Mikrobiyal Gübre Olarak Kullanılan ve Yabani Bitkilerden İzole Edilen Rhizobium
Suşlarının Farklı Sıcaklık Şartlarında Azot Bağlama Potansiyellerinin Araştırılması
Hatice ÖĞÜTCÜ ¹* Ömer Faruk ALGUR ² Medine GÜLLÜCE ² Ahmet ADIGÜZEL ³
1Ahi Evran Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Kırşehir, TÜRKİYE 2Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi ,Biyoloji Bölümü, Erzurum, TÜRKİYE
3Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Erzurum, TÜRKİYE
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 24.11.2009
e-posta: hogutcu@ahievran.edu.tr Kabul Tarihi : 21.12.2009
Özet
Bu çalışmada Erzurum yöresindeki yüksek rakımlı bölgelerden (2000-2500m) toplanan yabani fiğ (Vicia cracca) bitkilerinden izole edilen
Rhizobium suşlarının düşük ve normal sıcaklık şartlarında fiğ (Vicia sativa L. cv. Karaelçi) bitkilerinde nodül oluşturma ve azot bağlama
potansiyelleri araştırılmıştır. Bu amaçla yabani fiğ bitkilerinden toplam 60 izolat elde edilmiştir. Kültür bitkilerinin tohumları izolatlarla inokule edilerek sera şartlarında düşük ( 15-9 oC / ışık-karanlık) ve normal (25-22 oC / ışık-karanlık ) sıcaklıklarda büyütülmüşlerdir. Normal sıcaklıkta
büyütülen bitkilerde izolatların tamamı nodül oluşturmuştur. Ancak 38 suş düşük sıcaklıkta nodül oluşturmuştur. Hasattan sonra bitkilerdeki kök, sürgün ve nodül kuru ağırlıkları, azot içerikleri tespit edilmiş ve kontrol gruplarıyla (aşısız ve ticari pitle aşılı kontroller) karşılaştırılmıştır. Farklı
Rhizobium ırkları ile aşılamanın, bitkilerde nodül kuru ağırlığında olduğu kadar , kuru madde verimi, azot içeriği ve azot alımı üzerinde de önemli
etkiye sahip olduğu gözlenmiştir. Araştırmamızda düşük sıcaklıkta büyütülen bitkilerde kuru biyomas, nodül kitlesi, azot içerikleri genel olarak dikkat çekici oranda azalmakla birlikte bazı suşların düşük sıcaklıkta etkili oldukları tespit edilmiş ve bu suşların uygun bölgelerde kullanılabileceği görüşüne varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Vicia, fiğ, nodülasyon, düşük sıcaklık, mikrobiyal gübre, Rhizobium leguminosarum subsp. viciae
Abstract
This study was conducted in order to evaluate the symbiotic effectiveness of Rhizobium leguminosarum subsp. viciae strains isolated from perennial wild vetchs (Vicia cracca) collected from high altitudes (2000-2500 m) in mountains in Erzurum, Eastern Anatolia, Turkey. For this purpose, 60 isolates were obtained from wild vetchs. Vetch seeds were inoculated with these isolates and grown in pots containing sterile sand under both low (15 C day/9 C night) and normal (25 C day/22 C night) temperature conditions in a controlled plant growth cabinet. All strains investigated formed nodules under the normal temperature, but only 38 strains were able to produce nodules at the low temperature. In both normal and low temperature experiments, generally, all strains producing nodules provided N to the plant, as indicated by shoot dry weight, total N content, and N fixed. However, strains showed significant differences for almost all parameters measured. Among the strains tested, demonstrated a good performance on vetch in terms of their high shoot dry matter yields, total N content, N fixed, and symbiotic effectiveness. These results indicated that effective strains isolated from wild vetchs had potential for use as inoculants on vetch.
Keywords: Vicia sativa, vetch, nodulation, low temperature, microbial fertilizer, Rhizobium leguminosarum subsp. viciae.
GİRİŞ
Günümüzde dünyamızın karşılaşacağı en önemli problem, 2025 yılında 8 milyara ulaşacağı tahmin edilen dünya nüfusudur. Halen dünya nüfusunun 830 milyonunun açlık sınırında olduğu ve küresel ısınmanın ve buna bağlı olarak değişen iklim sisteminin gıda üretimi üzerindeki olumsuz etkileri de göz önüne alındığında önümüzdeki 20 yıl içerisinde en önemli konunun tarımsal üretim olacağı kesindir. Ancak, bitkisel üretimde artış sağlamak amacıyla, dünyada giderek yaygınlaşan; sulama, ikinci ürün yetiştirme ve daha fazla gübre kullanımı gibi uygulamalar açlık tehlikesini önlemekten uzak görünmekle beraber üstelik bu uygulamalar yeni çevresel sorunlar oluşturmaktadır. Özellikle bitkisel üretimin artırılması için azotlu mineral gübreleme maliyetlerinin yüksek olmasının yanısıra ve
bu gübrelerin ortamda farklı özel ihtiyaçlarının olması ve çevre kirliliğine yol açması nedeniyle topraktaki azot açığının giderilmesi için , biyolojik azot fiksasyonu gibi, doğal ve daha ekonomik kaynaklardan yararlanma çalışmaları gün geçtikçe artmaktadır.Gerek simbiyotik fiksasyon yapan Angiosperm türlerinin gerekse baklagil bitki türlerinin birer azot üretim fabrikası gibi çalıştıkları bir gerçektir[1]. Ayrıca, biyolojik azot fiksasyonu önemli bir potansiyele sahip olup, bu yolla toprağa bağlanan azot miktarının 175 milyon ton / yıl olduğu belirtilmektedir [2] .
Çevresel etmenler azot fikse eden bitkilerin aktivitelerini ve büyümelerini sınırlayabilir. Rhizobium-baklagil simbiyotik ilişkisinde azot fiksasyonu bitkinin fizyolojik durumu ile alakalıdır. Baklagillerde nodülasyon ve azot fiksasyonunu sınırlayan faktörler; tuzluluk, uygun olmayan toprak asitliği, besin farklılığı, yetersiz
fotosentez, bitkisel hastalıklar, mineral toksikliği, ekstrem sıcaklıklar, verimsiz ve aşırı toprak basıncıdır. Çevresel şartlar; üstün azot bağlama gücü olan bazı
Rhizobium suşlarının kolonize olmasını ve azot bağlama
potansiyellerini olumsuz etkilediğinden çeşitli ekstrem ekolojik şartlara adaptasyon sağlamış suşların seçimi ve aşılamada kullanımı büyük önem arzetmektedir. Erzurum gibi serin iklim koşullarının hakim olduğu yörelerde , düşük sıcaklık şartlarında suşların tespitini amaçlayan bu araştırmada, yüksek rakımlı bölgelerden toplanan fiğ bitkilerinden izole edilen Rhizobium bakterilerinin kültür formlarında, farklı sıcaklık şartlarında nodül oluşturma ve azot bağlama potansiyelleri araştırılmıştır. Kültür bitkilerine nazaran yabani olarak yetişen fiğ bitkilerinde ki nodüllerin içerdiği Rhizobium suşlarının ekstrem koşullara daha dayanıklı olduğu ifade edilmiş [3, 4] , bu nedenle araştırmamızda yabani fiğ bitkileri kullanılmıştır.
MATERYAL VE METOT
Rhizobium bakterisi içeren yabani baklagil bitkileri
(Leguminosae familyasına ait) Erzurum iline ait Palandöken dağı, Alibaba dağı, Turnagöl dağı, Hasanbaba dağı, Eğerli dağı, Yıldırım dağı, Çubuklu dağı, Telsizler tepesi ve Dumlu tepesi’nden (Vicia cracca) toplanmış ve pit kültürü örnekleri Ankara Toprak Gübre Araştırma Enstitüsü’nden, tohumlar fiğ (Vicia sativa- Karaelçi ) Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümünden temin edilmiştir. Bitki örnekleri belirtilen bölgelerden Haziran ve Temmuz aylarında toplanmıştır. Steril nodüllerden YMA plaklarına çizgi ekimi yapılmış, petriler 28+1 0C’de 3-5 gün süreyle inkübasyona
bırakılmıştır. Oluşan tipik koloniler (beyaz, saydam veya hafif mat, mukozlu, yuvarlak, kabarık) seçilerek yatık YMA tüplerine aktarılmıştır [5, 6]. Yatık YMA tüpleri buzdolabında +4 0C’de muhafaza edilmiştir.
Bakteriler sitolojik ve biyokimyasal analizlerle tanımlanmaya çalışılmıştır. Bu amaçla bakteriler Brom Thymol Mavili besiyerinde ve Kongo Kırmızılı YMA’da üretilmiş, gram özellikleri belirlenmiş, hareket, katalaz ve oksidaz testlerine tabi tutulmuştur. Kültür bitkilerinin tohumlarına aşılanacak inokulum hazırlanması için stok izolatlar önce YMA’da 48 saat süreyle üretilmiş ve buradan içerisinde 100 ml steril YMB bulunduran 250
ml’lik erlenmayerlere aşılanmıştır. Erlenmayerler 28
0C’de termostatlı çalkalayıcıda 160 devir/dk’da 6 gün
süreyle inkübasyona bırakılarak çoğaltılmıştır [7]. Bu son kültür tohumların aşılanmasında inokulum olarak kullanılmıştır. Deneme, normal (25-22 oC/ ışık-karanlık)
ve düşük (15-9 oC/ ışık-karanlık) sıcaklık uygulamasına
tabi tutulan aşısız (azotlu ve azotsuz) ve aşılı (izolatlar) gruplar halinde düzenlenmiş ve tesadüf parselleri deneme desenine göre iki paralel olarak yürütülmüştür. 50 gün sonunda bitkiler hasat edilerek; bitki başına kök, sürgün ve nodül kuru ağırlığı, sürgündeki toplam azot miktarı belirlenmiştir. Elde edilen veriler deneme desenine uygun olarak SPSS istatistik paketi kullanılarak analiz edilmiştir. Ortalamalar arasındaki farklar Duncan Çoklu Karşılaştırma Testi kullanılarak karşılaştırılmıştır
BULGULAR
Bu araştırmada yabani fiğ bitkilerinden 72 izolat elde edilmiş ve biyokimyasal testlere tabi tutularak, uygun özellik gösteren 60 izolat stoğa alınmıştır. Daha sonra bitkilere aşılama yapılmış izolatların hepsi nodül oluşturmuştur.
İzolatlarla aşılamanın fiğ bitkilerinin kök ve sürgün kuru ağırlıkları üzerindeki etkileri Çizelge 1 ve Çizelge 2’de verilmiştir. Normal sıcaklıkta izolatlardan 7 tanesi, düşük sıcaklık denemelerinde ise 8 tanesi standart kontrolden daha yüksek kök kuru ağırlığı oluşturmuştur. Yine normal sıcaklıkta izolatların 29 tanesi, düşük sıcaklık uygulamasında ise 38 izolatın tamamının standart kontrolden daha yüksek sürgün kuru ağırlığı oluşturduğu belirlenmiştir.
İzolatlarla aşılamanın fiğ bitkilerinin nodül kuru ağırlıkları üzerindeki etkileri Çizelge 1 ve Çizelge 2’de verilmiştir. Normal sıcaklıkta izolatların 45 tanesi , düşük sıcaklık uygulamasında ise 38 izolatın 21 tanesi standart kontrolden daha yüksek nodül kuru ağırlığı oluşturmuştur.
İzolatların fiğ bitkilerinin toplam azot içeriği üzerindeki etkileri Çizelge 1 ve Çizelge 2’de verilmiştir. Toplam azot içeriği bakımından; normal sıcaklıkta 50 tane izolatın, düşük sıcaklık denemelerinde ise 1 izolatın standart kontrolden daha yüksek değerler verdiği tespit edilmiştir.
Izolat No. Kök kuru ağ. (mg plant-1) Sürgün kuru ağ. (mg plant-1) Nodül kuru ağ. (mg plant-1) Toplam azot içeriği (mg plant-1) HF187 400.00 523.30 32.68 13.24 HF28 383.15 302.55 18.86 7.14 HF142 376.65 400.70 26.64 6.40 HF128 374.40 297.85 19.79 7.04 HF160 371.30 436.40 32.63 11.63 HF161 364.40 388.80 26.27 7.44 HF252 362.80 387.45 26.16 9.34 HF133 358.50 391.15 26.94 7.02 HF60 353.50 293.75 18.65 6.57 HF136 352.40 261.40 18.74 6.15 HF206 351.55 382.60 26.16 7.55 HF358 351.25 437.10 26.26 10.26 HF150 348.85 467.30 26.27 8.46 HF156 345.70 390.65 26.21 13.21 HF151 342.85 393.65 26.80 8.53 HF145 342.45 377.75 26.31 6.51 HF126 341.75 346.20 26.65 6.50 HF140 340.85 392.70 26.54 6.43 HF194 340.30 354.10 26.39 4.50 HF158 338.55 273.80 18.64 6.12 HF146 338.30 392.15 26.27 5.54 HF205 337.20 421.65 26.16 8.59 HF154 336.60 414.30 26.09 8.27 HF155 336.20 333.90 26.80 6.66 HF144 335.75 398.80 26.35 7.17 HF138 334.70 363.30 26.36 4.86 HF209 334.35 394.60 26.24 9.66 HF207 332.35 374.30 26.37 7.93 HF153 331.80 346.50 26.65 6.65 HF362 331.10 401.25 26.30 9.93 HF148 330.50 363.40 27.10 6.91 HF152 330.45 368.05 26.93 8.72 HF166 329.80 370.80 26.43 6.80 HF59 329.15 281.60 18.87 5.70 HF125 328.60 267.15 18.76 7.09 HF203 328.30 412.80 26.07 11.53 HF163 327.70 273.10 19.08 5.32 HF202 326.90 392.50 26.24 10.34 HF360 326.10 327.55 26.78 6.23 HF164 325.75 350.90 26.29 6.57 HF27 324.85 247.30 18.80 6.03
Çizelge 1. Normal sıcaklıkta, izolatlarla aşılamanın fiğ bitkisinde kök, sürgün, nodül kuru ağırlıkları ve toplam azot
Çizelge 1. Normal sıcaklıkta, izolatlarla aşılamanın fiğ bitkisinde kök, sürgün, nodül kuru ağırlıkları ve toplam azot
içeriğine etkisi (devam)
Izolat No. Kök kuru ağ. (mg plant-1) Sürgün kuru ağ. (mg plant-1) Nodül kuru ağ. (mg plant-1) Toplam azot içeriği (mg plant-1)
HF201 323.95 362.65 26.23 9.14 HF132 323.75 373.15 26.82 7.50 HF165 323.55 385.90 26.55 6.20 HF162 322.75 341.30 26.25 7.00 HF159 319.68 371.30 26.74 6.83 HF208 319.30 326.55 26.33 8.53 HF157 317.80 338.90 26.89 6.82 HF22 317.55 238.40 19.81 5.41 HF26 317.40 348.45 26.34 8.73 HF141 316.52 345.40 26.28 7.42 HF167 315.15 371.85 26.18 9.79 HF24 311.05 237.70 18.70 4.80 HF134 310.75 334.10 26.19 8.18 HF58 310.10 269.65 18.69 4.75 HF131 307.05 362.25 26.69 6.43 HF204 305.60 385.60 26.45 10.72 HF21 304.40 270.60 18.75 5.67 HF25 298.60 253.05 19.32 4.11 HF23 294.85 264.95 19.13 3.11 Standart kontrol 358.50 365.80 25.96 5.68 Azotlu kontrol 205.00 255.40 0.00 6.15 Azotsuz kontrol 203.00 204.35 0.00 2.76 LSD (P<0.01) 82.36 110.30 4.39 3.62
Çizelge 2. Düşük sıcaklık denemesinde, izolatlarla aşılamanın fiğ bitkisinde kök, sürgün, nodül kuru ağırlıkları ve
toplam azot içeriğine etkisi
İzolat No. Kök kuru ağ.
(mg plant-1) Sürgün kuru ağ. (mg plant-1) Nodül kuru ağ. (mg plant-1) Toplam azot içeriği(mg plant-1)
HF362 180.20 200.30 3.01 5.54 HF161 160.65 194.45 4.61 4.20 HF59 150.70 165.85 2.93 4.96 HF206 143.25 192.15 7.28 4.80 HF28 141.65 144.45 4.25 2.71 HF152 132.15 161.30 6.44 2.91 HF126 131.05 162.80 6.73 3.82 HF25 126.45 131.50 4.29 2.42 HF162 125.15 161.70 8.20 3.78 HF201 119.85 185.40 8.09 2.32 HF158 118.95 183.85 4.61 2.16 HF157 117.05 151.85 2.71 2.71 HF24 116.50 169.60 7.51 4.22 HF134 106.75 167.95 2.26 3.38 HF60 102.10 188.50 4.66 4.98 HF145 99.45 174.05 6.73 3.83 HF208 98.95 155.20 5.98 3.79 HF204 98.80 155.60 0.44 2.07 HF146 98.75 165.35 1.21 3.07 HF209 97.50 153.15 3.35 3.64 HF166 94.65 154.00 0.41 2.11 HF21 93.95 157.50 1.24 1.96 HF136 93.55 154.30 0.38 2.53 HF22 93.45 158.60 0.61 2.63 HF131 88.75 134.05 0.73 1.68 HF360 87.05 155.25 0.41 2.65 HF202 86.65 157.65 1.08 2.56 HF153 86.60 157.75 0.32 2.80 HF252 84.75 158.50 0.79 2.85 HF187 84.00 158.20 1.03 2.54 HF159 83.50 150.55 1.03 2.13 HF140 81.70 114.20 5.23 2.10 HF163 81.45 156.15 1.06 2.75 HF156 78.70 153.20 0.60 2.42 HF27 78.80 152.15 1.09 2.16 HF23 77.25 153.45 2.33 2.69 HF26 75.25 154.90 1.01 1.93 HF125 66.75 124.75 4.63 2.33 Standart kontrol 126.40 92.15 1.36 5.01 Azotlu kontrol 167.20 291.00 0.00 9.12 Azotsuz kontrol 160.30 120.20 0.00 2.12 LSD (P<0.05) 59.46 74.95 (P<0.01) 3.98 (P<0.01) 2.28 (P<0.01)
TARTIŞMA VE SONUÇ
Bitkide kuru madde artışının azot fiksasyonunun bir göstergesi olduğu belirtilmektedir [8] . Fiğ bitkisinde normal sıcaklıkta HF187, HF142, HF160, HF161 ve HF252 nolu suşlar, düşük sıcaklıkta ise HF59, HF152, HF 362, HF 126, HF206, HF161 ve HF28 nolu suşlar her iki organda standart kontrole nazaran daha yüksek kuru ağırlık değerleri vermiştir. Bu bulgular, etkili suşlarla aşılamanın bitki toplam kuru ağırlığında artışa yol açtığı, kontrol gruplarında toplam kuru ağırlığın deney gruplarına nazaran daha az olduğu ve bunun sebebinin simbiyotik azot fiksasyonuna bağlı olduğu şeklindeki araştırma sonuçlarıyla paralellik göstermektedir [9].
Yine bitkide nodül sayısının ve kuru madde artışının azot fiksasyonunun bir göstergesi olduğu bildirilmektedir [8]. Fiğ bitkisinde normal sıcaklıkta kuru biyomas artışına yol açan FH187, HF142, HF160, HF161 ve HF252 nolu suşlar ile düşük sıcaklıkta biyomas artışı sağlayan HF59, HF152, HF362, HF126, HF206, HF161 ve HF28 nolu suşların standart kontrolden etkili olmaları dikkat çekmiştir. Soya, üçgül ve fiğ [10] ve güvercin bezelyesi [11]üzerinde yapılan nodülasyon denemelerinden elde edilen sonuçlarda yukardaki sonuçlara paralellik arzetmektedir.
Toplam azotun azot fiksasyonunun belirlenmesinde, tespit edilen azotun da aşılamada kullanılan bakterinin etkinliğinin belirlenmesinde çok önemli kriter olduğu belirtilmektedir [7]. Gök ve Martin [10] tarafından elde edilen değerler bizim değerlerimize çok yakın bulunmuştur.
Sonuç olarak; normal sıcaklıkta izolatların çoğunun etkili olduğu, düşük sıcaklık denemesinde ise kuru biyomas ve azot içeriğinin azaldığı tespit edilmekle birlikte bazı suşların (HF 362, HF206, HF60 ve HF59) yüksek derecede etkili olduğu belirlenmiştir.
* Bu çalışma TÜBİTAK-TARP 2046 nolu proje ile
desteklenmiştir.
KAYNAKLAR
[1] Boşgelmez ve ark., 2001. Ekoloji-II, Ankara [2] Sarıoğlu, G., Özçelik, S., Kaymaz, S., 1993. Elazığ
ve yöresinde üretilen mercimek bitkilerinden etkili nodozite bakterilerinin (Rhizobium leguminosarum bv. Vicieae) seçimi. Doğa Tr. J. of Agricultural and Forestry, 17, 569-573.
[3] Zahran, H.H., 2001. Rhizobium from wild legumes: diversity, taxonomy, ecology, nitrogen fixation and biotechnology, J Biotecnology, 2-3, 143-153 [4] Berger, J., Abbo, S., Turner, N.C., 2003,
Ecogeography of annual wild Cicer species, Crop Science, 43, 1076-1090.
[5] Somasegaran, P., Hoben, H.J., 1985. Methods in Legume Rhizobium Technology, Library of Congraca Number 87-106109 Havaii,1-52.
[6] Öğütcü, H., Algur., Ö.F., Elkoca, E.,Kantar, F.,2008,’The Determination of Symbiotic Effectiveness of Rhizobium Strains Isolated from Wild Chickpeas Collected from High Altitudes in Erzurum’, Turk. J. Agric. For., 32, 241-248. [7] Prevost, D., Bordeleau, L.M., Antoun, H., 1987,
Simbiotic effectiveness of arctic rhizobia on a temperate forage legume sainfoin( Onobrychis viciifolia). Plant and Soil., 104, 63-69.
[8] Brockwell, J., Holliday, A.R., and Pilka A., 1988, Evaluation of the symbiotic nitrogen-fixing potential of soils by direct microbiological means. Plant and Soil, 108,163-170.
[9] Yaman, M., Cinsoy, A.S., 1996, Soya fasulyesi tarımında yüksek azot bağlayan Rhizobium bakterisi ( Rhizobium bakterisi L.) suşlarının saptanması, Anadolu Journal of AARI. 6 (1), 84-96. [10] Gök, M., Martin, P.,1993, Farklı Rhizobium bakterileri ile aşılamanın soya, üçgül ve fiğde simbiyotik azot fiksasyonuna etkisi, Doğa Tr. J. of Agricultural and Forestry, 17, 753-761.
[11] Matos, I., Schröder, E.C., 1989, Strain selection for pigeon pea Rhizobium under greenhouse conditions, Plant and Soil, 116, 19-22.
