G E N E T I C A L T E R A T I O N S O F A N D R O G E N R E C E P T O R G E N E A N D P 5 3 B Y F L U O R E S C E N C E , I N S I T U H Y B R I D I Z A T I O N A N D I M M U N O D E T E C T I O N O F B C L - 2 I N P R O S T A T I C I N T R A E P I T H E L I A L N E O P L A S I A A N D C A R C I N O M A H a n d a n K a y a , M . D . * / İ l t e r G ü n e y , M . D . * * / Ç i ğ d e m Ç e l i k e l , M . D . * L e v e n t T ü r k e r i , M . D . * * * / A t ı f A k d a ş , M . D . * * * / S e v g i K ü l l ü , M . D . * * D e p a r tm e n t o f P a th o lo g y , S c h o o l o f M e d ic in e , M a r m a r a U n iv e rs ity , Is ta n b u l, T u rk e y . * * D e p a r t m e n t o f M e d ic a l B io lo g y , S c h o o l o f M e d ic in e , M a r m a r a U n iv e rs ity , Is ta n b u l, T u rk e y . * * * D e p a r tm e n t o f U ro lo g y , S c h o o l o f M e d ic in e , M a r m a ra U n iv e rs ity , Is ta n b u l, T u rk e y . A B S T R A C T O b j e c t i v e : p 5 3 a n d a n d r o g e n r e c e p t o r g e n e c h a n g e s a n d b c l - 2 e x p r e s s i o n i n p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a ( P I N ) a n d a d e n o c a r c i n o m a w e r e s t u d i e d . T h e g e n e t i c a s s o c i a t i o n s o f P I N a n d a d e n o c a r c i n o m a a s d e t e c t e d b y F I S H a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w e r e d i s c u s s e d . M a t e r i a l a n d M e t h o d : T h e s t u d y g r o u p c o n s i s t e d o f 1 8 p r o s t a t e c a n c e r c a s e s t r e a t e d b y r a d i c a l p r o s t a t e c t o m y . T h e p 5 3 a n d a n d r o g e n r e c e p t o r g e n e c h a n g e s a t c h r o m o s o m a l l e v e l w e r e s t u d i e d u s i n g t h e F I S H t e c h n i q u e . A l s o , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w a s u s e d t o s e a r c h f o r b c l - 2 e x p r e s s i o n . R e s u l t s : O f t h e 1 8 c a s e s s t u d i e d b y F I S H , it w a s f o u n d t h a t i n b e n i g n a r e a s A R g e n e a m p l i f i c a t i o n w a s 7 8 % ( 1 4 / 1 8 ) a n d 1 0 0 % d i s o m y w i t h w i l d t y p e p 5 3 , i n P I N a r e a s A R g e n e a m p l i f i c a t i o n w a s 3 3 % ( 6 / 1 8 ) , p 5 3 a m p l i f i c a t i o n 2 8 % ( 5 / 1 8 ) , in c a r c i n o m a s A R g e n e a m p l i f i c a t i o n w a s 3 9 % ( 7 / 1 8 ) , a n d p 5 3 a m p l i f i c a t i o n 2 8 % ( 5 / 1 8 ) . W e o b s e r v e d t h e b c l - 2 i m m u n e x p r e s s i o n m a i n l y i n b a s a l d u c t a l c e l l s i n b e n i g n , P I N a n d c a r c i n o m a a r e a s . C o n c l u s i o n : T h e r e s u l t s o f o u r s t u d y s u g g e s t t h a t A R g e n e a m p l i f i c a t i o n i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n b e n i g n a r e a s c o m p a r e d t o c a r c i n o m a t o u s f o c i a n d t h a t t h e p r e s e n c e o f A R g e n e a m p l i f i c a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h t h e t u m o u r s t a g e . P I N i s t h e m o s t l i k e l y p r e c u r s o r o f p r o s t a t i c c a r c i n o m a . K e y W o r d s : A n d r o g e n r e c e p t o r g e n e , p 5 3 , F I S H , P r o s t a t e c a r c i n o m a I N T R O D U C T I O N P r o s t a t e c a n c e r i s t h e m o s t c o m m o n c a n c e r a m o n g s t m e n a n d s e c o n d o n l y t o l u n g c a n c e r a s a c a u s e o f d e a t h f r o m c a n c e r ( 1 ) . T h e G l e a s o n h i s t o l o g i c g r a d e i s a n i m p o r t a n t p r o g n o s t i c a t o r c l o s e l y t i e d t o t u m o u r v o l u m e , c a p s u l a r p e n e t r a t i o n , s e m i n a l v e s i c l e i n v o l v e m e n t , l y m p h n o d e m e t a s t a s e s , c l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c s t a g e a n d p a t i e n t s u r v i v a l ( 2 ) . ’ P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a ( P I N ) i s a m i c r o s c o p i c f i n d i n g , a n d h i g h g r a d e P I N i s c o n s i d e r e d t o b e t h e m o s t l i k e l y p r e c u r s o r o f p r o s t a t e c a n c e r ( 3 , 4 ) . T o d a y t h e a s s e s s m e n t o f t h e m a l i g n a n t p o t e n t i a l o f p r o s t a t i c c a n c e r i s m a i n l y b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l g r a d i n g , s t a g i n g a n d e v a l u a t i o n o f ( A c c e p t e d 6 J u n e , 2 0 0 1 ) M a r m a r a M e d ic a l J o u r n a l 2 0 0 1 ; 1 4 ( 4 ) : 2 0 7 - 2 1 2
Correspondance to: Handan Kaya, M.D, - Department of Pathology, Marmara University Hospital 81190 Altunizade - istanbul, TURKEY
t h e t u m o u r v o l u m e . A l t h o u g h s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t u m o u r b e h a v i o u r c a n b e s h o w n b e t w e e n g r o u p s o f p a t i e n t s c o n c e r n i n g t h e s e v a r i o u s f a c t o r s , t h e i r r e l i a b i l i t y a s p r e d i c t o r s o f t h e c o u r s e o f a n y i n d i v i d u a l t u m o u r i s l i m i t e d . I d e n t i f i c a t i o n o f m a r k e r s t h a t a s s i s t i n f o r e c a s t i n g t h e b e h a v i o u r o f a s p e c i f i c p a t i e n t ’s t u m o u r w o u l d b e v e r y u s e f u l . A n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) p l a y s a c e n t r a l r o l e i n m e d i a t i n g t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f a n d r o g e n s . M u c h r e s e a r c h a c t i v i t y h a s b e e n f o c u s e d o n s e a r c h i n g f o r m o l e c u l a r d e f e c t s o f t h e A R g e n e i n h o r m o n e r e f r a c t o r y p r o s t a t e c a n c e r ( 1 ) . B c l - 2 f u n c t i o n s a s a c e l l d e a t h s u p p r e s s o r . It p r o v i d e d t h e f i r s t c l u e t h a t a l t e r e d g e n e e x p r e s s i o n c o u l d e n h a n c e c e l l s u r v i v a l w i t h o u t a f f e c t i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n ( 5 ) . T h e e x p r e s s i o n o f B c l - 2 i n h o r m o n a l r e s p o n s i v e o r g a n s i s c o m p l e x . I n a d u l t p r o s t a t e , B c l - 2 e x p r e s s i o n a p p e a r s t o b e i n v e r s e l y r e l a t e d t o a n d r o g e n s t i m u l a t i o n , b e i n g m a i n l y r e s t r i c t e d t o b a s a l d u c t a l c e l l s t h a t a r e r e s i s t a n t t o a n d r o g e n s t i m u l a t i o n a n d a n d r o g e n r e g u l a t e d a p o p t o s i s ( 5 ) . S e c r e t o r y c e l l s s e n s i t i v e t o a n d r o g e n t r e a t m e n t a r e l a r g e l y B c l - 2 n e g a t i v e ( 6 , 7 ) . M u t a t i o n s i n t h e P 5 3 g e n e r e p r e s e n t t h e m o s t c o m m o n g e n e t i c c h a n g e s i n h u m a n m a l i g n a n c i e s . T h e P 5 3 g e n e i s l o c a t e d o n c h r o m o s o m a l l o c u s 1 7 p 1 3 a n d e n c o d e s f o r a 5 3 k D n u c l e a r p h o s p h o p r o t e i n t h a t f u n c t i o n s a s a c e l l - c y c l e r e g u l a t i o n p r o t e i n a n d i n h i b i t s t h e p r o g r e s s i o n o f g e n e t i c a l l y d a m a g e d c e l l s t h r o u g h t h e S - p h a s e ( 8 ) . Q u a n t i t a t i v e D N A a n a l y s i s b y f l o w o r i m a g e c y t o m e t r y h a s b e e n r e p o r t e d t o o f f e r a d d i t i o n a l p r o g n o s t i c i n f o r m a t i o n f o r p r o s t a t i c c a r c i n o m a b u t f l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ( F I S H ) i s f o u n d t o b e m o r e s e n s i t i v e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f g e n e a n d c h r o m o s o m e d o s a g e i n s o l i d t u m o u r s ( 9 , 1 0 ) . F u r t h e r m o r e , F I S H a l l o w s p r e c i s e h i s t o p a t h o l o g i c c o r r e l a t i o n o f n o r m a l e p i t h e l i u m , p r e m a l i g n a n t l e s i o n s a n d c a r c i n o m a w i t h i n a s i n g l e s e c t i o n , i n c l u d i n g t h e e v a l u a t i o n o f i n t r a t u m o r a l h e t e r o g e n i t y . W e s t u d i e d p 5 3 a n d a n d r o g e n r e c e p t o r g e n e c h a n g e s a t c h r o m o s o m a l l e v e l w i t h t h e F I S H t e c h n i q u e . W e a l s o s e a r c h e d f o r b c l - 2 e x p r e s s i o n b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . W e d i s c u s s e d t h e g e n e t i c a s s o c i a t i o n s o f P I N a n d a d e n o c a r c i n o m a d e t e c t e d b y F I S H a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . M A T E R I A L A N D M E T H O D T h e s t u d y g r o u p c o n s i s t e d o f 1 8 p r o s t a t e c a n c e r c a s e s t r e a t e d b y r a d i c a l p r o s t a t e c t o m y . R e p r e s e n t a t i v e f o r m a l i n - f i x e d , p a r a f f i n - e m b e d d e d t u m o u r b l o c k s w e r e s e l e c t e d b y h i s t o p a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f h a e m o t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n e d s l i d e s . W e s e l e c t e d a r e p r e s e n t a t i v e b l o c k f o r e a c h c a s e w h i c h h a d h i g h g r a d e P I N a n d b e n i g n a r e a s b e s i d e s t h e c a r c i n o m a t o u s f o c i o n t h e s a m e s e c t i o n a n d e a c h f o c i w e r e m a p p e d d i r e c t l y o n e a c h s l i d e . T h e c l i n i c a l d a t a w e r e c o l l e c t e d f r o m p a t i e n t r e c o r d s . T u m o u r s w e r e s t a g e d a c c o r d i n g t o T N M ( 1 9 9 9 ) c l a s s i f i c a t i o n a n d h i s t o l o g i c a l g r a d i n g w a s d o n e a c c o r d i n g t o W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n s ( W H O ) r e c o m m e n d a t i o n s . T h e c l i n i c a l d a t a a r e p r e s e n t e d i n T a b l e I. D N A P r o b e s T h e f o l l o w i n g l o c u s s p e c i f i c i d e n t i f i e r ( L S I ) D N A f l u o r o p h o r e - l a b e l e d p r o b e s w e r e u s e d f o r t h e p r o s t a t e c t o m y s p e c i m e n s : L S I A n d r o g e n R e c e p t o r S p e c t r u m O r a n g e ( V y s i s , L o t / C h . B : 2 2 3 8 9 ) , L S I p 5 3 S p e c t r u m O r a n g e ( V y s i s , L o t / C h . B : 2 5 0 7 6 ) . L S I / W C P h y b r i d i z a t i o n ( D e x t r a n s u l p h a t e , f o r m a m i d e , S S C ) . F l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n W e p e r f o r m e d f l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o n 5 p m . t h i n s e r i a l s e c t i o n s o f t h e s e l e c t e d c a s e s . T h e s e c t i o n s w e r e d e - w a x e d i n x y l e n e ( 2 x 5 m i n ) , r i n s e d i n 1 0 0 % e t h a n o l ( 2 x 5 m i n ) a n d a i r d r i e d . P r i o r t o F I S H , t h e s l i d e s w e r e p l a c e d i n a c o p l i n p l a s t i c j a r f i l l e d w i t h P B S f o r 5 m i n a n d d e h y d r a t e d i n e t h a n o l s ( 7 0 % , 8 0 % , 9 0 % ) . A f t e r a i r d r y i n g , t h e s e c t i o n s w e r e p r e t r e a t e d b y 2 X s t a n d a r d s a l i n e c i t r a t e ( S S C ) a t 3 7 ° C f o r 3 0 m i n u t e s , f o l l o w e d b y 0 . 0 1 N H C L + 1 0 0 p l p e p s i n t r e a t m e n t a t 3 7 ° C f o r 1 0 m i n . A f t e r w a r d s , 2 X S S C t r e a t m e n t w a s a p p l i e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 5 m i n . S u b s e q u e n t l y , s e c t i o n s w e r e p l a c e d i n a c o p l i n p l a s t i c j a r f i l l e d w i t h d e n a t u r a t i o n s o l u t i o n ( 7 0 % f o r m a m i d e / 2 X S S C ) a t 7 3 ° C f o r 5 m i n , f o l l o w e d b y d e h y d r a t i o n i n e t h a n o l ( 7 0 % , 8 0 % , 9 0 % ) . P r o b e m i x t u r e w a s p r e p a r e d a s f o l l o w s : 7 p l L S I h y b r i d i z a t i o n b u f f e r + 1 p l p r o b e + 2 p l p u r i f i e d H 2 0 . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n , t h e p r o b e m i x t u r e t u b e w a s c e n t r i f u g e d , t h e n p l a c e d i n a 7 3 ° C w a t e r b a t h f o r 5 m i n . a n d w a r m e d t o 4 5 ° C . P r o b e m i x t u r e w a s a p p l i e d t o t h e t a r g e t a r e a o n s l i d e s , t h e y w e r e t h e n p l a c e d i n a p r e - w a r m e d a n d
Genetic alterations of AR gene and P53 by fluorescence
T a b l e I.: C lin ic a l a n d h is to p a th o lo g ic fe a tu re s o f th e c a s e s in c a rc in o m a to u s , in tra e p ith e lia l n e o p la s tic a n d b e n ig n a re a s
SM: Invasion in surgical margin, VS: Invasion in Vesicula Seminalis GS: Gleason Score D: Diploid, A: Aneuploid
AR: Androgen Receptor Gene, P53: p53 wild type, Ca: Carcinoma PIN: Prostatic intraepithelial neoplasia B: Benign
bcl-2: bcl-2 protein expression by immunohistochemistry Rec: Recurrence
h u m i d i f i e d c h a m b e r i n a 3 7 ° C i n c u b a t o r f o r 1 2 h o u r s . A f t e r h y b r i d i z a t i o n , t h e s l i d e s w e r e w a s h e d i n 0 . 4 X S S C / 0 . 3 % N P - 4 0 m i x t u r e f o r 2 m i n a n d t h e n i n 0 . 4 X S S C / 0 . 1 % N P - 4 0 a t 7 3 ° C f o r 2 s e c o n d s . T h e s l i d e s w e r e c o u n t e r s t a i n e d w i t h 4 , 6 d l a m l n d l n o - 2 - p h e n y l i n d o l e ( D A P I ) a n d t h e c o v e r s l i p w a s a p p l i e d . E v a l u a t i o n A n O l y m p u s B X 4 0 f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e w a s u s e d f o r s c o r i n g s i g n a l c o p y n u m b e r s f r o m a m i n i m u m o f 1 0 0 n u c l e i p e r h y b r i d i z a t i o n f o r e a c h p r o b e f r o m t h e p r e v i o u s l y m a p p e d c a r c i n o m a t o u s , P I N a n d b e n i g n f o c i . T h e n u m b e r o f e p i t h e l i a l n u c l e i c o n t a i n i n g z e r o , o n e , t w o , t h r e e , f o u r , f i v e a n d m o r e s i g n a l s w a s r e c o r d e d f o r e a c h p r o b e . T h e c r i t e r i a f o r F I S H a n o m a l i e s w e r e d e f i n e d a s p r e v i o u s l y e x p l a i n e d ( 1 1 ) . I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w a s p e r f o r m e d b y a p p l y i n g t h e B i o t i n S t r e p t e a v i d i n A m p l i f i e d s y s t e m o n t h e s e r i a l s e c t i o n s o f t h e c a s e s . T h e b c l - 2 m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( B i o G e n e x A M 2 8 7 - 5 M ) w a s a p p l i e d f o r 3 0 m i n . a t r o o m t e m p e r a t u r e . D i a m i n o b e n z i d y n ( D A B ) w a s u s e d a s a c h r o m o g e n . T h e s e c t i o n s w e r e c o u n t e r s t a i n e d w i t h M a y e r ’s h a e m o t o x y l i n a n d s m a l l c e l l l y m p h o m a w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . B e n i g n , P I N , c a r c i n o m a t o u s f o c i i n a l l I m m u n o s t a i n e d s l i d e s w e r e e v a l u a t e d a s t h e p r e s e n c e ( + ) o r a b s e n c e ( - ) o f b c l - 2 I m m u n e x p r e s s i o n . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s S t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d u s i n g G r a p h P a d I n S t a t v e r s i o n 2 . 0 4 a ( G r a p h P a d S o f t w a r e U . S . A . ) . C l i n i c o p a t h o l o g i c a l c o r r e l a t i o n s w e r e a n a l y s e d b y P a e r s o n ’s C h i - S q u a r e , S t u d e n t ’s T - T e s t a n d O n e W a y A n o v a t e s t . T h e s i g n i f i c a n c e w a s p < 0 . 0 5 . R E S U L T S P a t i e n t s r a n g e d i n a g e f r o m 5 3 t o 7 0 y e a r s ( m e a n 6 2 y e a r s ) . P a t h o l o g i c a l s t a g e s i n c l u d e d T 1 N 0 M 0 ( 5 c a s e s ) , T 2 N 0 M 0 ( 1 3 c a s e s ) . T a b l e I s u m m a r i s e s t h e t u m o u r , t h e p a t h o l o g i c s t a g e a n d g r a d e o f t h e t u m o u r , t h e r e c u r r e n c e s t a t u s o f
t h e p a t i e n t , A R g e n e a n d w i l d t y p e p 5 3 p l o i d y r e s u l t s w i t h f l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n d b c l - 2 p r o t e i n i m m u n e x p r e s s i o n d a t a f o r t h e i n d i v i d u a l c a s e s . O f t h e 1 8 c a s e s s t u d i e d b y F I S H , w e f o u n d A R g e n e a m p l i f i c a t i o n i n b e n i g n « a r e a s ( F i g . 1 ) w a s 7 7 . 7 % ( 1 4 / 1 8 ) a n d 1 0 0 % d i s o m y w i t h w i l d p 5 3 , i n P I N a r e a s it w a s 3 3 . 3 % ( 6 / 1 8 ) , p 5 3 a m p l i f i c a t i o n 2 7 . 7 % ( 5 / 1 8 ) , i n c a r c i n o m a s it w a s 3 8 . 8 % ( 7 / 1 8 ) , a n d p 5 3 a m p l i f i c a t i o n 2 7 . 7 % ( 5 / 1 8 ) r e s p e c t i v e l y . S t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n w a s f o u n d o n l y b e t w e e n A R g e n e a m p l i f i c a t i o n a n d s t a g e ( p < 0 . 0 5 ) . W e c o u l d n o t r e v e a l a n y s t a t i s t i c a l c o r r e a t i o n b e t w e e n w i l d t y p e p 5 3 a n d p r o g n o s t i c p a r a m e t e r s s u c h a s s t a g e , s u r g i c a l m a r g i n i n v a s i o n , v e s i c u l o s e m i n a l i s i n v a s i o n , r e c u r r e n c e , W H O g r a d e , G l e a s o n s c o r e , A R a n d a l s o b c l - 2 i m m u n e x p r e s s i o n ( F i g . 2 ) . A l s o , b c l - 2 i m m u n e x p r e s s i o n d i d n o t s h o w a n y s t a t i s t i c a l c o r r e l a t i o n w i t h t h e s a m e p r o g n o s t i c p a r a m e t e r s .
F i g . l : A ndrogen receptor gene a m plification (X40)
F i g . 2 : bcl-2 ¡m m unoexpresslon (X20)
F i g . 3 : Intraepithelial neoplasia and ca rcino m a of the prostate (H &E X40). D I S C U S S I O N P r o s t a t e c a n c e r i s s e c o n d o n l y t o lu n g c a n c e r a s a c a u s e o f d e a t h f r o m c a n c e r ( 1 ) . A n d r o g e n w i t h d r a w a l c o n s t i t u t e s t h e o n l y e f f e c t i v e f o r m o f s y s t e m i c t h e r a p y f o r m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a n c e r . T h e m e c h a n i s m s o f t h e a p p e a r a n c e o f a n d r o g e n i n d e p e n d e n t c l o n e s o f t u m o u r c e l l s l i m i t t h e e f f e c t i v e c o n t r o l o f t h e p a t i e n t ’s d i s e a s e ( 1 2 ) . I n o u r s t u d y w e f o u n d t h a t t h e p r e s e n c e o f A R g e n e a m p l i f i c a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h t h e a d v a n c e d s t a g e o f t h e t u m o u r ( p < 0 . 0 5 ) . T a k e d o e t a l , h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c a r c i n o m a s w i t h a l o w G l e a s o n s c o r e h a v e a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r A R t h a n t h o s e w i t h a h i g h G l e a s o n s c o r e a n d A R c o n t e n t h a s n o t b e e n f o u n d t o b e c o r r e l a t e d w i t h t h e e x t e n t o r t h e d i s e a s e i n s t a g e D 2 p r o s t a t e c a r c i n o m a s ( 1 4 ) . A R c o n c e n t r a t i o n h a s b e e n f o u n d t o b e l o w e r c o m p a r e d t o b e n i g n t i s s u e a n d h a s n o c o r r e l a t i o n w i t h G l e a s o n s c o r e i n s t a g e D 2 p r o s t a t e c a r c i n o m a s b u t t h e r e h a s b e e n c o r r e l a t i o n o f p 5 3 e x p r e s s i o n t o G l e a s o n s c o r e ( 1 5 ) . A R g e n e a m p l i f i c a t i o n a n d P S A p r o t e i n h a v e b e e n f o u n d t o b e c o r r e l a t e d b y F I S H a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( 1 6 ) . O u r r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e v i o u s s t u d i e s , a s A R g e n e a m p l i f i c a t i o n w a s s h o w n t o b e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n b e n i g n a r e a s ( 7 8 % ) c o m p a r e d t o c a r c i n o m a t o u s f o c i ( 3 9 % ) . O n t h e o t h e r h a n d , o u r r e s u l t s s h o w d i s c o r d a n c e w i t h s t u d i e s w h i c h d e m o n s t r a t e t h a t A R a m p l i f i c a t i o n i s o b s e r v e d o n l y i n r e c u r r e n t t u m o u r s d u r i n g a n d r o g e n d e p r i v a t i o n t h e r a p y a n d i n n o n e o f t h e u n t r e a t e d p r i m a r y t u m o u r s ( 1 7 - 2 0 ) .
Genetic alterations of AR gene and P53 by fluorescence
I n t h e l i t e r a t u r e , A R g e n e a m p l i f i c a t i o n i s a l s o f o u n d t o b e c o r r e l a t e d w i t h p 5 3 i m m u n o s t a i n i n g i n h o r m o n e r e f r a c t o r y r e c u r r e n t p r o s t a t e c a n c e r ( 1 7 ) . O u r s t u d y g r o u p w a s c o m p o s e d o f p r i m a r y c a n c e r c a s e s , w i t h o u t a n y p r i o r e n d o c r i n e t r e a t m e n t a n d w e c o u l d n o t r e v e a l a n y s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n w i l d t y p e p 5 3 a n d A R g e n e a m p l i f i c a t i o n . A p r e v i o u s s t u d y r e p o r t e d i n t r a t u m o u r a l p 5 3 h e t e r o g e n i t y i n a p r o s t a t e c a r c i n o m a s a m p l e w i t h s o m e a r e a s o f t h e t u m o u r h a v i n g m u t a t e d p 5 3 a n d o t h e r s h a v i n g w i l d t y p e p 5 3 ( 2 1 ) . P 5 3 m u t a t i o n s h a v e b e e n s h o w n i n 1 9 % o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) a n d 2 p a t i e n t s w i t h m u t a t i o n s i n B P H t i s s u e d e v e l o p e d p r o s t a t e c a n c e r i n 2 - 3 y e a r s . T h u s it h a s b e e n c o n c l u d e d t h a t p 5 3 m u t a t i o n i n B P H t i s s u e m a y b e a r i s k f a c t o r ( 2 2 ) . I n c o n t r a s t t o t h i s s t u d y w e f o u n d 1 0 0 % d i s o m y w i t h p 5 3 i n b e n i g n a r e a s o f t h e p r o s t a t e c a r c i n o m a s . P o s i t i v e a s s o c i a t i o n b e t w e e n p 5 3 i m m u n r e a c t i v i t y a n d h i g h e r G l e a s o n g r a d e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( 2 3 ) . W e c o u l d n o t d e m o n s t r a t e a n y s t a t i s t i c a l c o r r e l a t i o n b e t w e e n w i l d t y p e p 5 3 a n d o t h e r p r o g n o s t i c p a r a m e t e r s s u c h a s t u m o u r s t a g e a n d g r a d e , p o s i t i v e s u r g i c a l m a r g i n , v e s i c u l o s e m i n a l i s i n v a s i o n , r e c u r r e n c e , W H O ( W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n ) g r a d e , G l e a s o n g r a d e , A R a n d a l s o b c l - 2 i m m u n e x p r e s s i o n . S e v e r a l h y p o t h e s e s o n t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f t u m o u r r e c u r r e n c e h a v e b e e n s u g g e s t e d . T h e s e i n c l u d e o v e r e x p r e s s i o n o f t h e b c l - 2 o n c o g e n e ( 2 4 - 2 6 ) , a c t i v a t i n g m u t a t i o n s , a m p l i f i c a t i o n a n d o v e r e x p r e s s i o n o f t h e A R g e n e ( 1 7 , 1 8 ) . b c l - 2 a m p l i f i c a t i o n h a s b e e n s h o w n b y i n c r e a s e d c o p y n u m b e r b y F I S H ; h o w e v e r n o h i g h l e v e l a m p l i f i c a t i o n s h a v e b e e n f o u n d i n h o r m o n e r e f r a c t o r y r e c u r r e n t p r o s t a t e c a r c i n o m a s ( 2 7 ) . W e c o u l d n o t r e v e a l a n y s t a t i s t i c a l c o r r e l a t i o n b e t w e e n b c l - 2 i m m u n e x p r e s s i o n a n d t u m o u r s t a g e , p o s i t i v e s u r g i c a l m a r g i n , v e s i c u l o s e m i n a l i s i n v a s i o n , r e c u r r e n c e , W H O g r a d e , G l e a s o n g r a d e , A R a n d a l s o w i l d p 5 3 a m p l i f i c a t i o n . W e m a i n l y o b s e r v e d t h e b c l - 2 i m m u n e x p r e s s i o n i n b a s a l d u c t a l c e l l s , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e ( 5 - 7 , 2 8 , 2 9 ) . W e d e m o n s t r a t e d t h a t P I N a n d p r o s t a t i c c a r c i n o m a f o c i h a v e a s i m i l a r p r o p o r t i o n o f g e n e t i c c h a n g e s f o r A R g e n e , b u t f o c i o f c a r c i n o m a h a v e m o r e a l t e r a t i o n s . T h i s s u p p o r t s t h e h y p o t h e s i s t h a t P I N i s t h e m o s t l i k e l y p r e c u r s o r o f p r o s t a t i c c a r c i n o m a ( 3 , 4 , 1 1 , 1 3 ) . T h e r e s u l t s o f o u r s t u d y s u g g e s t t h a t t h e p r e s e n c e o f A R a m p l i f i c a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h a d v a n c e d d i s e a s e a n d P I N i s t h e m o s t l i k e l y p r e c u r s o r o f p r o s t a t i c c a r c i n o m a . A c k n o w l e d g e m e n t s : M a n y t h a n k s t o A s s i s t a n t P r o f e s s o r D r . N u r a l B e k i r o g l u f o r t h e b i o s t a t i s t i c a l s t u d i e s o f t h e r e s e a r c h . R E F E R E N C E S1. Bostwick DG. The pathology o f incidental carcinom a. C ancer Surveys 1 9 9 5 ;2 3 :7 -1 7 . 2. H um phrey PA, W alther PJ. A denocarcinom a o f
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1 162.
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C h r o m o s o m a l a n o m a lie s in p r o s t a tic
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c h ro m o s o m a l a lte r a tio n s in p r o s t a tic in tr a e p ith e lia l n e o p la s ia a n d c a rc in o m a d e te c te d b y flu o re s c e n c e in s itu h y b rid iz a tio n . J P a th o l 1 9 9 9 :3 5 :4 7 9 -4 8 3 .
14. Takeda PI, A k a k u ra R, M asai M, A k im o to S, Y a ta n i R. A n d ro g e n r e c e p t o r c o n te n t o f p r o s ta te c a r c in o m a c e lls e s tim a te d b y im m u n o h is to c h e m is tr y is re la te d to p ro g n o s is o f p a tie n ts w ith s ta g e D 2 p ro s ta te c a rc in o m a . C a n c e r 1 9 9 6 :7 7 :9 3 4 -9 4 0 . 15. M yd lo J fl, K ra i JG , V o lp e M, A x o tis C, M a cch ia RJ, P e rts v h u k LP. A n a n a ly s is o f m ic ro v e s s e l d e n s ity , a n d ro g e n re c e p to r, p 5 3 a n d Her- 2 / n e u e x p re s s io n a n d G le a s o n s c o re in p ro s ta te ca n c e r. E u r U ro l 1 9 9 8 :3 4 :4 2 6 -4 3 2 . 16. K o iv is ta PA, P lelin P1J. A n d ro g e n r e c e p to r g e n e
a m p lific a tio n in c re a s e s tis s u e PSA p ro te in e x p re s s io n in h o rm o n e - re fra c to ry p ro s ta te c a rc in o m a . J P a th o l 1 9 9 9 ;1 8 9 :2 1 9 -2 2 3 . 17. V is o k o rp i T, fly y tin e n E, K o v is to P, e t al. In
v iv o a m p lific a tio n o f th e a n d ro g e n re c e p to r g e n e a n d p ro g re s s io n o f h u m a n p ro s ta te ca n ce r, n a tu r e G e n e t 1 9 9 5 ;9 :4 0 1 -4 0 6 . 18. K o iv is to PA, K o n o n e n J, P alm b e rg C, e t at.
A n d ro g e n r e c e p t o r g e n e a m p lif ic a t io n : a p o s s ib le m e c h a n is m f o r fa ilu re o f a n d ro g e n d e p r iv a tio n th e r a p y in p r o s ta te c a n c e r. C a n c e r Res 1 9 9 7 ;5 :3 1 4 -3 1 9 .
19. M iy o s h i Y, U e m u ra fl, E u jin a m i K, e t al. F lu o re s c e n c e in s itu h y b rid iz a tio n e v a lu a tio n o f c -m y e a n d a n d ro g e n r e c e p t o r g e n e a m p lific a tio n a n d c h ro m o s o m a l a n o m a lie s in p ro s ta te c a n c e r in J a p a n e s e p a tie n ts . P ro sta te 2 0 0 0 ,1 5 :2 2 5 -2 3 2 .
2 0 . K o iv is ta PA, R a n ta la I. A m p lific a tio n o f th e a n d ro g e n re c e p to r g e n e is a s s o c ia te d w ith p 5 3 m u ta tio n in h o rm o n e -re fra c to ry re c u rre n t p ro s ta te ca n ce r. J P a th o l 1 9 9 9 ;18 7 :2 3 7 -2 4 1 . 2 1 . E ffe rt PJ, U e u b a u e r A, W a lth e r PJ, L iu ET. A lte ra tio n s o f th e p 5 3 g e n e a re a s s o c ia te d w ith th e p ro g re s s io n o f a p ro s ta te c a rc in o m a . J U ro l 1 9 9 2 ,1 4 7 :7 8 9 . 2 2 . S c h e c h te fl, L e n k S K , L ô n in g T, e t al. P53 tu m o u r s u p p re s s o r g e n e m u ta tio n s in b e n ig n p ro s ta tic h y p e rp la s ia a n d p ro s ta te c a n c e r. E u r U ro l 1 9 9 8 ;3 4 :4 3 3 -4 4 0 .
2 3 . B h a s k a r K S , K a lla k u ry S, Figge J, e t al. A s s o c ia tio n o f p 5 3 im m u n o r e a c tiv ity w ith h ig h G le a s o n tu m o u r g ra d e in p r o s t a tic a d e n o c a rc in o m a . H u m P a th o l 1 9 9 4 ;2 5 :9 2 -9 7 . 2 4 . Me D o n n e ll TJ, T ro n c o s o P, B ris b a y SM, e t al.
E x p re s s io n o f th e p ro to o n c o g e n e b e I -2 in th e p ro s ta te a n d its a s s o c ia tio n w ith e m e rg e n c e o f a n d ro g e n in d e p e n d e n t p ro s ta te c a n c e r. C a n c e r Res 1 9 9 2 ;5 2 :6 9 4 0 -6 9 4 4 . 2 5 . C o lo m b e I M, S y m m a n s F, G ill S, e t al. D e te c tio n o f th e a p o p to s is s u p p re s s in g a n c o p r o te in b e 1-2 in h o r m o n e re fr a c to r y h u m a n p r o s ta te c a n c e rs . A m J P a th o l 1 9 9 3 ;1 4 3 :3 9 4 -4 0 0 . 2 6 . K ra je w s k a M, K ra je w s k i S, E p s te in JL, e t al. Im m u n o h is to c h e m ic a l a n a ly s is o f b e I -2, bax, b c l- x , a n d m c l- l e x p re s s io n in p ro s ta te ca n ce rs. A m J P a th o l 1 9 9 6 ; 1 4 8 :1 5 6 7 -1 5 6 9 . 2 7 . IT u p p o n e n HH, K o k k o la L, K o iv is to P,
V is a k o rp i T. G e n e tic a lte ra tio n s in h o rm o n e re fra c to ry re c u rre n t p ro s ta te c a rc in o m a s . A m J P a th o l 1 9 9 8 ; 1 5 3 :1 4 1 -1 4 8 .
2 8 . H a u s s ie r O, E p s te in J l. A m in MB, H e itz PU, H a ile m a ria m S. C e ll p ro life ra tio n , a p o p to s is , o n c o g e n e a n d tu m o u r s u p p re s s o r g e n e s ta tu s in a d e n o s is w ith c o m p a r is o n to b e n ig n p ro s ta tic h y p e rp la s ia , p ro s ta tic in tra e p ith e lia l
n e o p la s ia a n d c a n c e r. H u m P a th o l 1 9 9 9 :3 0 :1 0 7 7 -1 0 8 6 . 2 9 . T h e o d e re s c u D, B ro d e r SR, B o y d J, M ills SE, F rie rs o n HF. p 5 3 , b e 1-2 a n d re tin o b la s to m a p ro te in s a s lo n g te rm p r o g n o s tic m a rk e rs in lo c a lis e d c a rc in o m a o f th e p ro s ta te . J U rol 1 9 9 7 ;1 5 8 :1 3 1 -1 3 7 .
