T hücre aktivasyonuna ba¤l› hepatik y›k›m:
Deneysel bir model(*)
‹stanbul Üniversitesi1‹stanbul T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji ABD Viroloji ve Temel ‹mmünoloji BD, 2Deneysel T›p Araflt›rma Enstitüsü, ‹stanbul
Nuray Gürel-Polat,1Suzan Ad›n-Ç›nar,2Ayd›n Çevik,2Mutlu Küçük,2Selim Badur1
‹letiflim / Correspondence: Nuray Gürel-Polat Adres / Address: ‹stanbul Üniversitesi, ‹stanbul T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji, Klinik Mikrobiyoloji AD, Çapa, ‹stanbul E-mail: nurayselcuk@hotmail.com
Hepatic damage due to T cell activation: An experimental model
ÖZET
Birçok infeksiyon hastal›¤›nda oldu¤u gibi deneysel modeller oluflturularak önemli sa¤l›k sorunlar›ndan olan hepatitlerin immü-nopatogenezi ayd›nlat›lmaya çal›fl›lmaktad›r; bu amaçla ilk aflamada immünolojik etkili mitojen veya toksik madde injeksiyonu ile deney hayvanlar›nda hepatit tablosu oluflturulmaktad›r.
Çal›flmam›zda T hücre aktivasyonuna ba¤l› hepatik hasar›n geliflimi deneysel olarak araflt›r›lm›flt›r. Bu amaçla BALB/c fareler-de intravenöz ( 10μg/ml ) endojen mediatör lipopolisakkarit ( LPS ) injeksiyonu ile akut inflamatuar karaci¤er hastal›¤›; lektin-lerden Con-A'n›n intravenöz (0.3mg/fare) injeksiyonu sonucu otoimmün kronik aktif hepatit geliflimi gözlenmifltir. Akut hepatik hasar 24 saat içinde plazma transaminazlar›n›n art›fl› ile izlenmifltir. Periferik kan lenfosit alt gruplar› (CD4, CD8, CD3 ve CD25) flow sitometri ile araflt›r›lm›flt›r. Histopatolojik olarak, kontrol gurubuna oranla deney grubunun karaci¤er dokular›nda sentral venler çevresinde ve portal alanlarda mononükleer ve polimorfonükleer hücre infiltrasyonu sonucu karaci¤er hasar› tes-pit edilmifl olan çal›flmada, Con-A ve LPS verilen gruplarda NK ve CD25 (s›ras›yla p<0.01; p<0.005 ve p<0.0003; p<0.0001) ekpresyonunda belirgin art›fl gözlenmifltir.
Bu deneysel model, T hücre aktivasyonuna ba¤l› hepatit gelifliminin araflt›r›lmas›nda rol oynayan hücrelerin gösterilmesi ve ayr›ca immün sistemin di¤er mekanizmalar›n›n araflt›r›lmas› için de uygun olacakt›r.
Anahtar kelimeler:BALB/c fare, con-A, LPS, karaci¤er hasar›, periferik lenfosit altgruplar› SUMMARY
This study attemps to have an insight into the immunopathogenesis of viral hepatitides, which are a major health problem thro-ughout the whole world. For this purpose, hepatitis has intentionally been produced in laboratory animals by injecting them mi-togenic or toxic substances know to have an immunologic effect the immune system.
In this study, development of hepatic damage due to T. cell activation was investigated in vitro. By injecting ›v 10μg/ml endoge-nous mediator lipopolysaccharide ( LPS ), acute inflammatory liver disease was produced in BALB/c mice. Likewise, autoimmu-ne chronic active hepatitis was observed to develop in the mice in which Con-A of the lectins was used ( ›v 0,3 mg/mice ). Acu-te hepatic damage was evidenced by the increase of the transaminase levels followed up for 24h. A flow cytomeAcu-ter was used in measuring the peripheral blood lymphocyte subgroups of CD4, CD8, CD3, NK and CD25. In the Con-A and LPS groups, a sig-nificant increase in the expression of NK ( p<0,01; p<0,005 respectively ) and CD25 ( p<0,003; p<0,0001 respectively ) was observed. The histopathological examination of the liver tissues of both the control and experiment groups revealed that in the latter group, there was hepatic damage around the central veins and portal areas due to mononuclear and polymorphonuclear cell infiltration.
The results show that the experimental method employed in this study will make it possible to investigate cells that are respon-sible for the development of hepatitis due to T cell activation, various cytokines and apoptosis .
Key words:Balb/c mice, Con-A, LPS, liver damage, peripheral lymphocyte subgroups.
G‹R‹fi
Viral hepatitler tüm dünya ülkelerinde önemli bir sa¤l›k sorunudur ve konu ile ilgili olarak çok sa-y›da araflt›rma yap›lmaktad›r. Bu çal›flmalardan bir bölümünde, hayvan modelleri oluflturularak viral hepatitlerin immünopatogenezi ayd›nlat›lma-ya çal›fl›lmakta, bu amaçla ayd›nlat›lma-ya virus transferi ayd›nlat›lma-ya da immünolojik etkili mitojen veya toksik mad-de injeksiyonu ile mad-deney hayvanlar›nda hepatit tablosu oluflturulmaktad›r. Biyolojik olaylarda en-dojen mediatör olan Gram negatif bakterilerden elde edilen lipopolisakkarit (LPS) injeksiyonu ile akut inflamatuar karaci¤er hastal›¤›, ayr›ca T hücrelerinin aktivasyonunu sa¤layan lektinlerden concovalin A'n›n (con-A) injeksiyonu ile otoim-mün kronik aktif hepatit geliflimi mümkündür. Con-A ile indüklenen hepatitin oluflumu T hücre aktivasyonu ve çeflitli sitokinlerin üretimi ile ba¤-lant›l›d›r. Lenfositler ve mononükleer hücrelerden lenfokinlerin sal›n›m› in vitro stimülasyonda pato-fizyolojik bulgular hakk›nda bilgi verir.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmada, 7-10 haftal›k BALB/c farelerden olu-flan üç deney hayvan› gurubu kullan›lm›flt›r. T hücre aktivasyonunu sa¤layan con-A (Sigma Che-mical Co, St Louis, Mo, ABD) patojenden ar›n-d›r›lm›fl PBS içinde (0.3 mg/fare), LPS ise (Esc-herichia coli, 0.11: B4; Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, ABD) intravenöz (10μg/ml) yoldan injekte edilmifltir. Kontrol grubuna ayn› flartlarda PBS injeksiyonu uygulanm›flt›r. ‹njeksiyon sonun-da aktif hepatik hasar oluflumunu takip etmek için serum alanin aminotransferaz (ALT), serum aspartat amino transferaz (AST) 24 saat içinde plazma transferazlar›n art›fl› ile takip edilmifltir. Plazma transaminazlar kuru sistem (spotchem, HESKA, ABD) ile de¤erlendirilmifltir. Plazma transaminaz de¤erlerinin art›fl› sonucu periferik kan lenfosit yüzey antijenleri Flow sitometri ile çal›fl›lm›flt›r.
Flow sitometri çal›flmas›. Periferik kan lenfosit alt gruplar›n›n de¤erlendirilmesinde CD4+
(Yar-d›mc› T lenfositleri; Pharmigen, San Diego, CA,
ABD), CD8a (Sitotoksik T; Pharmigen, San go,CA), Natural Killer (NK; Pharmigen, San Die-go, CA), CD25 (IL-2 reseptörü; Pharmigen, San Diego, CA) ve CD3 (Total T, Serotec, ‹ngiltere) monoklonal antikorlar kullan›lm›flt›r. Nonspesifik ba¤lanma uygun izotipte iflaretli antikorlar ile be-lirlenmifltir. 100μl heparinli kan uygun konsan-trasyonda monoklonal antikor ile 10 dakika oda ›s›s›nda inkübe edildikten sonra 2 ml lysing so-lüsyonu (Becton Dickinson, ABD) eklenerek 10 dakika oda ›s›s›nda inkübe edilmifltir. ‹nkübasyon sonras›nda PBS ile 5 dakika 850 rpm'de santri-füj edildikten sonra, üst s›v› uzaklaflt›r›lm›fl ve 1 ml PBS %0.2 paraformaldehit eklendikten sonra Flow sitometri (FACScan, Becton Dickinson, ABD) cihaz›nda Lysis II yaz›l›m› ile analiz edil-mifltir.
Histolojik de¤erlendirme. Hayvanlar serum tran-saminazlar›n›n yükselmesi sonucu 24 saat sonra sakrifiye edilmifltir. Karaci¤er dokular› %10 for-malinde fikse edilmifl ve parafine gömülmüfltür. Histolojik de¤erlendirme için 5μm kesitler haz›r-lanarak ve hematoksilen-eosin ile boyan›p ›fl›k mikroskobunda de¤erlendirilmifltir.
‹statistiksel de¤erlendirme. Mann Whitney-U testi kullan›lm›fl, p<0.05 anlaml› kabul edilmifltir. BULGULAR
BALB/c farelere yap›lan uyar› injeksiyonlar› so-nucunda, plazma transaminaz seviyelerinin 24 sa-at içinde en yüksek düzeye ulaflt›¤› saptanm›flt›r (Tablo 1).
Periferik kan lenfosit yüzey antijenlerinden CD3, CD4, CD8, CD25 ve NK ekspresyonlar›ndaki de-¤iflim Flow sitometri ile çal›fl›lm›flt›r. CD3, CD4, CD8 ekspresyonu incelendi¤inde, kontrol grubu-na göre anlaml› bir fark saptanmamas›grubu-na karfl›-l›k, con-A ve LPS grubunda NK (p<0.01; p<0.005), CD25 (p<0.0003; p<0.0001) ekspresyo-nunun anlaml› derecede artt›¤› görülmüfltür (Tab-lo 2, 3). Histopato(Tab-lojik olarak, kontrol grubuna göre deney grubunun karaci¤er dokular›nda, san-tral venler çevresinde ve portal alanlarda mononük-leer ve polimorfonükmononük-leer hücre infiltrasyonu sonu-cu karaci¤er hasar› tespit edilmifltir (fiekil 1).
fiekil 1. con-A ve LPS injeksiyonundan 24 saat sonra karaci¤er dokusunda görülen de¤iflikliklerin ›fl›k mikroskobu görüntüleri A: Kontrol grubu, B,B',C: LPS grubu, D: con-A grubu (Hematoksilen-eosin A,B,B',D x20, C x40 büyütme).
A:KONTROLx20 B:LPSx20
B’:LPSx20 C:LPSx40
Con-A injeksiyonu sonucunda karaci¤er dokusun-da morfolojik de¤ifliklikler gözlenmifltir. Kontrol grubuna göre doku bütünlü¤ünün bozuldu¤u ve vakuolleflmenin oldu¤u saptanm›flt›r. Hepatositler-de Hepatositler-de sitoplazman›n azald›¤› ve vakuolleflmenin artt›¤› görülmüfltür. Portal alanlara kan yoluyla hücre göçü ve damar etraf›nda hücre birikimi ol-mufltur. Bu hücrelerin kan yoluyla gelen lökosit-ler ve mononükleer hücrelökosit-ler oldu¤u düflünülmek-tedir. Çünkü con-A genel olarak T hücre akti-vasyonuna neden olur. Bundan dolay› con-A'ya ba¤l› doku hasarlanmas› mekanizmas›, karaci¤er-de makrofajlar ve aktive olan yard›mc› T lenfo-sitlerinin oldu¤unu düflündürmektedir. Mitojen ile aktive edilmifl CD4 lenfositlerinde CD25 ekspres-yonunun kontrol grubuna göre anlaml› olarak art-mas› bunun göstergesidir (Tablo 2).
LPS injeksiyonu sonucunda ise, con-A tablosun-da görülen de¤ifliklikler gözlenmekle beraber tablosun- da-ha fazla nekrotik alanlar gözlenmifltir. Karaci¤er dokusunda görülen hücreler aras› etkileflimin azalmas› ve vakuolleflmenin artt›¤› saptanm›flt›r. ‹nflamatuar hücrelerin sentral venler ve portal alanlara yo¤un göçü gözlenmifltir. Periferik kan-da NK hücrelerinin art›fl›kan-da bunun göstergesidir (Tablo 3). Kan yoluyla bu hücrelerin dokuya gö-çü artm›flt›r. LPS' in injeksiyonu ile karaci¤erde-ki makrofajlardan salg›lanan inflamatuar sitokaraci¤erde-kin- sitokin-lerin de doku hasar›nda rol oynad›¤› düflünülmek-tedir (Tablo 3).
TARTIfiMA
Deneysel modellerin azl›¤› nedeniyle hepatit ve hepatosellüler bozulman›n geliflimi hücresel ve moleküler düzeyde tam çal›fl›lamamaktad›r. Bu yüzden uygun hayvan modelleri ile otoimmün he-patit gibi immünolojik bazl› hepatik hastal›klar›n patofizyolojisinin araflt›r›lmas›na olanak sa¤lar. Bu amaçla çal›flmam›zda Con-A ve LPS kullan›lm›fl-t›r. LPS, Gram negatif bakterilerin d›fl membra-n›nda bulunan kompleks bir glikolipiddir, kanda bulunan soluble CD14 molekülü ile oluflturdu¤u kompleks ile endotelial ve epitel hücreleri aktive etmektedir. Kanda bulunan pikomolar
konsantras-Tablo 1.con-A ve LPS injeksiyonu sonras›nda plazma transaminaz de¤erleri (24 saat).
SGOT (AST) SGPT (ALT) 407.3 ± 224 49.3 ± 53.3 499.3±224 39.1±47.8 20 - 48 20 - 45 con-A LPS Normal De¤er (IU/ml) CD4 CD8 CD3 CD25 NK
Tablo 2. con-A injeksiyonu sonucu lenfosit yüzey antijenleri ekspresyonunun kontrol grubu ile karfl›laflt›r›lmas›.
Con-A Kontrol p 38.28 ±11.9 18.42 ± 6 49.2 ± 13.6 30.7 ± 9.8 4.14 ± 3.5 29.1 ± 8.7 20 ± 7.2 52.1±19.9 5.2 ± 2 1.6 ± 0.8 0.100 0.550 0.730 0.0003* 0.010 CD4 CD8 CD3 CD25 NK LPS Kontrol p 31.7 ± 11 30.1 ± 17 40.2 ± 22.5 33 ± 15.7 3.2 ± 1.4 29.1±8.7 20±7.2 52.1±19.9 5.2±2 1.6±0.8 0.480 0.130 0.230 0.0001* 0.005*
Tablo 3. LPS injeksiyonu sonucu lenfosit yüzey antijenleri ekspresyonunun kontrol grubu ile karfl›laflt›r›lmas›.
CD4 CD8 CD3 CD25 NK Con-A LPS p 38.3 ± 11.9 18.4 ± 6 49.2 ± 13.6 30.7 ± 9.8 4.1 ± 3.5 31.7 ± 11 30.1 ± 17 40.2 ± 22.5 33 ± 15.7 3.2 ± 1.4 0.180 0.260 0.590 0.840 0.830
Tablo 4. con-A ve LPS'nin lenfosit yüzey antijenleri ekspresyonuna etkisinin karfl›laflt›r›lmas›.
sonucunda karaci¤er dokusu histopatolojisinde benzer bulgular› gözledik.
Con-A'n›n artan dozu ile (>1,5 mg/kg) transmi-nazlar 8 saat içinde sal›n›ma bafllad›¤› ve kara-ci¤er hasarlanmas›n›n elektron mikroskobik ince-lenmesi sonucunda, hepatositlerde vakuol ve en-dotelial hücrelerde lökosit birikimi gözlemifllerdir (6). Con-A ile oluflturulan hepatit modelinde se-rumda IL-2 sal›n›m›n› 2 saat sonra ölçmeye bafl-lanabilmesine ra¤men 4 saat sonra maksimum düzeye ulafl›r. Bizde çal›flmam›zda IL-2 reseptö-rü olan CD25 reseptör art›fl›n› kontrol grubuna göre anlaml› düzeyde (p <0.003) artm›fl oldu¤u-nu saptad›k.
LPS enjeksiyonu yap›lan deney grubunda da an-laml› art›fl olmas› (p<0.0001) bu reseptörün mak-rofajlar ve monosit yüzeyinde de bulunmas›ndan kaynaklanmaktad›r (6).
Ayr›ca LPS ile indüklenen monosit-makrofaj hüc-re grubundan TNF- sal›n›m› gerçekleflece¤in-den karaci¤erde nekrotik alanlar›n oluflmas›n› te-tiklemektedir. TNF- karaci¤er hücrelerinde in vivo ve in vitro olarak apoptosise de neden ol-maktad›r (4,11). T hücre mitojenik bitki lektini olan con-A'n›n injeksiyonu da TNF- gibi he-patik apoptosise de neden olmaktad›r (2,1,7). Con-A ile oluflturulan modelde, T hücre aktivas-yonu sonucu salg›lanan interferon (IFN-) 'n›n otoimmünite, viral hepatitler ve karaci¤er allog-raft rejeksiyonu gibi rolleri oldu¤u çal›flmalarla gösterilmifltir (2,7). LPS ve con-A ile uyar›lma sonucu oluflturmaya çal›flt›¤›m›z deneysel model karaci¤er patolojisinde rol oynayan immünolojik, metabolik ve inflamatuar araflt›rmalar için uygun bir model oldu¤unu ve ayr›nt›l› çal›flmalara ze-min oluflturaca¤›n› göstermifltir.
Kaynaklar
1. Ulevitch RJ ve Tabias PS. Receptor-dependent mechan›sms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immu-nol. 1995; 13: 437.
2. Kusters S, Gantner F, Künstle G, Tiegs G. Interferon gam-ma plays a critical role in T cell-dependent liver injury in mi-ce initiated by concanavalin A. Gastroenterology 1996; 111: 462. 3. Nussler AK, Di Silvio M, Billiar TR, Hoffman RA ve
γ γ
α α
α
yonda bile etkili, makrofaj ve polimorfonükleer hücrelerin aktivasyonuna neden olmakta böylece immün, inflamatuar ve vasküler sistemi etkilemek-tedir(1).
Uygulad›¤›m›z deneysel modelde, LPS'in kuyruk veninden enjeksiyonu ile kan tablosunda IL-2 re-septörü CD25 ekspresyonunda da anlaml› oranda art›fl saptanm›flt›r.
NK hücrelerinde de kontrol grubuna göre art›fl gözlenmifltir. Histopatolojik incelemede ise, por-tal alanlarda hücre birikimi görülmüfl, bu hücre grubunun kan yolu ile göç eden PMN ve NK hücreleri oldu¤u kan›s›na var›lm›flt›r. Portal alan-lar ve sentral venler çevresinde meydana gelen nekrotik alanlar›n kontrol grubuna göre fazlal›¤› dikkat çekicidir. Karaci¤er dokusundaki genel ha-sar görünümü ve büyük nukleuslu hücreler ›fl›k mikroskobunda görülmektedir. Bu hasar› karaci-¤er makrofajlar›n›n aktive olmas› ve bu aktivas-yon sonucunda inflamatuar sitokinleri salg›lad›k-lar› çeflitli çal›flmalarla gösterilmifltir. (2,3,9) Galaktozamin (GalN)'e duyarl› farelerde LPS uyar›s› ile monosit makrofaj hücre grubundan si-tokin sal›n›m›n›n gerçekleflti¤i, karaci¤erde nekro-tik alanlar›n olufltu¤u gösterilmifltir (4). Tümör nekroz faktör (TNF ) karaci¤er hücrelerinde in vivo ve in vitro apoptosise neden olmaktad›r (4). Mizuhara ve arkadafllar›n›n (5) oluflturdukla-r› deneysel modelde ise, con-A enjeksiyonu ile çeflitli saat aral›klar›nda karaci¤er, dalak, böbrek, akci¤er ve kalp gibi organlar› sakrifiye etmifller-dir. Bu organlar›n hemotoksilen-eosin boyas› ile ›fl›k mikroskobunda incelenmesi sonucunda yal-n›zca karaci¤erde çeflitli etkilerin oldu¤unu göz-lemlemifllerdir. ‹njeksiyondan 8 saat sonra hepa-tositlerde hafif dejeneratif de¤ifliklikler olmas›na ra¤men, nekroz ve hücre infiltrasyon görülmemifl-tir. Oysaki, 24 saat sonra mononükleer ve poli-morfonükleer hücrelerin portal alanlara ve santral venler çevresine göçünü gözlemifllerdir. ‹mmüno-histokimyasal boyanmalar sonucu bu göç eden hücrelerin CD4 T ve CD8 T hücreleri oldu¤unu saptam›fllard›r. Çal›flmam›zda, con-A enjeksiyonu
α α
arkadafllar›. Stimulation of the nitric oxide synthase pathway in human hepatocytes by cytokines and endotoxin. J Exp Med 1992; 176: 261.
4. Santucci L, F›orucci S, Chiorean M, Brunori PM, Matte-o FMD, S›dMatte-oni A, M›gliMatte-orati G. ve MMatte-orelli A. Interleukin 10 reduces lethality and hepatic ›njury ›nduced by lipopoly-saccharide in galactosamine-sensitized mice. Gastroenterology 1996; 111: 736.
5. Mizuhara H, O'Neill E, Seki N, Ogawa T, Kusuroki C, Otsuka K. ve arkadafllar›. T cell aktivation associated hepa-tic injury:mediation by tumor necrosis factors and protection by interleukin 6. J Exp Med 1994; 179: 1529.
6. Tiegs G, Hentschel J, Wendel A.A T cell-dependent ex-perimental liver injury in mice ›nducible by concanavalin A. J Clin Invest 1992; 90: 196.
7. Seino K-I, Kayagak› N, Takeda K, Fukao K, Okumura K, Yag›ta H. Contribution of fas ligand to T cell-mediated he-patic injury in mice. Gastroenterology (1997) 113: 1315.
8. Vicari AP, Zlotnik A. Mouse NKI.I+ T cells: a new fa-mily of T cells. Immunol Today 1996; 17(2)71.
9. Fitch FW, McKisic MD, Lancki DW ve Gajewski TF. Differential regulation of murine T lymphocytes subsets. An-nu Rev Immunol 1993; 11: 29.
10. Moriyama T, Guilhot S, Klopchin K, Moss B, Pinkert CA, Palmiter RD, Brister RL, Kanagawa O, Chisar› FV. Immunobiology and pathogenesis of hepatocellular injury in hepatitis B virus transgenic mice. Seience 1990; 248: 361. 11. Ando K, Moriyama T, Guidotti LG, Wirth S, Schreiber RD, Schlicht HJ, Huang S-n, Chisari FV. Mechanisms of class I restricted immunopathology. A Transgenic mouse mo-del of fulminant hepatitis. J Exp Med 1993; 178: 1541. 12. Cressman DE, Greenbaum LE, DeAngelis RA, Ciliberto G, Furth EE, Poli V, Taub R. Liver failure and defective hepatocyte regeneration in interleukin -6- deficient mice. Sci-ence 1996; 274: 1379.
