PRİMER HİPERTANSİYON HASTALARINDA
ENDOTELYAL NİTRİK OKSİT SENTAZ GEN
POLİMORFİZMİ (GLU298ASP) VE NİTRİK OKSİT
DÜZEYLERİNİN ARAŞTIRILMASI
UZMANLIK TEZİ
DR. RAZİYE DİDEM TUNCER
TEZ DANIŞMANI
PROF. DR. SÜLEYMAN DEMİR
DENİZLİ-2011
T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
PRİMER HİPERTANSİYON HASTALARINDA
ENDOTELYAL NİTRİK OKSİT SENTAZ GEN
POLİMORFİZMİ (GLU298ASP) VE NİTRİK OKSİT
DÜZEYLERİNİN ARAŞTIRILMASI
UZMANLIK TEZİ
DR. RAZİYE DİDEM TUNCER
TEZ DANIŞMANI
PROF. DR. SÜLEYMAN DEMİR
DENİZLİ-2011
T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
“Işığında Kaybolan” Çok Sevdiğim Canım Babamın Anısına…
TEŞEKKÜR
Uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım tez danışmanım Prof. Dr. Süleyman DEMİR’e, uzmanlık eğitimime katkılarından dolayı Anabilim Dalı başkanımız Prof. Dr. Simin ROTA’ya, hocalarım Prof. Dr. Diler ASLAN’a, Prof. Dr. Bünyamin KAPTANOĞLU’na, Doç. Dr. Hülya AYBEK’e, Doç. Dr. Yaşar ENLİ’ye, desteklerinden dolayı tüm Araştırma Görevlisi arkadaşlarıma, Biyokimya Laboratuvarı ve kan alma birimimizin çalışanlarına, deneyimleri ile tezime destek olan Yrd. Doç. Dr. Nedim KARAGENÇ’e, verilerimi değerlendirmemde yardımcı olan Halk Sağlığı Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Mehmet ZENCİR’e,
Bu zorlu süreç boyunca benden desteğini hiç esirgemeyen, çok değer verdiğim canım ablam Yrd. Doç. Dr. Duygu HEREK’e ve eşi değerli hocamız Doç. Dr. Özkan HEREK’e, her yıldığımda “Daima bir çıkış yolu vardır” diyerek bana güç veren, iyi ki var dediğim abim Önder KORKMAZ’a, bana her şeyiyle güç katan teyzem Ayşe KORKMAZ’a, her türlü akademik uğraşımda kapısını çaldığım, her şekilde bana destek olan, biricik kardeşim “Uğur Çocuğum” Uğur Nurdan TUNCER BİLMEZ’e,
Cennetin en güzel köşelerinde bir arada olduklarına inandığım, beni yetiştiren, benim için daima öz veride bulunan, sevgileriyle beni hayata bağlayan ama daha paylaşacağım onca güzel anım olacakken erkenden dünyadan göç eden birtanecik annem Ümmü TUNCER ve ölesiye sevdiğim, gidişine dayanamadığım güzel yürekli, ışığında kaybolan adam, gururum, canım babam Himmet Hidayetdin TUNCER’e sonsuz teşekkür ederim…
Çalışmamız Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi’nin 21.07.2009 tarih ve 2009TPF006 proje nolu kararı ile desteklenmiştir.
İÇİNDEKİLER
ONAY SAYFASI ………. III TEŞEKKÜR ………. V İÇİNDEKİLER ..……….. VII SİMGELER VE KISALTMALAR ……… VIII ŞEKİLLER DİZİNİ .……… X TABLOLAR DİZİNİ ………... XI ÖZET ……… XII SUMMARY ……….. XIV GİRİŞ ……… 1 GENEL BİLGİLER ………... 2 PRİMER HİPERTANSİYON …...…... 4
Primer Hipertansiyonun Etiyopatogenezi …………..…..………. 5
NİTRİK OKSİT (NO) ………...……….. 9
NİTRİK OKSİT SENTAZ (NOS) ENZİMİ ………... 10
NOS’un İzoformları …………... 11
eNOS GENİ ve ÖZELLİKLERİ ………... 12
eNOS Gen Polimorfizmleri ………... 13
HİPERTANSİYON PATOGENEZİNDE NO’NUN ROLÜ ………. 14
GEREÇ VE YÖNTEM………. 17
ÇALIŞMA GRUPLARI ………... 17
eNOS GEN POLİMORFİZMİNİN GÖSTERİLMESİ …... 20
Kan Örneklerinden DNA’nın İzole Edilmesi ……… 20
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Yöntemi ……….. 22
Kesim Parça Uzunluğu Polimorfizmi (RFLP) Yöntemi ……... 23
Agaroz Jel Elektroforezi …………...………... 24
NİTRİK OKSİT DÜZEYLERİNİN ÖLÇÜMÜ ………... 26 TOTAL KOLESTEROL ÖLÇÜMÜ ………... 27 TRİGLİSERİT ÖLÇÜMÜ ………... 28 HDL-KOLESTEROL ÖLÇÜMÜ ………... 28 VLDL ve LDL-KOLESTEROL HESAPLANMASI ………... 28 İSTATİSTİKSEL ANALİZ ………... 29 BULGULAR……….………... 30 TARTIŞMA………... 38 SONUÇLAR………... 46 KAYNAKLAR………... 48 VII
SİMGELER VE KISALTMALAR
NO : Nitrik Oksit
eNOS : Endotelyal nitrik oksit sentaz
VNTR : Değişken sayıda tandem (birbiri ardına) tekrarlar
WHO : Dünya Sağlık Örgütü
ISH : Uluslararası Hipertansiyon Derneği
JNC : Amerika Birleşik Devletleri Birleşik Ulusal Komitesi
VKİ : Vücut kütle indeksi
LDL : Düşük yoğunluklu lipoprotein
HDL : Yüksek yoğunluklu lipoprotein
DM : Diabetes mellitus
ACE : Anjiyotensin “converting” enzim
AT : Anjiyotensin
PAI : Plazminojen aktivatör inhibitörü
PGE2 : Prostoglandin-E2
EDRF : Endotel kaynaklı gevşeme faktörü (Endothelial derived relaxing factor)
cGMP : Siklik guanizin mono fosfat
NOS : Nitrik Oksit Sentaz
BH4 : Tetrahidrobiyopterin
FMN : Flavinmononükleotid
FAD : Flavin Adenin Dinükleotid
NADPH : İndirgenmiş Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat
CaM : Kalmodulin
L-Arg : L-Arjinin
ADP : Adenozin Difosfat
nNOS : Nöronal nitrik oksit sentaz
iNOS : İndüklenebilir nitrik oksit sentaz
DNA : Deoksiribonükleik asit
mRNA : Haberci ribonükleik asit
IX
EDTA : Etilen diamin tetra asetik asit
rpm : Dakikadaki dönüş sayısı
RTÇ : Retikülosit tuz çözeltisi
STE : Salin (tuz)-Tris-EDTA
SDS : Sodyum dodesil sülfat
PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu
dNTP : Deoksinükleotid trifosfat
RFLP : Kesim parça uzunluğu polimorfizmi
TBE : Tris-borik asit-EDTA
NED : Naftiletilendiamin
VLDL : Çok düşük yoğunluklu lipoprotein
SVO : Serebro vasküler olay
HT : Hipertansiyon
SD : Standart sapma
NCEP : Ulusal Kolesterol Eğitim Programı
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1. Kardiyovasküler risk faktörleri ve ortaya çıkardığı zarar oranları. 4
Şekil 2. Anjiyotensin-II’nin kardiovasküler sistem ve NO üzerine etkisi... 7
Şekil 3. NO’nun damarlar üzerine olan etkileri ……….. 9
Şekil 4. NOS’un yapısı ve NO’nun sentezi ……… 11
Şekil 5. 7. kromozomda eNOS geninin yerleşimi………... 13
Şekil 6. eNOS geni intron/ekzon bölgelerinin düzenlenmesi ve bazı polimorfizmlerin şematik görünümü………. 13
Şekil 7. NO sentezi ve damar düz kası üzerine etkisi……….. 15
Şekil 8. Hipertansiyon gelişiminde vasküler mekanizma……… 16
Şekil 9. Eco241 kesim enziminin hedefi………. 24
Şekil 10. PCR sonrası elektroforez görüntüsü ……….. 25
Şekil 11. RFLP sonrası elektroforez görüntüsü………. 26
TABLOLAR DİZİNİ
XI
Tablo 1. WHO/ISH ile ESH/ESC’nin önerdiği hipertansiyon sınıflaması... 2
Tablo 2. JNC 7’nin önerdiği hipertansiyon sınıflaması……… 3
Tablo 3. Hipertansiyonun etiyolojik sınıflaması……….. 3
Tablo 4. Esansiyel hipertansiyonda rol oynayan başlıca faktörler……….. 5
Tablo 5. Primer Hipertansiyon ve kontrol grubunun özelliklerinin
karşılaştırılması……….………. 31
Tablo 6. Glu298Asp polimorfizminin genotipik dağılımı ve allellik sıklığı 32
Tablo 7. T allel varlığının primer HT için odds oranları……….. 32
Tablo 8. Primer HT ve kontrol grubunda cinsiyete göre T allel sıklığı…… 33
Tablo 9. Tüm grup ve genotipe göre plazma NO düzeyleri ……… 33
Tablo 10. T allel varlığında ve T allel yokluğunda plazma NO düzeyleri…. 34 Tablo 11. Sigara kullanımının cinsiyete göre dağılımı………... 34 Tablo 12. Sigara kullanımının polimorfizme göre dağılımı ………. 35
Tablo 13. Polimorfizime göre bel çevresi/kalça çevresi oranlarının
ortalaması………... 35
Tablo 14. Primer HT ve kontrol grubunun polimorfizme göre serum lipid
düzeyleri ortalaması ………..……… 36
Tablo 15. Primer HT grubunun serum lipid profili ve genotipe göre plazma
NO düzeyleri……….. 37
Tablo 16. Çeşitli çalışmalardaki Glu298Asp polimorfizminin genotipik
ÖZET
Primer hipertansiyon hastalarında endotelyal nitrik oksit sentaz gen polimorfizmi (Glu298Asp) ve nitrik oksit düzeylerinin araştırılması.
Dr. Raziye Didem TUNCER
Günümüzde tüm dünyadaki ölümlerin %30’undan kardiovasküler nedenler sorumludur. Kardiovasküler hastalık riskini en az iki kat arttıran hipertansiyon, aynı zamanda serebrovasküler olay, koroner arter hastalığı (Akut myokard infarktüsü), konjestif kalp yetmezliği, böbrek fonksiyon bozukluğu gibi ciddi birçok hastalık için de tek başına major bir risk faktörüdür.
Primer Hipertansiyonun kesin nedeni henüz tam olarak açıklanamamıştır. Epidemiyolojik araştırmalar, genetik ve çevresel faktörlerin primer hipertansiyon oluşumunda önemli rol oynadığını göstermiştir. Genetik etki bu faktörlerden en önemli olanlardan birisidir.
Hipertansiyonda gözlenen vasküler tonus artışının, endotel tarafından salgılanan vazodilatatör ve vazokonstriktör mediyatörler arasındaki dengesizlikten kaynaklandığı öne sürülmüştür. Endotelden salınan güçlü bir vazodilatör olan nitrik oksitin, kan basıncının düzenlenmesi, tromboz ve ateroskleroz oluşumunda önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Damar endotelindeki nitrik oksitin başlıca kaynağı endotelyal nitrik oksit sentaz enzimidir. Yapılan çalışmalar, eNOS geni ile ilişkili mutasyonların, nitrik oksit salınımını azaltarak vasküler tonus artışına neden olduğunu, bunun da hipertansiyon gelişimine yol açabileceğini göstermektedir.
eNOS geninde promotor bölgede, ekzonlarda ve intronlarda pek çok dizi (allel) varyasyonları tanımlanmıştır. Tek bir bazın değişmesinden kaynaklanan tek nükleotid polimorfizmleri ve bazı dizilerin tekrarlanmasından kaynaklanan tekrar polimorfizmleri bulunmuştur. Şu ana kadar tanımlanan tek ekzon bölgesi polimorfizmi Glu298Asp’dir. Ekzon bölgesi genin kodlayıcı kısmı olduğundan, bu bölgedeki polimorfizmler protein yapıyı etkileyerek enzim aktivitesini değiştirebilmektedir.
Bu çalışmada eNOS geninin 7. ekzonundaki, 894. pozisyonda bulunan guanin bazının timin bazı ile yer değiştirmesinden kaynaklanan Glu298Asp polimorfizminin (G894T) primer hipertansiyon ile ilişkisi ve NO düzeyi araştırıldı.
Kardiyoloji Kliniğine başvurmuş ve primer hipertansiyon tanısı almış 123 hasta ve sağlıklı olarak kabul edilen 78 kontrol çalışmaya dahil edildi. Tüm katılımcıların PCR ve RFLP yöntemi ile genotipleri saptandı ve Griess yöntemi kullanılarak plazma NO düzeyleri ölçüldü.
Glu298Asp polimorfizmi genotipi ve T allel sıklığı primer hipertansiyon ve plazma NO düzeyleriyle ilişkili bulunmadı. Plazma NO düzeyleri primer hipertansiyon grubunda farklı değildi.
Sonuç olarak Denizli toplumunda yapılan bu çalışmada Glu298Asp polimorfizmi, plazma NO düzeyi ve primer hipertansiyon arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı.
Anahtar kelimeler; Primer Hipertansiyon, Nitrik Oksit, eNOS, Polimorfizm.
SUMMARY
Investigation of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism (Glu298Asp) and nitric oxide levels in patients with primary hypertension.
Dr. Raziye Didem TUNCER.
Today, cardiovascular events (reasons) are responsible for 30% of all deaths in all over the world. Hypertension that increases the risk of cardiovascular disease at least twice is also a stand-alone major risk factor for many serious diseases such as cerebrovascular disease, coronary artery disease (acute myocardial infarction), congestive heart failure and renal dysfunction.
The exact cause of primary hypertension is not yet fully elucidated. Epidemiological researches show that genetic and environmental factors play important roles in the etiology of primary hypertension. Genetic impact is the most important one of these factors.
An imbalance between vasodilatator and vasoconstrictor mediators secreted by endothelial cells was suggested to increase the vascular tonus which is observed in hypertension. Nitric oxide a strong vasodilatator secreted from the endothel is thought to play an important role in the regulation of blood pressure, in the formation of thrombosis and atherosclerosis. The major source of nitric oxide in vascular endothel is formed by the reaction catalyzed by endothelial nitric oxide synthase enzyme. Studies have shown that the mutations associated with eNOS gene results with decreased nitric oxide secretion resulting with increase in the vascular tonus leading to hypertension.
At the promoter region of eNOS gene many sequence (allele) variations in exons and introns have been described. Single nucleotide polymorphism caused by the change of a single base and repeated polymorphisms resulting from repetition of some sequences were demonstrated. The only exon region polymorphism described so far is Glu298Asp polymorphism. As the exon region is the coding part of the
gene, the polymorphisms in this region can change the enzyme activity by affecting the protein structure.
In this study the relationship between primary hypertension and Glu298Asp polymorphism (G894T, replacement of guanine base with thymine base at the 894th position of the 7th exon of eNOS gene) and the level of NO is evaluated.
One hundred twentythree patients who attended to the cardiology clinic and diagnosed as primary hypertension and 78 controls accepted as healthy were included to the study. The genotypes of all the participants were determined by PCR-RFLP method and plasma NO levels were measured by using Griess method.
Glu298Asp polymorphism genotype and T allele frequency were not associated with primary hypertension and plasma NO levels. Plasma NO level of primary hypertension group was comparible to the control group.
In conclusion, no significant relationship between Glu298Asp polymorphism, plasma NO levels in primary hypertension was detected in this study.
Keywords; Primary Hypertension, Nitric Oxide, eNOS, Polymorphism.
GİRİŞ
Günümüzün en sık görülen sağlık sorunlarından birisi olan hipertansiyon; koroner arter hastalığı (Akut miyokard infarktüsü), serebrovasküler hastalıklar, konjestif kalp yetmezliği, böbrek fonksiyon bozukluğu gibi ciddi birçok hastalık için tek başına major bir risk faktörüdür (1).
Esansiyel hipertansiyon henüz tam olarak açıklanamayan nedenlerle, kan basıncının normal kabul edilen değerlerden yüksek olması durumudur. Epidemiyolojik araştırmalar, genetik ve çevresel faktörlerin esansiyel hipertansiyon oluşumunda önemli rol oynadığını göstermiştir. Genetik etki bu faktörlerden en önemli olanlardan birisidir (2,3).
Nitrik oksit (NO), endotel hücrelerinde homodimerik endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) enzimi etkisiyle L-Argininden sentezlenen ve vazodilatasyona yol açan bir moleküldür (4). eNOS tarafından endotelde üretilen NO, düz kas hücrelerinde gevşemeye yol açarak, damar duvarı basıncını azaltır (5). eNOS geni birçok basamakta ekspresyonel ve fonksiyonel olarak düzenlenir. eNOS geninde fonksiyonel olarak sonuç doğuran çeşitli polimorfizmler mevcuttur. eNOS geninin transkripsiyon hızının düzenlenmesinde önemli olan promotor bölgedeki T786C, intron 4’deki değişken sayıda tandem (birbiri ardına) tekrarlar (VNTR) ve ekzon 7’deki Glu298Asp değişimi tanımlanmıştır. eNOS polimorfizmi ile ilgili çalışmalar daha çok koroner arter hastalıklarıyla ilişkisini ortaya koymayı amaçlamıştır. Hipertansiyonla ilgili çalışmalar az sayıdadır. Bunların çoğu intron bölgesindeki polimorfizmlerle ilişkilidir. Polimorfizm çeşitlerinin toplumlara göre dağılımı değişiktir. Denizli’de yapılan bir çalışmada sağlıklı kişilerde Asp/Asp %5, Glu/Asp %23,3 olarak bulunmuştur (6).
Çalışmamızın amacı eNOS enzimini kodlayan genin 7. ekzonundaki 894. pozisyonunda bulunan guanin bazının timin bazı ile yer değiştirmesinden kaynaklanan Glu298Asp polimorfizmi ile esansiyel hipertansiyon arasındaki ilişkinin ve bu polimorfizmin nitrik oksit düzeyine etkisinin araştırılmasıdır.
GENEL BİLGİLER
Kanın arter duvarına yapmış olduğu basınç olan “arteriyal kan basıncı”nın tekrarlayan ölçümlerde normal kabul edilen değerlerin üzerine çıkmasına hipertansiyon (sistemik arteriyal hipertansiyon) denir (7). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Uluslararası Hipertansiyon Derneği (ISH) ile Avrupa Hipertansiyon Derneği (ESH) ve Avrupa Kardiyoloji Derneği (ESC) 18 yaş üzeri erişkinlerde, arteriyal kan basıncının, 130-139/85-89 mmHg arası değerlerini “yüksek normal”, 140/90 mmHg üstündeki değerlerini “hipertansiyon” olarak tanımlarken, Amerika Birleşik Devletleri Birleşik Ulusal Komitesi (JNC) ise 120-139/80-89 mmHg arasındaki değerleri “prehipertansiyon” olarak kabul etmiştir (8,9,10). Sistolik ve diyastolik kan basıncı ayrı ayrı yükselebildiği gibi, çoğu olguda ikisi birden yüksek seyreder (7). Arteriyal kan basıncına göre hipertansiyon sınıflamaları Tablo 1 ve Tablo 2’de gösterilmiştir.
Tablo 1. WHO/ISH ile ESH/ESC’nin önerdiği hipertansiyon sınıflaması (8,9)
Etiyolojik nedene göre hipertansiyon esansiyel (primer) hipertansiyon ve sekonder hipertansiyon olarak iki gruba ayrılır. Hipertansif vakaların %95’ini oluşturan primer hipertansiyon olgularında, saptanabilen düzeltilebilir etiyolojik bir neden yoktur. %5’lik grubu oluşturan sekonder hipertansiyon saptanabilir ve düzeltilebilir bir etiyolojik nedene bağlı gelişir (Tablo 3) (7).
Sistolik Kan Basıncı
(mmHg) Diyastolik Kan Basıncı(mmHg)
Normal < 130 <85
Yüksek Normal 130-139 85-89
Evre 1 (Hafif) Hipertansiyon 140-159 90-99
Alt grubu: Sınırda (WHO/ISH) 140-149 90-94
Evre II (Orta) Hipertansiyon 160–179 100–109
Evre III (Şiddetli) Hipertansiyon ≥180 ≥110
İzole Sistolik Hipertansiyon ≥140 <90
Tablo 2. JNC 7’nin önerdiği hipertansiyon sınıflaması (10) Sistolik Kan Basıncı
(mmHg)
Diyastolik Kan Basıncı
(mmHg)
Normal <120 <80
Prehipertansiyon 120-139 80-89
Evre I Hipertansiyon 140-159 90-99
Evre II Hipertansiyon ≥160 ≥100
Tablo 3. Hipertansiyonun etiyolojik sınıflaması (7)
I. SİSTOLİK VE DİYASTOLİK HT NEDENLERİ
1. Primer (esansiyel) 2. Sekonder nedenler; a. Renal nedenler
-Renal parankimal hipertansiyon -Renovasküler hipertansiyon -Renin salgılayan tümörler
-Primer sodyum retansiyonu (Liddle sendromu)
b. Endokrin nedenler
-Akromegali -Hipotiroidi -Hipertiroidi
-Hiperkalsemi (Hiperparatiroidi) -Sürrenal kökenli hipertansiyonlar
Sürrenal korteks kökenli hipertansiyonlar -Cushing sendromu
-Primer hiperaldosteronizm -Konjenital sürrenal hiperplazi Sürrenal medulasına bağlı hipertansiyon -Feokromositoma
-Sürrenal hormon alımına bağlı hipertansiyon -Sürrenal dışı kromafin tümörler
-Karsinoid
c. Aort koarktasyonu
d. Gebeliğe bağlı hipertansiyon e. Nörolojik bozukluklara bağlı hipertansiyon
-Kafa içi basınç artışı -Uyku apnesi -Kuadripleji -Ailevi disotonomi -Kurşun zehirlenmesi -Guillain-Barre sendromu
II. SİSTOLİK HT NEDENLERİ 1. Artmış kalp debisi
-Aort kapak yetersizliği -Arteriovenöz fistül -Hipertiroidi -Beriberi
-Hiperkinetik dolaşım yaratan diğer nedenler
2. Aort rijiditesindeki artış
(Yaşlılardaki sistolik tansiyon)
Ülkemizdeki hipertansif hastalarda, kan basıncı yüksekliğine eşlik eden kardiyovasküler risk faktörleri ve sıklıkları “Türk Hipertansiyon ve Böbrek Hastalıkları Derneği” tarafından 2003 yılında gerçekleştirilen “Türk Hipertansiyon Prevalans Çalısması”nda belirlenmiştir. Hipertansif hastalarda vücut kütle indeksi (VKİ), açlık kan şekeri, trigliserit ve LDL-kolesterol yüksekliği, HDL- kolesterol ve
kreatinin klirensinin düşüklüğü ve mikroalbuminüri gibi ek risk faktörlerinin bulunduğu saptanmıştır. Risk faktörlerinin bir arada olması, ortaya çıkaracağı zarar olasılığını da geometrik olarak arttırmaktadır (Şekil 1) (11,12).
Şekil 1. Kardiyovasküler risk faktörleri ve ortaya çıkardığı zarar oranları (11,12).
S:Sigara, DM: Diabetes mellitus, HT: Hipertansiyon, HL: Hiperlipidemi, O: Obesite
PRİMER HİPERTANSİYON
Kesin nedeni bilinmeyen, ikincil bir hastalığa bağlı oluşmamış arteryel kan basıncının sürekli yüksekliğidir. Nedeni tam olarak bilinmemekle birlikte genetik yatkınlık ve çevresel faktörlerin rolü olduğuna inanılmaktadır. Bazı ailelerde ve toplumlarda daha sık görülmesi, tek yumurta ikizlerinde birlikte görülme şansının yüksek olması, genetik faktörlerin önemini ortaya koymaktadır (7).
Arteriyal kan basıncının normal kabul edilen sınırlarda tutulmasında birbiriyle ilişkili birçok sistem rol oynar. Kan basıncını, kalp debisi ve periferik sistemik vasküler direnç belirler. Hipertansiyonun ilk yıllarında arteriyal kan basıncı artışından artan kalp debisi sorumlu iken, ilerlemiş hipertansiyonda periferik damar direnci artışı başlıca rolü oynar (7).
Primer Hipertansiyonun Etiyopatogenezi
Esansiyel hipertansiyonun etiyopatogenezinde hemodinamik değişiklikler, genetik etkenler, aşırı tuz alımı, renal sodyum tutulumu gibi birçok faktör rol oynamaktadır (Tablo 4).
Tablo 4. Esansiyel hipertansiyonda rol oynayan başlıca faktörler (13) 1-Hemodinamik Değişiklikler
a) Kardiyak değişiklikler (hiperkinetik dolaşım, sıvı volümü artışı, kardiyak hipertrofi) b) Periferik arter değişiklikleri (vazokonstriksiyon, damar duvarı/lümen oranında artış, remodelling)
2- Genetik Etkenler 3- Aşırı Tuz Alımı
4- Renal Sodyum Retansiyonu
a) Basınç-natriürezis ilişkisi (Guyton hipotezi) b) Edinsel natriüretik hormon
c) Renin ve nefron heterojenitesi d) Azalmış nefron kitlesi
5- Renin-angiotensin sistem değişiklikleri 6- Stres ve aşırı sempatik aktivite
7- Hücre membranı değişiklikleri
a) İyon transportundaki değişiklikler b) Hücre membranındaki anormallikler
8- Endotel disfonksiyonu
9- İnsülin direnci ve hiperinsülinemi 10-Obezite
11-Diğer olası mekanizmalar
a) Anormal steroid metabolizması b) Vazoaktif peptidler
c) Prostaglandinler
12- Katkıda bulunan faktörler
a) Fötal etkenler
b) Kalsiyum-PTH metabolizması c) Diğer mineral değişiklikleri d) Sigara
e) Alkol
Hemodinamik Değişiklikler: Kan basıncının kontrolü böbrekler, santral sinir
sistemi, periferik sinir sistemi, vasküler endotel ve adrenal bez arasındaki karmaşık etkileşimle sağlanır. Kan basıncını belirleyen en önemli parametre kalp debisi ve periferik arteriyal direncin oluşturduğu hemodinamik değişikliklerdir. Bu iki faktörden birinde veya her ikisinde birden artış olması kan basıncında yükselmeye neden olur. Yeni tanı konmuş genç hipertansiflerde, intravasküler hacim artışı (ön yük) veya kalbin nöral uyarımının artmasına bağlı kontraktilitenin artması ile kalp debisi artar ve hiperkinetik dolaşım sonucu hipertansiyon gelişir. Fakat hipertansif hastalarda daha çok görülen hemodinamik durum artmış periferik vasküler dirence eşlik eden normal kalp debisidir (14).
Genetik Faktörler: Kan basıncı değişkenliğinin kalıtsal özelliği, monozigot ve
dizigot ikizlerin, biyolojik ve evlat edinilmiş kardeşlerin, anne-baba ve çocuklarının kan basınçlarının karşılaştırıldığı epidemiyolojik çalışmalarda gösterilmiştir. Çocuklarda hipertansiyon prevalansı, her iki ebeveyn de hipertransif ise %46, bir ebeveyn hipertransif ise %28, her iki ebeveyn de normotansif ise %3 düzeyinde kalmaktadır (15). Kan basıncı değişkenliğinden sorumlu olan spesifik genlerin araştırılması halen devam etmektedir. Fizyolojik hipertansiyon çalışmaları ve kromozomal/genomik harita çalışmaları, yüksek kan basıncı ile ilişkilendirilen bazı aday genleri ortaya çıkarmıştır (16-18).
Aşırı Tuz Alımı: En büyük dikkati çeken çevresel faktör tuz alımıdır. Diyetteki
sodyum miktarı hipertansiyon gelişimini kolaylaştırıcı bir etken olarak değerlendirilmiştir. Batı tipi diyetlerde erişkinler günlük sodyum gereksiniminin birkaç misli, hipertansiyonu indükleyebilecek eşik değerin (60-120 mEq/gün) çok üstünde, sodyum tüketmektedir. Hipertansiflerin yaklaşık %60’ında kan basıncı, kısmen alınan sodyum miktarına cevap verir. Bu tuz duyarlılığını obezite, yaş, ırk, plazma renin seviyesi, sempatik sinir sistemi aktivitesi ile DM (Diabetes mellitus), böbrek yetmezliği gibi eşlik eden hastalıklar etkilemektedir (14,19-21).
Renin-anjiyotensin-aldosteron Sistemi: Böbreklerde jukstaglomerüler hücrelerde sentezlenen ve bu hücrelerden salınan renin, anjiyotensinojenden anjiyotensin-1’in oluşmasını katalize eder. Anjiyotensin-I, ACE (Anjiyotensin
“converting” enzim) ve diğer proteazlar tarafından işlenerek anjiyotensin-II’ye dönüşür. Anjiyotensin-II’nin, damarlarda vazokonstriksiyon, aldosteron sentezinin ve salınımının uyarılması, renal tubüler sodyum geri emiliminin uyarılması, renin salımının baskılanması, susama hissinin uyarılması, antidiüretik hormonun salınımı ve sempatik debide artış gibi birçok nörohormonal etkisi vardır. Aynı zamanda güçlü bir büyüme hormonu ve mitojendir. Tüm bu etkiler sonucunda ekstrasellüler sıvı volümü ve total periferik arteryal kan basıncı artar (Şekil 2). Bu fizyolojik mekanizmada oluşabilecek bozuklukların primer hipertansiyon gelişiminde rol oynayabileceği öne sürülmüştür. Primer hipertansiyonlu bireylerde renin normal, düşük veya yüksek olabilmektedir (21-23).
Anjiyotensinojen
Anjiyotensin-I
Anjiyotensin-II
Sempatik etkinlik
AT-I reseptörü AT-II reseptörü
Aldestron ↑ Nitrik Oksit ↑
Şekil 2. Anjiyotensin-II’nin kardiovasküler sistem ve NO üzerine etkisi (24)
ACE: Anjiyotensin “converting” enzim, AT: Anjiyotensin, PAI: Plazminojen aktivatör inhibitörü
Stres ve Aşırı Sempatik Aktivite: Tekrarlayan strese bağlı
vazokonstriksüyonun damar hipertrofisine neden olduğu, periferik direnç ve kardiak debide ilerleyici artışlara yol açtığı hipotezi öne sürülmüştür. Hipertansiyonun erken dönemindeki genç hastalarda kalp hızındaki ve debideki artış dikkati çeker. Bu hastalarda plazma norepinefrin düzeyi yüksek bulunmuştur. Serebral korteksdeki stres reseptörleri, hipotalamik çekirdekleri uyararak merkezi sempatik deşarjlarla,
RENİN ACE Myokardiyal fibrozis ↑ Norepinefrin ↑ Vazokonstriksiyon ↑ PAI/Endotelin ↑ Myokardiyal fibrozis ↓ Antiproliferatif etki? Antiinflamatuvar etki? Vazodilatasyon ↑
böbrekleri ve diğer organları etkiler. Bunun sonucu olarak renal arteriyoler vazokonstriksiyon ve efferent renal sempatik sinir aktivitesinde artış, dolayısıyla kalp debisi, kalp hızı ve kan basıncında artış meydana gelir. A tipi kişiliğe sahip - agresif, sabırsız, yarışmacı- kişilerde normal şartlarda kan basıncı diğer kişilerden farklı olmadığı halde, stres halinde kan basıncı daha fazla yükselir (3, 25,26).
Nörojenik Faktörler-Baroreseptörlerin Rolü: Baroreseptörler kan basıncının
düşmesi ya da yükselmesine refleks olarak, atım hacmi, kalp hızı ve periferik direnci etkileyerek kan basıncını ayarlar. Hipertansiyonu olanlarda baroreseptör cevabı daha yüksek kan basıncı seviyelerinde ortaya çıkabilmektedir (26).
Lokal Vasküler Faktörlerin Rolü: Küçük arter ve arteriyol endotelinde renin,
anjiyotensin, endotelin, serotonin gibi vazokonstriktör ve prostasiklin, PGE2
(Prostaglandin-E2), kallikrein, NO gibi vazodilatatör etkisi olan pek çok vazoaktif
madde yapılmaktadır. Bu maddeler arasındaki denge lokal vasküler faktörlerin etkisini belirlemektedir. Bu dengeyi değiştirebilen faktörlerin hipertansiyon oluşumunda rol aldığı düşünülmektedir. Endotel hücrelerinden gerilme stresi, pulsatil gerilme gibi çeşitli uyarılara yanıt olarak NO salınır. Nitrik oksit güçlü bir vazodilatatördür. Aynı zamanda trombosit adezyon ve agregasyonu ile damar düz kas hücrelerinin proliferasyonunu baskılar (27). NO’in kan basıncının düzenlenmesi, tromboz ve ateroskleroz oluşumunda önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Yapılan fonksiyonel çalışmalar, NO ile ilişkili damar gevşemesinin hipertansif hastalarda, normotansif kişilerle karşılaştırıldığında, azalmış olduğunu göstermektedir. Endotel fonksiyon bozukluğu sonucu yetersiz NO salınımının, hipertansiyon gelişimine katkıda bulunan bir faktör mü olduğu, yoksa hipertansiyonun bir sonucu olarak mı ortaya çıktığı konusunda tartışmalar devam etmektedir (28).
NİTRİK OKSİT (NO)
Nitrik Oksit’in Fonksiyonları
Nitrik oksit (NO), membranları kolayca geçebilen, gaz yapısında, eşleşmemiş elektron içeriği nedeniyle zayıf bir oksidan veya indirgeyici bir bileşen olarak görev yapan, serbest radikal olarak da nitelendirilen, bir nitrojen ve bir oksijen atomundan oluşan, biatomik, kısa ömürlü küçük bir moleküldür (29-37).
Önceleri “Endotel Kaynaklı Gevşeme Faktörü” (Endothelial derived relaxing factor- EDRF) olarak tanımlanan NO’nun, vazodilatör, nörotransmitter, antimikrobiyal efektör molekül ve immünomodulatör olarak pek çok fizyolojik ve patofizyolojik rolleri bulunmaktadır. NO, endotelden salındıktan sonra düz kas hücresi zarından diffüze olarak, guanilat siklazın “hem” grubundaki demirine bağlanır ve enzimi aktive eder. Hücre içi cGMP düzeyi artar. NO, ayrıca Ca++
bağımlı K+ kanallarını aktive ederek hücre içi K+ düzeyini artırır ve hücre zarında
hiperpolarizasyona yol açar. Sonuç olarak bu iki tür etki ile düz kas hücrelerinde gevşeme ve damarlarda dilatasyon meydana gelir. Membranları kolayca geçen NO’nun, guanilat siklaz enzimi aracılığıyla neden olduğu kardiovasküler etkileri şekil 3’de özetlenmiştir (30,35-39).
NİTRİK OKSİT SENTAZ (NOS) ENZİMİ
NOS’un Yapısı ve NO Sentezi
NO, organizmada nitrik oksit sentaz (NOS) enziminin katalizlediği bir reaksiyonla, L-arjinin aminoasidinin L-sitrülin’e dönüşümü sırasında açığa çıkmaktadır. NOS enzimi, N-terminal oksijenaz ve redüktaz olmak üzere iki adet globüler proteinden oluşur. Oksijenaz bölgesi; Hem, L-Arjinin ve BH4 için; redüktaz bölgesi ise FMN, FAD ve NADPH için gerekli bağlanma alanlarını taşır. Bu iki bölgenin birbirine kenetlenmesi kalmodulin (CaM) sayesinde gerçekleşir. NOS enziminin tam işlev gösterebilmesi için oksijenaz ve redüktaz bölgelerinden oluşan monomerlerin birleşerek dimerleşmesi gerekmektedir. “Hem” ve BH4’ün varlığı enzim dimerizasyonu için gereklidir. NO üretimi esnasında NADPH’nın dehidrojenizasyonu ile elde edilen elektronlar, redüktaz bölgesindeki flavinlere (FAD ve FMN) geçerler, oradan da esnek protein yapıda olan oksijenaz bölgesindeki “Hem”e transfer olurlar. Bu sayede Hem’in demiri O2’e bağlanarak L-arjinin’den
NO sentezini katalizler. Bu elektron transferi kalmodulinin, kalsiyum aracılığıyla, spesifik bağlanma bölgesine bağlanması sonucu aktive olmasıyla gerçekleşir (Şekil 4) (42-48).
NO sentezi iki basamakta gerçekleşir; Birinci basamakta, L-arjininin “guanido nitrojeni” hidroksillenir ve “guanido hidroksi L-arjinin” oluşur. Dolayısıyla arjininin yapısına bir oksijen atomu katılmış olur. İkinci basamakta ise guanido hidroksi L-arjinin okside olur, “sitrülin ve NO” meydana gelir. NO’nun yapısındaki oksijenin kaynağı, ilk basamakta argininin yapısına katılan oksijen atomudur. NO sentezi sırasında her iki basamakta birer tane olmak üzere 2 mol oksijen ile birinci basamakta 1 mol, ikinci basamakta 0.5 mol olmak üzere toplam 1.5 mol NADPH kullanılır (Şekil 4) (49,50). Oluşan NO kolayca endotelden geçer, çok kısa yarı ömürlü olduğundan, kanda hemoglobinin “hem” grubu ile etkileşerek nitrit (NO2) ve nitrata (NO3) okside olur. Nitrat, NO’nun kandaki stabil biyoreaksiyon ürünüdür (51)
Şekil 4. NOS’un yapısı ve NO’nun sentezi (35)
BH4: Tetrahidrobiyopterin, L-Arg: L-Arjinin, CaM: Kalmodulin, FMN: Flavin mononükleotid, FAD: Flavin Adenin Dinükleotid, NADPH: Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat.
NO sentez ve salınımının en önemli tetikleyicisi “shear stres”dir. Shear stres, kalbin her sistolde damara gönderdiği kanın, damar endoteli yüzeyinde oluşturduğu mekanik etki, “damar çeperine sürtünme stresi” olarak ifade edilebilir. Bu mekanik etki ile endotel hücreleri içine gönderilen sinyaller, NOS’u fosforile ederek aktivasyonunu sağlar ve NO sentezi başlatılır (52). Asetilkolin, histamin, bradikinin, trombin, P maddesi, serotonin, ADP (Adenozin difosfat), izoproterenol gibi hücre içi kalsiyum düzeyini arttıran bileşikler de kalsiyuma bağımlı bir enzim olan NOS’u aktive ederek, NO sentezine neden olmaktadır (53).
NOS’un İzoformları
Memeli hücrelerinde NO sentezi NOS enzim ailesi tarafından düzenlenmektedir. Üç farklı tip NOS izoformu bulunmaktadır; iNOS (İndüklenebilir nitrik oksit sentaz) (NOS-II), eNOS (NOS-III) ve nNOS (Nöronal nitrik oksit sentaz)
(NOS-I). eNOS ve nNOS yapısal NOS olarak adlandırılırken, iNOS uyarılabilir formdur. eNOS, endotel hücrelerinde, kardiyak miyositlerde ve trombositlerde yer alır. nNOS, santral ve periferik nöronlarda eksprese edilir. Sitokin ve diğer bileşikler tarafından uyarılabilen form olan iNOS çesitli inflamatuvar mediyatörlere yanıt olarak endotel hücrelerinde, düz kas hücrelerinde, kardiyak miyositlerde ve makrofajlarda eksprese edilir (31,42,43). NOS izoenzimlerinin hepsinin ortak ürünü NO’dur, fakat bulundukları yerler ve üstlendikleri roller farklıdır. eNOS, düşük miktarlarda üretilir ve damar tonusunu ayarlar. nNOS, düşük miktarlarda üretilip, sinaptik şekillenme ve sinirsel iletimi düzenler. iNOS, yüksek miktarlarda üretilerek enflamatuvar olaylarda rol alır ve hücre aracılı immun cevapta etkilidir. Dolaşımdaki NO’nun asıl kaynağı ise eNOS izoenzimidir (4,34).
eNOS ve nNOS enzimlerine, CaM bağlanması ve aktif hale gelebilmeleri için kalsiyuma ihtiyaçları vardır. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun azalmasıyla yapısal enzimler inaktive olurlar. Bu nedenle etki süreleri kısa, üretilen NO miktarı azdır. iNOS enziminin dimerik formu CaM molekülüne, kalsiyumdan etkilenmeksizin, geri dönüşümsüz olarak sıkıca bağlanır. Bu nedenle aktivitesi uzun sürer ve fazla miktarlarda NO üretimine yol açar (33,45).
eNOS GENİ ve ÖZELLİKLERİ
Oldukça kompleks yapılar olan genlerin ekzon bölgeleri protein yapımından sorumlu şifreyi taşıyan kısımlardır. Bu bölgeler intron bölgeleri ile birbirinden ayrılırlar. İntronlar protein yapımı için bir şifre içermezler; genin çalışması, üretim kapasitesi ve fonksiyonlarının düzenlenmesinde görev alırlar. Ayrıca genlerin uç kısımlarında, genin işleme sokulup sokulmamasında görev alan, düzenleyici bölgeler mevcuttur (54).
21 kilobazlık genomik DNA (Deoksiribonükleik asit)’dan oluşan, 4052 nükleotidlik mRNA (Haberci ribonükleik asit) tarafından kodlanan ve 26 ekzon içeren eNOS geni, 7. kromozomun uzun kolunda, 35 ve 36. loküsde yerleşmiştir (Şekil 5) (4).
Şekil 5. 7. kromozomda eNOS geninin yerleşimi (4).
eNOS Gen Polimorfizmleri
eNOS geninin dizisi belirlendikten sonra, DNA dizi çalışmaları ile promotor bölgede, ekzonlarda ve intronlarda pek çok dizi (allel) varyasyonları rapor edilmiştir. Yapılan araştırmalarda dizideki tek bir bazın değişmesinden kaynaklanan tek nükleotid polimorfizmleri ve bazı dizilerin tekrarlanmasından kaynaklanan tekrar polimorfizmleri bulunmuştur. Genel olarak 3 tip varyasyon tanımlanmıştır. Bunlar:
1) İntron kodlayan bölge varyasyonları, Ör; intron 11 (-30 A/G), intron 18 (27 A/G), intron 23 (10 G/T), intron 4 VNTR.
2) Promotor bölgedeki varyasyonlar,
3) Ekzon 7’deki tek nükleotid polimorfizmi (Şekil 6) (54-56) .
Şekil 6. eNOS geni intron/ekzon bölgelerinin düzenlenmesi ve bazı polimorfizmlerin şematik görünümü (55).
İntronlardaki polimorfizmlerin, promotor veya ekzon bölgesindekilere göre daha az fonksiyonel olduğu öne sürülmüştür. Ekzon bölgesindeki polimorfizmler protein yapıyı etkileyerek enzim aktivitesini değiştirebilmektedir (57).
Şimdiye kadar yapılmış çalışmalarda sadece tek bir ekzon bölgesi polimorfizmi (G894T/Glu298Asp) tanımlanabilmiştir. Glu298Asp ekzon polimorfizmi, eNOS geninin ekzon 7’sinde, 894. pozisyondaki guanin (G) bazının, timin (T) bazı ile yer değiştirmesi sonucu meydana gelir. Bu durumda normalde eNOS geninde 298. pozisyonunda ifade edilen glutamat (Glu) amino asiti yerine, aspartat (Asp) amino asiti sentezlenmiş olur (57-59). İlk olarak 1998’de Yoshimura ve arkadaşları tarafından gösterilen Glu298Asp polimorfizminin, koroner arter hastalığı, miyokard enfarktüsü, ateroskleroz, Alzheimer, migren, serebrovasküler hastalık, diabetes mellitus, hipertansiyon ve esansiyel hipertansiyon gibi birçok hastalıkla ilişkisinin araştırıldığı çalışmalar yapılmıştır (60-64).
HİPERTANSİYON PATOGENEZİNDE NO’NUN ROLÜ
Endotel fonksiyonunun değerlendirilmesinde genellikle endotel kaynaklı vasküler tonus değişikliği dikkate alınmaktadır. Endotel çevresel uyarılara yanıt olarak vazokonstriktör ve vazodilatatör nitelikte maddeler sentezleyip, salgılayabilen kompleks yapıda dinamik bir organdır. Endotel disfonksiyonu, endotelden salgılanan vazoaktif maddeler arasındaki dengenin bozulması sonucu, endotelin yapı ve fonksiyonlarında değişiklikler olmasıdır. Hipertansiyonda gözlenen vasküler tonus artışının, temelde endotel tarafından salgılanan vazokonstriktör ve vazodilatatör mediyatörler arasındaki dengesizlikten kaynaklandığı öne sürülmüştür (65,66). Kan ile damar duvarı arasındaki yerleşimi nedeniyle endotel, kan akımı ile ilişkili hemodinamik güçlere (shear stress) direkt olarak maruz kalmakta ve hemodinamik uyarılara karşı vazoaktif mediyatörler salgılamaktadır. Sağlıklı bir endotel varlığında, kan akımındaki artış, NO ve prostasiklin salınımı ile vazodilatasyonu uyarır. “Akıma bağlı vazodilatasyon” önemli bir korunma mekanizmasıdır. Bu mekanızma damar duvarını, kan akımı ile damar duvarı arasındaki, sürtünmeden köken alan kuvvetlere karşı koruyan önemli bir etkendir (67). NO, vasküler tonusu ve kan basıncını düzenlemenin yanı sıra, uyarılmış düz kasın gevşemesini sağlamakta, trombositlerin
endotele adezyonu ve agregasyonunu inhibe etmekte ve düz kasın proliferasyonunu baskılamaktadır (Şekil 7) (68,69).
Şekil 7. NO sentezi ve damar düz kası üzerine etkisi (70)
Deneysel modellerde NO inhibitörü verildiğinde kan basıncının yükseldiği, tuza duyarlı hipertansif sıçanlarda ise NO prekörsürü olan L-arjinin verilmesinin, kan basıncını düşürdüğü gözlemlenmiştir (70).
Yapılan çalışmalarda hipertansif bireylerde tanımlanan eNOS geni ile ilişkili mutasyonlar, hipertansiyon patogenezinde “bozulmuş NO-ilişkili vazodilatasyon”un varlığı yönünde önemli bir kanıttır (58). Hipertansiyonda endotel disfonksiyonu nedeniyle, hemodinamik strese cevap olarak üretilen ve vazodilatasyona neden olan NO'nun salınımı azalır, güçlü bir vazokonstriktör olan endotelin-1 yapımı artar, anjiyotensin dönüştürücü enzim uyarılır. Vazokonstriktör maddelerle ilişkili büyüme faktörleri ve sitokinler, endotelyal matrikste yapısal değişikliklere ve patolojik vasküler yeniden yapılanmaya (remodelling) neden olurlar (Şekil 8). Sonuçta endotel disfonksiyonu, vasküler hasar ve vasküler dirençte artışa neden olarak, hipertansiyonun gelişmesinden sorumlu olan “vasküler mekanizma” patogenezinde önemli bir rol oynar (71,72).
Şekil 8. Hipertansiyon gelişiminde vasküler mekanizma (71)
Hipertansif hastalarda endotel disfonksiyonu sonucunda artan serbest oksijen radikalleri, NO'nun damar duvarı üzerindeki yararlı ve koruyucu etkilerini ortadan kaldırır (72). Disfonksiyone endotel, normal endotele kıyasla daha fazla miktarda süperoksit üretmektedir. NO ve süperoksit tepkimeye girerek oldukça toksik bir bileşik olan nitratı (NO3) oluşturur. Bu bileşik, peroksinitröz aside dönüşür. Hidroksil
ve nitrojen dioksit radikalleri ile beraber nitronyum iyonu da oluşur. Bu radikaller çok kuvvetli oksidan maddelerdir. Oksidatif stres, kardiyovasküler sistemde NO'nun biyoyararlanımını azaltır, vazokonstriksiyona yol açarak kan basıncının yükselmesine neden olur. Aynı zamanda eNOS enziminin kofaktörlerinin konsantrasyonları da azalır. Bu azalmanın sonucu olarak süperoksit ile peroksinitröz asit üretimi daha da hızlanır. Biyoaktif NO kaybı ve oksidatif stres artışı sonucu lipid peroksidasyonu, oksidatif nitratlanma hasarı, sitotoksisite, DNA hasarı ve enzim inaktivasyonu gerçekleşir. Lipid peroksidasyonu ve oksidatif nitratlanma hasarı, hipertansiyon ve aterosklerozun yer aldığı birçok kardiyovasküler hastalıkla yakından ilişkilidir. Sonuç olarak, endotel fonksiyon bozukluğu, hipertansiyon ve hipertansiyona bağlı organ hasarının başlamasında tetikleyici rol oynamaktadır (68,70).
GEREÇ VE YÖNTEM
ÇALIŞMA GRUPLARI
Pamukkale Üniversitesi Eğitim Uygulama ve Araştırma Hastanesi Kardiyoloji Kliniği’ne başvurmuş ve primer hipertansiyon tanısı almış, yaşları 18-65 yaş arasında değişen 123 hasta ve sağlıklı olarak kabul edilen, yaşları 22-68 yaş arasında değişen 78 kontrol çalışmaya dahil edilmiştir. Tüm katılımcılara yaş, cinsiyet, boy, kilo, bel çevresi, kalça çevresi, hipertansiyon aile öyküsü, koroner arter hastalığı öyküsü, serebrovasküler hastalık öyküsü, diabetes mellitus varlığı, sigara ve alkol kullanımı, hipertansiyon tedavisi görüp görmediğini içeren anket formu soru-cevap yöntemi ile uygulanmıştır. Sekonder nedenlerle hipertansiyon gelişmiş hastalar çalışma grubuna alınmamıştır. Çalışma grubunda myokard infarktüsü geçirmiş hasta yoktur.
Çalışmaya katılan tüm bireylerden 12 saatlik açlık sonrası lipid profili (Total kolesterol, trigliserit, HDL-K) ölçümü için bir adet jelli vakumlu tüpe en az 8 ml ve eNOS genotiplendirmesi ve plazma NO düzeyi ölçümü için iki adet EDTA’lı tüpe 2 ml olmak üzere kan alındı. EDTA’lı tüpe alınan örneklerden biri DNA izolasyonu için tam kan olarak -20oC de saklandı, diğeri plazma NO düzeyi ölçümü için 3000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilerek plazmasına ayrıldı ve analize kadar -20°C’de saklandı.
KULLANILAN CİHAZLAR
o Masa üstü santrifüj (NF 1215, Nüve, Türkiye)
o Soğutmalı masa üstü santrifüj (Hettich, MİKRO 22 R, Almanya) o Spektrofotometre (U.V 1601, Shimadzu, Japonya)
o Etüv (EN 500, Nüve, Türkiye) o pH metre (pH 526, WTW, Almanya)
o Vorteks/Spin santrifüj (FVL-2400N, Biosan, Letonya) o Kuru ısıtıcılı blok (TDB120, Biosan, Letonya)
o Yatay elektroforez seti (Model 75.1214, Model 75.710, CLP, ABD) o Elektroforez güç kaynağı (Power station 300, Labnet, ABD)
o Thermal cycler (ATC 201, CLP, ABD) o Mikrodalga fırın (Beko, Türkiye) o -20°C derin dondurucu (Beko, Türkiye) o +4°C buzdolabı (Vestel, Türkiye) o Hassas terazi (Sartorius, Almanya)
o Jel görüntüleme sistemi (Gel Logic 200, Kodak, ABD)
o Otomatik pipet seti (1-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL) (Eppendorf, ABD) o Architect Cİ 8200 analizörü (Abbott Diagnostics/Almanya)
o BioTek Power Wave XS (211561 seri no, USA) ELİSA cihazı
KULLANILAN SARF MALZEMELER
o Sodyum klorür (NaCL, MW: 58,4 g/mol) (Sigma-S6150, Almanya) o Potasyum klorür (KCL, MW: 74,55 g/mol) (Sigma-P1597, Almanya) o Magnezyum klorür (MgCL2,MW: 95,21 g/mol) (Sigma-M8266, Almanya)
o Amonyum klorür (NH4CL, MW: 53.49 g/mol) (Sigma-A9434, Almanya)
o Potasyum Bikarbonat (KHCO3, MW: 100.12 g/mol) (Sigma-Aldrich-237205,
Almanya)
o Sodyum dodesil sülfat (CH3(CH2)11OSO3Na, MW: 288.38 g/mol) (Sigma-L4390,
Almanya)
o Proteinaz K (20.1 mg/mL) (Sigma-P5568, Almanya)
o Fenol (C6H5OH, MW: 94.11 g/mol) (Sigma-Aldrich-P1037, Almanya)
o Kloroform (Scharlau, İspanya)
o izoamilalkol (CH3)2CHCH2CH2OH, MW: 88.15 g/mol) (Aldrich-W205702,
Almanya)
o Etanol (Scharlau, İspanya)
o Sodyum asetat (CH3COONa, MW: 82,03 g/mol) (Sigma-Aldrich-S8750,
Almanya)
o Primerler (Metabion, Almanya)
Oligonükleotid 2; 5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' o dNTP karışımı (Fermentas, Litvanya)
o Tag polimeraz (10x tamponu ile birlikte) (Bioron, Almanya) o Magnezyum klorür (Bioron, Almanya)
o Eco241 kesim enzimi (10x tamponu ile birlikte) (Fermentas, Litvanya) o 50 bp DNA marker (Fermentas, Litvanya)
o Agaroz (Scharlau, İspanya) o Borik asit (Scharlau, İspanya)
o Etilen diamin tetra asetik asit (Scharlau, İspanya) o Etidyum bromür (Scharlau, İspanya)
o Jel yükleme boyası
o Sodyum hidroksit (Carlo Erba, İtalya)
o Tris-(hidroksimetil)-aminometan (Scharlau, İspanya) o N-(1-naftil) etilendiamin (NED) (Merck, Almanya) o Sülfanilamid (Sigma, Almanya)
o Ortofosforik asit (Merck, Almanya) o β-NADPH (Fluka, Almanya) o Nitrat redüktaz (Roche, Almanya) o Sodyum nitrat (Merck, Almanya)
o 10 µL, 100 µL, 1000 µL filtreli otomatik pipet ucu (CLP, ABD) o 0,2 µL’lik kapaklı tüp (CLP, ABD)
o 1,5 mL nükleaz içermeyen kapaklı mikrosantrifüj tüpü (CLP, ABD) o EDTA’lı tüp (Greiner bio-one, Almanya)
o Cam malzemeler o Mikroplak 96’lık
eNOS GEN POLİMORFİZMİNİN GÖSTERİLMESİ
Kan Örneklerinden DNA’nın İzole Edilmesi
EDTA’lı tam kan örneklerinden kit kullanılmadan DNA izolasyonu yapıldı. DNA izolasyonu için gerekli çözeltiler aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır;
• 5xRTÇ (Retikülosit tuz çözeltisi): (686 mM) NaCL 40.08 g, (25 mM) KCL 1.86 g ve (35 mM) MgCL2 7.11 g tartılıp, 1 L distile suda çözüldü. Bu çözelti
1xRTÇ olacak şekilde dilüe edilerek kullanıldı.
• Lizat Çözeltisi: (155 mM) NH4CL 8.29 g, (10 mM) KHCO3 1 g ve 500 mM
EDTA’dan 200 µL alınıp, 1 L distile suda çözüldü.
• 1xSTE (Salin (tuz)-Tris-EDTA): (100 mM) NaCL 5.84 g, 1 M’lık Tris’den 10 mL ve 500 mM EDTA’dan 1 mM olacak şekilde 2 mL alınıp, 1 L distile suda çözüldü.
• 10xSDS (Sodyum dodesil sülfat): SDS (288.38 g/mol)’den %10’luk hazırlandı.
• Proteinaz K: 822 U/mL (20.1 mg/mL)
• Trisle doyurulmuş fenol: Kristal haldeki fenol 65°C’de eritildi, hidroksi kinolin eklendi ve trisle pH: 7.0’a getirildi.
• Kloroform izoamilalkol 24:1 oranında hazırlandı. • %70’lik soğuk etanol
• 3 M Sodyum asetat (CH3COONa): pH: 5.2 olacak şekilde asetik asit ile
ayarlandı.
DNA İzolasyonu Çalışma Basamakları;
1- 5 mL kan örneği 50 mL’lik falkon tüpe boşaltıldı. Üzerine 40 mL 1xRTÇ
çözeltisi eklendi.
2- 2000 rpm’de 15 dk santrifüj yapılarak, üstteki süpernatan atıldı. 1xRTÇ ile
yıkama işlemi bu şekilde 3 defa uygulandı.
3- Altta kalan pelletin üzerine 40 mL soğuk lizat çözeltisi eklendi,
vortekslenerek pelletin iyice çözülmesi sağlandı. +4°C’de buzdolabında 1 saat çözelmeye bırakıldı.
4- 1 saat sonunda 3500 rpm’de 15 dk santrifüj yapıldı.
5- Santrifüj sonrası süpernatan döküldü, dipteki çökeltinin üzerine 15 mL
1xSTE çözeltisi eklendi.
6- 3500 rpm’de 15 dk santrifüj yapıldı. Santrifüj sonrası süpernatan döküldü. 7- Tüpün üzerine 450 µL 1xSTE çözeltisi eklendi. Tüm sıvı içerik ependorf
tüpüne boşaltıldı. Üzerine sırasıyla 50 µL %10’luk SDS ve 5 µL proteinaz-K eklendi. Hafifçe karıştırıldı. 37°C’de bir gece inkübasyona bırakıldı.
8- Bir gece sonra inkübasyondan alındı, üzerine 600 µL trisle doyurulmuş fenol
eklendi. Vortekslenerek karışması sağlandı.
9- 11.000 rpm’de 15 dk santrifüj yapıldı.
10- Santrifüj sonrası berrak süpernatan, alttaki sıvı ile karıştırılmadan dikkatlice
temiz bir ependorf tüpüne pipetle aktarıldı. Üzerine 400 µL 24:1 oranında kloroform izoamilalkol hızla eklendi ve iyice vortekslendi.
11- 11.000 rpm’de 15 dk santrifüj yapıldı. Bu esnada temiz cam tüplere 7 mL
%70’lik soğuk etanol ve üzerine 50 µL 3 M sodyum asetat eklendi, hafifçe çalkalanarak karıştırıldı.
12- Santrifüjlenen karışımların süpernatanları alınıp, hazırlanan cam tüplere
konuldu. Beyaz iplikçik şeklinde DNA gözlemlendi. Bu beyaz pelletle birlikte alınabildiği kadar sıvı kısım alınıp, temiz ependorf tüplerine konuldu.
13- 13.000 rpm’de 15 dk santrifüj yapıldı. Üzerlerine %70’lik soğuk etanol
eklendi. 11.000 rpm’de 2 dk santrifüj yapıldı. Santrifüj sonrası DNA çepere yapışmış olduğundan sıvı kısım döküldü.
14- Ependorf tüpleri ağızları açık bir şekilde kurutma cihazında kurutuldu.
Sonrasında 150 µL steril distile su eklendi. Pelletin çözülmesi için hafifçe vortekslendi. +4°C’de bir gece bekletilip, ertesi gün DNA saflığı ve miktarı değerlendirildi ve PCR’da kullanılmak üzere -20°C’ye kaldırıldı.
DNA Saflık Değerlendirmesi: DNA örnekleri distile su ile 1/100 oranında
seyreltildi. Spektrofotometrenin distile su ile kör ayarı yapıldıktan sonra, nükleotidlerin heterosiklik halkalarının maksimum absorbans verdikleri 260 nm’de DNA’nın ve 280 nm’de RNA ile proteinlerin vermiş olduğu absorbanslar ölçüldü. 260 nm’de okunan absorbansın, 280 nm’de okunan absorbansa bölünmesi ile elde
edilen orana bakılarak DNA izolasyonunun saflığı değerlendirildi. Saf bir DNA izolasyonu için bu oran 1,7-2 olmalıdır (73).
DNA Miktarının Hesaplanması: DNA’nın 260 nm’de vermiş olduğu 1
birimlik absorbans (A) 50 µg/mL DNA’ya karşılık gelir. Buna göre elde edilmiş olan DNA’nın miktarı aşağıdaki formüle göre hesaplandı (73).
DNA miktarı (µg/mL): Seyreltme katsayısı (100) x A260 x 50
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Yöntemi
Elde edilen DNA örneklerinden, hedef eNOS gen bölgesini içeren 248 baz çiftlik (bp) kısmın çoğaltılmasında 5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA–3' ve 5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA–3' baz dizili oligonükleotidler kullanıldı. Naber ve arkadaşlarının programı modifiye edilerek hedef DNA’nın çoğaltılmasında kullanıldı (74).
Öncelikle örnek sayısına uygun olarak “PCR karışımı” hazırlandı;
1 örnek için PCR karışımının içeriği Miktar (µL)
10x PCR tamponu 2
dNTP karışım (0,2 mM her biri) 2
MgCl2 (1,5 mM) 4
Oligonükleotid 1 (10 pmol/µL) 1
Oligonükleotid 2 (10 pmol/µL) 1
Tag polimeraz (1,25 U) 0,25
Distile su 7,75
PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu, dNTP: Deoksinükleotid trifosfat, MgCL2: Magnezyum klorür
Kontrol PCR tüpüne negatif kontrol için 2 µL distile su ve örnek tüplerinin her birine 2 µL DNA örneği konulduktan sonra üzerine hazırlanmış olan PCR karışımı eklendi. Ardından uygun ısı ve sayıda döngü için Thermal Cycler cihazına yerleştirildi (74).
İlk aşama:
Tüpler 95oC’de 5 dk ısıtıldı, çoğaltılacak olan DNA çift sarmalının birbirinden ayrılması sağlandı (DNA denatürasyonu).
İkinci aşama: 3 kademeli 30 döngü uygulandı;
* Birinci kademede; 94oC’de 30 sn ısıtıldı, çoğaltılan eNOS gen bölgesi çift zincirlerinin ayrılması sağlandı,
* İkinci kademede; 60oC’de 30 sn ısıtıldı, oligonükletid 1 ve 2’nin bağlanması sağlandı (Annealing),
* Üçüncü kademede; 72oC’de 30 sn ısıtıldı, uzama (Extension) sağlandı. (Tag polimeraz enzimi ile tamamlayıcı zincir sentezi olur.)
En son aşama: 72oC’de 5 dk ek bir uzama inkübasyonu uygulandı. 248 bp’lik PCR ürünleri elde edildi.
Kesim Parça Uzunluğu Polimorfizmi (RFLP) Yöntemi
eNOS gen bölgesinin çoğaltılması ile elde edilmiş olan 248 bp’lik hedef DNA’nın kesilmesi için standart RFLP yöntemi kullanıldı (74).
Öncelikle “kesim karışımı” hazırlandı;
1 örnek için kesim karışımının içeriği Miktar (µL)
10x Kesim tamponu 2
Eco241 (HgijII) kesim enzimi* (1 Ü/µL) 2
Distile su 2
*Eco241 (HgijII) kesim enzimi Escherichia Coli bakterisinden izole edilmiştir (75)
PCR tüpüne 2 µL çoğaltılmış olan hedef DNA parçası konup, üzerine kesim için hazırlanmış olan karışım eklendi. Hemen ardından 37oC’de 16 saat inkübe edildi.
Şekil 9. Eco241 kesim enziminin hedefi (58,74)
eNOS: Endotelyal nitrik oksit sentaz, G: Guanin, Glu: Glutamik asit, T: Timin, Asp: Aspartik asit
eNOS geninin 894. pozisyonunda normalde guanin bazı bulunur. Bu durumda 298. aminoasit glutamik asittir. Enzim bu bölgedeki baz dizilimini tanıyarak glutamik asit oluşumunu sağlayan normal alleli iki banda ayırarak keser. eNOS geninin 894. pozisyonu timin bazı ile yer değiştirdiyse, 298. amino asit aspartik asit olur. Bu durumda Eco241 enzimi gen bölgesini tanıyamaz ve kesim yapamaz. Homozigot polimorfizimi gösteren olgularda her iki allelde de 894. pozisyonda normalde olması gereken guanin bazı, timin bazı ile yer değiştirmiştir, sonuçta 298. amino asit aspartik asit (Asp/Asp) olduğundan, Eco241 enzimi hiç kesim yapamaz. Heterozigot polimorfizm gösteren olgularda allellerden birinde 298. amino asit glutamat, diğer alleldeki aspartattır (Glu/Asp). Bu nedenle Eco241 enzimi normal olan alleli, 163 bp ve 85 bp’lik iki parça olarak keser (58,74,76).
Agaroz Jel Elektroforezi
Etidyum bromür içeren % 2’lik agaroz jel hazırlanarak, PCR sonrası elde edilen ürünler ve sonrasında RFLP’den elde edilen ürünler ayrı ayrı elektroforetik olarak yürütüldü (73).
5xTBE (Tris-borik asit-EDTA) tampon solüsyonu hazırlandı; 27,5 gr borik asit ve 54 gr tris-baz tartıldı. Üzerine 20 mL 0,5 M pH’ı 8,0 EDTA eklendi. Son hacim
distile su ile 1000 mL’ye tamamlandı. Oda ısısında saklandı. 5xTBE tampon solüsyonu 5 kat sulandırılarak 1xTBE tampon solüsyonu hazırlandı. Elektroforez tankında 1xTBE tampon solüsyonu kullanıldı (73).
%2’lik agaroz jel hazırlandı; 0.7 gr agaroz tartılıp, 40 mL 1xTBE tampon çözeltisi içinde, mikrodalga fırında maksimum sıcaklıkta 2 dk ısıtılarak çözüldü. Üzerine 2 µL etidyum bromür eklendi. Agaroz jel sıvı halde iken tanka döküldü. Oda ısısında yaklaşık 30 dk soğuması beklendi.
Agaroz jelin ilk kuyucuğuna 50 bp’lik DNA marker, diğer kuyucuklarına Orange-G boyası ile karıştırılan örnekler yüklendi ve 140 Volt’ta 40 dk yürütüldü. Ardından jel görüntüleme sistemi ile incelendi (Şekil 10 ve 11).
Hedef eNOS gen bölgesinin;
Şekil 10. PCR sonrası elektroforez görüntüsü (74).
Şekil 11. RFLP sonrası elektroforez görüntüsü (74)
M: Moleküler marker, T: Timin, TT: Homozigot polimorfik olgu, G: Guanin, GG: Homozigot normal olgu, GT: Heterozigot olgu, bp: Baz çifti
* Genetik polimorfizm göstermeyen olgularda (GG), 163 bp ve 85 bp’de iki bant görülür.
* 894. pozisyonda G→T değişimi olan homozigot olgularda (TT), 248 bp’de tek bant görülür.
* Heterozigot olgularda (GT), 248 bp, 163 bp ve 85 bp’de üç bant görülür (Şekil 11) (58,74,76).
NİTRİK OKSİT DÜZEYLERİNİN ÖLÇÜMÜ
-20oC’de dondurularak saklanan EDTA’lı kan örneklerinin plazmasından Griess yöntemi ile NO düzeyi saptandı. Nitrik oksit çok kısa yarı ömürlü olduğu için hızla metabolitleri olan nitrit ve nitrata dönüşür. Griess yönteminde; NADPH varlığında nitrat, nitrat redüktaz tarafından nitrite indirgenir. Sülfanilamidin amino grubu asit ortamda, nitrit ile reaksiyona girerek diazotizasyona uğrar ve Naftiletilendiamin (NED) ile mor renkli bir azo ürünü oluşturur (77).
Griess A Reaktifi; 0,1 gr NED, 100 mL distile suda çözülerek hazırlandı. Griess B Reaktifi; 1 gr sülfanilamid, %5 (v/v) 100 mL ortofosforik asitte
* Ölçüm için ilk basamakta 1 µM, 2,5 µM, 5 µM, 10 µM ve 25 µM düzeylerinde seyreltilerek hazırlanan nitrit standartları ile örnekler 50’şer µL olmak üzere mikroplağa konuldu.
* Ardından nitratın nitrite dönüşümü için 12 mM’lık β-NADPH’dan ve 100 Ü/L’lik nitrat redüktaz enziminden 25’er µL eklenerek 37oC’de 30 dk inkübe edildi.
* Sürenin bitiminde 50’şer µL Griess A ve Griess B reaktifi eklendi ve 10 dk oda ısısında inkübasyona bırakıldı.
* İnkübasyonun ardından tüm örneklerin ve standartların optik dansiteleri, enzim bağlı immunosorbent yöntem (ELISA – Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay) ile BioTek Power Wave XS (211561 seri no, USA) cihazında 540 nm dalga boyunda okundu.
Nitrit standartları kullanılarak hazırlanmış kalibrasyon eğrisine göre plazma NO düzeyleri hesaplandı (77,78).
TOTAL KOLESTEROL ÖLÇÜMÜ
Total kolesterol ölçümü enzimatik kolorimetrik yöntem ile Architect Cİ 8200 analizöründe (Abbott Diagnostics/Almanya) yapıldı. Bu yöntemin ilk reaksiyonunda kolesterol esterleri, kolesterol esteraz ile serbest kolesterol ve yağ asidi oluşturacak şekilde parçalanır. Ardından kolesterol, kolesterol oksidaz ile kolest–4-en–3-one ve hidrojen peroksite (H2O2) dönüştürülür. Açığa çıkan H2O2, kromofor oluşturmak
üzere, hidroksibenzoik asid (HBA) ve 4-aminoantipyrin ile birleştirilerek, oluşan rengin absorbansı fotometrik olarak tespit edilir.
Kit prospektüsünde kolesterolün referans değeri erkeklerde ve kadınlarda < 200 mg/dL (5,18 mmol/L) olarak verilmiştir.
TRİGLİSERİT ÖLÇÜMÜ
Trigliserit ölçümü enzimatik kolorimetrik yöntem ile Architect Cİ 8200 analizöründe (Abbott Diagnostics/Almanya) yapıldı. Bu yöntemde trigliseritlerin gliserole, hızlı ve tam olarak hidroliz olabilmesi için lipoprotein lipaz kullanılır. Üretilen H2O2 daha sonra 4-aminofenazon ve 4-klorofenol ile kırmızı bir boya
maddesi oluşturmak için peroksidazın katalitik etkisi altında reaksiyona girer. Ortaya çıkan rengin absorbansı fotometrik olarak ölçülür.
Kit prospektüsünde trigliseritin referans değeri erkeklerde ve kadınlarda < 150 mg/dL (<1,70 mmol/L) olarak verilmiştir.
HDL-KOLESTEROL ÖLÇÜMÜ
HDL-kolesterol ölçümü homojen enzimatik kolorimetrik yöntem ile Architect Cİ 8200 analizöründe (Abbott Diagnostics/Almanya) yapıldı. Bu yöntemde, HDL-kolesterol esterleri polietilen glikol (PEG)-HDL-kolesterol esteraz enzimi yardımıyla serbest HDL-kolesterol oluşturacak şekilde parçalanır. Ardından PEG-kolesterol oksidaz enziminin katalizi altındaki bir reaksiyon ile H2O2 meydana gelir. Oluşan
H2O2, sodyum N-(2-hidroksi–3-sülfopropil)-3,5-dimethoksianilin (HSDA) ve
4-Aminoantipirin ile reaksiyona girerek renkli bir ürün ortaya çıkartır. Bu renkli bileşiğin verdiği absorbans fotometrik olarak ölçülür.
Kit prospektüsünde HDL-kolesterolün referans aralığı erkeklerde >45 mg/dl (>1,17 mmol/L) ve kadınlarda >55 mg/dL (>1,42 mmol/L) olarak verilmiştir.
VLDL ve LDL-KOLESTEROL HESAPLANMASI
VLDL-kolesterol ve LDL-kolesterol Friedewald formülü kullanılarak hesaplandı:
LDL-kolesterol= [Total kolesterol - (VLDL+HDL)] VLDL-kolesterol= Trigliserit/5
Formül trigliserit <400 mg/dL olduğunda geçerlidir. Örneklerimizin trigliserit sonuçlarının hepsi <400 mg/dL olduğu için tüm VLDL-kolesterol ve LDL-kolesterol düzeyleri bu formül ile hesaplandı. LDL-kolesterolün referans aralığı <100 mg/dL (<2,59 mmol/L) olarak verilmiştir.
İSTATİSTİKSEL ANALİZ
İstatistiksel analiz SPSS 11,0 versiyonu kullanılarak yapıldı. Çalışma grubunun ölçümle belirtilen verileri ortalama±standart sapma ( ±SD) olarak verildi ve
Kruskal Walles ve gerek duyulduğunda post-hoc testleri ile analiz edildi. Sayımla
belirtilen verileri ise Ki-kare testi ile karşılaştırıldı. Çalışma grubu polimorfizm ve genotip dağılımı Ki-kare testi ile değerlendirildi. Gruplar arasında genotip dağılım ve allel sıklığının anlamlı farkı olup olmadığının kontrolü için Ki-kare testi ve
Fischer’in Kesin Ki-Kare testi (Fischer Exact Test) kullanıldı. Tüm analizlerde
BULGULAR
Çalışmaya 38’i erkek, 40’ı kadın toplam 78 kontrol ve 48’i erkek, 75’i kadın toplam 123 primer hipertansiyon hastası dahil edildi. Çalışma grubunun özellikleri ve laboratuvar verileri Tablo 5’de görüldüğü gibidir.
Ailede hipertansiyon öyküsü, vücut kütle indeksi (VKİ (kg/m2)), bel çevresi, kalça çevresi, bel çevresi/kalça çevresi oranı, total kolesterol, trigliserit ve LDL-kolesterol ortalamaları primer hipertansiyon grubunda kontrol grubundan istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek (p<0,001); HDL-kolesterol anlamlı düzeyde düşük bulundu (p<0,001). Primer HT grubunda kadın cinsiyet yüzdesi (%61), kontrol grubuna göre (%48,7) yüksek olmasına rağmen bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Yaş, cinsiyet ve SVO (Serebrovasküler olay) geçirme öyküsü açısından iki grup arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Diabetes mellitus, SVO geçirme öyküsü, KAH öyküsü kontrol grubunda mevcut değildi (Tablo 5).
Hastaların 89 (%72,4)’u sigara içmiyor, 28 (%22,8)’i sigara içiyordu, 6 (%4,9)’sı sigarayı bırakmıştı. Kontrol grubunun 53 (%67,9)’ü sigara içmiyor, 22 (%28,2)’si sigara içiyordu, 3 (%3,8)’ü sigarayı bırakmıştı. Sigara kullanımı açısından iki grup arasında anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 5).
Hasta ve kontrol grubunda düzenli alkol alımı öyküsü yoktu. Alkol alımı sosyal içicilik düzeyindeydi. Hasta ve kontrol grubunda alkol kullanımı açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 5).
Tablo 5. Primer Hipertansiyon ve kontrol grubunun özelliklerinin karşılaştırılması Değişken Primer HT (n=123) (Ortalama±SD) Kontrol (n=78) (Ortalama±SD) p Yaş (yıl) 49,91±9,86 50,28±8,59 0,778 Cinsiyet (Erkek(%)/kadın(%)) 48 (39)/75 (61) 38 (51,3)/40(48,7) 0,190 VKİ (kg/m2) 29,17±4,26 25,76±2,59 0,000* Bel çevresi 108,12±14,63 93,15±14,58 0,000* Kalça çevresi 119,52±11,11 108,02±10,50 0,000*
Bel çevresi/ Kalça çevresi 0,90±0,08 0,86±0,09 0,001*
SVO geçirme öyküsü (n %) 3 (2,4) -
-KAH öyküsü (n %) 18 (14,6) -
-Ailede hipertansiyon öyküsü (n %) 105 (85,4) 30 (38,5) 0,000* Diabetes mellitus (n %) 42 (34,1) - -Sigara kullanımı (n%) 28 (22,8) 22 (28,2) 0,666 Total kolesterol (mg/dL) 187,85±39,79 160,98±24,66 0,000* Trigliserit (mg/dL) 156,71±78,59 88,73±41,98 0,000* HDL-kolesterol (mg/dL) 46,32±12,47 60,68±11,31 0,000* LDL-kolesterol (mg/dL) 109,94±34,42 82,54±22,08 0,000*
* İstatistiksel olarak anlamlı, Primer HT: Primer hipertansiyon, n: Olgu sayısı, VKİ: Vücut kütle indeksi, HDL: Yüksek yoğunluklu lipoprotein, LDL: Düşük yoğunluklu lipoprotein, SD: Standart sapma
Primer HT grubunda Glu298Asp homozigot olgu sayısı (%9,8), kontrol grubundan (%3,8) daha yüksek saptanmasına rağmen, istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (Tablo 6). T allel varlığının primer HT için odds oranları Tablo 7’de verilmiştir.
Tablo 6. Glu298Asp polimorfizminin genotipik dağılımı ve allellik sıklığı
Primer HT: Primer hipertansiyon, n: Olgu sayısı, eNOS: Endotelyal nitrik oksit sentaz, Asp: Aspartik asit, Glu: Glutamik asit, T: Timin, G: Guanin, χ2: Ki kare
Tablo 7. T allel varlığının primer HT için odds oranları
χ2 (%95 Güven aralığı)Odds oranı p GG’ye karşı GT ve TT 0,054 0,934 (0,525-1,661) 0,228 G allele karşı T allel 0,015 1,030 (0,641-1,654) 0,904 G: Guanin, T: Timin, χ2: Ki kare
Çalışma grubundaki allel sıklığı Hardy-Weindberg eşitliğine göre beklenen sıklıktan anlamlı farklılık göstermedi (c2= 1,36, p= 0,756).
Primer HT (n=123) Kontrol(n=78) χ 2 / p eNOS genotip 3,064 / 0,216 Asp/Asp [n (%)] (TT) 12 (9,8) 3 (3,8) Glu/Asp [n (%)](GT) 38 (30,9) 30 (38,5) Glu/Glu [n (%)](GG) 73 (59,3) 45 (57,7) Alleller 0,015/ 0,904 T [n (%)] 62 (25,2) 36 (24,66) G [n (%)] 184 (74,8) 120 (75,34)
Primer HT ve kontrol grubunda cinsiyete göre T allel sıklığı karşılaştırıldığında, her iki cinsiyette T allel varlığı açısından anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 8). Primer HT grubunda kadınlarda GG genotip dağılımı (%67,1), erkeklere göre daha yüksek olmakla birlikte istatistiksel olarak anlamlı değildi (Tablo 8).
Tablo 8. Primer HT ve kontrol grubunda cinsiyete göre T allel sıklığı
Primer HT Kontrol Cinsiyet
T allel var *
[n (%)] T allel yok**[n (%)] T allel var*[n (%)] T allel yok**[n (%)] p
Kadın 26 (52) 49 (67,1) 16 (48,5) 24 (53,3) 0,093
Erkek 24 (48) 24 (32,9) 17 (51,5) 21(46,7) 0,674
*GT+TT genotipli,**GG genotipli, Primer HT: Primer hipertansiyon, n: Olgu sayısı, G: Guanin, T: Timin.
Tüm grup ve eNOS genotiplerine göre plazma NO düzeyleri karşılaştırıldığında, primer HT grubunun ortalaması (0,87±0,58), kontrol grubunun ortalamasından (1,02±0,58) daha düşüktü, ancak istatistiksel olarak anlamlı değildi. Primer HT ve kontrol grubunun genotipler arası plazma NO düzeyleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (Tablo 9).
Tablo 9. Tüm grup ve genotipe göre plazma NO düzeyleri (µM±SD) ( ±SD)
Genotip ve NO düzeyleri Gruplar (n = 201) Tüm grup NO düzeyleri (µM± SD) GG (n=118) GT (n=68) TT (n=15) p Primer HT (n=123) 0,87± 0,58 0,88± 0,54 0,84 ± 0,56 0,91 ± 0,86 0,578* Kontrol (n=78) 1,02± 0,58 1,11± 0,59 0,89 ± 0,53 0,92 ± 0,94 0,106* Primer HT: Primer hipertansiyon, NO: Nitrik oksit, n: Olgu sayısı, : Aritmetik ortalama, SD: Standart sapma, µM: Mikromolar, T: Timin, G: Guanin. * Genotiplere göre NO düzeyi istatistiğine ait değer.
T allele (GT/TT) sahip örneklerde plazma NO ortalaması (0,87±0,57), T allel içermeyen (GG) bireylere (0,97±0,56) göre daha düşüktü, fakat istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (Tablo 10).
Tablo 10. T allel varlığında ve T allel yokluğunda plazma NO düzeyleri(µM± SD) T allel var * (n=83) T allel yok** (n =118) p NO Düzeyi Ortalaması( ±SD) 0,87±0,57 0,97±0,56 0,231
* GT/TT genotipli,* * GG genotipli, NO: Nitrik oksit, n: Olgu sayısı, T: Timin, SD: Standart sapma, µM: Mikromolar
Her iki grubun sigara kullanımı cinsiyete göre değerlendirildiğinde; primer HT’lu kadınların 73 (%97,3)’ü sigara içmiyor, 1 (%1,3)’i sigara içiyor, 1 (%1,3)’i sigarayı bırakmıştı. Kontrol grubunda ise kadınların 38 (%95)’i sigara içmiyor, 2 (%5)’i sigara içiyordu. Kadın cinsiyette sigara kullanımı açısından hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı fark bulunmadı (Tablo 11). Primer HT’lu erkeklerin 16 (%33,3)’sı sigara içmiyor, 27 (%56,3)’si sigara içiyor, 5 (%10,4)’i sigarayı bırakmıştı. Kontrol grubunda ise erkeklerin 15 (%39,5)’i sigara içmiyor, 20 (%52,6)’si sigara içiyor, 3 (%7,9)’ü sigarayı bırakmıştı. Erkek cinsiyette sigara kullanımı açısından hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı fark bulunmadı (Tablo 11).
Tablo 11. Sigara kullanımının cinsiyete göre dağılımı
Sigara Cinsiyet ve Örnekler İçmiyor
(n %) İçiyor (n %) Bırakmış (n %) χ2 / p Primer HT (n=75) 73 (97,3) 1 (1,3) 1 (1,3) Kadın Kontrol (n=40) 38 (95) 2 (5) -1,892/0,388 Primer HT (n=48) 16 (33,3) 27(56,3) 5 (10,4) Erkek Kontrol (n=38) 15 (39,5) 20 (52,6) 3 (7,9) 0,418/0,812 Primer HT: Primer hipertansiyon, n: Olgu sayısı, χ2: Ki kare
