A n k a r a E c z . F a k . Mec. 12. 20 (1982) J . F a c . P h a r m A n k a r a 12. 20 (1982) N i k o t i n a m i d A d e n i n D i n ü k l e o t i d İ n h i b i s y o n u * I n h i b i t i o n o f N i c o t i n a m i d e A d e n i n e D i n u c l e o t i d e B i l g e U Z A L P * * G İ R İ Ş N i k o t i n a m i d a d e n i n d i n ü k l e o t i d ( N A D ) v e n i k o t i n a m i d a d e n i n d i n ü k l e o t i d fosfat ( N A D P ) ile i n d i r g e n m i ş formlarının, p r o t e i n l e r i n d e a m i n a s y o n u n d a (3), p e n t o z fosfat ve glikolitik y o l l a r d a k i oksidatif o l a y l a r d a k i rolleri çok ö n e m l i d i r (1,12,15,18). Bu e n z i m l e r i n i n h i -bisyonu ile v ü c u t t a k i birçok m e t a b o l i k olaylar incelenmiş ve incelen-m e k t e d i r (4,7,10,13).
N A D v e N A D P ile r e d ü k t e f o r m l a r ı n ı n rol aldığı m e t a b o l i k olay-l a r b u k o e n z i m olay-l e r e b a ğ ı m olay-l ı o k s i d o - r e d ü k t a z e n z i m olay-l e r i n inhibisyonu ile bloke edilebilir. B u n u n için N A D v e N A D P n i n asıl görev y a p a n b ö l ü m ü n i k o t i n a m i d yerine o n u n yerini alabilecek fakat h i d r o j e n a t o m u t a ş ı m a y a c a k b i r y a p ı sokularak a n a l o ğ u o l u ş t u r u l u r s a b u a n a l o g k o m p e t i t i f inhibisyonla asıl kofaktörün yerini a l a r a k b a ğ ı m l ı e n z i m l e r i n h i d r o j e n alım v e r i m i n i bloke edebilir (5,6).
A m a c ı m ı z b u g ü n e k a d a r 6 - a m i n o n i k o t i n a m i d ( 6 - A N ) kulla-n ı l a r a k y a p ı l a kulla-n i kulla-n vitro v e i kulla-n vivo 6 - a m i kulla-n o kulla-n i k o t i kulla-n a m i d a d e kulla-n i kulla-n d i n ü k l e o t i d ( 6 - A N A D ) sentezlerini karşılaştırarak (4,7), b u t ü r e v i n o r g a n i z m a d a oluşturulmasıyla s a ğ l a n a c a k e n verimli inhibisyon y ö n t e m i n i n v e k o n t r o l ü n ü n s a p t a n m a s ı d ı r .
R e d a k s i y o n a verildiği t a r i h : 1 9 . 3 . 1 9 8 2
* " N i k o t i n a m i d A d e n i n D i n ü k l e o t i d İ n h i b i s y o n u n u n Kolesterol M e t a b o l i z m a s ı İ l e İlişkisi" k o n u l u doçentlik tezinin (1981) b i r b ö l ü m ü d ü r .
D E N E L K I S I M M A T E R Y A L v e Y Ö N T E M
D e n e y l e r d e ; T o y o S F - 2 0 0 A ve T o y o S F - 1 6 0 K tipi kollektörler, T o y o U v i c o n 540 M tipi k o n t r o l ve o p t i k ü n i t e ve yazdırıcı, H i t a c h i 2 0 4 - A tipi flüoresans spektrofotometresi, A m i n c o D W - 2 uv / vis spektrofotometre, H i t a c h i i n k ü b a t ö r ve santrifüj ile 4°C de soğuk o d a d a n y a r a r l a n ı l d ı .
Ç a l ı ş m a l a r ı m ı z d a i n vitro d e n e y l e r d e D İ E T R İ C H v e çalışma a r k a d a ş l a r ı ile B R U N N E M A N N v e çalışma a r k a d a ş l a r ı n ı n u y g u l a -dıkları y ö n t e m l e r kullanıldı (7,4). Bu m e t o d l a r d a n h a r e k e t edilerek in vivo d e n e y l e r d e iki y ö n t e m i n birleştirilmesi y o l u n a gidildi.
İ n vivo d e n e y l e r d e 180-250 g r a m ağırlığında beşerlik g r u p l a r h a l i n d e erkek sıçanlar (Wistar r a t ) ve 15-20 g r a m ağırlığında onarlık g r u p l a r h a l i n d e erkek fareler ( I C R mice) kullanıldı. D e n e y h a y v a n l a r ı 23°C de 12 saat ışıklı, 12 saat k a r a n l ı k t u t u l a n , h a v a l a n d ı r m a l ı o d a d a , pelet y e m ve su ile serbest o l a r a k beslendiler.
6 - A N (Sigma) için süre v e d o z a bağımlılık testleri yapıldı. F a r e l e r d e 200 mg / kg, s ı ç a n l a r d a 15 mg / kg tek doz i n t r a p e r i t o n e a l yolla u y g u l a n d ı . 20 saat s o n r a d e n e y h a y v a n l a r ı n ı n karaciğer, b ö b r e k , k a l p v e beyinleri izole edildi. K u r u b u z d a d o n d u r u l a r a k t a r t ı l d ı . D o k u l a r 9 katı % 3 perklorik asitle h o m o j e n i z e edildi. H o m o j e n a t 5-10 d a k i k a , 2500 r p m de soğukta santrifüj edildi (7), S o n r a , soğuk o d a d a 5 N p o t a s y u m hidroksitle nötralize edilerek, doveks 1 x 1 0 (formiyat formu) (Biorad L a b o r a t o r y ) k o l o n d a n geçirildi (4).
A y r ı l a n n ü k l e o t i d l e r d e n 260 n m d e U V a b s o r b a n s l a r ı n a b a k ı -l a r a k seçi-len ö r n e k -l e r i n ince t a b a k a k r o m a t o g r a f i -l e r i yapı-ldı. B u n u n için Kieselger 6 0 a d s o r b a n ı ( M e r c k ) v e belirteç o l a r a k U V l a m b a s ı n -d a n y a r a r l a n ı l -d ı . Solvan sistemi o l a r a k metil etil k e t o n - a m o n y u m hidroksit ( 1 : 1 ) , izobütirik a s i t - a m o n y u m hidroksit-su ( 6 6 : 1 . 7 : 3 3 ) ,
1 M a m o n y u m a s e t a t - % 95 e t a n o l (3:7) ve n - p r o p a n o l - a m o n y u m hidroksitsu (60:30:10) solvan sistemleri d e n e n e r e k b u n l a r d a n n -p r o -p a n o l - a m o n y u m hidroksit-su ( 6 0 : 3 0 : 1 0 ) seçildi.
K o n t r o l l e r l e u y g u n R f d e ğ e r i n e s a h i p lekelerin flüoresans ak-tiviteleri (8,9,11,14,17) ve alkol d e h i d r o g e n a z e n z i m i için s u b s t r a t o l u p o l m a d ı k l a r ı (2,16) s a p t a n d ı .
22 Bilge U Z A L P
B U L G U L A R
D e n e y sonuçları şekillerde özetlenmiştir. Şekil 1 a, 2a, 3a, 4a, 5a doveks ve aktif k ö m ü r kolonlarla ayrılan in vitro ve in vivo d e n e y s o n u ç l a r ı n ı n 260 n m d e U V s p e k t r u m l a r ı n ı göstermektedir. Şekil
l b , 2b,3b,4b v e 5 b kolon kromatografisi ile ayrılıp, U V a b s o r b a n s ı n a b a k ı l a r a k seçilmiş 20 ml. lik (Şek. l b , 3b,4b, 5b) ve 10 ml. lik (Şek. 2b) ö r n e k t ü p l e r d e n a l ı n a n n u m u n e l e r v e kontrollerin ince t a b a k a k r o m a t o g r a m l a r ı n ı göstermektedir.
Şek. ı a ) D İ E T R İ C H v e çalışma g r u b u n u n uyguladıkları y ö n t e m l e , i n vitro 6 - A N A D sen-teziyle ilgili U V s p e k t r u m u .
o
10 20 3 0 40 50 60 7 0 80 »90 100 110 120 130 140 150 160 n o X 10 I tüp s a y ı s ı
Şek. 1b) D İ E T R İ C H ve çalışma g r u b u n u n uyguladıkları y ö n t e m l e , in vitro 6 - A N A D senteziyle ilgili ince t a b a k a k r o m a t o g r a m ı .
E 2 6 0 10 2 0 3 0 4 0 5 0 X 20 ml T ü p s a y ı s ı 3.C 2 . 0 1.0 0 . 5 0 0.5 i E 260
Şek. aa) B R U N N E M A N N v e çalışma g r u b u n u n uyguladıkları y ö n t e m l e , i n vitro 6 - A N A D senteziyle ilgili U V s p e k t r u m u .
Şek. 2b) B R U N N E M A N N v e çalışma g r u b u n u n u y g u l a d ı k l a r ı y ö n t e m l e , i n vitro 6 - A N A D senteziyle ilgili ince t a b a k a k r o m a t o g r a m ı .
NADaz 6AN NAD NA 27 30 35 43 59 60 61 71 88 101 102 104 106 II I 148 150 158 160 163 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Rf 0 9 0.8 0.7 0.6 0 5 0.4 0.3 0.2 0.1
24 Bilge U Z A L P
0 . 5
Şek. 3a) D I E T R I C H ve çalışma g r u b u n u n u n vivo 6 - A N A D sentezi y ö n t e m i sonuçlarının aktif k ö m ü r kolondaki a y r ı m ı n ı n U V s p e k t r u m u .
Şek. 3b) D I E T R I C H ve çalışma g r u b u n u n in vivo yöntemiyle 6 - A N A D sentez ,sonuçla-rıyla ilgili ince t a b a k a k r o m a t o g r a m ı .
E 260 3 2 1 0 1 0 5 0 4 0 t ü p s a y ı s ı X 2 0 m l 0 . 9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0 . 3 0 . 2 0.1
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
NADa 6-AN NAD ADP.R3 10 17 21 24 32 48
Şek. 4b) D I E T R I C H ve BRUNNEMANN ile çalışma gruplarının 6-ANAD sentezlerinin birleştirilmesiyle elde edilen yöntemle farelerde 6-ANAD sentezi sonuçlarının ince tabaka
kromatogramı. 10 20 3 0 4 0 5 0 60 7 0 2 0 ml 0.5 E 26 0 0 3 1 Tüp Sayısı
Şek. 4a) D I E T R I C H ve BRUNNEMANN ile çalışma gruplarının 6-ANAD sentezlerinin birleştirilmesiyle elde edilen yöntemle farelerde 6-ANAD sentezi sonuçlarının UVspektrumu.
26 Bilge U Z A L P
Şek. 5a) D I E T R I C H ve B R U N N E M A N N ile çalışma g r u p l a r ı n ı n 6 - A N A D sentezlerinin bir-leştirilmesiyle elde edilen y ö n t e m l e s ı ç a n l a r d a 6 - A N A D sentezi s o n u ç l a r ı n ı n U V s p e k t r u m u
Şek. 5b) D I E T R I C H v e B R U N N E M A N N ile çalışma g r u p l a r ı n ı n 6 - A N A D sentezleri-nin birleştirilmesiyle elde edilen y ö n t e m l e sıçanlarda 6 - A N A D sentezi sonuçlarının ince
t a b a k a k r o m a t o g r a m ı . 10 20 30 40 50 60 70 80 * 20 ml Tüp S a y ı s ı E260 3 2 1 0.5 û
NADaz 6-AI NAD 9 10 32 46 50 55 64 70 Rf 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
S O N U Ç
İ n vitro deneyler s o n u c u n d a D İ E T R İ C H v e çalışma g r u b u n u n y ö n t e m i ile k a r b o n k o l o n d a n geçirilen nükleotidlerin b i r b i r i n d e n a y r ı l m a s ı n ı n d a h a u z u n v e zor o l m a s ı n a karşılık (Şek. l a , b ) B R U N N E -M A N N v e çalışma g r u b u n u n y ö n t e m i ile d a h a kısa sürede v e kolayca sağlanabildiği g ö r ü l d ü (Şek. 2 a , b ) . Bu n e d e n l e fare ve a l b i n o r a t -l a r d a y a p ı -l a n in vivo d e n e y -l e r d e doveks ko-lon-la a y r ı m a gidi-ldi ve 6 - A N u y g u l a n a n d e n e y h a v a n l a r ı n d a 260 n m d e U V absorbsiyonu v e r e n (Şek. 3a,4a,5a), ince t a b a k a k r o m a t o g r a m l a r ı n d a lekelerin k u y r u k teşkil e t m e d i ğ i ve iyi ayrıldığı g ö r ü l e n n - p r o p a n o l - a m o n y u m hidroksit-su (60:30:10) solvan sistemiyle k o n t r o l N A D lekesine ya-kın leke veren (Şek. 3b,4b,5b), f l ü o r o m e t r i k aktivite gösteren ve fa-k a t alfa-kol d e h i d r o g e n a z e n z i m afa-ktivitesi fa-k o n t o l ü n d e etfa-kisiz fa-k a l a n ör-n e k 6 - A N A D o l a r a k k a b u l edildi.
Ö Z E T
İ n vitro v e i n vivo o l a r a k n ü k l e o t i d l e r i n a y r ı m ı n d a , b u a r a d a 6 - A N u y g u l a n a n h a y v a n l a r d a oluşan 6 - A N A D ı n a y r ı m ı n d a doveks 1x10 (formiyat formu) kolon kullanılması d a h a u y g u n b u l u n m u ş t u r . İ n c e t a b a k a k r o m a t o g r a m l a r ı için n - p r o p a n o l - a m o n y u m hidroksit -su (60:30:10) solvan sistemi kullanılmıştır. N ü k l e o t i d l e r i n flüore-sans gösterme özelliklerinden k o n t r o l niteliğinde y a r a r l a n ı l m ı ş t ı r . K o l o n v e ince t a b a k a k r o m a t o g r a f i l e r i ile a y r ı m l a r ı n s o n u c u n d a N A D ' y e y a k ı n R f deki lekelerden 6 - A N A D ' ı n a y r ı m ı e n z i m a t i k o l a r a k k o n t r o l edilmiştir. Alkol d e h i d r o g e n a z e n z i m i için N A D s u b s t r a t o l m a k l a b e r a b e r 6 - A N A D 1 / 1000 o r a n ı n d a s u b s t r a t teş-kil e t t i ğ i n d e n e n z i m a t i k k o n t r o l güvenli bir yol o l u ş t u r m a k t a d ı r .
S U M M A R Y
I t was s h o w n t h a t t h e d o w e x c o l u m n i s m o r e suitable t h a n t h e active c a r b o n e c o l u m n i n t h e separations o f t h e nucleotides a n d 6 A N A D w h i c h i s synthetized i n vivo b y 6 A N p r e t r e a t m e n t . n p r o p a -n o l - a m m o -n i u m h y d r o x i d e - w a t e r (60:30:10) solve-nt system was used for t h i n layer c h r o m a t o g r a p h y of nucleotides. T h e fluorescence activities of the nucleotides used for c o n t r o l . N A D a n d 6 - A N A D were
2» Bilge U Z A L P
distinguished from e a c h o t h e r by cotrolling their activities on t h e al cohol d e h y d r o g e n a s e e n z y m e p r e p a r a t i o n s .
K A Y N A K L A R
1 - A m n i o n , H . P . T . , S t e i n k e , j . , Diabetes, 2 1 : 143 (1972).
2- B e r g m e y e r , H.U., M e t h o d s of E n z y m a t i c Analysis, Vol. 4, 2. Edit., Verlag C h e m i e
W e i n h e i m A c a d e m i c Press, Berlin (1974).
3- B i n g ö l , G., Biyokimya, 2. Bası, Mis M a t b a a s ı , A n k a r a (1981).
4- B r u n n e m a n n , A., C o p e r , H. u n d N e u b e r t , D., Nauyn Schmiedeberg's Arch. Exp. Path. u. Pharmak., 2 4 6 , 437 (1964).
5- C o p e r , H., N e u b e r t , D . , Biochim. Biophys. Acta, 8 2 , 167 (1964).
6- D a v e n p o r t , H.W., Physiology of Digestive T r a c t , 3. E d i t . , Y e a r Book M e d i c a l
Publishers, C h i c a g o (971).
7- D i e t r i c h , L.S., F r i e l a n d , I.M., K a p l a n , L.A., J. Biol. Chem., 2 3 3 : 4, 964 (1958). 8- E w i n g , G.W., I n s t r u m e n t a l M e t h o d s of C h e m i c a l Analysis, 4. Edit., Mc G r a w - H i l l
Book C o m p . , N e w York, T o r o n t o , T o k y o , Paris, L o n d o n (1975).
9- H a r v e y , H., Anal. Biochem., 29, 58 (1969). 10- H o w e l l , B.F., Methods Enzymol., 66, 55 (1980).
1 1 - K o n s t a n t i n o v a , M.A., F l u o r o m e t r i c Analysis, Israel Prog, for Scient T r a n s . L t d . ,
J e r u s a l e m (1965).
1 2 - K ö h l e r , E., B a r r a c h , H., N e u b e r , D . , Febs. Letters, 6: 3, 225 (1970).
1 3 - M a g a s a n i k , B., V i s c h e r , E., D o n i g e r , R., E l s o n , D . , S h a r g a f f , E., Biol. Chem., 186, 37 (1950).
1 4 - N a k a y a m a , M . , M e t h o d s i n M e d i c a l Chemistry, T o k y o U . P . , T o k y o (1978). 15- N u m a , S., Reviews of Physio., Biochem. and Exp. Pharm., 69, 79 (1974).
16- R o o d y n , D.B., A u t o m a t e d E n z y m e Assays, N o r t h H o l l a n d Publishing C o o p . ,
Amster-d a m (1970).
17- U d e n f r i e n d , E., Fluerescence Assay in Biology a n d M e d i c i n e , A c a d e m i c Press,
N e w Y o r k (1962).
