211 G‹R‹fi
Kinolonlara direnç kullan›ma girdikleri 1980’li y›l-lardan beri belirgin flekilde artmaktad›r. Direnç kino-lonlar›n farkl› hasta gruplar›nda yayg›n olarak kulla-n›mlar›na ba¤l›d›r (1). Kinolon direnci DNA giraz veya topoizomeraz IV gibi hedef enzimlerdeki flikliklere ba¤l› olabilece¤i gibi, d›fl membran de¤i-fliklikleri ve/veya antibiyoti¤in aktif olarak d›flar›ya pompalanmas› yoluyla bilefli¤in hücreiçi yo¤unlu¤u-nun düflürülmesiyle de geliflebilmektedir (2). Escherichia coli (E.coli) birçok farkl› tip hemolizin üretebilmektedir. Bunlar›n bafll›calar› α-hemolizin (hücre d›fl›), β-hemolizin (hücreye ba¤l›), γ-hemoli-zin (nalidiksik asit dirençli mutantlar taraf›ndan sal-g›lan›r) ve enterohemolizindir (hücreye ba¤l›). α ve β hemolizinler de¤iflik memeli türlerinde ayn› aktivi-teyi göstererek belirgin bir hemoliz zonu
oluflturur-lar. γ-hemolizinler ise insan ve tavflan eritrositlerini hemolize edememeleriyle, α ve β hemolizinlerden ayr›l›rlar (3). E.coli sufllar›nda α-hemolizin üretimi-nin üriner sistem infeksiyonlar›, sepsis ve di¤er sin-dirim yolu d›fl›nda kalan infeksiyonlarla iliflkili oldu-¤u birçok epidemiyolojik çal›flmayla gösterilmifltir. Bu protein yüksek sitotoksik aktivite sahibi olmas›-n›n yan›s›ra fagositozu da etkileyebilmektedir (3,4). Bu çal›flmada üriner sistem infeksiyonu etkeni olarak izole edilen E.coli sufllar›n›n baflta kinolon grubu an-tibiyotikler olmak üzere çeflitli anan-tibiyotiklere diren-cinin hemolizin üretimi ve hemolizin tipleri ile ilifl-kisinin araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bakteri: Çal›flmada ‹stanbul T›p Fakültesi Mikrobi-yoloji ve Klinik MikrobiMikrobi-yoloji Anabilim Dal›’nda üri-ner sistem infeksiyonlu hastalardan izole edilen 100
Escherichia coli Sufllar›nda Çeflitli Antibiyotiklere
Diren-cin Hemolizin Üretimi ve Tipleri ile ‹liflkisi
Ömer KÜÇÜKBASMACI(*), Özden BÜYÜKBABA-BORAL(**), Tolga Ö⁄ÜT(**),Serdar SUSEVER(**), Mine AN⁄-KÜÇÜKER(**), Özdem AN⁄(**)
ÖZET
Yüz klinik Escherichia coli suflu hemolizin üretimi, hemolizin tipleri ve ampisilin, ampisilin-sulbaktam, gentamisin, trimetop-rim-sulfometoksazol, tetrasiklin, nalidiksik asit, norfloksasin, ofloksasin ve siprofloksasin direnci aras›ndaki iliflki bak›m›ndan incelenmifltir. Sufllar›n 24’ü en ez bir tip hemolizin üretmektedir. Hemolitik olmayan sufllarda hemolitik olanlara göre norflok-sasin ve siprofloknorflok-sasin direncine daha yüksek oranda rastlan›l›rken (p<0.05), di¤er antibiyotikler için böyle bir iliflki bulun-mam›flt›r.
Anahtar Kelimeler: Antibiyotiklere direnç, hemolizin, Escherichia coli SUMMARY
The Relationship Between Haemolysin Production and Haemolysin Types and Resistance to Various Antibiotics among Escherichia coli Strains
One hundred clinical isolates of Escherichia coli were investigated for haemolysin production, haemolysin types and their re-lationship with resistance to ampicillin, ampicillin-sulbactam, gentamicin, trimethoprim-sulphometoxazole, tetracycline, na-lidixic acid, norfloxacin, ofloxacin and ciprofloxacin. 24 strains produce at least one type of haemolysin. The percentages of resistance to norfloxacin and ciprofloxacin, but not to other agents, among non-haemolytic isolates were significantly higher (p<0.05) than among haemolytic isolates.
Key Words: Antibiotic resistance, haemolysin, Escherichia coli Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33:211-213
(*) ‹stanbul Üniversitesi, Deneysel T›p Araflt›rma Enstitüsü, Çapa, ‹stanbul
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33:211-213
212
E.coli suflu kullan›lm›flt›r. Sufllar›n hepsi ayr› hastalar-dan izole edilmifltir. Sufllar kullan›ma kadar –70°C’de %10 gliserol katk›l› triptik soy s›v› besiyerinde sakla-n›lm›flt›r.
Antibiyotik duyarl›l›¤›: Antibiyotik duyarl›l›¤› disk diffüzyon yöntemiyle saptanm›flt›r (5). Her sufl için ampisilin (10 μg), ampisilin-sulbaktam (10/10 μg), gentamisin (10 μg), trimetoprim-sulfometoksazol (TMP/SMX) (1.25/23.75 μg), tetrasiklin (30 μg), nali-diksik asit (30 μg), norfloksasin (10 μg), ofloksasin (5 μg) ve siprofloksasin (5 μg) kullan›lm›flt›r (Oxoid-He-makim).
Hemolizin üretiminin saptanmas›:
α ve enterohemolizin: α ve enterohemolizinlerin saptanmas› için bakteriler 10 mM CaCl2 ve üç kez PBS (pH 7.2) ile y›kanm›fl %5 koyun kan› ilaveli trip-tik soy agara ekilmifltir. Üç saat inkübasyon sonras› görülen hemoliz zonu α-hemolizin, ayn› petrinin bir gece daha inkübe edilmesiyle oluflan ekstra hemoliz zonu ise enterohemolizin olarak de¤erlendirilmifltir (3,6).
β-hemolizin: %5 koyun kanl› agarda bir gecelik inkü-basyondan sonra görülen hemoliz zonu β-hemolizin olarak de¤erlendirilmifltir (3).
γ-hemolizin: Mikroorganizman›n %5 koyun kanl› Columbia agarda hemoliz zonu oluflturup insan kanl›-da oluflturmamas› γ-hemolizin üretimi olarak de¤er-lendirilmifltir (3).
‹statistik: Hemolitik ve hemolitik olmayan sufllar aras›nda antibiyotik direncinin istatistiksel olarak farkl› olup olmad›¤› χ2
ve Fisher kesin χ2
testi (norf-loksasin, ofloksasin ve siprofloksasin için) kullan›la-rak saptan›lm›flt›r. p de¤erinin <0.05 oldu¤u farkl›l›k-lar anlaml› ofarkl›l›k-larak kabul edilmifltir.
BULGULAR ve TARTIfiMA
Yüz E.coli suflu için antibiyotik direnç oranlar› ampi-silin %49, ampiampi-silin-sulbaktam %25, gentamisin %5, tetrasiklin %75, TMP/SMX %45, nalidiksik asit %40, norfloksasin %20, ofloksasin %23 ve siprofloksasin için %20 bulunmufltur. Türkiye için direnç oranlar› bölgelere göre farkl›l›k gösterebilirse de, ayn› Anabi-lim Dal›’nda 1996 y›l›nda kinolonlara direncin %2 olarak bulundu¤u bir çal›flmadan oldukça yüksek
ola-rak bulunmufltur (7). Bu art›fl kinolonlara direncin son y›llarda h›zla artmakta oldu¤unu bir kez daha do¤ru-lamaktad›r.
Sufllar›n %24’ü en az bir tip hemolizin üretirken kalan %76’s› hiçbir besiyerinde hemolitik aktivite göster-memifllerdir. Üçlü (α, β, γ) tipi %9 ile en s›k belirle-nen hemolizin tipi olmufltur. Hemolizin tipleri ve an-tibiyotiklere direnç aras›nda herhangi bir iliflki bulun-mam›flt›r (Tablo 1). Norfloksasin ve siprofloksasine karfl› dirence hemolitik olmayan sufllarda hemolitik olanlara göre daha fazla rastlan›l›rken (p<0.05) di¤er antibiyotiklerde böyle bir farkl›l›k belirlenmemifltir. Ayr›ca nalidiksik asit ve ofloksasinde de hemolitik ol-mayan sufllarda direnç daha yüksek bulunmufltur fakat aradaki fark istatistiksel olarak anlaml› de¤ildir (Tab-lo 2).
Hariharan ve ark. (8) ishalli domuzlardan elde edilen hemolitik ve ›s›ya duyarl› enterotoksin üreten E.coli
sufllar›n›n, her iki virülans faktörüne sahip olmayan sufllara oranla daha s›k TMP/SMX, neomisin ve tetra-siklin direncine sahip olduklar›n› belirlemifllerdir. Martinez-Martinez ve ark. (9) hemolitik olmayan E.coli sufllar›nda kinolonlara ve tetrasikline daha yük-sek oranda dirence rastlam›fllard›r. Buna karfl›l›k bu çal›flmada di¤er araflt›rmac›lardan farkl› olarak hemo-litik ve hemohemo-litik olmayan sufllar aras›nda gentamisin, tetrasiklin ve TMP/SMX direnci aras›nda anlaml› bir fark belirlenmemifltir. Martinez-Martinez ve ark. (9) ayn› çal›flmalar›nda in vitro koflullarda siprofloksasin dirençli hale getirilen hemolitik ve siprofloksasin
du-Tablo 1. 24 hemolitik E.coli suflunda hemolizin tiplerinin da¤›l›m›.
α
n (%) 3 (12.5) 1 (4.2) 4 (16.7) 3 (12.5) 2 (8.3) 9 (37.5) 2 (8.3)
Tablo 2. 24 hemolitik ve 76 hemolitik olmayan E.coli suflunda antibiyotiklere direnç.
Hemolitik Hemolitik olmayan
Ampisilin Ampisilin-sulbaktam Gentamisin Trimetoprim-sulfometoksazol Tetrasiklin Nalidiksik asit Norfloksasin Ofloksasin Siprofloksasin * : p<0.05 50 37.5 8.3 45.8 75 33.3 4.1* 8.3 4.1* 48.7 21 3.9 44.7 75 50 25 27.6 25 β γ α+β β+E α+β+γ α+β+γ+E % Direnç Antibiyotik
Ö. Küçükbasmac› ve ark., Escherichia coli Sufllar›nda Çeflitli Antibiyotiklere Direncin Hemolizin Üretimi ve Tipleri ile ‹liflkisi
213 yarl› E.coli sufllar›n›n hemolizin üretmeye devam
et-tiklerini göstermifllerdir. Hemolizin aktivitesi ve anti-biyotik direnci aras›nda ki bu ilginç birlikte¤i olufltu-ran mekanizmalar halen tam olarak bilinmemektedir. Hemolizin sekresyonu için özellikle gerekli bir d›fl membran proteini olan TolC, bu birliktelik için bir aç›klama olarak de¤erlendirilebilinir. TolC mutasyon-lar› çok farkl› flekillerde gerçekleflebilmektedir ve be-raberinde kendisiyle ilgili ilgisiz birçok genin eks-presyonunu etkileyebilmektedir (10). Bir baflka aç›k-lama ise lipopolisakkarit biosentezindeki genlerdeki mutasyonlar olabilir; bu tip mutasyonlar›n baz› bakte-riyofajlara, novobiosin gibi bilefliklere dirençte rol oynad›¤› bilinmektedir (11).
Gyr A mutasyonlar› E.coli sufllar›ndaki kinolonlara karfl› en önemli direnç mekanizmalar›d›r ve Martinez-Martinez ve ark. (9) DNA katlanmas›ndaki art›fl›n he-molizin üretiminde yer alan genleri etkilemesinin mümkün olabilece¤ini ileri sürmüfllerdir. Son zaman-larda E.coli ve Klebsiella pneumoniae sufllar›nda plazmite ba¤l› siprofloksasin direnci bildirilmektedir (12).
Bagel ve ark. (13) kinolon dirençli E.coli sufllar›nda genellikle tip 1 fimbriya ekspresyonunun azald›¤›n› göstermifllerdir, böylece geliflen kinolon direncinin bir flekilde bakteri virülans›n› azaltt›¤›n› söylemek müm-kündür. Bu çal›flmada ço¤u kinolon dirençli E.coli su-flunun hemolitik aktiviteye sahip olmad›¤› gösteril-mifltir ve aradaki fark siprofloksasin ve norfloksasin için anlaml› bulunmufltur. Hemolizin üretimi ve di¤er antibiyotiklerle direnç aras›nda bir ba¤lant› gösterile-memifltir ayr›ca hemolizin tipleri ve kullan›lan tüm antibiyotikler aras›nda bir ba¤lant› belirlenmemifltir. Antibiyotiklerin bakterilerde üremeyi durduran veya öldüren etkinlikleri d›fl›nda virulans faktörleri üzerine de etkili olabildiklerini gösteren daha genifl epidemi-yolojik ve detayl› moleküler çal›flmalara ihtiyaç oldu-¤u da bir gerçektir.
KAYNAKLAR
1. Garau J, Xercavins M, Rodriguez-Carballeira M, Gomez-Vera JR, Coll I, Vidal D, Llovet T, Ruiz-Bre-mon A: Emergence and dissemination of quinolone-resis-tant Escherichia coli in the community. Antimicrob Agents Chemother 43:2736-41 (1999).
2. Hooper DC: Emerging mechanisms of fluoroquinolone resistance. Emerg Infect Dis 7:337-41 (2001).
3. Beutin L: The different hemolysins of Escherichia coli. Med Microbiol Immunol 180:167-82 (1991).
4. Bhakdi S, Muhly M, Korom S, Schmidt G: Effects of Escherichia coli hemolysin on human monocytes. Cytoci-dal action and stimulation of interleukin 1 release. J Clin Invest 85:1746-53 (1990).
5. National Committee for Laboratory Standards: Per-formance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tes-ting; Ninth Informational Supplement. NCCLS document M 100-S9, Wayne, Pennsylvania USA (1999).
6. Beutin L, Montenegro MA, Orskov I, Orskov F, Pra-da J, Zimmermann S, Stephan R: Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohe-molysin production in strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol 27:2559-64 (1989).
7. Ayd›n MD, Büyükbaba Ö, An¤ Ö: ‹drar yolu infeksiy-donu etkeni Enterobacteriaceae sufllar›nda kinolon duyar-l›l›¤›. Ankem Derg 19-23 (1996).
8. Hariharan H, Haeway J, Bryenton J: Observations our production of haemolysin, heal labil enterotoxin and antimicrobial drug resistance among enterotoxigenic Esc-herichia coli from pigs. Compar Immunol Microbiol Infect Dis 229-34 (1992).
9. Martinez-Martinez L, Fernandez F, Perea EJ: Rela-tionship between haemolysin production and resistance to fluoroquinolones among clinical isolates of Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 43:277-9 (1999).
10. Wandersman C, Delepelaire P: TolC, an Escherichia coli outer membrane protein required for hemolysin secre-tion. Proc Natl Acad Sci U S A 87:4776-80 (1990). 11. Bauer ME, Welch RA: Pleiotropic effects of a mutati-on in rfaC mutati-on Escherichia coli hemolysin Infect Immun 65:2218-24 (1997).
12. Martinez-Martinez L, Pascual A, Jacoby GA: Qu-inolone resistance from a transferable plasmid. Lancet 351:797-9 (1998).
13. Bagel S, Heisig P, Wiedemann P: Fluoroquinolone resistance of Escherichia coli frequently is associated with decreased expression of type 1 fimbriae. In program and Abstracts of the Thirty-Seventh Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Toronto. Abs-tract C-37,p 52. American Society for Microbiology, Was-hington, DC. (1997).
