücre dışında bulunan, bakır ve çinko içeren homotetramer ekstrasellüler süperoksit dismutaz (ECSOD=SOD3) (111).
Süperoksit Dismutaz 2 enzimi süperoksit radikalini dismutasyona uğratarak hidrojen perokside ve moleküler oksijene dönüşümünü sağlar. Organizmada, substrat olarak serbest radikal kullanan tek enzim süperoksit dismutazdır.
Süperoksit Dismutaz 2, bakteriden insana kadar, bütün aerobik organizmalarda bulunan bir metaloenzimdir (112). Mitokondride bulunan diğer enzimler gibi SOD2 geni tarafından kodlanır. SOD2 geninin transkripsiyonu sonucunda 3 küçük (1 kb) ve bir büyük (4,2 kb) olan mesenger RNA sitozole çıkar (113). Buradaki translasyon sürecinde 222 amino asit içeren SOD2 alt birimi meydana gelir. SOD2’nin translasyon sonrası mitokondri içine girmesi gereklidir.
Süperoksit Dismutaz 2’nin süperoksitin hücrelere zarar vermemesi için, çok önemli koruyucu görevi vardır. SOD2 radyasyon vb. aksi koşulardan dolayı oluşan oksidatif strese hücrenin direnmesini sağlayarak hücrenin yaşamasında önemli yer alır (114). SOD2’nin seviyesinde olan değişikliklerin bir çok hastalık ile ilişkisi vardır, bunların arasında Parkinson hastalığı (115), Alzheimer hastalığı (116), yaşlanma (117), ateroskleroz sayılabilir (118). SOD2 aktivitesinin kanserde değişiklik gösterdiği bildirilmiştir (119). Düşük SOD2 aktivitesi
26
birçok değişik tümör tipinde görülmüştür (120). SOD2’nin yüksek seviyede (overekspresyon) olması, meme kanseri, prostat kanseri (121) ve insan glioma hücrelerinde (122) tümör oluşumuna engel olmaktadır. Bunun sonucu olarak SOD2’nin birçok tümör oluşumunda baskılayıcı (süpresor) olduğu tahmin edilmektedir (123,124).
Enzimatik analizler kullanılarak insanın SOD2 geninin 6.kromozomda bulunduğu ilk olarak Creagan ve ark. 125) tarafından 1973 aydınlatılmıştır.
Süperoksit Dismutaz 2’ın promoter bölgesinde üç özel mutasyonun görülmesi ilgi çekici olmuştur (Şekil 7) (126,127).
Şekil 7. Süperoksit Dismutaz 2 enziminin yapısı (a) Homodimer; mavi ve yeşil monomer, aktif bölgedeki mangan kofaktörü pembe küre ile gösterilmiştir. (b) Tek mnomerin pembe Mn kofaktörü ve altı-koordinatlı aktif bölge. N-terminal α-heliks bölgesi lila renkli ve α-heliks yapısı mavi, antiparalel β-kırmalı tabaka yapısı ise sarı olarak gösterilmektedir. (c) Altı-koordinatllı aktif bölgedeki mangan iyonunun ve ona bağlı 4 protein kalıntısının yakından görüntüsü (127).
Birçok kanserde, intronik bölgelerde metilasyon ve yüksek AP-2 seviyesinden dolayı SOD2’nin sentezi azalmaktadır (128). Bazı normal dokularda düşük seviyede görülen SOD2’nin sentezi sitokinler (IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α), lipopolisakarit ve alkol gibi çok sayıda
27
madde tarafından arttırılmaktadır. Bundan ötürü SOD2’nin stresten sorumlu gen olduğu öne sürülmektedir (129).
28
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı, Patoloji Anabilim Dalı ve Biyofizik Anabilim Dalı tarafından Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.
Çalışmamız Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu onayı alınarak gerçekleştirilmiştir. (Ek-1).
DENEY PROTOKOLÜ
Çalışmada Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvar’ından temin edilen, başlangıçta ortalama ağırlıkları 200 gr olan 30 adet dişi ve ortalama ağırlıkları 260 gr olan 30 adet erkek olmak üzere toplam 60 adet Wistar Albino cinsi rat kullanıldı. Grupların oluşturulması ve prosedürün uygulanmasının ardından ratlar takibe alındı. Takip sırasında deneklerin hepsi sağ kaldı. Tüm ratların deneyin sonuna kadar 10’arlı gruplar halinde, ortalama %50 nispi nem, 22±1 °C oda sıcaklığında, 12 saat gece ve 12 saat gündüz ışıklı periyodu olan ortamda bakım ve takipleri yapıldı. Ratların tümüne %20 protein içeren yem ve su verildi. Deneyin tamamlandığı gün–sakrifikasyon gerçekleştirildi.
Çalışmada 15’er ratlık 4 grup oluşturuldu.
Kontrol erkek grubu: Sadece gözlem yapılan erkek ratlardan oluşan deney grubu Kontrol dişi grubu: Sadece gözlem yapılan dişi ratlardan oluşan deney grubu Deney erkek grubu: Radyoterapi uygulanan erkek ratlardan oluşan deney grubu Deney erkek grubu: Radyoterapi uygulanan dişi ratlardan oluşan deney grubu
Çalışma süresince kontrol ve radyoterapi gruplarındaki tüm hayvanların genel durum takipleri ve tartımları yapıldı, belirli aralıklarla ağırlıklarının genel ortalaması saptandı. İzlem
29
süresi sonrasında sakrifiye edilen ratlardan alınan akciğer dokusu ve kan örneklerinde DNA izolasyonu sonrası ATM, TGF TGF-1 ve SOD2 geni incelendi.
Anestezi
Tüm deney boyunca genel anestezi için 50 mg/kg bw ketamin (Ketasol, Richter Farma AG, Avusturya) ve 3.9 mg/kg bw xylazine (Rompun, Bayer Türk Kimya San. Ltd. Şti., Türkiye) kullanıldı.
Işınlama
Radyoterapi grubundaki hayvanlar anestezileri uygulandıktan sonra mavi köpük üzerine prone pozisyonda sabitlendi (Şekil 8,9). Mecaserto marka Simics model simülatör kullanılarak dişiler için 6x4 cm. boyutlarında erkekler için 6x5 cm boyutlarında akciğer alanları simüle edildi (Şekil 10,11). Simüle edilen ilk ratların alan görüntülenmesi için simülasyon grafisi çekildi. Ratların ön-arka kalınlığı cetvelle ölçülerek dişiler için d=1,5 cm, erkekler için d=1,75 cm. yarı kalınlık saptandı. Çalışmamızın sıfırıncı (0.) gününde kaynak-cilt mesafesi 100 cm. olacak şekilde yarı kalınlıkta doz hesaplanarak belirlenen alana Varian Linak Cihazı (lineer akseleratör) ile tek fraksiyonda tüm ratların total –sağ ve sol- akciğerine 10 Gy radyoterapi uygulandı.
30
Şekil 9. Prone pozisyonda dişi rat simülasyon grafisi
31
Şekil 11. Prone pozisyonda erkek rat simülasyon grafisi
Sakrifikasyon
Radyoterapi uygulanması sonrası 6 hafta izlem sonunda derin anestezi verilen ratlardan kalp kanı alınarak sakrifikasyonları yapıldı. Akciğer dokusu örnekleri alındı. Doku örnekleri histopatolojik inceleme için formolde, moleküler inceleme için de -80 °C’de saklandı.
RNA EKSTRAKSİYONU:
ATM, SOD ve TGF-1 Genlerine ait hedef gen ekspresyonlarını tespit etmek amacıyla gerekli olan RNA örnekleri BIONEER Marka ExiPrepTM16 Model Tam Otomatik DNA/RNA Ekstraksiyon Cihazı ile elde edildi (130) (Şekil 12).
Temel Teknik Özellikler
Genomik DNA’dan (Kan, Doku, Hücre, Bakteri, Bitki vb), RNA, Viral DNA/RNA, Plasmid DNA ve Fragment DNA’dan DNA, RNA veya PROTEİN ekstraksiyon yapar.
İzolasyon Tipi : Silika manyetik boncuk yöntemi Hızı : 60 dakikada 16 Örnek
Pipetleme : Robotik Sterilizasyon Tipi : Ultraviyole
32 Decontaminator : VAR
Isıtmalı blok kontrol : 60-90 ºC arasında otomatik Bağlantı ara yüzü : TCP/IP
Şekil 12. BIONEER Marka ExiPrepTM16 Model Tam Otomatik DNA/RNA Ekstraksiyon Cihazı (130)
DNA veya RNA Uyumlu protokoller:
Sıvı numuneler : Kan, Serum, Plazma, İdrar vb.
Katı numuneler : Doku (Canlı veya Bitki), Tohum, Yaprak vb. Hücre topluluğu : Bakteri, Mantar, hücre kültürü vb.
Plasmid DNA : Virüs, E.Coli vb.
Örneklerin RNA izolasyonu için BIONEER Marka ExiPrepTM Tissue Total RNA Kit’i kullanıldı.
Ekstraksiyon robotunun 202 Numaralı (Animal Tissue) protokolü seçilerek örneklerin total RNA’ları elde edildi (Tablo 6).
33
Tablo 6. RNA izolasyon protokolü (131)
50 veya 100 µl’lik final hacim içindeki DNA’lar 0,2 ml’lik tüplere pipetlenmiş olarak cihazdan alındı, etiketlendi, saflık ve miktar tayini yapıldıktan ve cDNA’ya sentezlendikten sonra derin dondurucuya kaldırıldı.
KALİTE VE KONSANTRASYON TESTİ
Elde edilen hasta RNA’larının saflık ve miktar tayinleri Nanodrop Spektrofotometre ile yapıldı.
Elde edilen RNA’ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonların yeterliliği olduğu kayıt altına alındı (Şekil 13).
34
Şekil 13. RNA’ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonları OLİGO SENTEZİ
Dişi, erkek ve kontrol gruplarında; ATM, SOD ve TGF-1 Genlerine hedef gen ekspresyonlarını tespit etmek amacıyla BIONEER Marka Primer setleri (S-1001) kullanıldı. Elde edilen RNA’lar RT-Premix ile cDNA’ya dönüştürülerek DNA gibi Amlifikasyon kontrolü sağlandı (Şekil 13), Real Time polimeraz zincir reaksiyon (PCR) cihazında cDNA’ları çoğaltılması ve miktar tayini yapabilmek için; GreenStar qPCR Master Mix’ler kullanıldı.
Primer veya problar, kullanmış oduğumuz Q-PCR cihazının özelliklerine uygun olarak dizayn edildi. Primer setlerinin, % 20-80 oranında Guanin (G) – Sitozin (C) içermesine, özellikle G ile benzer çalışan nükleotitlerden ve probun 5’ ucuna G bazı gelmemesine, seçilen dizide G’den çok C bazı olmasına, melting temperature (Tm) sıcaklığının 65-85 oC
arasında olmasına dikkat edildi (Tablo 7).
Tablo 7. Gen bölgesini çoğaltmak için kullanılan Primer dizileri Primer Setleri Sekanslar
ATM F: TTGCAGATATTTGTAAAAGCTTGG
R: CATCATCATCATCTCTCAACGAA
SOD F: TGGACAAACCTGAGCCCTAA
R: GACCCAAAGTCACGCTTGATA
35
Buna göre Q-PCR deneylerimizde GreenStar qPCR Mastr Miks ve primer setleri kullanıldı. Primerin gen bölgelerini arttırıp azaltması SYBER GREEN Boyasının serbest halde DNA üzerine bağlanmasıyla oluşan sinyalin, 6-karboksifloresan filtresi kullanılarak floresan miktarının ölçülmesi prensibine dayanmaktadır. Uygun PCR koşullarında primerin hedef bölge üzerine bağlanması ve uzamasının ardından yeni zincir oluşmaya başlar. DNA zincir sentezi uzadıkça ve her bir döngüde ürün miktarı arttıkça floresan ışıma da ona bağlı olarak artmaya devam eder. Kullanılan primer dizileri uygun ve uyumlu olduğu sürece ilgili gen bölgesi çoğalır, tek bir baz değişikliği bile gen bölgesinin tamamının çoğalmasını engelleyeceği ve sonraki dizinin bölgeyi çoğaltmasına izin vermeyeceği için; aynı diziye sahip olmayan gen bölgelerinde farklı Amplifikasyon eğrileri elde edilecektir (Şekil 14,15).
Şekil 15. Amplifikasyon Eğrileri
36
MASTER MİKSLER VE Q-PCR KOŞULLARI
Kullanmış olduğumuz GreenStar qPCR Master Mix protokolu, 50-100 µl’lik reaksiyon hacmi hazırlamak için 1-100 ng arasında cDNA eklenmesini önermektedir. Ekstraskiyon cihazımızdan elde ettiğimiz RNA miktarları 200 ng’ın üzerinde olduğu için bu çalışmada kullanımı uygundur. Çalışmalarımızda BIONEER Marka AccuPower GreenStar qPCR PreMix kullanıldı.
Bu miksler, PCR koşulları için gerekli tüm materyali içerisinde bulundurmakta ve
kullanıcı sadece primer ve örnek cDNA’sını ekleyerek kullanılır. 8’li strip tüpler içerisinde hazır olarak gelen bu kitler liyofilize halde derin dondurucularda saklandığı için miadları 1-2 yıldır. Absolute Quantification çalışmasından (Kantitatif Analizlerde) sonra yapılan ekspresyon testi deneylerinde, primerlerin ve örnek cDNA (veya Negatif Kontrol için PCR Grade suyun) hazır reaksiyon tüplerine eklendi, PCR Grade su ile son örnek hacmi 50 µl’ye tamamlanarak çalışıldı. Tüpler Q-PCR chazına yüklenmeden önce, homojenliğin sağlanması için hem vortex hem de spin işlemini programlı şekilde otomatik olarak yapan BIONEER Marka ExiSpin Model Vortex-Mikser kullanıldı.
37
Hazırlanan miksler, optik şeffaf filme kaplı 0,2ml’lik PCR tüpleri içerisinde (BIONEER Marka ExiSpin Model Vortex-Mixer cihazı ile homojenliği sağlandıktan sonra) BIONEER Marka ExiCycler96 Model Q-PCR cihazına yerleştirildi. Deneylerin amplifikasyon koşulları, (SyberGreen Master Mix için gerekli sıcaklık, süre ve döngü sayıları) zaten BIONEER (Cihazları, Master Mix’leri ve Primer-Prob’ların üreticisi) tarafından optimize edildiği için çalışmalardan olumlu sonuçlar alındı.
Eşik Değerine Göre Amplifikasyon Eğrileri
Syber Green yöntemiyle yapılan Q-PCR’ın başlangıcında ortamda tek zincirli cDNA molekülü, primerler ve reaksiyon tampon çözeltisi içinde Syber Green boyası bulunmaktadır. Bağlı olmayan serbest cDNA molekülü tek zincirli olduğu için çok az bir floresan ışıma yapmaktadır. Primerler bağlanıp uzama başladığında ise Syber Green, çift zincirli cDNA’nın arasına girerek floresan yayılımı başlatmaktadır. Başlangıçtaki döngülerde zayıf olan floresan sinyal; oluşan ekspresyona bağlı olarak belirli sayıda çoğaltım sonrasında ilerleyen döngülerde hızla artmaya başlamaktadır. Bu artış miktarı Q-PCR cihazının 2D-CCD kamerasının algılayabildiği miktara ulaştığında Ct (Eşik Değeri) olarak algılanmakta ve analiz yazılımı bu değerleri kullanarak sonuç vermektedir (Şekil 16).
Şekil 16. Eşik değerine göre amplifikasyon eğrileri
STANDART’lar, her bir kopya için Ct (Treshold: İlk algılanma, Eşik değeri) değerleri ile ‘Standart Doğru’ oluşturabilmek için kullanılır (Şekil 17). Yazılım, miktarları yani kopya sayıları arasındaki farkı bilinen standartlar kullanarak bir doğru çizer, örneklerin Ct
Ct / Eşik Değeri Amplifikasyon Eğrisi
38
değerlerini bu doğruya göre kıyaslayarak örneklerin başlangıçtaki kopya sayılarını hesaplar. Hedef miktarı ile kopya sayısı oranı doğru orantılı olduğu için, örnekler ve kontroller arasındaki Amplifikasyon oranı veya kıyası kolaylıklar hesaplanır (Şekil 18,19).
Şekil 17. “Standart Doğru” oluşturup örneklerin kopya sayılarını bulabilmek için kullanılan seri dilüsyon Standartları.
Şekil 18. Standart Doğru ve Ct değerleri ile Konsantrasyonlar arasındaki ilişki.
