Smad1’ın übikütinlenmesi ve p97/VCP ile bağlanması

Buraya kadar ki çalışmalarımızda p-Smad1-p97/VCP ilişkisini birlikte lokalizasyon ve ko-immunopresipitasyon ile gösterdik. p97/VCP ile etkileşimde olan bir çok proteinin übikütinlenmesi (übikütin zincirlerinin proteine eklenmesi) gerekmektedir. Giriş kısmında anlatıldığı gibi p97/VCP übikütinlenmiş olan pproteinlere bağlanarak onları proteasoma taşır. Bu nedenle çalışmamızın bir kolunda, übikütinlenmiş Smad1 ve ya p-Smad1’in p97/VCP ile etkileşip etkileşmediklerini araştırdık. Bunun için ilk olarak, hücre ekstratlarından p-Smad1’in çöktürülmesi ve übikütinlenmesini, ikinci olarak da übikütinlenmiş p-Smad1’in p97/VCP ye bağlanmasını gösterdik (Şekil 4.11.1).

Şekil 4.11.1. Sıçan testisinde ubikütünlenmiş p-Smad1’in p97/Valosin-containing protein (p97/VCP) ile bağlanması. 15 ve 60 günlük sıçan testislerinden elde edilen hücre ekstartları (input: başlangıç materyali) kullanılarak p-Smad1 (IP: immunopresipitasyon: p- Smad1) ve izotip kontrol antikorları (IP: immunopresipitasyon: kontrol) çöktürüldü. Sonrasında, p-Smad1, p97/VCP immunoblotlama ile saptandı. Beta aktin ise yükleme kontrolu olarak kullanıldı. Optikal densitometre ile bantlar quantifiye edildi.

TARTIŞMA

Çalışmamız, postnatal gelişmekte olan testis ve epididimis dokularında, UPS proteinleri, BMP sinyal yolağına ait bazı proteinleri ve bunların birlikte ekspresyonlarını göstermesi nedeniyle orijinal bulgular içermektedir. Bu projede, immunohistokimya, immunofloresan, Western blot ve koimmunopresipitasyon metodları kullanılmıştır.

Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP ve Jab1/CSN5’in 5, 15, 30 ve 60 günlük testislerde ve epididimiste gonosit, spermatosit, Sertoli hücreleri, spermatidler ve epididimal epitelyal hücrelerinde birlikte ekspre edildikleri göstermiştir. 5 günlük sıçan testisinde, UPS proteinlerinin gonositlerde ekspresyonunun diğer günlere göre daha az olduğu saptanmışır. Bu proteinlerin bu kadar erken gelişim döneminde bu proteinlerin fonksiyonlarının henüz belirgin olmadığını ya da az olduğunu göstermektedir. Fakat 5. günden sonra UPS proteinlerindeki ekspresyon birden artış göstermiştir ve 30. günde en yüksek seviyelere ulaşmıştır. Daha önceki çalışmalar postnatal 4. günden 30. güne kadar sıçan testis ve epididimisinde hızlı bir proliferasyonun ve büyümenin olduğunu göstermektedir (Clermont ve Peley, 1957). p97/VCP ve Jab1/CSN5’in ekspresyonlarında da testiküler ve epididimal büyümeye paralel olarak görülen bu artış, p97/VCP ve Jab1/CSN5’nin testis ve epididimis büyümesi için gerekli olabilecek proteinler arasında olduğunu göstermektedir. Gerçekten de literatüre bakıldığında, Jab1/CSN5’in hücre büyümesi için temel bir protein olduğu ve hızlı büyüme ile ilişkisi gösterilmiştir (Bounpheng ve arkd., 2000).

Postnatal gelişim boyunca, sıçan testisi çeşitli gelişimsel basamakları gösterir (Malkov ve arkd., 1998). Postnatal 0-5. günlerde, testiküler tübüller sadece gonosit ve somatik hücrelerden oluşmuştur. 6-7. günlerde, spermatogonyumlar görülmeye başlar. 13- 23.günlerde, spermatositler belirir ve 24-25. günlerde yuvarlak spermatidler ortaya çıkarlar. 30. günde uzamış spermatidler ve 36. günde uzamış spermatozoalar testis tübüllerinde gözlenir. p97/VCP ve Jab1/CSN5’nin yukarıda saydığımız tüm basamaklarda görülmesi bu proteinlerin gelişmekte olan testis için önemlerini vurgulamaktadır. Örneğin: p97/VCP ve

Jab1/CSN5’nın yuvarlak ve uzamış spermatidlerde görülmesi, bu proteinlerin akrozom ve spermin kuyruk gelişimi ile ilgili bir fonksiyonunun olabileceğini aklımıza getirmektedir. Ayrıca bu proteinlerin olgunlaşan spermatositlerde görülmeleri yine bu proteinlerin spermatosit gelişimi için gerekli proteinler olabileceklerini göstermektedir.

Sertoli hücreleri ile yapılan ultrastruktural çalışmalar sonucunda sitoplâzmalarında birçok fagositik vakuollerin bulunduğunu göstermiştir (Hutchison ve arkd., 2008). Sertoli hücrelerinin spermatogenez boyunca germ hücrelerinin sitoplazmik artıklarını fagosite ettikleri bilinmektedir (Russell ve arkd., 1983; Sakai ve arkd., 1988). p97/VCP’nin ise, otofagozom maturasyonunda görev yaptığı gösterilmiştir (Dai ve Li, 2001; Meusser ve arkd., 2005). Fakat ilk olarak bizim çalışmamızda, p97/VCP’nin Sertoli hücrelerindeki varlığı belirlenmiştir. Çalışmamız fonksiyonel deneyler içermediği için, p97/VCP’nin Sertoli hücresinde ne gibi fonksiyon gösterdiğini belirleyememiştir. Fakat p97/VCP’nin Sertoli hücresinde übikütinlenmiş substratların yıkımı için gerekli bir protein olduğu muhtemeldir.

Çalışılan proteinlerin epididimisde gelişime bağlı olarak artış göstermeleri, bu proteinlerin sperm maturasyonuyla ilgili fonksiyonları olabileceğini göstermektedir. Özellikle de p97/VCP ve Jab1/CSN5’nin, epididimisin kaput ve korpus epididimis bölgelerinde ekspresyonlarının fazla bulunması, bu proteinlerin sperm olgunlaşmasında fonksiyon görebilen proteinler olabileceklerini vurgulamaktadır. Defektif spermatozoanın epididimisde elimine edildiği bilinmektedir (Sutovsky, P; 2003; Baksa, M; 2008). Fakat eliminasyonun nasıl olduğu, hangi proteinlerin bu işde görev yaptığı bilinmemektedir. Çalıştığımız epididimisde varlığı saptanan proteinler muhtemelen defektif spermatozoanın ortadan kaldırılmasına yardımcı proteinler olabilir. Jab1/CSN5’nin daha önce bilinen görevleri göz önüne alındığında, yapısında bulunan JAMM domaini metalloproteinaz aktivitesine sahiptir. p97/VCP’ye direk olarak bağlanan Jab1/CSN5 ubikütinlenmiş defektif proteinlerin uzaklaştırılmasında görev yapabileceği muhtemeldir.

Spermatogenezin düzenlenmesinde çeşitli sinyal molekülleri ve çoklu-sinyal yolakları vardır. Moleküler mekanizmanın özelliklede sinyal moleküllerinin ve yolakların tam olarak anlaşılması spermatogenez düzenlenmesinde gereklidir ve erkek infertilitesi için yeni tedavi hedefleri sunarak önemli etkilere sahiptir. Smad sinyal yolağı insan embriyonik

kök hücrelerin korunmasında ve ortaya çıkabilecek birden fazla potansiyel sonuç olması durumunda gereklidir. Bu bağlamda öncelikle, Smad1 protein ve mesajcı RNA (mRNA)’

nın çeşitli boyama yoğunluğuna sahip fare ve sıçan testisinin sertoli hücrelerinin yanı sıra germ hücrelerinde de belirtilebileceği rapor edilmiştir. Bu gözlemler doğrultusunda bizim çalışmamız 5, 15 ve 60 günlük sıçan testisinde Smad1 ve p-Smad1’in gonosit, spermatogoya, spermatosit, sertoli hücreleri ve bazı intertisyal hücrelerde lokalize olduğunu göstermiştir.

Son çalışmalar TGFβ-BMP sinyal yolağı için çeşitli proteinlerin Smadlarla etkileşimde olduğunu göstermiştir (Wotton ve arkd.,1999). Bu regülatörlerden bazıları Smad sinyalizasyonunda aktif olabilirken Ski, Evi-1 ve TGIF represör Smadlar olarak tanımlanmıştır. Aynı zamanda TGFβ sinyalizasyonunun Smad proteinlerinin sirkülasyonu ile düzenlendiği de göstermiştir. Smur1 ve Smurf 2’nin her ikisi de Smad ubikinasyonu ve degradasyonu için ubikitin ligaz olarak tanımlanmıştır (Ebisawa ve arkd., 2001; Lin ve arkd., 2000). Dahası Smad1’in bir proteozomal substrat olduğu ve de degradasyonu için BMP’ ler tarafından indüklendiği gösterilmiştir. Bu çalışmalardan, Smad1’in birçok tanımlanmış etkileşen partnerlerinin varlığı açıkça anlaşılmaktadır. Ancak, sıçan testis ve epididimisinde Smad1 protein ekspresyonunu kontrol edebilen başka regülatör proteinlerin olup olmadığı bilinmemektedir.

Biz bu çalışmada, postnatal testis ve epididimde Smad1 ve p-Smad1’in p97/VCP ile etkileşimine dair kanıt sağladık ki bu etkileşim TGF-β-BMP sinyal yolağının düzenlenmesi için önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu çalışmada postnatal sıçan testisinde co-lokalizasyon deneyleri Smad1 ve p97/VCP ekspresyonunun gonositlerde, spermatogonyonyada, spermatositlerde ve sertoli hücrelerinde ekspre edildiğini göstermiştir. En önemlisi, Smad1 ve p97/VCP arasındaki etkileşim co-IP ile doğrulandı. Etkileşimin biyolojik önemi açıklamak amacıyla, Smad1-p97/VCP etkileşim mekanizmasının gelecekte araştırılması gerekmektedir. Başlangıçta p97/VCP, UPS’de çalışan şaperon bir protein olarak gösterildi (Dai ve arkd, 2000). Gösterilmiştir ki p97/VCP ubikitinlenmiş proteinlere bağlanır ve onları proteozoma taşır. Aynı zamanda p97/VCP’nin nükleer faktör κB inhibitör, IP3 reseptörleri, α-T hücre reseptör, δ-CD3, kaspaz 3 ve 7, p53, and siklin B1 gibi çeşitli proteinlerin degradasyonuna katıldığı iyi bilinmektedir. p97/VCP ekspresyonu testis ve epididimisin

yanı sıra çeşitli dokularda saptandı( bizim yayınlanmamış verilerimizde). Bu çalışmanın Smad1 ve p97/VCP arasındaki etkileşimi göstermesinden dolayı, Smad1’in p97/VCP için yeni tanımlanan bir subsrat olduğu ve ubikitinlenmiş Smad1’in p97/VCP vasıtasıyla proteozoma transfer olabileceği mümkündür. Ayrıca, bu çalışma Smad1-p97/VCP etkileşiminin özgüllüğünü test etmiştir. Biz p97/VCP’nin diğer Smadlarla etkileşiminin olup olmadığından şüphelendik. Sahip olduğumuz ilk datalar p97/VCP için Smad4’ün hedef bir subsrat olduğunu fakat Smad2’nin olmadığını ileri sürmektedir (yayınlanmamış veriler).

İlginçtir ki, Jab1/CSN Smad4 ve Smad7 degradasyonuna katılarak TGF- β sinyalizasyonunda bir regülatör olarak gösterilmiştir (Kim ve arkd., 2004; Wan ve arkd., 2002) fakat Smad1 ile olan etkileşimi gösterilememiştir. Jab1/CSN5’in ektopik ekspresyonu endojen Smad4’ün kararlı seviyelerinde azaldığı ve ubikitinlenerek uyarıldığı ki bu durumun da TGF- β uyarılı gen transkripsiyonu inhibe eden sonuçlara yol açtığı rapor edilmiştir. Buna zıt olarak, Jab1/CSN5 insan karsinom hücrelerinde Smad7’ye bağlanarak ve kendi degradasyonunu teşvik ederek, TGF- β1 sinyalizasyonunu artırdığı gösterilmiştir. Jab1/CSN5’in p97/VCP ile birlikte Smad protein ekspresyonlarını modüle ederek TGF- β sinyalizasyonunu regüle etmesi mümkündür. Bu çalışma p97/VCP ve BMP yolakları arasında bir bağlantı olduğunu destekler ki bu durum Smad1 ekspresyonunun p97/VCP ile kontrol edilebileceğini ileri sürmektedir. Gelecekteki çalışmalar gelişmekte olan sıçan testis ve epididimisinde bu etkileşimin fizyolojik rolünü netleştirmek için gerekli olacaktır.

Sonuç olarak, bu çalışmamız postnatal sıçan testis ve epididiminde BMP proteinleri ve UPS etkileşimini göstermiştir ki bu durum, UPS’in BMP yolağını düzenleyebileceğini ileri sürmektedir. Bizim çalışmamızda olduğu gibi, sinyal molekülleri ve yolaklarında yapılan gelişmeler erkek infertilite etiyolojisinde karmaşık bir süreç olan spermatogenezin daha iyi anlaşılması için yararlı olacaktır.

SONUÇLAR