Hirschsprung Hastalığında Methyl Green Pyronin İle Ganglion Hücrelerinin
Araştırılması
Investigation of the Ganglion Cells with Methyl Green Pyronin in Hirschsprung Disease
Ersin TUNCER * , Hatice ÖZER* , D.Sema ARICI **, Ahmet MÜSLEHİDDİNOĞLU,*,
Ö.Fahrettin GÖZE ***, Gökhan KÖYLÜOĞLU ****
* Uzm Dr. C. Ü. Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Sivas ** Doç. Dr., C. Ü. Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Sivas *** Prof. Dr. C. Ü. Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Sivas **** Doç. Dr. C. Ü. Tıp Fakültesi Çocuk Cerrahisi Anabilim Dalı, Sivas
ÖZET
Hirschsprung Hastalığı (HH) kolon duvarında Meissner ve Auerbach pleksuslarındaki ganglion hücrelerinin yokluğu ile karakterli konjenital bir hastalıktır. Ganglion hücrelerinin yokluğunun histopatolojik olarak gösterilmesi kesin tanı için gereklidir Histolojik olarak gösterilemediği durumlarda da histokimyasal ve immünohistokimyasal yöntemlerin uygulanması gerekebilir. Bu çalışmada HH ve kontrol olgularında Methyl Green Pyronin (MGP) ile boyama yöntemi uygulanarak ganglion hücrelerinin boyanma özellikleri araştırıldı. MGP’nin kontrol kolon biyopsilerinde ganglion hücrelerini belirgin olarak boyadığı, oysa HH olgularında ganglion hücrelerinin yokluğundan dolayı bu boyanmanın olmadığı görüldü. Sonuç olarak MGP ile histokimyasal incelemenin ganglion hücrelerinin varlığı ya da yokluğunun araştırılmasında yararlı olabileceği sonucuna varıldı.
Anahtar kelimeler: Hirschsprung hastalığı, kolon,
ganglion hücresi, Methyl Green Pyronin
SUMMARY
Hirschsprung Disease (HD) is a congenital disease characterized by the absence of the ganglion cells in the Meissner and Auerbach plexuses in the wall of the colon. It is necessery to confirm the absense of the ganglion cells histopathologically for the exact diagnosis. In those cases when the presence of the ganglion cells is not shown, histochemical and immunohistochemical techniques are needed to be applied. In the present study the staining properties of the ganglion cells were investigated in HD and control cases by using Methyl Green Pyronin (MGP) stain. The ganglion cells of the control colonic biopsies were properly stained with MGP whereas no staining was observed in HD cases due to the absence of the ganglion cells. As a result, it is concluded that the demonstration of the presence or the absense of the ganglion cells with the histochemical analysis by using MGP stain might be usefull.
Key words: Hirschsprung Disease, colon, ganglion cell,
Methyl Green Pyronin
C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 27 (1): 19 – 23, 2005 GİRİŞ
Hirschsprung Hastalığı (HH) kolonda submukozal (Meissner) ve myenterik (Auerbach) sinir pleksuslarındaki ganglion hücrelerinin yokluğu ile karakterli konjenital bir hastalıktır ve tanısı histopatolojik olarak bu ganglion hücrelerinin yokluğu ile konur (1-11). Ganglion hücreleri iri veziküler nükleuslu, küçük belirgin nükleollü geniş bazofilik multi ya da bipolar sitoplazmalı, sitoplazmalarında çok sayıda Nissl granülleri içeren hücrelerdir. Nissl granülleri bol miktarda RNA içeren endoplazmik retikulumdan oluştuğu için ganglion
hücreleri RNA içeriği en fazla olan hücrelerdendir. Ganglion hücrelerinde belirgin olarak izlenen nükleoluslar da RNA içeriği bakımından zengin yapılardır(12).
HH tanısında öncelikle materyallerden bol kesit alınması ve Hematoksilen-Eozin (H&E) boyası ile materyalin incelenmesi esas olsa da, özellikle musküler tabakayı içermeyen submukozal biyopsi örneklerinde seyrek dağılım gösteren submukozal ganglion hücrelerinin H&E boyalı kesitlerde net olarak seçilememesi nedeniyle patolog için tanı zorlukları olabilir. Bu nedenle HH’da tanıya yönelik çalışmalarda maliyeti yüksek ve uygulanması zor çeşitli enzim histokimyasal ve immünohistokimyasal yöntemler uygulanmaktadır(1-6,10,13).
Methyl Green Pyronin (MGP), 100 yıldan fazladır ayırıcı bir histokimyasal yöntem olarak kullanılmaktadır ve hücrede özellikle DNA ve RNA’nın gösterilmesinde etkin bir boyama yöntemidir(14,15). Bu nedenlerle bu çalışmada HH tanısı almış olgulardaki aganglionik kolon segmentleri ve kontrol grubunu oluşturan ganglion hücresi içeren kolon segmentlerinde her ortamda rahatlıkla uygulanabilecek, maliyeti düşük ve pratik bir histokimyasal yöntem olan MGP boyası uygulanarak, bu boyama yönteminin HH tanısındaki değeri ve yararlılık düzeyinin araştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM
C.Ü.T.F Patoloji Anabilim dalında Ocak 1997-Şubat 2005 tarihleri arasında klinik ve histopatolojik olarak HH tanısı almış yeterli doku örneğine sahip 20 olguya ait parafin bloklara gömülü kolon biyopsisi örnekleri çalışmaya alındı. Bu materyallerden 18 tanesi epitelden başlayarak musküler tabakayı içerirken 2 tanesi submukozal alanı geçmeyen biyopsi örneklerinden oluşmaktaydı. 10 adet normal kolon rezeksiyon materyali de matür ganglion hücreleri içerdiğinden dolayı kontrol boyama amaçlı olarak alındı. Çalışmada kullanıma hazır ticari formdaki MGP solüsyonu (Methyl Green Pyronin Stain Cat No: HT 70 Sigma Diagnostics St. Louis USA) kullanıldı. Çalışmada parafin bloklara gömülü doku örneklerinden 5µm kalınlığında kesitler lama alındı. Bu kesitler daha sonra etüvde 60°C sıcaklıkta 3 saat bekletilerek deparafinize edildi ve deiyonize suda hidrate edildi. Kesitler kullanıma hazır MGP solüsyonunda 5 dakika bekletildi ve distile suda yıkandıktan sonra aseton, aseton/ksilen ve ksilenden geçirilerek şeffaflaştırılarak kapatma solüsyonu ile
kapatılarak incelendi. Tüm materyallerdeki ganglion hücre varlığı önce H&E kesitlerde, daha sonra da MGP ile boyanmış kesitlerde araştırıldı.
BULGULAR
20 olguya ait kolon biyopsi örnekleri çalışmaya alındı. Bu biyopsi örneklerinden 16’sı erkek, dördü ise kız bireylere aitti.
H&E ile boyanan kesitler incelendiğinde normal kolona ait kesitlerde özellikle büyük büyütmelerde nükleus iriliği, nükleol belirginliği ve sitoplazmik özellikleri ile submukozal ve myenterik ganglion hücreleri izlendi. H&E ile boyanan normal kolon segmentlerinde periferik sinirler normal boyutlarda idi. HH tanısı almış olan olgulara ait H&E ile boyanmış kesitlerde ise hem büyük büyütmelerde, hem de küçük büyütmelerde submukozal ve myenterik ganglion hücreleri görülemedi. HH olgularında H&E boyalı kesitlerde dikkati çeken önemli bir özellik, submukozal ve musküler tabakalarda yer alan periferik sinirlerin belirgin hipertrofi göstermesi idi (Resim 1).
Resim 1: Hirschsprung hastalığında muskularis propriadaki
kas tabakaları arasında periferik sinir hipertrofisi (H&E, 200x).
MGP ile boyanan kesitlerin incelemesinde ise; normal kolon segmentlerinde hem submukozal hem de musküler tabakada ganglion hücreleri belirgin pironinofili gösteren bipolar ya da multipolar geniş sitoplazmaları, iri berrak nükleusları ve pironinofilik nükleolleri sayesinde küçük büyütmelerde bile tek tek ya da gruplar halinde organize olmuş biçimde rahatlıkla izlenebilmekte idi (Resim 2). MGP ile boyanan HH
olgularında ise, normal kolon kesitlerinde hem submukozal hem de musküler tabakalarda yukarıdaki boyanma özelliklerine sahip ganglion hücrelerinin bulunmadığı dikkati çekti (Resim 3). Hem normal kolon kesitleri, hem de HH olguları kesitlerinin MGP ile boyanarak yapılan incelemesinde periferik sinirlerde herhangi bir pironinofili görülmeyip, sadece soluk eozinofilik boyanma tespit edildi. Ayrıca çevre stromal bağ dokusu ve çizgili kaslarda da soluk eozinofilik boyanma özelliği mevcuttu.
Resim 2: Normal kolon mukozasında MGP ile piraninofilik
boyanma gösteren ganglion hücreleri (MGP, 400x).
Resim 3: Hirschsprung hastalığında submukozada ganglion
hücreleri yokluğu, periferik sinir hipertrofisi ve MGP negatifliği (MGP, 200x).
MGP ile boyamada hem normal kolon kesitlerinde, hem de HH olgularında hücresel döngüsü hızlı, RNA ve protein sentezi yüksek olan yüzey epitel hücrelerinin, lamina propriadaki lenfoid follikülerin santralindeki sentrositik ve sentroblastik hücrelerin, genç fibroblastların ve yer yer izlenen plazma hücrelerinin sitoplazmalarının da yoğun pironinofilik boyanma gösterdiği dikkati çekti.
TARTIŞMA
HH, hindgut’un Meissner ve Auerbach pleksuslarındaki parasempatik intrinsik ganglion hücrelerinin yokluğu ile karakterli bir konjenital malformasyondur. HH her 5000-30000 canlı doğumda bir görülür, genellikle erkeklerde daha sıktır (1-11). Çalışmada yer alan 20 olgudan 16’sı erkek, dördü ise kız bireylerden oluşmaktaydı ve erkek/kız oranı dört olarak bulundu.
HH, klinik olarak tutulan barsak segmentinin uzunluğuna göre altı tipte sınıflandırılır: 1- Çok kısa segment (Anorektal bölge), 2- Kısa segment (Distal sigmoid kolon), 3- Uzun segment (Proksimal kolona dek uzanabilen), 4- Total kolonik aganglionozis (Zueller-Wilson sendromu), 5- Total kolonik aganglionozisle birlikte ince barsağın bir bölümünün tutulumu, 6- Total intestinal aganglionozis (7). Çalışmaya alınan olgularda biyopsilerin gerçek lokalizasyonları hakkında yeterli bilgi olmadığı için olgular lokalizasyonları yönünden sınıflandırılamadı ancak histopatolojik incelemede olgulara ait tüm biyopsilerin kolon biyopsileri olduğu görüldü.
HH’nın etyopatogenezi tam olarak bilinmemekle birlikte bu konuda farklı görüşler vardır. Bir görüşe göre, hindgut’taki nöral krest hücrelerinin gestasyonun 5-12. haftaları arasındaki dönemde enterik pleksusu oluştururken gerçekleşen arresti nedeniyle olduğu düşünülürken, bir diğer görüş ise nöronların diferansiyasyonundaki bir bozukluğa neden olan intestinal mikroortamdaki anormalliğin HH’na neden olduğu şeklindedir. Ayrıca Sitomegalovirüs (CMV) infeksiyonları, fibromusküler hiperplaziye bağlı iskemi sonucu gerçekleşen nöronal hasarlar, Cajal’ın interstisyel hücrelerinin yokluğu, nöromusküler kavşaklarda asetilkolin depolayan sinaptik veziküllerin normalin yarısı kadar görülürken mukozada artış göstermesi ve düz kasların gevşemesini sağlayan nitrik oksit’in HH’daki yokluğu da etyolojide bazı araştırmacıların öne sürdükleri diğer etkenlerdir
(1,3,6-11). Son zamanlarda yapılan çalışmalarda endotelin B reseptör geni (EDNRB), endotelin 3 (EDN3), RET protoonkojeni ve “glial cell-linked derived neurotrophic factor” (GCDNF) genlerinin konjenital aganglionozisden sorumlu olduğu gösterilmiştir. Down sendromu ve MEN Tip2A’lı olguların da HH ile birlikteliği bildirilmiştir (1,6,16-21).
Tanıda klinik ve radyolojik bulgular ile rektal manometrik ölçümler önemli olmakla birlikte, asıl tanı koydurucu yöntem rektal ve kolonik biyopsilerdir (1-7). Biyopsi yöntemleri; tam kat rektal biyopsi, submukozal biyopsi, seromusküler biyopsi, suction biyopsi ve punch biyopsi şeklinde farklılıklar gösterir (2,5). Bu çalışmada HH tanısı alan olgulara ait biyopsilerin 18 tanesi tam kat biyopsilerden, iki tanesi ise submukozal biyopsi örneklerinden oluşmakta idi.
HH’da etkilenen kolon segmentlerinin histopatolojik incelemesinde submukozal alanda ve muskularis propriadaki kas demetleri arasında ganglion hücrelerinin yokluğu ile hipertrofik periferik sinirlerin varlığı tanısal değer taşır (2,5-11,13). Buna paralel olarak çalışmada yer alan HH olgularının H&E ve MGP ile boyalı kesitlerinde submukozal ve musküler alanlarda ganglion hücrelerinin yokluğu yanı sıra her iki alanda bulunan periferik sinir liflerinin hipertrofik yapıda olduğu görüldü.
HH’da Neuron-Spesific Enolase (NSE), S-100 protein, PGP 9.5, Kolinasetil transferaz (ChAT), neurofilament protein ve mikrotübül associated protein 5 (MAP 5) immünohistokimyasal olarak ganglion hücrelerini göstermek amacıyla tanıda kullanılan yöntemlerdir. Bunlar arasında en sık NSE ve S-100 kullanılır. NSE, ganglion hücrelerinde yoğun immün boyanma göstererek küçük immatür ganglion hücrelerinin görülmesini sağlar. S-100 ile yapılan immünohistokimyasal boyamada ise ganglion hücreleri pozitif boyanmış Schwann hücreleri arasında bulunan negatif boyanmış hücreler şeklinde görülürler (6). Ancak, immünohistokimyasal yöntemler, boyamanın her laboratuvarda rahatlıkla yapılamaması ve maliyetinin yüksek olması nedeniyle günlük kullanımda pratik olmayabilir (22). Histokimyasal tanı aracı olarak kullanılan Asetilkolin esteraz (ACh E) boyası ise HH tanısında sensitivitesi yüksek bir tanı yöntemidir (1-6,13). Asetilkolin esteraz boyası muskularis mukozada yer alan ve değişik derecelerde mukozaya penetrasyon gösteren hipertrofik kaba, kalın ve düzensiz kolinerjik sinir liflerini gösterir ve bu nedenle yüzeyel biyopsilerde
de (suction biyopsi, submukozal biyopsi gibi) çok yararlı bir yöntemdir (6). Ancak bu boyanın yalnızca frozen kesitlerde uygulanabilmesi, maliyetinin yüksek olması ve toksisitesi nedeniyle kullanımı yaygın değildir. Bu nedenlerle bu çalışmada spesifitesi ve sensitivitesi yüksek olmamakla birlikte tanıda yardımcı olabileceği düşünülen ve standart laboratuvar koşullarında her zaman kullanılabilecek olan MGP ile boyama yönteminin HH tanısındaki yararlılığı araştırıldı.
MGP ile boyama yöntemi ilk olarak Pappenheim tarafından 1898’de tanımlanmıştır ve 1940’da Brachet ile başlayan çalışmalarda nükleik asitlerin boyanma özellikleri incelenerek, Pyronin Y’nin RNA’yı, Methyl Green’in DNA’yı boyadığı belirlenmiştir (14,15,22). Methyl Green DNA’yı yeşil, Pyronin Y RNA’yı kırmızı (pironinofilik) boyar. Tekrarlanabilirliği güvenilir olmayan bir boyadır ve kullanılan boyanın kalitesine göre boyama özellikleri farklılıklar gösterir (15). Prento ve ark. boyama özelliklerinin boyama süresinden bağımsız olduğunu ancak Methyl Green ve Pyronin Y konsantrasyonları ve boyama solüsyonunun pH özelliklerine bağımlı olduğunu ortaya koymuşlardır (14). Düşük pH değerlerinde tüm yapılar pironinofilik boyanırken, yüksek pH değerlerinde Methyl Green ile boyanma özellikleri daha baskındır (15). Bu çalışmada boyaya ait teknik sorunlardan uzak kalabilmek için standart hazır solüsyon kullanılmıştır. Kullanılan hazır boya solüsyonu içinde bulunan kristal violet nedeniyle DNA’nın gösterilmesi bu çalışmada mümkün olmamıştır. Bu nedenle RNA’lar için pironinofilik boyanma elde edilmiştir.
Çalışmada kontrol amaçlı kullanılan tam kat kolon rezeksiyon materyallerinde hem submukozal hem de myenterik sinir pleksuslarında yer alan ganglion hücrelerinde nükleollerde ve sitoplazmada belirgin pironinofilik boyanma elde edildi ve bu boyanma özelliği nedeniyle ganglion hücreleri diğer hücrelerden kolaylıkla ayırd edilebildi. Bu bulgular Doğan ve ark.nın çalışmalarındaki bulgular ile uyumlu idi (22). HH tanısı alan materyallerde ise bu alanlarda ganglion hücrelerinin varlığını gösterecek bir boyanma elde edilemedi. H&E ile boyanan kesitlerle kıyaslandığında MGP’nin ganglion hücrelerinin belirlenmesinde H&E boyasına göre belirgin bir üstünlük gösterdiği görüldü.
Sonuç olarak, MGP’nin her ne kadar spesifik bir boya olmasa da HH gibi ganglion hücrelerine ait patolojilerde ucuz bir yöntem olması nedeniyle ve ayrıca immünhistokimyanın uygulanmasının mümkün
olamadığı koşullarda kullanışlı olabileceği ve patoloğa tanı konusunda yardımcı olabileceği sonucuna varıldı.
KAYNAKLAR
1. Amiel J, Lyonnet S. Hirschsprung disease, associated syndromes, and genetics: a review. J Med Genet 2001;38(11):729-39.
2. Harjai MM. Hirschsprung's disease: revisited. J Postgrad Med 2000;46(1):52-4.
3. Kapur RP. Developmental disorders of the enteric nervous system. Gut 2000;47 Suppl 4:iv81-3; discussion iv87.
4. Ghosh A, Griffiths DM. Rectal biopsy in the investigation of constipation. Arch Dis Child 1998;79(3):266-8. 5. Swenson O. Hirschsprung's disease: a review. Pediatrics
2002;109(5):914-8.
6. Fenoglio CM, Noffsinger AE, Stemmermann GN, Lantz PE, Listrom MB, Rilke FO. Gastrointestinal pathology an atlas and text: Small Intestine. New York: Raven Press 1999; 275-512.
7. Holscheneider AM, Meier-Ruge W, Ure BM.
Hirschsprung’s disease and allied disorders-A review. Eur J Pediatr Surg 1994;4:260-66.
8. Lowichik A, Weinberg AG. Eosinophilic infiltration of the enteric neural plexuses in Hirschsprung’s disease. Ped Pathol Lab Med 1997;17:885-91.
9. Taguchi T, Suita S, Hirata Y, Hirose R, Yamada T, Toyohara T. Abnormally Shaped Arteries in the Intestine of Children with Hirschsprung’s Disease: Ethiological Considerations relating to Ischemic Theory. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1994;18:200-24.
10. Kobayashi H, Hirakiwa H, Puri P. NADPH-Diaphtolojik incchemistry: A reliable test for the intraoperative diagnosis of Hirschsprung disease. J Pediatr Surg 1996;31:1552-53.
11. Widenman B, Riedel C, John M, Ahnert-Hilger G. Qualitative and quantitative analysis of synapses in Hirschprung’s disease. Pediatr Surg Int 1998;13:468-73.
12. Levine DS, Haggitt RC: Normal Histology of the colon. Am J Surg Path 1989;13:966-984.
13. Ratcliffe EM, deSa DJ, Dixon MF, Stead RH. Choline acetyltransferase (ChAT) immunoreactivity in paraffin sections of normal and diseased intestines. J Histochem Cytochem 1998;46(11):1223-31.
14. Prento P, Lyon HO. Methyl green-pyronin Y staining of nucleic acids: studies on the effects of staining time, dye composition and diffusion rates. Biotech Histochem 2003;78(1):27-33. (Abstract)
15. Böck P. Romeis Microskopische Tecknik, 17.Aufl. Müchen-Wien-Baltimore Urban & Schwarzenberg. 1989; 358-9.
16. Duan XL, Zhang XS, Li GW. Clinical relationship between EDN-3 gene, EDNRB gene and Hirschsprung's disease. World J Gastroenterol 2003;9(12):2839-42.
17. Garcia-Barcelo MM, Sham MH, Lui VC, Chen BL, Song YQ, Lee WS, Yung SK, Romeo G, Tam PK. Chinese patients with sporadic Hirschsprung's disease are predominantly represented by a single RET haplotype. J Med Genet 2003;40(11):122.
18. Eketjall S, Ibanez CF. Functional characterization of mutations in the GDNF gene of patients with Hirschsprung disease. Hum Mol Genet 2002;11(3):325-9. 19. Milla PJ. Endothelins, pseudo-obstruction and
Hirschsprung's disease. Gut 1999;44(2):148-9.
20. Newby DE, Strachan FE, Webb DJ. Abnormal endothelin B receptor vasomotor responses in patients with Hirschsprung's disease. QJM 2002;95(3):159-63.
21. Decker RA, Peacock ML, Watson P. Hirschsprung disease in MEN 2A: increased spectrum of RET exon 10 genotypes and strong genotype-phenotype correlation. Hum Mol Genet 1998;7(1):129-34.
22. Doğan Ö, Çevikbaş U. Metil Green Pyronin Yöntemi ile İntestinal Sistemde Ganglion Hücrelerinin Değerlendirilmesi. Türk Patoloji Dergisi 1992;8(1):37-9.
Yazışma Adresi :
Uzm Dr. Ersin TUNCER
Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı 58140 / SİVAS
Telefon: 0346-2191300 / 2257-2181 e-posta adresi: etuncer@cumhuriyet.edu.tr
