TARIM BILIMLERI DERGISI 2001, 7 (3), 70-73
İ
dris
(Prunus mahalep
Çö
ğ
ürlerinde Genomik Farkl
ı
l
ı
k
Düzeylerinin RAPD Tekni
ğ
i
İ
le Belirlenmesi
Y.Sabit AĞAOĞLU' Ali ERGÜL2
Geliş Tarihi: 26.02.2001
Özet: Ülkemizin değişik bölgelerinden (Tokat, Ayaş, inegöl) sağlanan tohumlardan çoğaltılan 17 idris (Prunus mahalep L.) bitkisinde DNA polimorfizmi araştınlmıştır. Bu amaçla, bitkilerden DNA izolasyonu Lodhi ve ark. (1994) metodundan Ağaoğlu ve ark. (1999) tarafından modifiye edilen yönteme göre gerçekleştirilmiştir.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniğinde kullanılan 15 primerden, UBC237, OPA20, PRA4 ve 0-10 primerlerinde polimorfizme ulaşılmıştır.
Çalışma sonucunda, türde DNA düzeyinde yürütülecek bundan sonraki araştırmalar için temel teknikierden olan DNA izolasyonu gerçekleştirilirken, RAPD düzeyinde polimorfızm gösteren primerler tespit edilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Prunus mahalep L., DNA ekstraksiyonu, RAPD
Determination of Genomic Diversity Level in Mahalep
(Prunus mahalep
L)
Seedlings by RAPD Technique
Abstract: DNA polymorphism of Prunus mahalep L. was investigated among 17 plants that were grown from seeds collected from different region (Tokat, Ayaş, inegöl).
For this purpose, DNA extraction was performed using the modifıed method by Ağaoğlu et al. (1999) from Lodhi et al. (1994). Among the tested 15 primers for RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analysis UBC 237, OPA20, PRA4 and 0-10 gaye polymorphic bands.
As a result, for next researchs in this species at DNA level, the fundamental technique such as DNA extraction was performed and the primers for polymorphism were determined.
Key Words: Prunus mahalep L., DNA extraction, RAPD
Giriş
Anavatanı Anadolu olarak bilinen Prunus mahalep L., başta Tokat, Amasya, Gümüşhane, .Uşak ve Van olmak üzere ülkemizin değişik bölgelerinde geniş yetişme alanlarına sahiptir (ilisulu 1992).
Soğuk ve kısmen kurak iklim koşullarına adaptasyonu ve toprak özellikleri açısından fazla seçici olmaması türün önemli özelliklerinden olup (Gerçekçioğlu ve Çekiç 1999), ülkemizde kiraz ve vişnenin orta kuwette bir anacı olarak kullanımı her geçen gün artmaktadır (Çelik 1983). Ülkemizdeki kiraz plantasyonlarının c/075-80'inde Prunus mahalep L.'in anaç olarak kullanıldığı
bildirilmektedir (Gülcan ve Özçağıran 1983).
Prunus mahalep L. ile ilgili yapılan çalışmaların büyük bir kısmı tohum çimlenme fizyolojisi ve anaçlık özellikleri üzerinde yoğunlaşırken (Gerçekçioğlu ve Güneş
1995, Gerçekçioğlu ve Çekiç 1999); diğer bir grup çalışma konusunu ise, fidancılıkta generatif çoğaltma sonucu elde edilen çöğürlerin tohum alınan bitkilere yakın homojenlik göstermesi açısından son derece önemli olan kaynak bitkilerin döllenme blyolojileri üzerindeki araştırmalar oluşmuştur (Mısırlı ve Gülcan 1992).
Mısırlı ve Gülcan (1992), ülkemizde döllenme biyolojisi konusunda ilk çalışmaları başlatmışlar, yaptıkları
araştırma ve inceledikleri kaynaklardaki bilimsel verilerde P. mahalep L. çeşit ve/veya tiplerinde değişik oranda kendine verimliliğin ve verimsizliğin bulunduğu saptamışlardır.
Bu çalışmada, türde döllenme şeklinin elde edilen çöğürlerin genetik yapısına doğrudan yansımasından hareketle, bitkilerin DNA düzeyinde genetik homojenlikleri veya farklılıkları araştırılmıştır. Kullanılan RAPD tekniği ile,
bu yöndeki çalışmalara yeni bir boyut kazandırmak amaçlanmıştır. Ülkemizde bu konuda yapılan ilk çalışma olması nedeniyle bir öndeneme olarak bundan sonra bu veya benzer yöntemlerle çalışacak olanlara bir ışık tutacağı kanısındayız.
Materyal ve Yöntem
Araştırmada bitkisel materyal olarak; inegöl, Tokat ve Ayaş bölgelerinden sağlanan tohumlardan elde edilen ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Ayaş Bahçe Bitkileri Araştırma istasyonu'nda yetiştirilen 17 çöğür bitkisinın genç yaprakları kullanılmıştır.
Araştırmanın yöntem aşamaları:
'Ankara Üniv. Ziraat Fak. Bahçe Bitkileri Bölümü-Ankara
Ilim. 2000 b • "IP 1500 b • ~1000 be 111111111
wı•kfr 500 bp
AĞAOĞLU,-Y.,S. ve A. ERGOL, "İdris (Prunus mahalep L.) çöğürlerinde genomik farklılık düzeylerinin RAPD tekniği ile belirlenmesi" 71
DNA izolasyonu
Izolasyon, Ağaoğlu ve ark. (1999) tarafından Lodhi ve ark. (1994)'e ait metodunun modifiye edilmiş şekline göre gerçekleştirilmiş ve DNA'ları saflaştırmak amacı ile etanol çöktürmesi yapılmıştır.
RAPD tekniği
PCR (polymerase chain reaction: polimeraz zincir reaksiyonu)'da uygun optimizasyon koşulları; 25 ııllik toplam hacimde 40-50ng DNA, 5Ong primer, 2.5mM dNTP, 1.5mM MgC12, 1x reaksiyon buffer ve 0.5 ünite DNA polimeraz (Promega) ile gerçekleştirilmiştir. PCR programı ise ; 94 °C' de 1 dk. ( DNA çift iplikçiğin ayrılması), 35 °C' de 2 dk. (primer DNA eşleşmesi), 72 C' de 2 dk. ( yeni iplikçiğin yazılımı) olarak 35 döngü ve 72
°
C' de 8 dk. ( son yazılım) olarak düzenlenmiştir.Primerler
RAPD analizleri için kulanılan primerlerin listesi Çizelge 1' de sunulmuştur.
Elektroforez koşulları
PCR amplifıkasyon ürünleri 2 saat süre ile 100 volt'da, % 1.5 konsantrasyonda agaroz jelde yürütülmüş
ve siyah beyaz filmle görüntülenmiştir.
Bulgular ve Tartışma
Araştırmada kullanılan 17 bitkinin 5'i inegöl,- 6'sı
Ayaş ve 6'sı Tokat bölgesinden sağlanan tohumlara ait çöğürlerden seçilmiştir. Araştırmada daha iyi sonuç veren 5 primerin idris bitkilerinde elde edilen bant profılleri Şekil 1, 2, 3, 4 ve 5' de sunulmuştur.
Primerler, RAPD bant desenleri açısından, monoformik (P123) ve poliformik (UBC237, OPA20, PRA4 ve 0-10) olarak iki gruba ayrılmıştır. Bunlarda
ulaşılan bant büyüklükleri / sayıları ise P123, UBC237, OPA20, PRA4 ve 0-10 primer'lerinde sırası ile 500-2500 bp / 4 bant, 500-1200 bp / 1-3 bant, 750-1100 bp / 2-3 bant, 600-2000 bp / 2-6 bant ve 500-1500 bp / 2-4 bant arasında değişmiştir.
Polimorfik bant desenleri veren primer'ler incelendiğinde ise; yöresel gruplar arasında ve içinde polimorfizme rastlanmakta, dolayısıyla grupların (Ayaş, Tokat, Inegöl) önemi ortadan kalkar iken, bireysel olarak her bir bitki kendine özgü bant deseni vermekte veya 2'li, 3'lü gruplar oluşturmaktadır.
Bu çalışma ile, Prunus mahalep L.'de DNA izolasyonu sözü edilen modifiye yöntemle başarılı bir
şekilde gerçekleştirilmiş, ayrıca türde RAPD tekniğinde polimorfiklik sağlayan primer dizileri belirlenerek bundan sonra DNA düzeyinde yapılacak araştırmalar için temel optimizasyon çalışmaları tamamlanmıştır.
Çizelge 1. Araştırmada kullanılan primer'ler
Primer adı Baz dizisi(5'-3')
P123 GGG ATT CGA C OPA20 _OPA20 GTT GCG ATC C CAG GCC CTT C P166 GTG ACG GAC T OPP17 TGA CCC GCC T 0-10 TCA GAG CGC C
UBC237 CGA CCA GAG C
PRA1 GTG ACG TAG G
PRA2 GTG ATC GCA G
PRA3 CAA TCG CCG T
PRA4 CAA ACG TCG G
Al 7 GAC CGC TTG T
Al 1 CAA TCG CCG T
A05 AGG GGT CTT G
A09 GGG TAA CGC C
TOKAT
İ
NEGOL
AYA
Ş
:I 2 3 • 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 K MŞekil 2. UBC237 primeri'nin RAPD amplifikasyonu (1-17), K: kontrol, M: markör
TOKAT İNEGOL AYAŞ
1 2 3. 4 5 6 7 ' 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 K M 11~111,
w
ı
r
W
10.000 lie 1500 bp • 1000 bp 11.1. 750 bp "M. ~O/ 0.01.0 0,1ffilfflo. awmpTOKAT
iNEGOL
AYA
Ş
1 2 3 4
6 7 8" 9 "10 11 12 13 14 15 16 17 K M
*100 2000 bp 1500 bp
1000 bp
72 TARIM BILIMLERI DERGISI 2001 Cilt 7, Sayi 3
Şekil 3. OPA20 primeri'nin RAPD amplifikasyonu (1-17), K: kontrol, M: markör
İ
NEGÖL
AYA
Ş
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
AĞAOĞLU, Y. S. ve A. ERGÜL, "İdris (Prunus mahalep L.) çöğürlerinde genomik farklılık düzeylerinin RAPD tekniği ile belirlenmesi" 73
Şekil 5. 0-10 primeri'nin RAPD amplifıkasyonu (1-17), K: kontrol, M: markör
Kaynaklar
Ağaoğlu, Y. S., B. Marasalı ve A. Ergül, 2001. Asmalarda (Vitis vinifera L.) farklı dokulardan izole edilen DNA'ların RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniğinde kullanımı üzerinde bir araştırma. Ank. Ünv. Zir. Fak. Tarım Bilimleri Dergisi (Baskıda).
Çelik, M. 1983. Meyve yetiştiriciliğinde anacın önemi ve Türkiye meyveciliğinde anaç sorunu. Ankara Only. Ziraat Fak. Yayınları: 886, Derlemeler: 57, Ankara.
Gerçekçioğlu, R. ve Ç. Çekiç, 1999. Mahalep (Prunus mahalep L.) tohumlarının çimlenmesi üzerine bazı uygulamaların etkileri. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 23 (1), 145-150.
Gerçekçioğlu, R. ve M. Güneş, 1995. Sarı ve kırmızı mahaleplerin fenolojik ve pomolojik özellikleri üzerinde bir araştırma. Türkiye Il. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, Meyvecilik, Cilt 1, s: 277-281, Adana.
Gülcan, R. ve R. Özçağıran, 1983. Tübitak VII. Bilim Kong. Teb., Adana, 1980, TOAG — 330: 41-46.
İlisulu, K. 1992. İlaç ve Baharat Bitkileri, Ankara Üniv. Ziraat Fak. Yayınları: 1256, Ders Kitabı: 360, Ankara.
Lodhi, M. A., G.-N. Ye, N. F. Weeden and B. I. Reisch, 1994. A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species. Plant Mol. Biol. Reptr., 12(1), 6-13.
Mısırlı, A. ve R. Gülcan, 1992. Bazı P. mahalep L. tiplerinin döllenme biyolojisi üzerinde araştırmalar. Türkiye I. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, Meyvecilik, Cilt 1, 495-499, Ankara.
