BOĞALARDA BOVINE HERPESVIRUS TİP- 1 (BHV-1) ENFEKSİYONUNUN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA), POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) VE VİRÜS İZOLASYONU (VI) METOTLARI İLE KARŞILAŞTIRMALI TEŞHİSİ VE SEROEPİDEMİYOLOJİSİ

Vet.Bil,Derg,(2004). 20,4: 61-70

BOGALARDA BOVINE HERPESVIRUS

Tip-ı

(BHV-l) ENFEKSivONUNUN

ENZVME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAV (ELISA),

POLVMERASE CHAIN

REACTION (PCR) VE ViRUS iZOLASVONU (VI) METOTLARI iLE

KARŞıLAŞTıRMAlıTEŞHisi

VE SEROEPiDEMiVOLOJiSi

Oya Bulut

' @ Sibel

Yavru!

Se

roepi dem iolog

y

and

Compa rat

iv

e Diag

nosis of Bovlne H

erpesvirus Type-

I

(

BH

V-

I)

in B

ulls

u

sing E

nzy me-Llnked Immun

csor bent Assay (E L

I

SA), Po

lymerase

C

hain

R

ea

ct ion

(p

e

R)

a

nd

V

irus I

solation

(V

I)

Özet: Araşbrmada,Konya ve çevresinden KonyaÖZelKonet mezbahasınakesim amacıile getirilen,100 adetsağlıklı

gö-rCınCımlO,yerli ırkve 1yaşındaki bOğaJardankan, sperma venasal swap örneklerialındı.Spermave naSaJswap örnekleri FôtalDana Böbrek(FOB)ve MadinDaıbyBovineKidney(MDBK)devamlıhücre kOnurlerineinokula edildi.fnkubasyon sü-resisonunda.26 adetspermave 2 adetnasarswap örneğinde sitopatik etki (CPE) gözlend i. Izoleedilen viruslann iden-tilikasyonuamacıylaEnzyme Linked Immunosa rbentAssay (ELlSAlAg)kullanıldıvespermaörneklerinden15adediBHV·l olarak identiliye edilirken,nasatswapörneklerinin hiçb irisi BHV·1olarakidentifiye edilemedi. Aynca sperma ve nasal swap örneklerinde BHV· 1'intespitiamacıyl aELlSAve Polymerase Chain Reaetion(PC R) metodunda nyararlamldı.DirektELlSA ile 1 adet sperma ve 1adet nasalswa p örneği pozitif bulund u. PCR ile ise 23 adet sperm a örneği pozitif olarak be-lirlenirken,nesetswap örneklerinin hiçbirinde pozitil sonuç tespit edilemedi. BHV·1'e karşı oluşanantikarlann tespit edil-mesiamacıylaELlSAlAb ve serummikronötralizasyo n(sen enmNT) testlerikullanıldı.BHV-1'ekarşıoluşanantikortanntes

-piti amacıyla uygulanan ELlSAlAb ile 23 adet kan serum a pozitilolarak belirtenirken,serum mNT testi ile 14 adet kan serumupozitif bulunduve antikorpoziut buörneklerinSN_sodeğerleriise 1:1.78- 1:22.4arasındatespitedildi.

AnahtarKeümeter:BovineHerpesvirusTip-l (BHV- 1),EU SA,NötralizasyonTesti,PCR ve VirusıZolasyon

$ummaıy:in this study,biood,semenandnasai swapsarre-eswere taken from 100cfinicaIly healty,indigenoosandone year oldbulls brou!lıl to Konya Private Konet abbatoirlrom Konya and ils environmenl with the purpose ol slaughter.

Semen and nasal swap samples were inoculated into Foela/ Bovine Kidney (FaK) and Madin Daıby Bovine KJdıeY

(MDBK)eellcultures.Ai theendof incubation,cyIopatogeniceltect (CPE)was determinedin26semenand2nasal swap sanıples. Enzyme linked lmmunosorbentAssay (EU SN Ag) was usedlor idenlification ofviruses isolated Two isolates from naseı swap could not be ideniilied, while 15out of 26 isolaıeslrom semen sampres was identified as BHV·l by ELlSA. FoflowingELlSAlAg and PolymeraseChain aeacnon(PCR)method was applied fordetect ion olBHV-1insemen

andnasatswap samples. Oneseme nsampla and 1nasalswap samptewere foundaspositiveby ELlSNAg.Nopositlve result could bedetectedin any ol nasal swap sampreswhile23 semen samples were detected as positiveby PCR. Be-sides,Enzymelinked immu nosorb entassay (EUSA)and serummic roneutralizationtest (serum mNT) were used for de -tecüonol antibodies aganist toBHV· 1.Twenty-three blood sera samplesweredetected positivebyELISA ,while 14blood sefa samplesweredetected positive by serum mNT.SN_so values olthe positive serasamples we re detected between

1:1.78- 1:22.4.

Key Words: Bovine Herpesvirus type-1 (BHV·l),EU SA, NeutralizationTest,PCRandVirusIsolation

Giriş

Infectious Bövine Rhinotrachei1is IInfectious Pustuler Vulvovaginitis i Infectious Pusıuler Ba -laroposütis(IBRlJPVIIPB)slğlMnnsolunum.sindirim veqenttalsistemlerininsubklinlk,akutveyalate nt se-yini öne mli bir viral enteksiyonudur. Enfeksiy on et -keni Bov ine He rpesviru s tip-1 (BHV· 1)'di r. BHV -1,

yaygın solunum sistemi enfeksiyonlanna, rhl-notracnelnse. konjuk1ivitise, süt ve rimind e azalmaya,

met ritise ,arthritise.emenuse.dişlierdevulvovaginitise, boğalarda balanopostitise, gebe hayvanlarda abor1

-tara ve na d ire n encepha litise se be p olabilmektedir (Smith ve ark 19 91 , Kit ve ark 19 92, Yason ve ark

1995).

GelişTarihi :28.01.2005 @:obulutrssclcuk.edu.tr Bumakalcaymisimlidoktora tezindenözet len miştir.

-BU

Ltrr. YAVRU

Bovine Herpesvirus tc-ı (BHV-l)'in en önemli özelliği primer enfeksiyonu takiben virusun bölgesel ganglionlarda latent durumda kalabilmesidir (Engels veAckermann 1996.Winklerve ark 2(02).Latenten -fekte hayvanlarda çeşitlistresfaktörlerininetkisiylela -tent virus reaktive olabilmekte ve sinir yoluyla rep

-likasyonun gerçekleşeceği mukozal yüzeylere ulaşarak buradan saçılmaya deva m edebilmektedir (Whetsone ve ark 1986, Jones ve ark 1990, Ka-astıcek ve ark 1996). Enfeksiyonu bir kez geçiren hayvanlar klinik tablo göstermeksizin yaşam boyu virustaşıyıcısı vereenfeksiyonlarda virus saçıcısı o la-rak bir sürücle enfeksiyon kaynağ ı olabilmektedir. Bu nedenle damızlı k olarak kullanılan ~Iann düzenli

aralıktarta serotojik kontrollerden geçirilmesi gerektiği

gibisperma.preputialçalkantı sıvısı, lökosit,burun ve göz akıntısından virus izolasyonu çalışmalannın da

yapılması gerekmektedir (Kupferschmied ve ark 1986,VanOirschotve ark 199 3).Çünküdamızlıkol a-rakkullan ılan boğalardanelde edilen spermalarıntabi ve suni tohumlama yoluyla duyarlı hayvanıara n

ak-ledilmesi bu hayvanların da enfeksiyona y

a-kalanmaları na nedenolmaktadır. Bu neden lerle, suni tohumlama istasyonlarında hem boğaların hem de

onlardan elde edilen spermalann virolojik kontrolü büyük önemtaşımaktadır(Yavru ve ark 1998b).

Bu araştırmada. Konya ve çevresinden Özel

Korıet Mezbahasına kesime getirilen boğalarda

BHV·l tarafından Oıuşturulan IBRIlPVIIPB e

n-feksiyonlarının seroprevatansınm belir1enmesininyanı

sıra sperma ve nasal swap örneklerinde de Enzyme Linked Imunosorbent Assay (ELISA), Polymerase Chain Reaetion (PCR) vehücre kültüründe virusl zo-lasyonumetotları ilevirolojikkontrolleryapılarak,bu 3 testin birbirlerine olan üstünlüklerinin karşılaştmlması

amaçlanmıştır.

Materyal ve Metot

Araştırmada Kullan ılan Hayvanlar: Araştırmada, Konya ve çevresinden Konya Özel Konet mez

-bahasınakesimamacıilegetirilen.100adetsağırldıg

ö-!Ünümlü, yerli ırk ve 1yaşındaki boğalardan serolojik

araştırmalar amacıylakan örnekleri, virolojikçalışmalar

içinisesperma ve nasalswapörneklerialındı. Serum Örneklerinin Mikronötralizasyon Testi (mNT) ile incelenmesi: Usulüne uygun olarak h

a-zırlanan kan serum örneklerinde BHV-l'e karşı rLÖI· rauzan antikorların varlığı Frey ve Liess'in (1971) b il-dirdiklerimikronötralizasyon testi(mNT) ilearaştırıldı.

Serum Örneklerinde indirekt ELlSA ile Antikor Tespiti: Bu amaçla, Laboratoire Service International (LSI, L1SSIEU, FRANSA) firmasının sığı r serumunda bulunan spesifik anti-lBR antikortannın tespiti için ha

-zırlamış olduğuELlSAkitikullanıldı.

62

Hücre Kültüründe Virus ızolasyonu ve BHV·1'in

I

dentifikasyonu;

usuıane

uygun

olarak lnokulasyona

hazırhale getirilen spenna

ve ra

sat

swap örneklerinin FötalDana Böbrek(FDB) hücre kültürlerinde3 kör pa-salı yapılarak, CPE gözlenen örnekler daha sonra Madln Darby Bovine Kidney (M OBK) devamlı hücre kültürlerine adapte edildi. Doku kültürü mikroskobu ile yapılankontrollerde,MDBKdevamlıhücrekültürlerinde

sitopatiketki (CPE) gözlenen hücrelerden toplanan

3

.

pasaj üst srvııan, ELlSA ile virus idenlifikasyonu ama -cıylakullanıldı.

ELlSA ile BHV· 1'in Teşhisi: Gerek hücre kül· türünde izole edilen viruslann BHV·l olarak iden

-ntikasyonu ve gerekse direkt olarakörneklerde BHV-1 antijen varlığının araştınıması amacıyla Bio-X Dj·

agnostics (Belçika) firması tarafından geliştirilen Bo-X BHV·1ELlSAkitikuUanddl.

PolymeraseChainReaetion (PCR) Metodu:Spe r-ma ve nasal swap örneklerinde n DNA ekstraksiyonu amacıyla QIAamp DNA Mini Ekstraksiyon Kiti (OL· AGEN,Almanya)kullanıldı. Ekstrakte edilen ONA'lar ti-cari olarak hazırlanan IBR DNA tespit PCR kili (NO· VENTISTM) kullanılarak amplifiye edildi. PCR ürünlerinin değerlendirilmesi için NOVENTISTM fir

-masınınbildirdiğielektroforeztekniğindenyararıamkn. Bulgular

Serolojik Çalışma Sonuçtan : Kan örneklerinin serum mNT ve ELlSA sonuçları Tablo l.'de gös-terilmiştir.

PozitifSerumlar mSerum Nötra lizasyon50 (SNSO) TestiSonuçları:Çalışmadaserum mNTsonundaBHV· 1 antikorlan yönünden pozitif olarak tespit edilen 14 adet (%14) kan serumu örneğinin mNT ile SNso

da-ğılımları 1/1.78- 1/22.4arası ndatespit edildi(Şekil 1). s

,

z a

•

_~

•

~ , O

"

:

§

~ < S 5 S

_'"

5

s

BoğalardaBovfne Herpesvit-us Tip-I.••

Tablo 1. Mikronötralizasyon ve ElISAile PozitifTespitEd- Tablo2. accekOOürlerildevirus izolasyorMJveizoleedlen

!enKanSerumlan viıuslannElISAileBHV-l olarakden1itikasyonsonuç!an

SenmNo mNT

EUSA

OmekNo uceeKO/tUründeVirusızolasyonu

i

Izoleedilen

1 + + Viruslan_tifjkasyonun ELlSA ileBHV-l Olarak Iden

-4 + +

5 + Sperma Nasal Swap

13 + Örneklerinde Örneklerinde 15 + + 1 +/(.)" -t , 18 + + 3 +/(+)

.

r

,

21 + + 4 +/(+)

-

t

:

7 +/(-) ./. 24 + + _{13 +/(+)} ./. 25 + ₁₄ +/(-) +/ . 37 + 15 +/(+) ./. 40

•

18 +/(-) ./. 43

•

+ 25 +1(+) ./. 45

•

+ 34 +/(-) ./. 48 + + 37 +/(.) ./. 47

_•

40 +/(+) +/. 44 + /(.) -t, 54

_•

_{45 +/(.) ./.} 55

_•

₄₇ +/(+) ./. 78

_•

58 +/(.) ./. 79

•

+ 58 +/(+) -t, BO

•

+ 62 +1(-) ./. 81 + + 64 +/(+) ./. 82 + + 72 +/(+) ./. 91 + + 82_{84 +}+/_/(.)₍₊₎ ·1· ·1· Sonuç 14 23 86 +/(+) ·1· 93 +/ (+) ·1·

Virolojik Çalışma Sonuçları: Hüc re kültü rle rinde 97 +/(+)

-

r

,

100 +/(+) -t•

virus ızolasyonu ve izole edilen virusların ELlSA ile

Sonuç 28/(15) 2/0

BHV-l olarakide ntifikasyonsonuçları Tab lo 2.'de gös

-terilmiştir. ( )"Hikrekültüründeizole edilenviruslarınElISA ile BHV·1

olarakidentifiye edilipedil emeciğiniifade etmektedr.

Şekil2. Spermaörneklerininpe Rsonuçlan M:Marker (390pb'ikDNA),VK:BHV·1KontrOı.

3:3'noIu soermaOmeği.7:TnoIuscerrreOme{;. 13:13'noIuspenrıaOmeği.NK:NegalilKc:ırıtra

83

Tablo 3. BHV- l AntijenVarlığıPozitifömekıemElISA

so-nUçIan

BHV·lAntijenVarlığı Pozitif

Örnek PozitifOmeklerin Örneklelin

No ElISA Sonuçlan ODDeğerleri

Sperma Nasa! Swap

12

_•

0.179

58 + 0.236

r

BULUT,YAVRU

Tablo 4.Araştırmanıntoplusonuçlan

Hücre Kültüründen Virusızolasyon u/

Örnek mNT ELlSNAntikor ELlSAile peRSonuçlan ELlSNAolijen

No Sonuçlan Sonuçlan Identifikasyonu Sonuçları

Sperma Nasal Swap Sperma Nasal Swap Sperma Nasal Swap

1 + + +/(-) .t; 3 +/(+) * .ı: ₊ 4 + + +/(+) -1 -5 + ·1· 7 +/(-) -1- + 12 -1- + 13 + +/(+) -I· + 14 +1(-) +1- + 15 + + +/(+) -I- + 18 + + +/(-) - 1-21 + + -I -24 + + -I-25 + +/(+) -I- + 34 +/(-)

.,

.

₊ 37 + +/(-) - I-40 + +1(+) +1- + 43 + + -I-44 +1(-) -1- + 45 + + +1(-) ·1· 46 + + -1 -47 + +/(+) -I- + 54 + -I-55 + -I- + 56 +/(-)

.

,

.

₊ 56 (+)'(+) -I- (+) (+) 62 +1(.) -I- + 64 +/(+) -1- + 71 -I· + 72 +/ (+) -I- + 78 ₊ .t: 79 + + - I-80 + + - I-81 + + - I-82 + + +/ (-) - I-64 +/(+) -1- + 85 -I- + 86 +/(+)

-

,-

+ 91 + + -I-93 +/(+) -1- + 97 +/(+) -1- + 100 +/(+) -1- +

( ).Hücre kültüründe izoleedilenviruslarınELlSAile8HV-1 olarakidentifiye edilipedilemediğin iifade etmektedir.

Boğalarda uovın eHerpesvirus Tip-i...

BHV-1 antijen van ığ ı nı n tespitiamacıyla direkt

EUSA ile incelenen ve pozitif olarak tespit edilen spermavenasalswap örneklerinin ELlS Asonuçları

Tablo3.'degösterilmiştir.

Potymerase Chain Reaetion (PCR) Sonuçları : Araştırmada kullan ı lanboğalardaneldeedilensper -ma örneklerinden 23 adedi (%23) PCR metodu ile

pozitifolarakbelirlenirken,nasal swapörneklerind e PCR metodu ile pozitif sonuç tespit edilemedt

(Şeklı2).

Tartış ma ve So n u ç

Buçalışmada, klinik olarak sağlıkl ı görünüm hl , biryaşında ve yeni ırk olan 100 adet boğadan alı­ nan kan serumu örneklerimNT ve EU SA ile kontrol edilerek, 14 (%14) adedi mNT ile ve 23 (%23)

adediELlS A ileBHV·1'e karşı oluşanantikonary ö-nunden pozitif olarak tespit edilmiştir. Elde edilen seropozitiflik oranları daha önce yapılan ça -lışmalarda (~Iorent ve Mameffe 1986, Burgu ve Akça1987,Oztü rk veark 1988, Bolatve ark 1996, Yavruve ark 1998b, Bilge·Oağalpve ark 2001)be -lirlenen oranlara göre düşük bulunmuştur. Be -lirlenen düşük seropozitivite oran la n nı n nedenleri, ömekalı nanhayvanlarmyaşlarınınküçükolmasına

(1 yaş), büyük bir kısmının hayvan hareketleri az

olan ilçelerden gelmesine, örnekleme yapılan ay -ların ilkbahar sonuve yaz başına rastlamasına, ırk hassasiyetine (yer li ırk) ve cinsiyete (boğa) bağ·

lanabilir.

Florent ve Marneffe (1986) BHV·1 virusuna karşı oluşan serum antikanannın tespiti amacıyla yaptıkları çalışmada, 42 adet sığ ı rdan kan serumu örneklerinialmışla r vebu hayvanlarda IBR/IPVlIPB

enfeksiyonlarının serotoilkteşhisi için EUSA'yl kul

-Ianm ışlard ı r. Araştırıcılar (1986), aldıkları 42 adet

kan serumunun 9 (%21.4) tanesini pozitif, 33

(%78.5) tanesinegatif olarakbellrlemlşlerdir.

Bu çalışmada, özellikle 1 yaş ında olan

bo-ğaları n örneklenmesi nedeniyle enfeksiyonun se·

roprevalansı her iki testte de düşük bulunmuştur.

Enfeksiyonun seroprevatanst ile hayvanların yaşı

arasındaki ilişkiyi beftnemek için pek çok çalışma (BurguveAkça 1986, Oztürkve ark 1988,Yavruve

ark 1998b, Bilge-Oağalp ve ark 2(01) yapı lmıştı r.

Burgu veAkça (1986)yaptıklan çalışmada, 3 yaşın üzerindeki boğalarda seropc zintltkoranının%1oo'e

ulaştığını, 1 yaşındaki hayvanlarda ise 0/033.3 ci

-varında olduğunu ifade etmişlerdir. Latent bir en -feksiyona neden olan BHV·1'inçeşitlitaktörterinet -kisi ile reaktivasyonu, enfeksiyonun ileri yaşlarda tekrar görülmesine neden olabilmektedir. Özellikle

65

2 yaş ve üzeri boğaların damızlık amacıyla kul

-lanı lması enfeksiyonun sperma vasıtasıyla bir

hay-vandan diğerine kolaylıkla bulaşmasının en önemli

nedenlerinden birisidir. Öztürk ve ark (1988) Konya Hayvancılık Merkez Araştırma Enstitüsünde yap

-tıkları araştırmada, en yüksek antikor dağılımın ı n 2

yaşın üzerindeki sığırlar arasında olduğunu bil

-dirmişlerdi r. Yavru ve ark (1998b) Konya Etve _Balık Kurumumezbahasınagetirilen farklı ırkveyaşlardaki boğalardan aldıkları kan serumu ömeklerinde en

yüksek antikor dağı tımının(%93.1-100) ve antikor tit -relerinin 3 yaşın üzerindeki boğalarda olduğunu b

il-dirmişlerdir. Yavru ve ark (1998b) yaptı kları

ça-lışmada, hayva nlarda seropo zitiflik oranlarının yaşa

bağlı olara k artmasın ın, özellilde tohumlamada aktif

olarak kuııanıld ığ ı yaşlarda daha yüksek oranda t

es-pitedilmesinin önem arz ettiğinedikkat çekmişlerdir.

Bu çatışmada örneklenen hayvanların 1 yaşında o l-ması belirlenen düşük seropezifliğin (mNT ile %14

ve ELl5Aile%23)birned eniolarak belirtilebüir.

IBRIIPV/lPB enfeksiyonlarında, bir bölged eki

hayvan hareketlerinin büyük önem arz ettiğini bit -dirilmiştir (Singh ve ark 198 5). Özellikle bir süreye yeni giren latent enfektehayvanla nn enfeksiyonuk o-laylıklaosürüyebulaşl ırabildiğibelirtilmektedir(

Msol-la ve ark 1981). Bu çalışmada, Konya ve çev

-resinden Kone l özel mezbahasma, hayvan

hareketle rinin çok yoğun olmadığı tespit edilen il·

çelerdeki işletmelerden kesim amacı lle getirilenhay

-vanlardanörnekleme yapılmıştır. Buaraştırmada, ör

-neklenen hayvanların geldiği bölgelerin özeltiği

nedeni lle elde edilen seropozitiflik oranları daha önce yapılan çalışmalara (Cho ve Bohac 1985,E d-wards ve ark 1986,Florent ve Marn effe 1986,Burgu ve Akça 1987, Öztürk ve ark 1988, Bolat ve ark 1996, Yavru ve ark 1998b, Bilge-Oağalp ve ark

2001)göredüşük bulun muştur. Ancak Msoltave ark (1981)Iskoçya'd a mNT ite yapmış old ukları serolojik

çalışmada eldeettikleri%12'tik seropozitiflikoranı ile

uyumiçindedir.

BHV-1enfeksiyonununözellikle kış mevsiminde daha sık ortayaçıktığı bilinmektedir. Kış mevsiminde

hayvanların kapalı işletmelerde banndmlması, en

-feksiyonun temasla birhayvandandiğerine kolaylıkla

nakli, latent enfekte hayvanlarda stres nedeniyle vi

-rusun reaktivasyonu ve yayılması enfeksiyonun a

r-tışındakien önemlinedenlerdir. Singh veark (1985), yağışlı mevsim lerde abert yapan hayvanlardaki s

e-ropoz itiviteyi yaz mev siminden daha yüksek

(p<O.05) oranda bulmuşlardır. Bu yüksek s

e-ropozitiviteyi virusurt yazın daha az aktif olmasına

bağlamışlardır. Bu çalışmada, örnekleme takviminin özellikle ilkbahar sonu ve yaz başına rastlaması,

i

BULlIT. YAVRU

elde edilen düşük seropozitiflik oranlarını daha iyi açık-layabilir.

IBRlIPVIIPB enfeksiyonlarında ırk hassasiyeti

ile ilgili birçok çalışma yapılmıştı r (Msolla ve ark

1981, Singh ve ark 1985, Yavru ve ark 1998b). Msolla ve ark (1981) yaptıklan ça lışmada, sürüye

sonradan giren Holstein ırkı dişilerile enfeksiyonun

ortayaçıkışı arası ndabirilişki olduğuha dikkat ç

ek-mişlerdir. Singh ve ark (1985), yerli hayv anlarda ki seropozltlvlteyt (%22.2) , Jersey (%50.3) ve Hcls

-tein-Fnesian(%35.4) ırkı hayv anlardan daha düşük

bulmalanna rağmen. çalışmada kullanılanyerli hay

-van sayısının az olması nedeniyle tam bir kar

-şılaştırma yapamayacaklanm bildirmişlerdir. Yavru

ve ark (1998b) yaptıklan çalışmada, Holstein ırkı

hayvanlardaki seropozitiviteyt (%19.66) yerli ırk­

lardan (OM) daha yüksek buımcşıarcnr. Bu araş­

tırmada da, örneklenen hayvanların yerli ırkıardan oluşması ve yerli ırkıan n özellikle çevresel şartlara ve iklim koşullarına karşı daha dayanıklı olması LLe

açıklanan düşü k seropozitiflik oranları (%14 ve

%23 ), Singh ve ark. (1986) ile Yavru ve ark

(1998bl'mn çalışma sonuçları ile uyumlu b

u-lunmuştur.

ElISA'nı nindirekt teşhistedahaduyarlıve pra

-tik olması nedeniyle, nötrarzasyon testi ile

kar-şılaştınldığında en uygun metot oldu{ıu b il-dirilmektedirBunedenle,bir çok araştırıcı (Durham

ve anıers 1986, Edwards ve ark 1986, Rorent ve

Mamefle 1986) duyarl ı lıklan ve spesititelerini be-linernek amacıyla serum mNT ile ELlSA'yl birlikte kullanarak buikitestikarşılaştı rmışlardır.

Durham ve Sillars (1986)ELlSAprosedürünü n

hızlı olduğunu ve serum mNT'n e göre daha çok r

e-aktörü tespit ettiğini belirtmişlerd ir. Araştırıcılar

(1986) aym zamanda sitotoksik özelliğinden dolayı

serum mNT ileincelenmek için uygunolmayan

se-rumiarın ELlSA ile sonuç verebildiğini de

blt-oirmişterdir. ColJins ve ark (1984/85)da ELlSA'mn diğer serolojik testlere göre daha duyarlı olduğunu veçok kısa sürede sonuç verdiğini belirterek, elde edilensonucun güvenirliliği nedeniyle, bu metodun kullanımımn son yıllarda hızla arttığını ifade et-mişlerdir.

Bolat ve ark(1996),Elazığve çevresindekitop

-lam 335 adet kültür ırkı sığırdan alınan kan

se-rumiarı nı mNT ve ELlSA ile kontroletmişlerve test

edilen örneklerin 188 ("IoS6.1l'ini ELlSA ile 98

(%29.2S)'ini de mNT ile BHV- 1'e karşı oluşan

an-tikorlar yönünden pozitif bulmuşlardı r. Araştırıcılar (1996),serummNT ve ELlSAarasındakisensitivite

66

farkım ise mNT'nde uyguladıkları inkubasyon s

ö-resine bağlamışlardır. Edward ve ark (1986) da 24

saat süren inkuba syon periyodunu n ardından

rrc-difiye serum mNT ile ELlSA arasında sensitivite tar

-kını n olmadığım, 1 saat süren inkubasyon pe

-riyodunun ardından standart serum mNT ile ELlSA

arasında sensltlvlt e farkının old uğun u bildirerek, uy

-gulanan inkübasyon süresine ba{ılı olarak bu farkı n

oluştuğunu belirtmişlerdir.

Bu çalışmada, serum mNT' nde 1 saat standart

inkubasyonperiyodu uygulanmış ve virusa karşı

otu-şan tüm antikorlan belirleyebilen ticari bir ELl SA krti

kuııanılmı ştı r. Araştırmada elde edilen sonuçla ra göre, ELlSA'nın mNT'nden daha duyartı bulunması ,

ELl SA ile tüm virusa bağlanan antikonann. serum

mNT'nde ise sadece virusu nötraüze eden a

n-tikonann tespit edilmesinebağlanabilir.

Yete rli düzeyde antiko r titresi oluşmamış veya

seronegatif latent enfe kte hayv anlarda, IBR/IPVlIPB

enfeksiyonları n ı n serotojik teşhisi nde uygulanantes

t-lertn bazen yetersiz kalabildiği bilinen bir gerçektir

(Kahrs 1977). Bu nedenle enfeks iyonun araş­

tırılması nda, serolojik teşhisin yanında, direkt olarak etken izolasyonuveya antijen varlığımntespitine yö

-neliktestlerden de faydalanmanın gerekli olduğu be

-Iirtilmektedir (Ünver 2002).

Edwardsve ark(1983) intranasalolarakBHV~1'i inekule ettikleri hayvan lardan aldıklan burun swap

-ları ndan immunofloresans (IF), immuno peroxidase (IP) ve ELl SA ile viral antijen varlığının belirlenmesi

ve primer dana böbrek (PDB) hücre kültürlerinde

virus izolasyonu ve izole edilen virusların iden

-titlkasyc nu için ise ıP tekniğini kullanm ış lar ve bu 4

testin hassasiyetini karşıfaştrrrr uştartnr. Araşt ırıcılar

(1983), hücre kültüründe virus izolasyonunun IF, ıP

ve ELlS A'dan dahaduyarlı olduğ unu belirtilmiştir.

Yavru ve ark (1998a) Ankara'daki suni t

o-humlama istasyonundan ve halkın elinde bulunan,

Konya Et ve Bal ık Ku rumu Mezbahasında kesime

getirilen, aşımda kullanılmış boğalardan aldıklan 60

adet sperma örneğindenvirus izolasyonuçalışmalan

yapmışlardı r. Araştırıcı lar (1998a) , izole ettikleri 5 adetvirusun 3'ünü nötralizasyon testi ile BHV-l o

la-rak identifiye etmişler ve hücre kültürleri nin oldukça

fazla ekipman gerektirmesine, masraflı olmasına ve

sonuçları n geç elde edilmesi ne rağme n teşhis için

hassas bir yöntemolduğunuifade etmişlerdir.

Bu çalışmada, spermaları n 26 (%26)'sl, nasal swapları n ise 2 (%2l'sivirus izolasyonu amacıylay

-

,-,

BoğalardaBovineHerpesvirusTip-I,..

lunmuştu r. Sperma ve nasal swap örneklerinden virus izole edilen örneklerin identifikasyonu için ELlSA ile kontrol edi lmiştir. CPE pozitif26 sperma örneğinden 15 adedi BHV-1 olarak identifiye edi-lirken,CPEpozitif2 nasalswapörneği BHV-1o la-rak identifiye edile me m i şt i r. Elde edilen sonuçlar,

hücre kültürlerinde virus izolasyon unun has-sasiyetini belirten diğer çalışmalarla (Edwards ve ark 1983, Yavru ve ark 1998a) uyumlu bu-lu nmuştur.

Türkiye'de IBRlIPV/IPB enfeksiyonlarınındirekt teşhisinde ELISA'nın kullanıldığı herhangi bir ça-lışma daha önce bildi rilmemiştir. Bu araştırmada,

sperma ve nasal swap örnekleri ka prosedürüne

uygunolarak ELlSA ile kontrol edi lmiştir. Incelenen sperma ve nasalswapörneklerinin 1(%1}'eradedi BHV-1antijenvarl ı ğ ı yönünden pozitif olarak tespit edilmişti r. Araştı rmada, ELISA'nın BHV-1'in antijen varlığının tespiti amacıyla kullanılabi leceğini, ancak hassasiyetinindaha az olduğ u ve başka bir test ile sonucun mutlaka desteklenmesi gerektiği ortaya konulmuştur.

Son yıllarda yapı lan çalışmalarda hızı, s pe-sititesive sensitivitesi nedeniyle polymerase chain reaction (PCR) metodu üzerinde yoğunlaş ı l mıştı r

(Sreenivasa ve ark 1996, Rocha ve ark 1999,

Fuchs veark1999). PCR metodunun çok kısa sü-rede sonuç verebilmesi ve diğe r rutin teknikiere oranla daha duyarl ı olması nedeniyle büyük bir avantaja sahip old uğ u bildi rilmiştir (Belak ve ark. 1987, Belak ve Ballagi-Pordany 1993, Çetinkaya

1998).

Birçok araştırıcı (Rola ve Zmudzinski 1989, Van Engelenburg ve ark 1995,Masri ve ark 1996,

Wagterve ark 1996, Rocha ve ark 1998, Smits ve

ark 2000)'ya göre PCR metodu klinik nu

-munelerden BHV-1'in tespitinde, hücre kültüründe virus izetasyonmetoduna göredaha duyarlıdır.

Rola ve Zmudzinski (1989) yaptıkları bir ç

a-lış mada, BHV·1 ile doğalolarak enfekte boğaların

sperma örneklerini kullanarak, PCR ve virus ize

-lasyon metotların ın duyarlılıklarını k ar-şılaştırm ışlard ı r. MDBK devamlı hücre kültürlerine

virus izolasyonu amacıyla yöntemine uygun olarak

hazırlad ı kları 44sperma örneğini inekuleederek,IF testi ile 6 (%13.6)'slnl BHV-1 olarak identifiye e t-mişlerdir. Araşt ırıcılar (1989), incelenen sperma ör-neklerinin21 {%47.7)'ini ise PCR metodu ilepozitif

olarak belirleyerek, PCR'ın virus izolasyon me -todundan 10 kat daha fazla duyarl ı olduğunu ifade etmişlerdir.

67

Rocha ve ark (1998) Brezilya 'da bir suni to

-humlama merkezinde bulunan 61 boğadan to

p-ladıkları 101 sperma örneği ni hücre kültüründe virus izolasyonu ve PCR metodu ile inceleyerek her iki testikarşılaştrrmı şlardır. Araştırı cılar(1998)hücre k ül-türünde izole ettikleri 20 adet (%19.8) virusu

n

öt

-raHzasyon testi ile, araştırılan örneklerin 32 adedini

(%31.7) ise PCR metodu ile BHV-1olarak identifiye

etmişlerdir.

Bu çalışmada, klinik olarak sağlıkl ı görünümlü vebiryaşındaolan100adetboğadanalınan sperma ve nasalswap örnekleri yöntemine uygun olarak ha

-zırlandıktan sonra PCR metodu ile incelenmiş ve

elde edilen PCR ürünlerinin agaroz jel elektrotorez

ile analizisonucunda 23 spermaörneği BHV-1 DNA

varlı ğ ı yönünden pozitif bulunurken, nasal swap ör-neklerinin hepsi negatif olarak tespit edilmiştir. Elde

edilensonuçlaragörepeR metoduhücre kültüründe

virus ızolasyonu ve ELlSA 'ya göre daha duyarlı bu -lunmuştur. Bu sonuç daha önce yapılan ve PCR metodunun hücre kültüründ e virus izolasyonundan

daha duyarlı olduğ unu gösteren çalışmalar (Rola ve

Zmudzin ski 1989, Van Engelenburg ve ark 1995, Rocha ve ark 1998, Zhou ve ark 1999,Smits ve ark 2000)ile uyumlubulunmuştur.

Araştırmada, toplam 25 hayvanvirus(hücre kü

l-türünde virus izolasyonu ile 15'i), viral genom (PCR ile 23'ü) veyaviralantijen (ELlSA He1'i)varlığını t es-pit etmek amacıyla yapılan testler ile pozitif olarak belirlenirken , 23 hayvan BHV-1'e karşı oluşan an -tikorlar yönünden pozitif (ELlSA ile 23 ve mNT ile 14) olarak tespit edilmiştir. Araştırmada virus/ viral genom veya viral antijen varlığ ı yönünd en pozitif b

u-lunantoplam 25 hayvandan 18 adedind eantikorte

s-pit edilememiştir. Bu sonuçlar, 18 hayvanda ö

r-neklemenin yapı ldığ ı dönem de enfeksiyonun akut

olarak seyrettiğ in i ve hayvanların virusa karşı henüz

antikor oluştu rmaya başlamadığın ı gösterme ktedir.

Böyle bir durumda 2-3 hafta sonra yapılacak olan 2.

bir örnekleme ile enfeksiyonun durumu daha açı k

olarakortaya konabilir.Bununyanı sıra, yukarıda be -lirtilen 18 hayvarıda Kahrs (1 977)' ın da bildirdiği gibı

virusun lokal bir enfeksiyon oluşturabi leceği ve bu

nedenle de lokal enfeksiyon esnas ı nda

sir-külasyonda antikorların tespit edilemeyecek kadar

düşük seviyede olabileceğ i de göz ard ı edi l-mem elidir. Hem antikor hem de virusl viral genom veya viral antijen varlığı yönün den pozitif olarak t es-pit edilen 7 hayvanda ise BHV-1 rekürrensinin (tek -rarlama) meydana geldiği düşünülebilir. Bununla ilgili olarak, Güngör (2003) tarafı ndan yapılan bir araş­ tırmada antikor yan ıtını n mevcut olduğu hayvanpo

-BULUT.YAVRU

pulasyonlarında BHV·1 rekü rrensi oluştuğu sa

p-tanmış, 1124'e kadar olan antikor litre değerlerinin

bireyleri BHV· 1 rekUrrens veya reenfe ksiyon -larından koruyamadığı önemli bir epidemiyolojik

sonuç olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada da antikoryanıtının mevcut olduğu hayvanlarınantikor titreleri 1/1.78 ile 1/22 .4 arasında tespit edilmiştir.

Araştırmada, virus! viral genom veya viral antijen

varlığ ı yönünden negatifoldu{ıuhaldeantikorvarlığı

yönünden pozitif olarak tesp it edilen 16 hayvanda

ise enfeksiyonun latent bir dönemde olabileceği

akla gelmektedir.

Sonuç olarak çalışmada, serolojlk teşhiste

ELISA'nın mNT' nden, BHV- 1'in teşhisinde ise

PCR' ln ELlSA ve virus ızolasyon metottanndan

daha hassas olduğu görü lmektedir. Bu çalışmada,

direkt teşhis amacıyla kullanı lan sperma ö

r-neklerinden tespit edilen virus! viral genom veya

antijenvarlığı (PCR ile 23,Vi ile 15ve ELlSAile 1) nasalswapömeklerinde tespit edilenden (PCR ile O, Vi ile Ove ELlSA ile 1) çok daha fazladır. Bu

durum enfeksiyonun hayvanların büyük

ço-ğunluğundalokal olarak seyrettiğini gösterme ktedir.

Bu durum, özellikle sunitohum lama merkezlerinde

kullanı lan ya da bu merkezlerde kullanılmak üzere

seçilen boğaları n BHV·' enfeksiyonu yönünden

araştırılmasında materyalolarak nasalswaptançok spennanın seçilmesinin.teşhis açısından daha g ü-venilir olduğunu göstermektedir. Bu araştırmadan

elde edilen sonuçlar, sığı rları n özellikle boğaların

rutin olarak BHV·1 antikor varlı ğı yönünden belirli

periyotlarda incelenm esi ve bu kontrollerin BHV-1

varlığını ortayakoyan direktteşhis metotlarından

bl-nsl

ile özellikle de PCR ile mutlaka desteklenmesi

gerektiğini göstermiştir.

Kaynaklar

BelakS,Rockbom G,WierupM, BelakK, BergM and

UnneT(1987). Aujeszky'sdisease inpigs diagnased

byasımpıemethodofnucleicacidhybridization,JVet

MedB,34.519-529.

BelakS and Ballagi-PordanyA(1993).Application of

the poIymerase chain reaetion(PCR) inveterinary di

-agnostic virology,VetRes Commun,17,55-72.

Bilge Oağalp S. Yıldırım Y ve Alkan F (2001). Bu

-zağılarda maternal BHV·1 antikor düzeyinin

be-lirlenmesi,AÜVetFak Derg,48,117·122.

Bolat Y, Bulut H, Özdarendeli A and Doymaz MZ (1996). Development of enzyme linked i

m-munosotbent assay for deteetion of antibodies i

n-fectious bavine rhinotrachei1isl infectious pustular v

ul-vovaginitisvirusincanla,FOSağBilOerg.10.2, 2

83-288.

Burgu

i

ve Akça Y (1986). Turkiye'de suni t

o-humlamada kullanılanbazı damızlıkboğalarda IBRIlPV

enfeksiyonu,AÜVet FakDerg,33.1.11~121.

Burgu

i

veAkçaY(1987).Firstisolation of IBRvirusin

Turkey,TropAnimHlthProd,19, 56.

Cho HJ and Bohae JG (1985). Sensitivity and spe-sifieityofaenzyme-linkedimmunosorbentassay for

de-tecuonofinfectious beyinerhinotraeheitis viralantibody

incattle,CanJComp Med. 49,189-194.

Collins JK, BuJla AG, Riegel CA and Butcher AC

(1984185). A single dilution enzyme-linked ım­

munosotbentassayforthequantitativedetectionof

an-tibodiesto beyine herpesvirustype 1.VetMıcrobiot, 10,

133-147.

Çetinkaya B(1998).Polimerazzincirreaksiyonu (PZR)

temelprensipleri, FÜSağBilDerg,12.2.14g.156. Durham PJK and Sillars HM (1986). Evaluation of an

enyzme-linked immunosorbent assay (EUSA) for s

e-rodiagnosis of infeeticus bovine rhinotracheitis i

n-fection, with results of a preliminary survey, New Ze

-aland VetJournal. 34.27-30.

Edwards S, Chasey D and White H (1983). Ex

-perimental infeetious bovine rhinotractracheitis: c

om-parison of four antigen detecnon methods, Res Vet

Sei,34,4245.

Edwards S, Woods SB, Westcon DG, Emmerson M,

Jones PC and PhillipsAJ (1986).An evaluationof five serologieal tests for the deteetion of antibodies to b o-yine herpesvirus 1 vaecinated and experimentally in

-fectedcattıe. Res Vet

S

el.

41,378-382.

Engels M and Ackermann M (1996). Pathogenesis of

ruminants herpesvirusinfections,Vet Mierobiol,53,3

-15.

AorentG andMamelfeOC (1986).Enzyme linkedi m-munosorbent assay ueed lo mcmtcr serum an1ibodies

to bevinerespiratorydiseaseviruses,Vet Microbiol,11,

309-317,

Frey HR and Uess B (1971) Vennehrungskinetik und veıwe nd barkei1 eines stark zytopatogenen VD-MD

-Virusstammes für diagnostische untersuchungen mit

der Mikrotiler-Methode.ZblVet Med.18.61-71.

Fuchs M, Hübert P. Detterer J and Rzıha I-LJ (1999).

Detection of bovlneherpesvirus type1inblood fromna

-turaııy cattle by using a sensitive PCR that dis

ı

i

,

,

,

.

BoğalardaBeetneHerpesvirusTip-l•••

gtycoprotein E. J ClinMicrobiol.2498-2507.

Güngör BA (2003).Birsüt sığırcıhğı işletmesinde tek-rar1ayan (rekürrent)BHV-l enfeks!yonoranı.virusızo­ lasyonu V8 karakterizasyonu. A U Vet Fak, Doktora

Tezi,Ankara.

JonesC.DelhonG,Bratanich A.KutishGand AockD

(1990).Anatysis of the transcriptiana! promoter which

regulales thelaıerıcy-related transcriptof bovine her

-pesvirus1.JViral.1164-1170.

KaashoekMJ. Straver PH. Van Aooij EMA.Quak J

and Van Olrschot JT (1996). Virulenee,

im-munoqenlcity and reactivation of seven bovine

her-pesvirus 1.1 strains: elinical and virological aspects,

VelAec, 26.416-421.

Kahrs AF (1977). Infectious bcvine rhinotracheitis: a

review and update, J Am Veı Med Assoc, 15, 171.

1055-64.

KiL S.OlsukaHand Kit M (1992).BlockingELlSAfor

distinguishing infectious beyine rhinotracheitis virus

(IBRV)-infected animalsfrom those vaccinatedwith a

gene-delel edmarkervaccine,J Virol Methods.40.

45-56.

KupferschmiedHU,Kihm U,Bachmann P.Mul1erKH

and Ackermann M (1966). Transmission of IBRIlPV

virus in bevine sperma: A case report, The -riogenology.25,3,439-443.

MasriSA,OısanW,NguyenPT,Prins SandDeregt D

(1996).Aapiddetection of BovineHerpesvirus 1inthe

sperma of infeeted bulls by a nested polymerase

chainreaetionassay,CanJvetRes, 60,100-107.

MsoJla PM, Wiseman A and Selman LE (1981). The

prevelence of serum neutraüzfnç antibodies to

in-fectiousbovjnerhinotrachettisvirusinScotland JHyg

Comb,86,209-215.

Öztürk F,Toker A ve Yavru S (1988). Konya Hay

-vancılık Merkez Araştırma Enstitüsü sığınarında

in-fecuous bovinerhinotracheitis üntecucus pustularvu

l-vovaginjtis (IBRIlPV) uzerine araştırma. S ÜVet Fak Oerg.4. 1,53-64.

RochaMA. BarbosaEF,Guimaraes SEF,Dias Neto Eand GouveiaAMG (1998). A highsensitivity-nested PCA assayforBHV-l detectianin spermaof naturally

infectedbulls,Vet MiCfobial,63,1-11.

RochaMA, BarbosaEF, GuedesAM,lageAP.Leite

RC and GouveiaAM(1999). Detection of8HV-l in a

naturally infeeted bevine fetus by a nested PCA assay,Vet Aes Commun,23, 2,133-141.

RolaJ and ZmudzinskiJF(1989).Detecticnofbovine

69

herpesvirus 1in0011sperma by PCA,Bull Vet ins Pu

-lawy,43.119-123

Singh BK, Kant R and Tangaonkar SS (1985).

Se-roIogical survey of infeeticus bevine rhinotracheitis (IBA) in dairy cente.IndJAnim SCi,55,10.843-846.

Smith GA. Young PL and Malli ck (1991). Nudeotide

and amino acidsequence anelvets of the thymidine ki

-nase gene of a beyine ence pheüüsherpesvirus. Arch

Virol. 119.199·210.

SmitsCB,Van Maanen C,GlasRO,De GeeAL,Dijks

-trabT,VanOirsehotJTand Rijsewijk FA (2000).

Com-parisonof threepolymerase chainreactionmethods for

routinedetection ofbovineherpesvirus1DNA infresh

bullsperma,JVirol Methods, 85,1-2,65-73.

Sreenivasa BP.AasoolTJ and Natenen C (1996).Di

-rect deteetion of Bovine Herpesvirus tip-l DNA from

canculturef1uids using polymerase chain reaetion, lnd

JExperBiol.34.1169-1171.

ÜnverA(2002).Slğır1ardaBHV-l infeksiyonlannınPCA ve ELlSA ile saptanması ve risk faktör1erinin be

-ürtenmesı.

i

Ü Vet Fak,DoktoraTezi.

Van Engelenburg FAC, Van Scnie FW. Rijsewijk FAM andVan OırscootJT, (1995). Excretion of bevine h

er-pesvirus 1in sperma is detectedmuchlonger by PCA

than byvirusisolation, JCrin Microbiol, 33,2, 308-312.

Van OirsehatJT.StraverPJ,VanLieshoutJA,OuakJ,

Wesıenbrink Fand VanExselAC(1993).A subclinical

infection of bulls with bovine herpesvirus type 1 at an

artificialinseminationcenter,Vet Aec,9,132, 32-35.

Wagter LH, Glas AD, Bleumink-Pluym N. Van

En-gelenburgFA,Rijsewijk FAand HouwerDJ(1996). A

polymerase chain reaetion (PCA) assay for the de

-tecticnofbeyine herpesvirus1(BHV1) inselectively di

-gestedwhole bovine sperma,Vet Aes Commun,20,4,

4010408.

Whetsone CA.Wheeler JG and Redd DE (1986). I

n-vestigationof possiblevaccine-inducedepizooticsofin

-feetious bovine rhinotracheitis, using restriction e

n-donud easeanalysis ofviral DNA.AmJ Vet Aes,47,8.

1789· 1795.

WinklerMTC. Doster A. Sur JH and Jones C (2002). Analysis of bevinetrigeminal ganglia following infeetion

withbovine herpesvirus 1,Vet Micröbicl,86, 139-155.

YasonCV,Harris LM,McKennaPK, Wadowska Dand

KibengeFS(1995).Establishment ofconditionsforthe

detection of Bovine Herpesvirus tip-t by polymerase

-BUL UT,YAYRU

gion,CanJVet Res,59,2, 94-101.

Yavru S, _Şimşek A veÖztürk F (1998a). _Boğalarda

BovineHerpesvmıstip1(BHV-1)enfeksiyonunun

se-rolojik ve virolojikolarakaraştı rıl m as ı, Vet BilDerg,14,

2,101-110.

Yavru S,Öztürk F, Şimşek A,Yapkıç Ove Yıldız C

(1998b). Suni ve tabii tohumlamada kullanılan b

o-ğaların spermalanndan virus lzoıesyonu, Vet Bil Derg,

14,2,39-46.

Zhou J, Lyaku J, Fred rickson RA and Kibenge FS

(1999). Improved dete ction of bovine herpesvirus 1 in

artificially infected bovine sperma by protein amp