Domateste erken yanıklık hastalığına dayanıklılık sağlayan genlerin moleküler markörler yardımıyla genetik haritalaması ön çalışmaları

DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI

Şerife TOPKAYA Yüksek Lisans Tezi Bitki Koruma Anabilim Dalı

Yrd. Doç.Dr. Özer ÇALIŞ 2008

BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA

GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI

ŞERİFE TOPKAYA

TOKAT 2008 Her hakkı saklıdır

Başkan : Doç. Dr. Yusuf YANAR İmza :

Üye : Doç. Dr.ahmet YILDIRIM İmza :

Üye : Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ İmza :

Yukarıdaki sonucu onaylarım

(imza)

Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü

kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat ya pılmad ığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

Şerife TOPKAYA 2008

DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA

GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI

Şerife TOPKAYA Gaziosmanpaşa Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı

Danışman : Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ

Fungal erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani her yıl Solanacea familyasına ait bitkilerde önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır. Domateste erken yanıklıktan dolayı her yıl minumum %10 ürün kaybı oluşmaktadır. Hastalığın kontrolünde kültürel önlemler yetersiz kalmakta, kimyasal mücadele ise kalıntı problemleri, çevre ve insan sağlığına olan olumsuz etkileri nedeniyle tercih edilmemektedir. Etmenin kontrolü dayanıklılık genlerini kullanarak mümkündür. Bu çalışmada yedi domates hattının Alternaria solani’ye karşı reaksiyonu belirlenmiştir. Testler sonucunda orta derecede dayanıklı NCEBR2 (♀) hattı ile orta derecede hassas NC84173 (♂) hattı melezlenerek F1, F2 ve geriye melez (BC1) bitki populasyonları oluşturulmuştur. Moleküler çalışmalarda ebevynler arasındaki polimorfizmi ortaya koyabilmek için beş adet RGA (Resistance Gene Analogs) markörü, 70 adet Simple Sequence Repeats (SSR) markörü, 23 adet CAPS/SNP (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence/ Single Nucleotide Polymorphism) markörü ve 1 adet INDEL (Insertion/Deletion) markörü kullanılmıştır. Çalışmada toplam 99 adet moleküler markör test edilmiş olup 11 adet moleküler markör ebeveynler arasında polimorfizm vermiştir. Patojenisite testlerinde 150 haritalama populasyonu bitkisinin fenotipleri ortaya konmuştur. Polimorfik markörlerin 150 haritalama populasyonu bitki DNA’sıyla olan genotipik reaksiyonları Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır.

2008 , 57 sayfa

Anahtar kelimeler: Solanacea, Alternaria solani, Erken yanıklık hastalığı, SSR, CAPS, INDEL markörleri

Master of Science Thesis

PRELIMINARY STUDIES ON MOLECULAR MARKERS ASSISTED GENETIC RESISTANCE GENES MAPPING TO TOMATO EARLY

BLIGHT DISEASE By :Serife TOPKAYA University of Gaziosmanpasa

Graduate School Plant Protection Division

Supervisor: Asst. Prof. Dr. Özer ÇALIŞ

Fungal early blight disease caused by Alternaria solani occurs every year important yield loss on Solanacea family plants. Each year, at least 10% crop loss happens due to early blight disease in tomatoes. Cultural manegement is not enought to control the disease, chemical applications constitutes residue problems, negatives effects on human health and enviroments, therefore, the fungicides does not prefer to control the fungal disease. Early blight disease is able to restrain with resistance genes. In this study, we identified seven tomato lines’ reactions to early blight disease using pathogenicity tests. According to the pathogenicity test results, intermediate resistant NCEBR2 (♀) line and intemediate susceptible NC84173 (♂) line were crossed F1, F2 and back cross (BC1) plant populations were produced. In the pathogenicity tests, 150 mapping population plants phenotypes were determined. In molecular studies, to determine polimorphism between NCEBR2 (♀) and NC84173 (♂) parents 5 resistance gene anologs (RGA) markers, 70 simple sequence repeats (SSR) markers, 23 cleaved amplified polymorphic sequence / single nucleotide polymorphism (CAPS/SNP) markers and 1 INDEL markers used. Among 99 tested molecular markers 11 molecular markers were found polimorphic between the parents. The polimorphic markers analysed with 150 mapping population plants and their genotypic reaction were revealed in polymerase chain reactions.

2008 , 57 pages

Key Words: Solanacea, Alternaria solani, Early Blight Disease, SSR, CAPS, INDEL markers

Tez konumun seçiminde ve çalışmalarımın gerçekleşmesinde değerli katkılarını esirgemeyen ve her zaman yardımlarını gördüğüm danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ’a teşekkürü bir borç bilirim.

Çalışmalarımın gerçekleşme aşamasında bilgilerini esirgemeyen hocalarım Doç. Dr. Nejdet KANDEMİR, Doç. Dr. Ahmet YILDIRIM, Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKİÇ’e, Arş. Gör. Özlem SÖNMEZOĞLU’na, manevi desteğini esirgemeyen sevgili arkadaşlarım, Arş. Gör. Tuğba ESERKAYA, Zir. Müh. Erkan KESAT, Arş. Gör. Sabriye YAZICI, Zir. Müh. Sevilay SAYGI, Zir. Müh. Rahime GÜNDÜZ, Arş. Gör. Mustafa ALKAN’a, bana çalışma imkanı sağlayan Moleküler Biyoteknoloji Laboratuvarı çalışanlarına teşekkürler ediyorum. Ayrıca çalışmada kullandığım hastalık etmeni fungusu tanımlayan Doç. Dr. Yusuf YANAR’a teşekkürlerimi sunuyorum.

Bütün eğitimim boyunca maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen aileme teşekkür ederim.

Şerife TOPKAYA 08/2008

ABSTRACT... ii ÖNSÖZ………... iii İÇİNDEKİLER………. iv ŞEKİLLER DİZİNİ ... v ÇİZELGELER DİZİNİ ... vi 1. GİRİŞ……….……... 1 2. LİTERATÜR ÖZETLERİ……….. 5 3. MATERYAL VE YÖNTEM………... 11

3.1. Hastalık Etmeninin İzolasyonu……….. 11

3.2. Domates Agarının Hazırlanışı………...…. 11

3.3. Hastalık Etmeninin Agar Ortamında Yetiştirilmesi………...… 11

3.4. Bitkilerin Elde Edilmesi……….... 12

3.5. Bitkilerin Yetiştirilmesi………...………... 13

3.6. Patojenisite testi……….………… 13

3.7. Melez Bitkilerin Oluşturulması………...……... 14

3.8. F2 Melez Bitkilerinin Oluşturulması……….. 15

3.9. Geriye Melez Bitkilerinin Oluşturulması………...……… 15

3.10. Bitkilerden DNA İzolasyonu………..……… 15

3.11. PCR Analizleri……….…….. 17 3.12 Jel Görüntüleme………. 18 3. 13 Moleküler Markörler……….………. 18 3.14. Restriksiyon Enzimleri……….……….. 27 3.15. Genel Solüsyonlar……….…………. 29 4. SONUÇ VE TARTIŞMA……….………… 30

4.1. Patojenisite Testi Sonuçları………..……. 30

4.2. Moleküler Analiz Sonuçları……….….. 34

5. KAYNAKLAR………..…… 47 6. EK 1………... 49 v

Alternaria solani’in besi ortamında gelişimi……… ₁₂ Şekil 2. Domates ve yabani akrabalarının 7 no’lu saksılara aktarıldıktan

sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri………... ₁₃ Şekil 3. Çalışmada kullanılan 70 adet SSR markörden 6 tanesiyle yapılan

PCR amplifikasyonun görünümü………. ₃₅ Şekil 4. Polimorfik olarak bulunan 7 SSR markörün ebevyn bitki

DNA’larıyla yapılan PCR sonuçları……….…… ₃₅ Şekil 5. SSR 63 markörü ile PCR yapılan F1 DNA’larının metafor jelde

görünümü……….. ₃₆

Şekil 6. Polimorfik SSR63 markörünün 150 haritalama populasyonu bitki

DNA’sıyla yapılan PCR amplifikasyonu………. ₃₈ Şekil 7. Polimorfik TOM144 markörünün 150 haritalama populasyonu bitki

DNA’sıyla yapılan PCR amplifikasyonu………. ₃₉ Şekil 8. Orta derecede dayanıklı NCEBR2 ve orta decede hassas NC84173

bitkileri arasında polimorfizmi ortaya koyan CAPS markörler……... ₄₀ Şekil .9. Polimorfik olan LEOH57 ve CAPS markörünün ebeveyn ve

haritalama populasyonuyla yapılan PCR amplifikasyonu……… ₄₂ Şekil 10. Polimorfik olan Rx-3L1 CAPS markörünün ebeveyn ve haritalama

populasyonuyla yapılan PCR amplifikasyonu………. ₄₃ Şekil 11. Dayanıklılık gen analoğu (RGA) markörlerin orta derecede

dayanıklı NCEBR2 ve orta derecede hassas NC84173 hatlarıyla

yapılan PCR amplifikasyonu sonuçları……… ₄₄ Şekil 12. Polimorfik INDEL CT10737I markörünün ebeveyn ve haritalama

populasyonu ile olan PCR amplifikasyonu………. ₄₅

laboratuvarımıza getirilen tohumlar………...……... 12 Tablo 2. Ebeveynler arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada

kullanılan dayanıklılık gen anoloğu (RGA) markörleri………...…. 18 Tablo 3. NCEBR2 ve NC84173 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak

için çalışmada kullanılan SSR markörleri………... 19 Tablo 4. Dayanıklı NCEBR2 ve hassas NC84173 bitkiler arasındaki polimorfizmi

ortaya koymak için çalışmada kullanılan CAPS markörleri……….… 25 Tablo 5. Dayanıklı NCEBR2 ve hassas NC84173 bitkiler arasındaki polimorfizmi

ortaya koymak için çalışmada kullanılan INDEL

markörleri………... 27

Tablo 6. Ebevynler arasındaki polimorfizmi bulmak için çalışmada kullanılan enzimler ve kestiği bölgeler………... 28 Tablo 7. Çalışmada kullanılan 7 kültür domates hattının 3 Alternaria solani

hastalık etmeni izolatı ile yapılan patojenisite test

sonuçları………..………..… 30

Tablo 8. Alternaria solani 2 no’lu izolat ile inokule edilen farklı nesillerdeki bitkilerin haftalık olarak ölçümlenen AUDPC değerlerine ait tanımlayıcı

istatistikler……….… 32

Tablo 9. Alternaria solani 2 no’lu izolat ile inokule edilen ebeveyn bitkilerde hastalığın gelişiminin istatistiki analiz sonuçlarının tabloda görünümü….. 33 Tablo 10. İnokulasyondan 42 gün sonra hastalığın tüm bitkilerde gelişimi……..…… 34 Tablo 11. Polimorfik olarak bulunan simple sequence repeat (SSR) markörlerin

nükleik asit dizileri ve ebevyn bitkilerde oluşturdukları amplifikasyon

büyüklükleri……….…… 37

Tablo 12. Polimorfik olarak bulunan CAPS markörler ve markörlerin nükleik asit

sıraları……… 41

1.GİRİŞ

Domates dünya üzerinde tarımı en fazla yapılan sebze türlerinden bir tanesidir. Taze olarak tüketildiği gibi, işlenmiş ürün olarak da sofralarımızda salça, domates kurusu, domates suyu ve konserve olarak yer almakta olup insan beslenmesinde oldukça önemli bir yere sahiptir. Türkiye FAO’nun 2006 yılı verilerine göre 260 bin hektar (ha) alanda 9,8 milyon ton (t) domates üretimi ile dünyada en çok domates üreten ülkeler arasında üçüncü sırada yer almaktadır (Anonim, 2006). Dünyada domates tüketimi 1985 yılından itibaren %10 artarak 2006 yılında 125,5 milyon ton olmuştur. Besin maddesi olarak domates A ve C vitaminleri bakımından zengin olup, içermiş olduğu antioksidan likopen maddesi kanser ve kalp hastalıklarına karşı koruma sağlamaktadır (Barone, 2003). Tokat yöresi yaklaşık 600 bin ton domates üretimiyle Türkiye domates üretiminin %7’sini, Dünya domates üretiminin ise %0,5’ini karşılamaktadır (Anonim, 2006). Tokat iklimsel olarak hem Karadeniz hem de karasal iklimin sıcak ve nemli özelliklerini gösterdiği için bu derece önemli olan üründe hastalıkların salgın halinde görülmesi kaçınılmazdır. Tokat’ta domates te en önemli ve iklim şartlarına bağlı olarak her yıl hastalık oluşturan erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani’dir.

Türkiye’nin yaş sebze ihracatı 22 milyon ton olup dünya sebze üretiminin %3.3’ünü ve 12 milyar dolar olan dünya sebze ihracatının %1.2’sini oluşturmaktadır (Anonim 2008a). Bu rakam sebze üreticisi olan Türkiye’nin arzu ettiği ihracat rakamının çok altındadır. Üretimde en büyük problem ihraç edilen sebzelerdeki ilaç kalıntıları, uluslararası standartlara ve tüketici tercihlerine uygun üretim yapılamamasıdır (Anonim 2008b). Domateste erken yanıklık hastalığını kontrol etmek için kullanılan koruyucu ve sistemik fungusitler kullanıcıların bilinçli olmaması, uygulandıktan sonra hasada kadar geçmesi gereken süreye riayet edilmemesi nedeniyle çok miktarda fungisit kalıntısı ortaya çıkmaktadır. Gerek iç tüketimde gerekse ihracatta son derece önemli olan fungisit kalıntıları iç piyasada halkımızın sağlığını tehdit etmektedir. Bu nedenle kısa vadede akut ve uzun vadede kronik hastalık oranlarında artış görüldüğü ve toplumun tercihinin organik tarıma kaydığı bildirilmektedir (Anonim 2008c).

Hastalık etmeni A. solani domateste büyük ürün kayıplarına neden olmaktadır. En basit ifadeyle hastalık etmeni en az %10 ürün kaybına neden olduğunda, Tokat için yaklaşık

60 bin ton domates kaybı görülmekte ve bunun ekonomik boyutları hastalığı kontrol altına alabilmek için uygulanan fungusitlerle maddi kayıp kat kat artmaktadır. Domateste erken yanıklık hastalık etmeninin kontrolü için kültürel önlemler, uzun süreli ekim nöbetleri ve kimyasal olarak fungusit uygulaması yapılmaktadır (Fooland ve ark., 2002). Kimyasal mücadelede kullanılan fungusitlerin hava şartlarına bağlı olarak 7-14 günde bir tekrarlanması gerekmekte olduğundan kullanılan bu fungusitler üründe kalıntılara neden olarak ürünün pazar değerini düşürmekte ihracatı da olumsuz etkilemektedir. Bu sebeple erken yanıklık hastalık etmeni A. solani ile mücadelede en etkili çözüm dayanıklı çeşitleri kullanmaktır.

Toprakta saprofitik olarak yaşayan nekrotrofik fungal hastalık etmeni A. solani başta domates ve patates gibi solanaceae familyası bitkilerini, sebzeleri (fasulye), süs bitkilerini (karanfil) ve meyve türlerini (elma, portakal) hastalandırmaktadır (Agrios, 1997). Fakat ekonomik olarak en fazla Solanaceae familyasına ait bitkilerde kayba neden olmaktadır. Günümüzde Türkiye’de ticari olarak yetiştiriciliği yapılan kültür domates çeşitleri Alternaria solani hastalık etmenine karşı hassastır. Kültür domatesi çeşitlerinde hastalık etmenine karşı dayanıklılık genlerinin olmayışı domatesin doğal olarak yetişen Lycopersicon türlerini dayanıklılık kaynağı olarak kullanmayı teşvik etmiştir. Çünkü doğada hastalık ve zararlılarıyla birlikte yaşayan yabani domates türleri bu etmenlere karşı dayanıklılık genleri taşımaktadır. Bu dayanıklılık genlerinin kültür domateslerine aktarılması ve üstün verim özelliklerinin kazandırılması son yıllarda çok önem kazanmıştır (Pandey ve ark., 2003). Günümüze kadar uygulanan klasik ıslah programları, bitkisel ürünlerde hastalık ve zararlılar başta olmak üzere kültür bitkilerinin diğer birçok tarımsal özelliklerinin iyileştirilmesinde büyük öneme sahiptir. Klasik ıslah yöntemleri bazı durumlarda yetersiz kalabilmekte ya da oldukça uzun süreye ihtiyaç duymaktadır. Bu sebeplerden dolayı son 15 yıl içerisinde gelişen bitki biyoteknolosi yöntemleri önem kazanmaktadır. Tarımsal yönden öneme sahip genler genetik haritalar kullanılarak, kültür çeşitlerine etkin bir şekilde, hızlı ve kolayca aktarılabilmektedir (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

Erken yanıklık etmeni Alternaria solani uygun hava şartlarıyla birlikte her yıl başta domates ve patates olmak üzere Solanecea familyası bitkilerinde salgın hastalıklar

oluşturur. Hastalığın oluşturduğu kaybı ortadan kaldırmak, en azından azaltmak için, kültürel ve kimyasal uygulamalar yapılmaktadır. Kültürel uygulamaların hastalığın kontrolünde yetersiz oluşu, kullanılan fungusitlerin domateslerde kalıntı bırakması, tekrar uygulama gerekliliği ve çevreye olan olumsuz etkilerinden dolayı son yıllarda bitki dayanıklılık genlerinin önemi artmıştır (Agrios, 1997). Türkiye’de kullanılan ticari domates çeşitlerinde erken yanıklık hastalık etmenine karşı dayanıklılık genlerinin bulunmayışı, ıslahçıları hastalığa karşı dayanıklı kültür çeşitleri oluşturmaya yöneltmiştir. Özellikle biyoteknolojik yöntemlerin yardımıyla domatesin yabani çeşitlerinden kültür çeşitlerine dayanıklılık genlerinin aktarılması sağlanmıştır. Domates bitkilerine yabani akrabalarından aktarılan genler erken yanıklık etmenini kontrol altına alırken bu genlerin hangi kromozomlar üzerinde olduğu, genlerin yapısal özellikleri, genlerin dayanıklılığı sağlarken aktive ettikleri savunma mekanizmaları ve patojenle olan ilişkileri konusundaki sorular henüz açıklanamamıştır. Bu soruları cevaplayabilmek, domateste dayanıklılık genlerini kromozomlar üzerinde haritalayabilmek için ebeveyn olarak farklı genetik materyal içeren anne ve baba domates bitkilerinin moleküler olarak farklılığının (polimorfizm) ortaya konması gerekmektedir.

Genetik çeşitliliğe sahip istenen özellikleri taşıyan domates çeşitlerinin oluşturulması biyoteknoloji ile günümüzde mümkündür. Özellikle dayanıklılık genlerinin önce kromozomlar üzerinde yerinin haritalanması sonrasında bu haritalanan yeri fiziksel olarak haritalamak ve istenen özelliklere sahip transgenik bitkilerin oluşturulması mümkündür. Çalışmamıza konu olan dayanıklı ve hassas domates bitkilerinde bu özellikleri kontrol eden genlerin haritalanması ve bu genlerin yapılarının anlaşılmasıyla domateste erken yanıklık hastalığının genetik kontrolü sağlanacaktır. Genetik olarak hastalığı kontrol eden genlerin haritalanması ancak ebeveyn bitkilerin genetik olarak polimorfik (farklı) olmasıyla mümkündür. Bu genlerin haritalanması da fenotipte bulunan özelliklerin bir veya daha fazla belirteçle genotipte dayanıklılık genine çok yakın olacak şekilde eşleştirilmesiyle yapılmaktadır. Bu nedenle ebeveynlerdeki polimorfizmin ortaya konması daha önce bahsedilen aşamalar için vazgeçilmez bir adımdır.

Domateste görülen hastalıkların kontrolü için alternatif teknolojiler üretmek, dayanıklılık lokuslarını kullanarak hastalık etmenlerini kontrol altına almak günümüzde sürdürülebilir tarımın vazgeçilmezlerindendir. Bu nedenle projemizde domates üretiminde önemli olan erken yanıklık hastalık etmeninin dayanıklı domates bitkilerinin genomunda bulunan dayanıklılık lokuslarını haritalamak için alt yapıyı oluşturmak amaçlanmaktadır.

2. LİTERATÜR ÖZETLERİ

Domates (Lycopersicon esculentum mill.) dünyada yaygın olarak yetişen sebze ürünlerinden biri olarak bilinmektedir. Taze sebze olarak aynı zamanda işlenmiş ve kutulanmış olarak tüketilmektedir. Domates tüketimi 1985’den beri dünyada yaklaşık %10 artmıştır. Bunun nedeni domatesin besin değerinden gelmektedir. Domates A ve C vitaminlerinin önemli bir kaynağıdır. Dahası son çalışmalar, kırmızı domatesin önemli bir bileşeni olan likopenin önemini göstermiştir. Antioxidant özelliğe sahip olan likopen kanser ve kalp hastalıklarına karşı koruyucu olarak bulunmuştur (Durant, 2008)

Erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani nemli havada yaprak üzerindeki lekelerde koyu füme veya koyu yeşil renkli kadifemsi görünüşte olan miseller oluşturur. Bunlar fungusun konidioforları ve konidilerinden ibarettir. Konidiler çok hücreli, uzun, koyu renkli, enine ve boyuna bölmeli olup uzun bazen çatallı uzantıları vardır. Enfeksiyon genellikle topraktan olur. Fungus hayatını topraktaki bitki artıkları üzerinde devam ettirir. Tohumla da bulaşabilir. Fide devresinde kotiledon yapraklarda nekrotik lekeler meydana getirerek fidelerin ölmesine sebep olur. Ölü fideler üzerinde meydana gelen yoğun popülasyon hastalığın yayılmasını sağlar (Agrios, 1997; Anonim 2008d). Erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani Sorauer domates bitkilerinde iki farklı hastalık semptomuna neden olabilir. Yapraklarda erken yanıklık ve gövdede yaka gibi çürüme (collar rot) oluşturabilir. Hastalık etmeni 6-30°C sıcaklık arasında gelişir. Optimum gelişme sıcaklığı ise 28-30°C’dir. Erken yanıklık hastalığına bitkilerin her devresinde rastlanır. Fidelerde kök çürüklüğü veya kök boğazı yanıklığı yapar. Hastalık yapraklarda, saplarda ve meyvelerde lekeler halinde görülür. Lekeler önce küçük gayri muntazam ve esmerdir. Lekeler sonra 1-2 cm’ye kadar büyürler. Koyu gri bir renk alırlar ve genellikle merkezi daireler şeklinde sınırlanma gösterirler. Hastalık şiddetli olursa bütün yapraklar kurur ve dökülürler. Aynı lekeler bazen saplarda da meydana gelir. Bu lekeler yüzünden bazen sap tamamen ölür. Çiçek ve meyve sapları hastalığa yakalanırsa dökülürler. Meyvelerde genellikle sapın tutunduğu kısımda koyu renkli çökük, çoğunlukla sınırlanmış lekeler meydana gelir. Hastalık kısa zamanda bitkiyi öldürür ve çok fazla miktarda ürün kaybına neden olur. Sebze ekilişi yapılan alanlarda hastalığın zararını her zaman görmek mümkündür. Ancak bazı yıllar fungal hastalık

etmeni epidemiler yapabilmektedir (Anonim 2008d; Agrios, 1997, Lawrence ve ark., 2000).

Hastalıklı dokularda bitki fotosentez faaliyetini yapamadığı için bitkide ürün oluşmamakta, oluşsa bile miktarının düşmesine ve meyve kalitesinin yok olmasına neden olmaktadır. Hastalık etmenin kontrolü için kimyasal uygulamalar yapılmaktadır Bu uygulamalar ürünün maaliyetini artırmaktadır (Agrios, 1997; Zhang ve ark. 2003). Hastalık etmeni solanaceae bitkilerinden başka sebzeleri (fasulye), süs bitkilerini (karanfil) ve meyve türlerini (elma, portakal) hastalandırmaktadır. Fakat ekonomik olarak en fazla solanaceae bitkilerinde ürün kaybına neden olmaktadır (Agrios, 1997) Günümüzde Türkiye’de ticari olarak yetiştiriciliği yapılan tüm kültür domates çeşitleri Alternaria solani hastalık etmenine karşı hassastır. Hastalık etmeni kültürel önlemler, uzun süreli ekim nöbetleri ve rutin fungisit uygulamaları ile kontrol altında tutulmaktadır (Fooland ve ark., 2002). Erken yanıklık hastalığının kimyasal mücadelesi her zaman ekonomik değildir ve sık sık kimyasal uygulamaları gerekmektedir. Bu yüzden bitki dayanıklılığı hastalıkla mücadelede en uygun yöntemdir (Barone, 2003; Fooland ve ark., 2002; Tirthamallappa ve Lohithaswa, 1999). Gerek klasik gerekse moleküler ıslah yöntemleriyle erken yanık hastalığına karşı dayanıklı çeşitler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Hastalık etmeninin kompleks yapısı ve dayanıklı bitkilerdeki karmaşık genetik yapıdan dolayı istenen dayanıklı kültür domates çeşitleri henüz ortaya çıkarılamamıştır (Zhang ve ark., 2003). Kültür domateslerinde hastalık etmenine karşı dayanıklılık genlerinin bulunamayışı domatesin doğal olarak yetişen Solanum türlerini dayanıklılık kaynağı olarak kullanmayı teşvik etmektedir. Çünkü doğada hastalık ve zararlılarıyla birlikte yaşayan yabani domates türleri bu etmenlere karşı dayanıklılık genleri taşımaktadır. Bu dayanıklılık genlerinin kültür domateslerine aktarılması ve üstün verim özelliklerinin kazandırılması son yıllarda çok önem kazanmıştır (Pandey ve ark., 2003).

Kültür domatesleri Solanum lycopersicum (syn. Lycopersicon esculentum) içinde erken yanıklığa tam dayanıklı çeşitler bilinmemektedir (Peralta ve ark. 2005). Tüm ıslah hatları ve akraba çeşitler orta derecede dayanıklı olup diğer kültür domates çeşitleri erken yanıklık hastalığına hassastırlar ( Gardner ve Shoemaker 1999). Bazı yabani

domates türleri, S. habrochaites (syn. L. hirsutum), S. pimpinellifolium (syn. L. pimpinellifolium), S. peruvianum (syn. L. peruvianum) ve S. chilense (syn. L. chilense), potansiyel dayanıklılık kaynağı olarak tanımlanmıştır (Nash ve Gardner 1988; Fooland ve ark. 2000; Thirthamalappa ve Lohithaswa 2000). Bu yabani türlerden bazıları özellikle S. habrochaites PI 126445 aksesyonu erken yanıklık hastalığına orta derecede dayanıklı hatlar geliştirmek için kullanılmıştır (Gardner ve Shoemaker 1999).

Yapılan çalışmalar domateste erken yanıklık hastalığına dayanıklılık sağlayan genlerin kantitatif olarak etkileşimleri sonucunda her birinin dayanıklılıkta küçükten orta dereceye kadar katkıda bulunduklarını göstermiştir. Klasik ıslah çalışmaları dayanıklı materyallerin ortaya konmasını sağlamış, fakat her bir genin dayanıklılığa nasıl etki ettiğini ve domates genomu üzerindeki yerini açıklayamamıştır. Örneğin Amerika Birleşik Devletlerinde piyasaya sunulan erken yanıklığa dayanıklı NCEBR-4 tohumları hastalığın kontrolünde kullanılmakta fakat genetik yapıları hakkında bilgi bulunmamaktadır (Gardner ve Shoemaker, 1999; Fooland ve Lin, 2001).

Biyoteknolojinin üstünlüğü moleküler markörleri, moleküler haritaları ve markör– destekli seleksiyon (MAS) teknolojilerini kullanarak klasik bitki ıslah yöntemlerini destekleyen bir yaklaşım olarak karşımıza çıkmasıdır. Özellikle moleküler markör teknolojisi kompleks özellikleri kontrol eden çok sayıda genlerin (Quantitatif trait loci: QTL) sayılarını, bireysel ve interaktif etkilerini ve kromozom üzerindeki yerini belirlemeyi kolaylaştırmaktadır (Tanskley ve ark.1989). Moleküler markörler 1980’lerden beri domates ve diğer bitkilerin genomlarında bulunmuş en önemli genetik yapılar olarak bilinmektedir (Barone, 2003). Dayanıklılık genlerine bağlı olan moleküler markörlerin tanımlanması iki nedenden önemlidir: birincisi bu markörler dayanıklılık fenotipinden ziyade markör genotipine bağlı olarak seleksiyona izin vermektedirler, ikincisi moleküler markörler istenmeyen bağlantı sürüklenmesini azaltabilmektedirler. Hastalıklara dayanıklılık genlerine bağlı moleküler markörleri bulmak için büyük projeler gerçekleştirilmektedir. Bu projelerden birisi domates genomunu ortaya koymaya çalışan Solanacea Genome Project (SGN) olup domates genomunun yaklaşık %40’ı tamamlanmıştır (http://www.sgn.cornell.edu). Erken yanıklık hastalığına dayanıklı domates haritası oluşturmak amacıyla Fooland ve

arkadaşları tarafından geriye melez (BC1) populasyonları kullanılarak genetik kaynak S. habrochaites (syn. L. hirsutum) da kantitatif karakter lokus (QTLs) etkilerinin büyüklüğü ortaya konulmuştur (Fooland ve ark. 2002b; Zhang ve ark. 2003).

Domates bitkilerinde erken yanıklık hastalığına karşı bitkilerin genetik yapısını ortaya koymak için çimlenme ve yetişkin bitki döneminde bulunan bitkiler melezlenerek patojenisite testelerinden geçirilmişlerdir. Çalışmada kullanılan Arka Saurabh (hassas) x IHR1939 (dayanıklı) melezininin 6 jenerasyon boyunca analizi yapılarak hem çimlenme döneminde hem de yetişkin bitki döneminde erken yanıklılığa dayanıklılığın çekinik genler tarafından kontrol edildiği gösterilmiştir. Erken yanıklığa karşı poligenik dayanıklılık görülmektedir. Eklemeli dayanıklılık olarak bilinen bu dayanıklılık mekanizmalarında birden fazla gen dayanıklılığı kontrol etmektedir (Tirthamallappa ve Lohithaswa 1999). Yukarıdaki domates hatlarıyla yapılan çalışmalarda, eklemeli x eklemeli gen etkilerinin çimlenme döneminde ve dominant x dominant gen etkilerinin yetişkin bitki döneminde önemli olduğu bulunmuştur (Tirthamallappa ve Lohithaswa 1999).

Domatesin tüm yabani türleri erken yanıklık hastalığına karşı dayanıklılık kaynağı olarak günümüzde yoğun olarak kullanılmaktadır (Fooland ve ark. 2000). İzole edilen Alternaria solani hastalık etmeninin ırklarının yabani türlere karşı dayanıklılık reaksiyonlarının bulunması, lokal patojenik populasyonların virülensliğine ve patojenitesine bağlı olabileceğinden dolayı özel çevreler için doğrulanmaya ihtiyaç bulunmaktadır. Çok sayıda araştırmacı dünyanın çeşitli yerlerinden erken yanıklığa dayanıklı domates genotiplerini tanımlamışlardır. Yapılan bu çalışmalar ve onların daha sonraki genetik analizleri, dayanıklılığın çoklu genler tarafından kontrol edildiğini tasdiklemişlerdir (Tirthamallappa ve Lohithaswa 1999).

Farklı üç domates türünü temsil eden 29 domates genotipinde Alternaria solani hastalık etmeninin dayanıklılığı incelenmiştir. Tarla, sera ve büyüme kabininde yapılan deneylerde Alternaria solani enfeksiyonuna karşı genotipler arasında önemli farklılıklar bulunmuştur. Tarla ve sera deneylerinde hastalıkla inokulasyondan sonra Lycopersicon hirsitum yabani domates türlerinin bazı hatları (PI126445 ve LA2099) hastalık etmenine

karşı neredeyse tam dayanıklılık göstermiş, diğer taraftan NC84173 ıslah hattı ve New Yorker domates çeşidi ise tam hassaslık göstermiştir (Fooland ve ark., 2000).

Yukarıda belirtilen çalışmaların tersine bir gen tarafından (monogenik) dominant olarak kalıtım gösteren gen Lycopersicon hirsutum PI 134417 içerisinde bulunmuştur (Datar and Lonkar, 1985). Bu çalışmada F2 popülasyonu bitkileri çok dayanıklı, orta dayanıklı ve hassas olarak bulunmuş, dayanıklılık; hassaslık oranı tesadüfen 3:1 olarak ortaya konmuştur (Datar ve Lonkar, 1985). Fakat erken yanıklık hastalığına karşı yabani ve kültür domateslerinde bulunan genlerin kantitatif yapıda olduğu her bir genin dayanıklılığı farklı miktarlarda katkıda bulunduğu Fooland ve Lin tarafından ortaya çıkarılmıştır. Burada F2 populasyonunda ortaya konan 3:1 dayanıklı:hassas oranın tesadüfen ortaya çıktığına karar verilmiştir (Fooland ve Lin 2001).

Domates erken yanıklık ve diğer fungal yaprak hastalıklarını kontrol etmek için rutin olarak fungusitler kullanıldığından dolayı, çevresel endişelerden dolayı fungusitleri azaltmaya karşı artan bir ilgi bulunmaktadır. Erken yanıklığa dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi bu hastalığı kontrol etmede yüksek başarı sağlayacaktır. Son yıllarda ABD’de erken yanıklığa orta derecede dayanıklı USDA7162, C1943, NCEBR-1, ve NCEBR-2 ıslah hatları geliştirilmiştir (Gardner, 1988). Bu hatlardan NCEBR-1 ve NCEBR-2 dayanıklılığı asıl olarak eklemeli genetikle belirlenirken, USDA7182 ve C1943’de erken yanıklığa dayanıklılığın resesif genler tarafından kontrol edildiği ortaya konmuştur. (Nash ve Gardner, 1988).

Yapılan bir haritalama çalışmasında L. pimpinellifolium LA722 ile domates NC84173 hattı melezlenerek bir haritalama populasyonu oluşturulmuştur. Bu çalışmada oluşturulan 119 BC1 haritalama populasyonu bitkisi üzerinde 151 RFLP markörü test edilmiştir. Yaklaşık olarak 1192 cM domates genomu içerisine bu markörler ortalama 7,9 cM mesafeyle yerleştirilmiştir. Haritanın uzunluğu ve markörlerin linear sırası domatesin önceden yayınlanan moleküler haritalarıyla iyi bir uyum içindeyken kromozomlar arasında rekombinasyonun dağılımında önemli farklılıklar bulunmuştur. (Chen ve Foolad, 1999).

Bir diğer çalışmada, domates dayanıklılık genleri ile moleküler markörler arasında bağlantı haritası Lycopersicon esculentum Mill. hattı NC84173 ile Lycopersicon hirsutum Humb PI126445 bitkileri arasında oluşturulan geriye melez populasyonunda çalışılmıştır. NC84173 bitkisi domateste bazı hastalıklara dayanıklı fakat erken yanıklığa ve geç yanıklığa dayanıklı olmayan geliştirilmiş ıslah hattıdır. PI126445 erken yanıklık ve geç yanıklık da dahil birçok domates hastalıklarına dayanıklı, kendine döllenen bir bitkidir. Haritalamada 142 RFLP markörü ve 29 RGA anoluğu test edilmiştir. Kullanılan dayanıklılık gen analogları bilinen dayanıklılık genlerinin Leucine rich repeats (LRR), Nucleotide Binding Site (NBS), Pto kinase (Ptokin) domainlerinden türetilmiştir. Tüm bu RFLP ve RGA markörleri 1469 santi Morgan (cM) olan domates genomu üzerinde ortalama 8,6 cM mesafeyle yerleştirilmiştir. RGA lokusları 12 domates kromozomunun 9 tanesi üzerinde haritalanmış olup bilinen genlerin (Cf2, Cf4, Cf9) konumları ile bazıları çakışmıştır (Zhang ve ark., 2003).

Moleküler markörler ve gen haritalarının gelişmesiyle bitki türleri arasındaki sınırlamaların artık üstesinden gelinebilmektedir. Moleküler bağlantı haritaları karmaşık özellikleri etkileyen QTL ‘lerin yada genlerin bireysel etkilerini, kromozomal bölgeleri ve sayılarını tahmini olarak belirlemeyi kolaylaştırabilmektedir. Kromozomal bölgelerdeki QTL’lerin tanımlanmasından sonra istenen QTL bölgeleri kültür bitkilerine aktarılabilir ve istenmeyen özellikler MAS yöntemiyle kısmen hızlı şekilde elemine edilebilmektedir (Zhang ve ark.2002).

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Hastalık Etmeninin İzolasyonu

Erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani Tokat-Kazova’dan 25 infekteli sırık ve yer domatesi bitkilerinin 2,5 ve 6 numaralı örneklerden 2004 sonbahar döneminde izole edilmiştir. İzole edilen bu 2, 5 ve 6 no’lu patojen izolatları domates besi ortamında 20-25 günde düzenli olarak yeni besi ortamlarına aktarılarak muhafaza edilmiştir. Hazırlanan otoklav edilmiş domates besi ortamı steril kabinde 9 cm çapındaki steril petrilere ~20 ml olacak şekilde dökülmüştür. Hastalık etmeni A. solani’in teşhisi, Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Yusuf YANAR tarafından yapılmıştır.

3.2. Domates Agarının Hazırlanışı

Ticari olarak üretilen (DİMES, Tokat) %100 domates suyundan 30 ml alınarak 270 ml çeşme suyu ilave edilerek 300 ml besi ortamı hazırlanmıştır. Hazırlanan domates suyunun pH’sı ölçülerek 5.5-6.0 olması için seyreltik HCl ilave edilmiştir. Bu domates ortamının katılaşması için %1.5 agar olacak şekilde 4.5 gr agar agarı (Lab M, İngiltere) ilave edilerek 1210C’de 1 atmosfer basınçta 20 dakika otoklav edildikten sonra steril besi ortamı hazırlanmıştır.

3.3. Hastalık Etmeninin Agar Ortamında Yetiştirilmesi

Besi ortamları petrilere döküldükten sonra üzerine Alternaria solani hastalık etmeninin en güçlü gelişimin olduğu yerden miselyumlar 5 mm çapında kesilerek Petrinin tam ortasına ters olarak bırakılmıştır. İnokule edilen petriler oda sıcaklığında gelişmeye bırakılmıştır. Böylece hastalık etmeni saf olarak üretilip patojenisite testlerinde kullanılmıştır (Şeki l). Çalışma kapsamına alınan 2, 5 ve 6 no’lu Alternaria solani izolatları içerisinde 2 no’lu izolatın daha çok sayıda spor oluşturması nedeniyle inokulasyon işlemlerinde kullanılmıştır.

Şekil 1. Çalışmada kullanılan 3 farklı erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani’in besi ortamında gelişimi A) 2 no’lu ,B) 5 no’lu, C) 6 no’lu A. solani izolatları

3.4. Bitkilerin elde edilmesi

Projemizde kullandığımız domates NCEBR 1-6 hatları Prof. Dr. Randy GARDNER (Horticultural Science, North Carolina University, USA) tarafından çalışmalarımızda kullanmak üzere hediye edilmiştir. Diğer yabani domates tohumları ve kültür domates tohumu NC84173 California Üniversitesi Tomato Genetics Resource Merkezinden (Anonim, 2007) temin edilmiştir. Türkiye domatesin anavatanı olmadığı için domatesin doğal yetiştiği Güney Amerika’nın And dağları bilim adamları tarafından taranarak domates genetik kaynakları oluşturulmuştur. Amerika’da oluşturulan Tomato Genetics Resources Merkezi en büyük domates ve yabani akrabalarının saklandığı merkezlerden birisidir. Çalışmada kullandığımız tohumların orijinal toplanma yerleri Tablo 1’de verilmiştir.

Tablo 1. Erken yanıklık (Alternaria solani) hastalığına karşı Amerikan Ulusal Germplasm Sisteminde (http://www.ars-grin.gov/npgs/) taranarak laboratuvarımıza getirilen tohumlar.

Tohumun adı (Accession

No) Orijini Latince adı

NC84173 _Amerika L. esculentum

NC EBR-1 _{Amerika L. esculentum}

NC EBR-2 _{Amerika L. esculentum}

NC EBR-3 Amerika L. esculentum

NC EBR-4 Amerika L. esculentum

NC EBR-5 Amerika L. esculentum

3.5. Bitkilerin yetiştirilmesi

Tomato Genetics Resource Merkezinden elde ettiğimiz bu tohumlar viollere ekilerek 2-3 gerçek yapraklı hale gelince 7 numaralı 20 cm çapındaki saksılara şaşırtılmıştır. Bu bitkiler Ziraat Fakültesi Biyoteknoloji serasında 16 saat gündüz, 8 saat gece, %60 nisbi nemde ve 26±1°C sıcaklıkta gelişmeye bırakılmıştır (Şekil 2).

Şekil 2. Domates ve yabani akrabalarının 7 no’lu saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri.

3.6. Patojenisite testi

Hastalık etmenine karşı dayanıklı ve hassas bitkileri ortaya koyabilmek için patojenisite testleri yapılmıştır. Bu amaçla besi ortamında steril şartlarda geliştirilen Alternaria solani izolatları distile suda toplanıp hazırlanan 2x106 spor ml-1 konsantrasyonunda bitkilere püskürtülmüştür. Hastalık etmeni sporların konsantrasyonu 0.1 mm x 0.1 mm x 0.1 mm (en x genişlik x derinlik) olan Haemocytometer (Thoma lamı) ile sayılarak ayarlanmıştır. Hazırladığımız bu spor konsantrasyonu bitkilere 6 damla yüzey gerilimini düşürücü Tween 20 katıldıktan sonra yaprak yüzeyi tamamen ıslanıncaya kadar püskürtülmüştür. Püskürtme işlemi ilk gün 3 defa tekrarlanmıştır. Daha sonra sera

şartlarında hastalık etmeninin gelişimi beş hafta (inokulasyondan sonra 35 gün) boyunca gözlemlenmiştir.

Bitkilerde hastalık şiddetinin belirlenmesinde 1= %0-3, 2= %3-6, 3= %6-12, 4= %12-25, 5= %25-50, 6= %50-75, 7=%75-87, 8= %87-94, 9= %94-97, 10= %97-100, 11= %100 kullanılmıştır. Bu ölçüm sisteminde ‘0’ semptom göstermeyen sağlıklı yaprağı, ‘100’ hastalıktan dolayı tamamen deforme olmuş yaprağı ifade etmektedir. Hastalığın gelişimi, bitkinin genel görünümüne bakılarak A. solani hastalık etmeninin yapraklarda hastalığın gelişmiş olduğu alan ölçülmüştür. Ebeveynlere ait hatlar (P1ve P2), F1, F2, geriye melez bitkileri (BCI) için hastalık gelişiminin olduğu alan (Area Under the Disease Progress Curve: AUDPC) aşağıdaki gibi hesaplanmıştır.

AUDPC=

[

_R

_R

]

[

_t

_t

]

∑

Ri: i. Gözlem gününde zarar görmüş dokuların tahmini oranı ti: İlk gözlem zamanı

n: Toplam gözlem sayısı (Foolad ve Lin, 2001). 3.7. Melez Bitkilerin Oluşturulması

Hastalık etmeni A. solani ile patojenisite testlerinde kullanılan bitkilerin hastalık gelişimlerine bakarak dayanıklı ve hassas bitkiler belirlenmiştir. Dayanıklı ve hassas domates bitkileri çiçeklenme dönemine geldiğinde birbirleriyle melezlenerek F1 hibrit melez bitkileri oluşturulmuştur. Melezleme işleminde hassas ebeveyn olan NC84173’den melezlemeden üç gün önce tamamen açılmış olan çiçeklerden polen tozları alınmış ve petri içinde gölge bir ortamda kurutulmaya bırakılmıştır. Melezleme gününde kuruyan polenler hafifçe ezilerek toz haline getirilerek kullanılmaya hazır hale getirilmiştir. Dayanıklı ebeveyn NCEBR2’nin tam açılmamış olan çiçeklerinin bir pens yardımı ile önce taç ve çanak yaprakları açılmıştır. Daha sonra polen ana hücreleri dişicik borusuna zarar vermeden, dişicik borusu yalnız kalacak şekilde uzaklaştırılmıştır. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hazırlanmış olan NC84173 polenleri değdirilerek tozlama işlemi gerçekleştirilmiştir. Melezleme yapılan çiçek dışarıdan

yabancı tozlanmayı engellemek için parşömen kağıttan yapılan ışığı ve havayı geçiren kese kağıtlara konularak kapatılmıştır. Melezleme işleminin başarılı olabilmesi için bu işlem bir gün aralıkla 3 defa tekrarlanmış ve bir bitkide en fazla üç tane çiçeğe melezleme yapılmıştır.

3.8. F2 Melez Bitkilerinin Oluşturulması

Elde edilen bu F1 hibrit bitkilerinin kendilenmeye bırakılması ile F2 populasyonu oluşturulmuştur. Kendilemeye bırakma işleminde çiçekler tomurcuk halindeyken tam açılmadan yabancı döllenmeyi engellemek için kese kağıt ile kapatılmıştır. Çiçekler tam açılınca parşömen kağıt açılarak kendi polen tozu dişicik borusuna samur fırça yardımı ile değdirilerek tozlanma sağlanmış ve kese kağıt tekrar kapatılmıştır. Melezlemenin gerçekleşebilmesi için bu işlem üç defa tekrarlanmıştır. Bu F2 popülasyonu bitkilerinin patojenisite sonuçları erken yanıklık hastalık etmenine karşı dayanıklı bitkilerdeki genetik özelliğin bir yada daha fazla lokus tarafından kontrol edildiğini ortaya koyacaktır.

3.9. Geriye melezleme populasyonunun oluşturulması

Hassas ve dayanıklı bitkilerin melezlenmesiyle elde edilen F1 bitkileri polen donör olan hassas (NC84173) bitkiyle geriye çaprazlanarak geriye melez (Back cross: BC1) populasyonu oluşturulmuştur. Elde edilen bu geriye melez populasyonuna haritalama popülasyonu da denilmektedir. Bu geriye melezleme popülasyonu dayanıklılık gen(ler)inin haritalanmasında kullanılmaktadır. Haritalama işlemi için dayanıklı ve hassas ebeveynlerle birlikte F1, F2 ve BC1 populasyonunda bulunan tüm bitkiler patojenisite testinden geçirilmiştir

3.10. Bitkilerden DNA izolasyonu

Bitkiler 2-3 gerçek yapraklı dönemde iken genç yapraklardan 2 örnek alınmıştır. Hücresel organellerin açığa çıkması ve hücre duvarının parçalanması için, fiziksel olarak dondurup-çözme işlemi ve kimyasal maddeler uygulanmıştır. Bu işlem için yaprak örnekleri sıvı azot içerisinde dondurularak sıcak ekstraksiyon buffer içerisinde öğütülerek yapılmıştır. Hücre membranı ise CTAB ya da SDS gibi deterjanların kullanılmasıyla parçalanmıştır. DNA’yı nükleazlardan ayırmak için EDTA gibi

deterjanlar kullanılmıştır. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve proteinlerin uzaklaştırılması buffer karışımına kloroform ve/ veya fenol karışımı eklenerek yapılmıştır.

Bitki DNA izolasyonunda aşağıda belirtilen protokol farklı DNA izolasyonu metotlarının modifiye edilmesi sonucu oluşturulmuştur.

1) 1,5 cm boyunda bir yaprak ependorf tüpte önce 50 µl buffer içinde öğütülür ve daha sonra 450 µl buffer ilave edilir.

100 ml Buffer: • 65 ml dH2O

• 10 ml 1 M Tris pH: 7,5 • 14 ml 5 M NaCl

• 10 ml 0,5 M EDTA pH: 8,0 ==> 65 oC’de ısıtılarak, • 1 gr CTAB

• 1 ml 14 M Beta MerkaptoEtanol (BME) eklenir.

2) Bir ünite Proteinase K eklendikten sonra (1 ünite 5 µl konsantrasyon) vorteksde karıştırılır.

3) 50 µl % 20 SDS (veya 80 µl %10 SDS) eklenerek 65oC’ deki su banyosunda 1 saat tutulur ve ara sıra alt üst ederek karıştırılır.

4) Su banyosundan çıkarılan tüplere 2 / 3 hacim (400 µl) kloroform : isoamil alkol (24:1) eklenir. 5-10 dakika alt üst edilerek karıştırılır.

5) 10.000 g’de 15 dakika santrifüj edilir.

6) Süpernatant 2 / 3 hacim yani 400 µl 2-propanol içeren yeni bir tüpe alınır. Alt üst edilerek DNA gözle görülür hale getirilir.

7) 15 dakika 10.000 g’de santrifüj edilir.

8) Sıvı dökülür. Pelet kuruduktan sonra 400 µl 1 x TE eklenir. 9) DNA 60 oC’ deki su banyosunda 3 saat eritilir.

10) 10 mg / ml RNase çözeltisinden 1 µl eklenir ve su banyosunda 1 saat bekletilir. 11) 400 µl kloroform : isoamil alkol (24:1) eklenir. Tüpler 10 dakika alt üst edilerek karıştırılır.

13) Süpernatant 100 µl 1.2M NaCl (veya 26 µl 5 M NaCl ) içeren yeni bir tüpe alınır. Hafifçe karıştırılır.

14) 800 µl % 96 soğuk etil alkol ilave edilir. Alt üst edilip karıştırılarak DNA çökeltilir. 15) 10.000 g’ de 20 dakika santrifüj edilir ve sıvıyı dökülür.

16) Pelet 900 µl % 70 soğuk etil alkol ile dikkatlice yıkanır. Ters çevrilmiş halde 2 saat kurutulur.

17) Kuruyan pelet 100 µl 1 x TE’ de çözülür. Toplam 20 µg civarında DNA elde edilebilir.

Elde edilen bu DNA’lar kullanılıncaya kadar 100 µl TE buffer içerisinde -200C’de saklanmıştır.

3.11. PCR analizleri

PCR, DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlarda DNA üretilmesini ifade etmektedir. Bu üretim için 6-25 nükleotid uzunluğunda başlatıcı DNA’lar (primerler) gerekir. Reaksiyon ortamının pH’sını ve tuz konsantrasyonunu optimum hale getiren tampon çözelti, polimeraz enzimin ihtiyaç duyduğu MgSO4 ve DNA üretiminde kullanılmak üzere A, T, G, C nükleotidlerinin her birinden konulur. Polimeraz enzimi bu başlatıcı DNA nın bir kalıp DNA üzerine bağlanmasından sonra, onu bir uçtan uzatmaya başlar ve kalıp DNA’nın aynısını üretir. DNA üretim işlemi birbirini izleyen bir seri çok spesifik sıcaklık devrelerinden yapılmaktadır. Reaksiyonda önce 950C civarında bir sıcaklık kullanımıyla kalıp (hedef) DNA’nın çift sarmal yapısı açılarak hedef DNA’nın denatürasyonu sağlanıp DNA tek iplik haline getirilmektedir. Yapışma safhasında 30-600C arasında bir sıcaklıkta primerlerin kalıp DNA’ya bağlanması sağlanmaktadır. Son olarak da 720C’de polimerizasyon yani DNA üretimi yapılmaktadır. Bu üç devre duruma bağlı olarak defalarca (normalde 30-45 döngü) tekrarlanarak milyonlarca hedef DNA elde edilmektedir. (Sambrook ve ark., 1989). Çalışmada dayanıklı (NCEBR2) ve hassas (NC84173) ebeveynleri birbirinden moleküler olarak ayıran (polimorfik) 99 adet moleküler markör kullanılmıştır

3.12. Jel görüntüleme

Çalışmada PCR ürünlerini görüntüleyebilmek için örnekler hazırlanan %1’lik agaroz jellere yüklenmiştir. Agaroz jelde yeterli derecede açılım bulunmadığında elde edilen PCR ürünleri %3 ve %4’lük metafor agaroz jellere yüklenerek elektroforez işlemine tabii tutulmuştur.

Hazırlanan agaroz jellere yüklenen DNA’ları ayırmak için ortalama 70-80 Volt (V), metafor agaroz jellere yüklenen örnekleri ayırt etmek için ortalama 90-100 V elektrik akımı uygulanmıştır.

3.13. Moleküler Markörler

Çalışmada belirlediğimiz 5 adet RGA (Resistance Gene Analogs) markörü (Tablo 2), 70 adet SSR (Simple Sequence Repeats) markörü (Tablo 3), 23 adet CAPS/SNP (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence/ Single Nucleotide Polymorphism) markörü (Tablo 4) ve 1 adet INDEL (Insertion/Deletion) markörü (Tablo 5) kullanılmıştır.

Tablo 2. Ebeveynler arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan dayanıklılık gen anoloğu (RGA) markörleri.

Markörün adı Nükleotid sıralaması Anneling sıcaklığı RLRR Forward 5’-CGCAACCACTAGAGTAAC-3’ Reverse 5’-ACACTGGTCCATGAGGTT-3’ 50°C XLRR Forward 5’-CCGTTGGACAGGAAGGAG-3’ Reverse 5’-CCCATAGACCGGACTGTT-3’ 50°C CLRR Forward 5’-TTTTCGTGTTCAACGACG-3’ Reverse 5’-TAACGTCTATCGACTTCT-3’ 50°C PTOKİN1 5’-GCATTGGAACAAGGTGAA-3’ 50°C PTOKİN2 _{5’-AGGGGGACCACCACGTAG-3’} 50°C

RGA markörleri ebeveynler arasında dayanıklılık gen anaologlarının bulunup bulunmadığı ortaya koymak açısından kullanılan markörlerdir. Bitkiler RGA markörünü zaman içinde rekombinasyonlar, silinmeler ve mutasyonlarla kaybedebilir.

Tablo 3. NCEBR2 ve NC84173 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri.

Kromozom yeri

Marker

İsmi Nükleotid sıralaması

Annelin g sıcaklığ ı Position 1 SSR92 Forward 5’-AAGAAGAAGGATCGATCGAAGA-3’ Reverse 5'-TCATGACCACGATACTACATGTTTC-3' 50° C 0,00 cM 1 TOM196 Forward 5’-CCTCCAAATCCCAAAACTCT–3’ Reverse 5’-TGTTTCATCCACTATCACGA–3’ 45°C 1 SSR192 Forward 5'-ACAACATGGGAAGCACTTGA-3' Reverse 5'-ATTAAATTGGGCCATGGTGA-3' 50° C 31,50 cM 1 SSR308 Forward 5'-TTTCCCTGTTTCAGCCTTTG-3' Reverse 5'-GGCACGAGAATTTAGCCACT-3' 55° C 121,00 cM 1 SSR222 Forward 5'-TCTCATCTGGTGCTGCTGTT-3' Reverse 5'-TTCTTGGAGGACCCAGAAAC-3' 55°C 97,50 cM 1 TOM202 Forward 5’-TGGTCACCTTCAACTTTTATAC-3’ Reverse 5’-AAATGATAATGAAATGGAGTGA-3’ 50°C 1 SSR65 Forward 5’-GGCAGGAGATTGGTTGCTTA-3’ Reverse 5’-TTCCTCCTGTTTCATGCATTC-3’ 50C 159,00 1 SSR117 Forward 5'-AATTCACCTTTCTTCCGTCG-3' Reverse 5'-GCCCTCGAATCTGGTAGCTT-3' 50°C 138,00 _cM

Tablo 3 devam ediyor Kromozom

yeri Marker İsmi Nükleotid sıralaması Anneling sıcaklığı Position

2 SSR96 Forward 5'-GGGTTATCAATGATGCAATGG-3' Reverse 5'-CCTTTATGTCAGCCGGTGTT-3' 50°C 36,50 cM 2 SSR22 Forward 5′-GATCGGCAGTAGGTGCTCTC-3′ Reverse 5′-CAAGAAACACCCATATCCGC-3′ 60°C 99,00 cM 2 SSR51 Forward 5'-CTACCCTGGTCTTGGTGGAA-3' Reverse 5'-AAAGGATGCTCTAGCTTCTCCA-3' 50°C 39,50 cM 2 SSR32 Forward 5'-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3' Reverse 5'-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3' 50°C 78,00 cM 2 SSR356 Forward 5''-ACCATCGAGGCTGCATAAAG-3' Reverse 5'-AACCATCCACTGCCTCAATC-3' 55°C 44,00 cM 2 SSR605 Forward 5'-TGGCCGGCTTCTAGAAATAA-3' Reverse 5'V-TGAAATCACCCGTGACCTTT-3' 55°C 48,50 cM 2 SSR349 Forward 5'-GAGTGATCATCCATCCTCTCA-3' Reverse 5'-GGAAGAGACTTTGGACTAAGGGA-3' 55°C 47,50 cM 3 SSR231 Forward 5'-TGCCAATCCACTCAGACAAA-3' Reverse 5'-TGGATTCACCAAGGCTTCTT-3' 50°C 75,40 cM 3 SSR27 Forward 5'-CCCAAATCAAGGTTTGTGGT-3' Reverse 5'-TCAGATGCCACCACTCTCAG-3' 50°C 169,00 cM 3 SSR22 Forward 5′-GATCGGCAGTAGGTGCTCTC-3′ Reverse 5′-CAAGAAACACCCATATCCGC-3′ 60°C 99,00 cM 3 SSR86 Forward 5’-AGGGCAACAAATCCCTCTTT-3’ Reverse 5’-GGAGACGAGGCTGCTTACAC-3’ 50°C 54,00 cM 3 SSRB50753 Forward 5’TGCAACATCTTAGCTCCAAGCTAGG-3’ Reverse 5’CATGGACCAAGAATATGGAAACTGC 3’ 55°C 72,60 cM 3 SSR22 Forward 5′-GATCGGCAGTAGGTGCTCTC-3′ Reverse 5′-CAAGAAACACCCATATCCGC-3′ 60°C 99,00 cM

Tablo 3 Devam ediyor Kromozom

yeri Marker İsmi Nükleotid sıralaması Anneling sıcaklığı Position

4 SSR638 Forward 5’–TGTTGGTTGGAGAAACTCCC-3’ Reverse 5’-AGGCATTTAAACCAATAGGTAGC-3’ 50°C 60°C 58,00 cM 4 TOM184 Forward 5’-CAACCCCTCTCCTATTCT-3’ Reverse 5’- CTGCTTTGTCGAGTTTGAA-3’ 45°C 25,30 cM 4 SSR214 Forward 5’-AAATTCCCAACACTTGCCAC-3’ Reverse 5’-CCCACCACTATCCAAACCC-3’ 50°C 95,00 cM 4 TOM210 Forward 5’-CGTTGGATTACTGAGAGGTTTA-3’ Reverse 5’- ACAAAAATTCACCCACATCG-3’ 45°C 25,30 cM 5 SSR49 Forward 5’-TCTCAAAGTCGTTCCTTCTTGA-3’ Reverse 5’-GGAAGAGAAACGCGGACATA-3’ 50°C 106,00 _cM 5 SSRB18031 Forward 5’AGACTCAGTCCCGAACAAGTTGAAG-3’ Reverse 5’ACATTACACTAAACCCCCAATTGCC-3' 55°C 119,00cM 5 SSR13 Forward 5’-GGGTCACATACACTCATACTAAGGA-3’ Reverse 5’-CAAATCGCGACATGTGTAAGA -3’ 50°C 27,00cM 6 SSR350 Forward 5’-GGAATAACCTCTAACTGCGGG-3’ Reverse 5’-CGATGCCTTCATTTGGACTT-3’ 55°C 101,00cM 6 SSR47 Forward 5’-TCCTCAAGAAATGAAGCTCTGA-3’ Reverse 5’-CCTTGGAGATAACAACCACAA-3’ 50°C 6,50 cM 6 SSR578 Forward 5’-ATTCCCAGCACAACCAGACT-3’ Reverse 5’-GTTGGTGGATGAAATTTGTG-3 55°C 44,00 cM 7 SSR45 Forward 5’-TGTATCCTGGTGGACCAATG -3’ Reverse 5’-TCCAAGTATCAGGCACACCA -3’ 50°C 60,00 cM 7 SSR285 Forward 5’-AGTGGCTCTCACCTACTGCG-3’ Reverse 5’-CAATTCTCAGGCATGAAACG-3’ 55 °C 2,00 cM 7 SSR241 Forward 5’-TCAACAGCATAGTGGAGGAGG-3’ Reverse 5’-TCCTCGGTAATTGATCCACC-3’ 55°C 0,00cM 8 SSR38 Forward 5’-GTTTCTATAGCTGAAACTCAACCTG -3’ Reverse 5’-GGGTTCATCAAATCTACCATCA-3’ 50°C 55,00 cM

Kromozom

yeri Marker İsmi Nükleotid sıralaması

Anneling sıcaklığı Position 8 SSR594 Forward 5′-TTCGTTGAAGAAGATGATGGTC-3′ Reverse 5′-CAAAGAGAACAAGCATCCAAGA-3′ 55°C 55,00 cM 8 SSR335 Forward 5′-CCTCTCCATTCTGTGGTGGT-3′ Reverse 5′-AACCGTCCTCGATTTCACAC-3′ 55°C 49,70 cM 8 SSR63 Forward 5′-CCACAAACAATTCCATCTCA-3′ Reverse 5′-GCTTCCGCCATACTGATACG-3′ 40°C 61,00 cM 8 SSRB105694 Forward 5’-AAAGCCAAAGTGGAAGAACTCAAGG-3’ Reverse 5’-CTCGTAAAACGTTCATCAATCTCGC -3’ 53°C 87,00cM 9 SSR73 Forward 5’-TGGGAAGATCCTGATGATGG–3’ Reverse 5’-TTCCCTTTCCTCTGGACTCA–3’ 45°C 32,00 cM 9 SSR69 Forward 5’-TTGGCTGGATTATTCCTGTTG-3’ Reverse 5’-GCATTTGATAGAAGGCCAGC-3’ 50°C 24,90 cM 9 TOM236 Forward 5’-GTTTTTTCAACATCAAAGAGCT-3’ Reverse 5’-GGATAGGTTTCGTTAGTGAACT-3’ 45°C 50°C 9 SSR70 Forward 5’-TTTAGGGTGTCTGTGGGTCC-3’ Reverse 5’-GGAGTGCGCAGAGGATAGAG-3’ 50°C 42,00 cM 9 SSR599 Forward 5’-GGATTTCTCATGGAGAATCAGTC–3’ Reverse 5’-TCCCTTGATCTTGATGATGTTG –3 55°C 109,00 cM 9 SS383 Forward 5’-ATTGTACAAAGACCCGTGGC-3’ Reverse 5’-GTTGCACACTGGATCAATGC-3’ 50°C 57,30 cM 9 SSR333 Forward 5’-GTTCCCGCTTGAGAAACAAC–3’ Reverse 5’-CCAATGCTGGGACAGAAGAT-3’ 50°C ? 10 SSR159 Forward primer (5'-3') ACAACAAAGGCAGCTGGTTC_–3’ Reverse primer (5'-3') GCTTCCGACAGCCCATATAA_–3’ 50°C 46,00 cM 10 SSR318 Forward 5’-GCAGAGGATATTGCATTCGC–3’ Reverse 5’-CAAACCGAACTCATCAAGGG-3’ 50°C 31,00 cM 10 SSR74 Forward 5’–ACTCACCATGGCTGCTTCTT-3’ Reverse 5’ –TTTCTTGAAGGGTCTTTCCC-3’ 55°C 74,00 cM

Tablo 3 Devam ediyor. Kromozom

yeri Marker İsmi Nükleotid sıralaması Anneling sıcaklığı Position

10 SSR318 Forward 5’-GCAGAGGATATTGCATTCGC–3’ Reverse 5’–CAAACCGAACTCATCAAGGG-3’ 55°C 34,50 cM 10 SSR34 Forward 5’-TTCGGATAAAGCAATCCACC–3’ Reverse 5’-TCGATTGTGTACCAACGTCC–3’ 50°C 45°C 25,30 cM 10 SSR596 Forward 5’– TTCGGATAAAGCAATCCACC-3’ Reverse 5’-TCGATTGTGTACCAACGTCC–3’ 55°C 25,70 cM 10 SSR248 Forward 5’-GCATTCGCTGTAGCTCGTTT-3’ Reverse 5’-GAGCTTCATCATAGTAACG-3’ 50°C 35,00 cM 10 SSR223 Forward 5’-TGGCTGCCTCTTCTCTGTTT-3’ Reverse 5’-TTTCTTGAAGGGTCTTTCCC-3’ 50°C 80,40 cM 10 SSR479 Forward 5’-TGTAAGAGTGTCTGCCTGCAC–3’ Reverse 5’-ATGGGTTCGGGTTAGCTCTT –3’ 52°C 86,00 cM 11 SSR136 Forward 5’-GAAACCGCCTCTTTCACTTG–3’ Reverse 5’-CAGCAATGATTCCAGCGATA –3’ 50°C 11,00cM 11 SSR67 Forward 5’-GCACGAGACCAAGCAGATTA–3’ Reverse 5’-GGGCCTTTCCTCCAGTAGAC –3’ 50°C 24,00cM 11 TOM 144 Forward 5’-CTGTTTACTTCAAGAAGGCTG–3’ Reverse 5’-ACTTTAACTTTATTATTGCGACG-3’ 45°C 12 SSR345 Forward 5’-AAgCCAAgCTCgAACCTgTA-3’ Reverse 5’-ATCCATgCTgTCgCTTTCAT-3’ 60°C 72,50 cM 12 SSR44 Forward 5’-TCATCTGCAATTCATGGCTC–3’ Reverse 5’-AGGTCAAGGATGTGCTTCCC –3’ 45°C 60,00 cM ? SSR21 Forward 5′-GGGTCTCAAAGAAATGGCAC-3′ Reverse 5′-ACGGATCTCAGCCTCAGAAA-3′ 50°C ? SSR33 Forward 5′-GTCTTTACACAATCTCTCACTTGG-3′ Reverse 5′-CTGGTCACTGAACTGCCAGA-3′ 55°C ? SSR424 Forward 5′-AAGGACTTGTGCTGGATTGG-3′ Reverse 5′-TAGTACGCCATGGACCTTCC-3′ 55°C

Tablo 3 Devam ediyor. Kromozom

yeri Marker İsmi Nükleotid sıralaması Anneling sıcaklığı Position

? SSR41 Forward 5′-TCTCTGAAACGAGACAGAGGAA-3′ Reverse 5′-AGTACGTCTCCCATGGCTGT-3′ 55°C ? SSR100 Forward 5′-GCAAGCCTGTGACAATTGAG-3′ Reverse 5′-GTCGTCGTGTTCCGTCATAA-3′ 50°C ? SSR118 Forward 5′-AGTGGTTCCACTTGTTTAGACC-3′ Reverse 5′-GAATCCGATCTGGGTCAGTG-3′ 55°C ? SSR130 Forward 5′-AAACCCTCAACACCATCACC-3′ Reverse 5′-CATCATTTCTTTCATGGCTCC-3′ 50°C ? SSR133 Forward 5′-CCGTTCTTGGTGGATTAGGA-3′ Reverse 5′-AAAGAGTGAAATGTGCACAGAC-3′ 50°C ? SSR142 Forward 5′-CGAACAGATGCATAGATGAAGA-3′ Reverse 5′-ACGGTGTGGACTCATGTGAA-3′ 50°C ? SSR254 Forward 5′-CCATTGGATAGCGTCTCCC-3′ Reverse 5′-ATTGTGCATGTTGATACCCA-3′ 57°C

SSR markörleri PCR amplifikasyonu sonucunda ebeveynler arasındaki polimorfizmi kolayca ortaya koyması, enzimlerle ayrıca kesmeye ihtiyaç duyulmaması nedeniyle hızlı güvenilir sonuçlar vermektedir. SSR markörlerin maliyeti ekstra kesme işlemine ihtiyaç duyulmadığı için daha düşüktür. Çalışmamızda yukarıda saydığımız kolaylıklarından dolayı SSR markörler öncelikle tercih edilmiştir.

Tablo 4. Dayanıklı NCEBR2 ve hassas NC84173 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan CAPS markörleri.

Kromozom

Marker Ismi Nükleotid Sıralaması

Anneali ng Sıcaklığı Resriksiyo n Enzimi Haritalama yeri 1- U223116 Forward 5’TCACTTCAATCTTCACTTCCTCCTCC-3’ Reverse 5’TGTCCAGTTTCCTTAAACTTCACATTC-3’ 53°C DpnII 91,70 cM 1 C2_At4g34700 Forward 5’TGAAGCATCCTACAATAAGTGGCG-3 Reverse 5’ TCTGTTGAACTTGGAACCACCAGG -3 55°C - 160,00 cM 1- C2_At4g34190 Forward 5’AGTAATTTGGATGTATGGCTTGGTCG -3 Reverse 5’ACCAATGCAGTGACTGCCAATGC -3 55°C AluI 152,00 cM 1- C2_At3g19370 Forward 5’AGATCGGCCAAGGCAAAGTTATC-3 Reverse 5’TGCATGCCCAGTACTCCTTCATCC-3 55°C HaeIII 137,20 cM 1- C2-At2g21100 Forward 5’ ACCTATTTATATGGGTGGCTCAAGC 3’ Reverse 5’AACGATAGCCATCTCACGAACCG 3’ 55°C Tsp509I COS II Marker Tomato 2- C2_At5g40530 Forward 5’ACATGATCCTTCAGTCATTGCTTGTG-3’ Reverse 5’ AGCTTGGATAATCGGTTCCCATC-3’ 55°C DraI 139,00 cM 2- C2_At5g67370 Forward 5’TGAAACCAGTCATTAAAATGCTGAAG-3’ Reverse 5’ AGTACTGTCCACCGGCCAATGC-3’ 55°C TaqI 129,00 cM 6 – TG279* Forward 5’ GTAGAATCCGCTGTCGCTTC 3’ Reverse 5’ TATGTCCACGAAGTCGGTGA 3’ 55°C _{Dra I 73,00 cM} 8- C2_At4g21800 Forward 5’ TTCTCCATCGACTTGTTTGCCACAC –3’ Reverse 5’ TGGGAAAAGTAGATGCAAAAGCTTC–3’ 58°C - 76,50 cM 8- C2_At1g63770 Forward 5’AGGTGGAAACGTTATGATGAAAC_–3’ Reverse 5’ATGCGATTTCAAACACATTCTCTG –3’ 50°C HinfI 72,50 cM 8- C2_At1g63980 Forward 5’ AGAAAGTCTGCCGCCTTCCG–3’ Reverse 5’ TAGGCCTTCTCCTTCTTCCCATC–3’ 50°C HinfI 77,00 cM 8- C2_At5g41350 Forward 5’ ACCTCCAATGCCAATGCCTTATG–3’ Reverse 5’ ATGAAACTGATGCTCGCATTTTG–3’ 55°C TaqI 75,50 cM

Kromozom

Marker Ismi Nükleotid Sıralaması

Anneali ng Sıcaklığı Resriksiy on Enzimi Haritalama yeri 9- C2_At2g37240 Forward 5’TCCTTTGTCGCATAAGAGCTGATTATC–3’ Reverse 5’ACAAGTGCGACTCCTGCTGCATCC–3’ 55°C Hpy188I 1,00 cM 9- C2_At2g37025 Forward 5’AACATCACAGGCTCTGGACTGTTTC–3’ Reverse 5’ATGCATGTTCGCCAGTTCACTGAC–3’ 53°C - 15,30 cM 9- C2_At2g41680 Forward 5’TCTGTGGAAGGTGTATTTGCAGC–3’ Reverse 5’AGTGATGGCTTGCCTCCATTC–3’ 55°C ApoI 15,50 cM 9- C2_At2g32600 Forward 5’TGAAGGGAATTACTTGGCTCACAC–3’ Reverse 5’TGTTTTGTTTCCGGATCAAATTGC–3’ 55°C HinfI 16,50 cM 9- C2_At3g09920 Forward 5’AAGCAATCATAAAGGGTCACAGGAG–3’ Reverse 5’AGACCATTGGGCAATAATCTTTCC–3’ 55°C - 17,00 cM 9- C2_At3g09925 Forward 5’ATTGAAGCCTCAGATGGAATGGATG–3’ Reverse 5’ACATGGGAGTTGTGTAGTAGAAAGGG–3’ 55°C - 25,00 cM LEOH57 Forward 5’-TGGTCAACAGATGGTGAAGAA–3’ Reverse 5’-GGATCCCATGCCAATGAATA-3’ 55°C BstUI RX-3L1 Forward 5’-CTCCGAGCGAAGAGTCTAGAGTC-3’ Reverse 5’GAAGGCAAAAGGAAAAGGAGAAGGATGG-3’ 55°C BsrB I LEOH18 Forward 5’-AGGCTGGTGCTTCATCATCT-3’ Reverse 5’GGAACCCTGCATTGTTCTTG–3’ 55°C BsaJ I LEOH19 Forward 5’AAGGCTCAGAAAGGGTCCAT–3’ Reverse 5’TGAGTTCATCAAACACATCACACA–3’ 55°C BsaB I LEOH23.3 Forward 5’CTATGCGTTTGTCGGTCGT–3’ Reverse 5’CAAGGTAGTTGAAGGTATGACCA–3’ 55°C Tsp509 I

Indel markörleri domates sekanslarına dayalı markörler olup nükleik asitlerin bu sekanslara eklenmesi (insertion) veya çıkarılması (deletion) ile çalışmaktadır. Son yıllarda nükleik asit sıralarındaki bu ekleme ve çıkarmaları hedefleyen özel markörler tasarlanarak ebeveynler arasında polimorfizmi ortaya koyan markörler oluşturulmuştur. Tablo 5. Dayanıklı NCEBR2 ve hassas NC84173 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan INDEL markörü

Markörün adı Nükleotid sıralaması Anneling _{sıcaklığı} CT10737 I Forward 5’-CCACTCCTGGGACTCAAATC-3’ Reverse 5’-TGGACCCACAGGTAATGAGG-3’ 50°C 3.14. Restriksiyon enzimleri

Çalışmada kullandığımız Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markörler ebeveynlerden aynı büyüklükte DNA parçaları amplifike etmektedir. Aynı büyüklükte olan DNA parçalarının bakterilerden elde edilen restriksiyon enzimleriyle kesilmesi sonucunda ebeveynler arasında polimorfizm görülebilmektedir. Aynı büyüklükte amplifike olan DNA parçalarında restriksiyon enzimleri bu parçaları sahip olduğu kesim bölgelerine göre farklı büyüklüklerde keserek polimorfizmin oluşmasını sağlamaktadırlar. Çalışmada 23 adet CAPS markör kullanılmıştır. Elde edilen DNA parçalarındaki polimorfizmi ortaya koyabilmek için 20 adet restriksiyon enzimi kullanılmıştır (Tablo 6). Kullanılan CAPS markörleri ile elde edilen amplifikasyon ürünlerinde kesme işlemi restriksiyon enzimini üreten firma ve Sambrook ve ark., (1989) tavsiye ettiği konsantrasyonda hazırlanmıştır (Tablo 1). Kesim işleminin tamamlanmasından sonra örnekler %1,5 agaroz jelde 80 V elektrik akımında koşturulmuştur.

Toplam 15 µl lik solusyon içerisine 5 µl amplifike edilmiş DNA konulmuş ve restriksiyon enziminin konsantrasyonuna göre ortama buffer, dH2O ve enzim ilave edilmiştir.

Tablo 6. Ebevynler arasındaki polimorfizmi bulmak için çalışmada kullanılan enzimler ve kestiği bölgeler.

Enzimin Adı Enzim Bufferı Kesim Bölgesi Kesme Sıcaklığı

1. TaqI Taq I+ BSA 5'-T^C G A-3'

3'-A G C^T-5' 65°C

2. HhaI Buffer M 5'-G C G^C-3'

3'-C^G C G-5' 37°C

3. HaeIII Buffer M 5'-G G^C C-3'

3'-C C^G G-5' 37°C

4. HinfI Buffer H 5'-G^A N T C-3'

3'-C T N A^G-5' 37°C

5. MspI Tango 5'-C^C G G-3'

3'-G G C^C-5' 37°C

6. Bme1390 Buffer 0 5'-C C^N G G-3'

3'-G G N^C C-5' 37°C

7. RsaI Tango 5'-G T^A C-3'

3'-C A^T G-5' 37°C

8. CfrI Tango 5'-Py^G G C C Pu-3'

3'-Pu C C G G^Py-5' 37°C

9. TasI Buffer B 5'-^A A T T -3'

3'- T T A A^-5' 65°C

10. DpnII Dpn II 5'-^G A T C -3'

3'- C T A G^-5' 37°C

11. Bsh1236 I Buffer R 5'-C G^C G-3'

3'-G C^G C-5' 37°C

12. AluI Tango 5'-A G^C T-3'

3'-T C^G A-5' 37°C

13. Mn Buffer G 5'-C C T.C N7^-3'

3'-G G A G N6^-5' 37°C

14. Tru1I Buffer R 5'-T^T A A-3'

3'-A A T^T-5' 65°C

15. Dde Buffer D 5'-C^T N A G-3'

3'-G A N T ^C-5' 37°C

16. BsaJ I Tango 5'-C^C N N G G-3'

3'-G G N N C^C-5' 55°C

17. BsaB I (Bse8 I) Buffer V2 5'-G A T N N^N N A T C-3'

3'-C T A N N^N N T A G-5' 55°C 18. Tsp509 I (Sse9I) Buffer V5 5'-^A A T T -3'

3'- T T A A^-5' 55°C

19. BstU I ( Bst FN) Buffer V5 5'-C G^C G-3'

3'-G C^G C-5' 55°C

20. BsrB I Buffer V5 5'-C C G^C T C-3'

3.15. Genel Solüsyonlar

Çalışmada jel eletroforezi, DNA’nın jele yüklenmesi, DNA izolasyonu ve diğer genel çalışmalar için kullanılan solüsyonlar Sambrook ve ark. (1989)’nın belirttiği gibi hazırlanmıştır. En çok kullanılan solüsyonlar aşağıda verilmiştir.

5X TBE Buffer Tris-Base pH:8.0 54,0 g l-1

Boric Asid 27,5 g l-1

0.5 M EDTA pH:8.0 20 ml l-1

6X Loading dye Bromophenol blue %0,25

Xylene Cyanol %0,25

Ficoll (Type 400 Pharmacia) %15

10X TE Buffer Tris-HCl pH:8.0 12,1 g l-1

Na2EDTA.2 H2O pH:8.0 3,7 g l-1

0,5 M EDTA pH:8.00 Na2EDTA.2 H2O pH:8.0 186,1 g l-1

NaOH 20,0 g l-1