ORTAÖĞRETİM FEN VE MATEMATİK ALANLAR
EĞİTİMİ ANA BİLİM DALI BİYOLOJİ EĞİTİMİ BİLİM DALI
JOJOBA'NIN (Simmondsia chinensis) IN VITRO HIZLI
ÇOĞALTIMI VE MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERLE
ERKEK VE DİŞİ BİTKİLERİN BELİRLENMESİ
Zeynep ÖNCEL
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMAN
Yrd.Doç.Dr. Semiha ERİŞEN
TEŞEKKÜR
Tez çalışmam boyunca, büyük sabır ve emek harcayan, gerek bilimsel gerekse manevi yönde desteğini benden esirgemeyen değerli hocam, Sayın Yrd. Doç. Dr. Semiha ERİŞEN’e en derin teşekkür ve saygılarımı sunarım.
Çalışmalarım boyunca her açıdan büyük destek gördüğüm ve yardımlarını benden hiçbir zaman esirgemeyen Sayın hocalarım, Prof. Dr. Mehmet BABAOĞLU ve Yrd. Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR’a ve her zaman yanımda olan, ilgi, destek ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen Sayın hocam, Dr. Emine ATALAY’a sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım.
Ayrıca laboratuvar çalışmalarımda destek ve yardımlarını gördüğüm Yük. Zir. Müh. M. Ufuk BACAKSIZ, Songül UYĞAN ve Zeynep TIRAŞ’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Maddi ve manevi desteklerini hayatımın her safhasında gördüğüm sevgili annem Perihan ÖNCEL’e ve tüm aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Zeynep ÖNCEL Konya, 2011
T. C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ Eğitim Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü
Ö
ğrencinin
Adı Soyadı Zeynep ÖNCEL
Numarası 085202011002
Ana Bilim / Bilim Dalı Ortaöğretim Fen ve Matematik Alanlar Eğitimi/ Biyoloji Eğitimi Bilim Dalı
Programı Tezli Yüksek Lisans Doktora
Tez Danışmanı Yrd.Doç.Dr. Semiha ERİŞEN
Tezin Adı
Jojoba'nın (Simmondsia chinensis) in vitro hızlı çoğaltımı ve moleküler işaretleyicilerle erkek ve dişi bitkilerin belirlenmesi
ÖZET
Bu tez çalışması, Jojoba (Simmondsia chinensis) bitkisinin in vitro hızlı çoğaltımı ve moleküler işaretleyicilerle erkek ve dişi bitkilerin belirlenmesi amacıyla yürütülmüştür. İn vitro hızlı çoğaltım için nodal segmentler (0.5, 1.0, 2.0 mg l-1)BAP, KİN ve (0.22, 0.44, 0.88 mg l-1) TDZ ile 1.5, 2.0 ve 2.5 mg l-1 BAP ve bunların bazı oksinlerle (1.25 mg l-1 IAA, IBA, NAA) kombinasyonlarını içeren MS besin ortamında kültüre alınmıştır. Denemeler sonunda eksplant başına en çok sürgün sayısı 9.13 adet ile 2.0 mg l-1BAP içeren MS besin ortamından elde edilmiştir.
İn vitro’da çoğalan sürgünler köklenme için NAA, IAA, IBA’nın farklı konsantrasyonlarını içeren MS besin ortamına alınmışlardır. Köklenme yüzdesi bakımından en iyi sonuç % 40 ile 3.0 mg l-1 NAA ve %30 ile 1.0 mg l-1 IBA içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. Köklenme yüzdesini artırmak amacıyla farklı şeker (%1.5) ve MS (1/2) konsantrasyonları ile aktif karbon (%0.5) ilavesinin etkisine bakılmıştır. En yüksek köklenme yüzdesi % 50 ile 1 mg l-1 IBA, % 1.5 şeker
ve % 0.5AC (aktif karbon) içeren ½ MS besin ortamından elde edilmiştir. Köklenen sürgünler başarıyla dış ortama alıştırılmış ve bitkiciklerin %75’inin hayatta kaldığı gözlemlenmiştir.
Cinsiyeti belirleme çalışmalarında; genomik DNA cinsiyeti belli erkek ve dişi bitkilere ve cinsiyeti belli olmayan rejenere sürgünlere ait genç yapraklardan izole edilmiştir. UBC-807 ve OPG-5 primerleri ile PCR uygulamaları gerçekleştirilmiştir. UBC-807 primerinden elde edilen jel görüntüsünden dişi ve erkek birey ayrımı başarıyla gerçekleştirilmiştir.
T.C.
SELÇUK ÜNİVERSİTESİ Eğitim Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü
Ö
ğrencinin
Adı Soyadı Zeynep ÖNCEL
Numarası 085202011002
Ana Bilim / Bilim Dalı Secondary School Science and Mathematics Education / Biology Education
Programı Tezli Yüksek Lisans Doktora
Tez Danışmanı
Yrd.Doç.Dr. Semiha ERİŞEN
Tezin İngilizce Adı In vitro micropropagation of jojoba (Simmondsia chinensis) and determination of male and female plants by molecular markers
SUMMARY
This thesis aimed in vitro micropropagation of jojoba plants and determination of male and female plants by the molecular markers. For in vitro micropropagation, nodal segments were cultured on MS basal medium containing (0.5, 1.0, 2.0 mg l-1 )BAP, KİN and (0.22, 0.44, 0.88 mg l-1 )TDZ or 1.5, 2.0 and 2.5 mg l-1 BAP alone and combinations with some auxine (1.25 mg l-1 IAA, IBA, NAA). The highest number of shoots per explant ( 9.13 shoots) was obtained on MS medium containing 2 mg l-1 BAP.
Regenerated shoots were cultured on MS medium containing different concentrations of NAA, IAA, IBA for rooting. The highest percentage of rooting (40%) was obtained on MS with 3.0 mg l-1 NAA followed by 1.0 mg l-1 IBA (30%). In order to increase the percentage of rooting, different concentrations of MS, sugar and the addition of activated carbon was examined. The highest percentage of rooting (50%) was obtained on ½ MS medium with 1.0 mg l-1 IBA plus 1.5% sugar and 0.5% activated carbon. Rooted shoots were succesfully acclimatized and the survival rate of plantlets was 75%.
Genomic DNA were isolated from leaves of male and female plants and non-gender regenerated shoots. PCR reactions have been carried with primers UBC-807 and OPG-5. Gel image obtained from UBC-807 were succesfully determinated male and female plants.
İÇİNDEKİLER
Bilimsel Etik Sayfası ... i
Tez Kabul Formu ... ii
Teşekkür ... iii Özet ... iv Summary ... vi İçindekiler ... vii Kısaltmalar ve Simgeler ... ix Tablolar Listesi ... xi
Şekiller Listesi ... xii
1. GİRİŞ ... … 1
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ... … 3
2.1. Jojoba ile ilgili genel bilgiler ... … 3
2.2. Bitki doku kültürü ile ilgili genel bilgiler ... … 7
2.3. Jojobanın in vitro hızlı çoğaltımı ile ilgili araştırmalar ... … 10
2.4. Genetik Markörler ... … 13
3. MATERYAL VE METOT ... … 16
3.1. Materyal ... … 16
3.2. Metot. ... … 16
3.2.1. Bitki doku kültürü çalışmaları ... … 16
3.2.1.1. Besin ortamlarının hazırlanışı ve sterilizasyonu ... … 16
3.2.1.2. Bitki büyüme düzenleyicileri ... … 17
3.2.1.3.Yeşil aksamın sterilizasyonu ... … 18
3.2.1.4.Tohumların sterilizasyonu ve çimlendirilmesi ... … 20
3.2.1.5. İn vitro'da yetiştirilen fidelerden eksplant izolasyonu ... … 20
3.2.1.6. Sürgünlerin köklendirilmesi ve dış ortama alıştırma ... … 21
3.2.1.7. Verilerin değerlendirilmesi ... … 21
3.2.2.1. DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve
saflıklarının belirlenmesi ... 21
3.2.2.2. PCR Çalışmaları ... 22
4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA ... … 24
4.1. Bitki doku kültürü çalışmaları ... … 24
4.1.1. Sterilizasyon çalışmaları ... … 24
4.1.2. Mikroçoğaltım çalışmaları ... 25
4.1.2.1. Farklı sitokininlerin sürgün çoğaltımına etkisi ... 26
4.1.2.2. BAP’ın farklı oksinlerle kombinasyonunun sürgün çoğaltımına etkisi ... 28
4.1.2.3. Köklendirme çalışmaları ... 32
4.2. Moleküler Genetik Çalışmalar ... 37
4.2.1. DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve saflıklarının belirlenmesi ... 37
4.2.2. PCR Çalışmaları ... 38 5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 40 6. KAYNAKLAR ... 43 7. ÖZGEÇMİŞ ... 47
KISALTMALAR VE SİMGELER 2IP: İzopentil adenin
2,4-D: 2,4-Diklorofenoksi asetik asit 2,4,5-T: 2,4,5-Triklorofenoksi asetik asit A: Adenin
AC: Aktif karbon atm: atmosfer
B5: Gamborg ve ark. 1968
BAP: 6-Benzil amino pürin Bp: Base pair-Baz çifti C: Sitozin
CH: Casein hydrolysate-kazein hidrolizat CTAB: Cetil Three Metil Amonyum Bromid cm: Santimetre
DNA: Deoksiribo nükleik asit dNTP: Deoksiribonükleotidtrifosfat EDTA: Etilen Diamin Tetra Asetik Asit F: F değeri G: Guanin g: Gram h/h: Hacim hacim HCl: Hidroklorik asit HgCl2: civa klorür
IAA: İndol-3- asetik asit IBA: İndol-3- butirik asit
ISSR: Inter Simple Sequence Repeat-İç Basit Dizi Tekrarları Kin: Kinetin
KO: Kareler ortalaması KOH: Potasyum hidroksit
LSD: Çoklu karşılaştırmalı istatistiksel test ml: Mililitre
mg: Miligram MgCl2: Magnezyum klorür mg l-1: Miligram / litre mm: Milimetre mM: Milimolar MS: Murashige ve Skoog, 1962 NAA: Naftalen asetik asit NaOCl: Sodyum hipoklorit ng: Nanogram
nm: Nanometre
PCR: Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu pH: Hidrojen gücü
pmol: Pikomol ppm: Milyonda bir
PVP: polyvinylpyrrolidone
RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA-Rastgele Çoğaltılmış DNA
Farklılığı
RNA: Ribonükleik asit
rpm: Rotation Per Minute-Dakikadaki Devir Sayısı SD: Serbestlik derecesi
T: Timin
Taq: Thermus aquaticus TBE: Tris-Borik asit-EDTA
TDZ: 1-Fenil-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) üre Tm: Melting Temperature-Erime Sıcaklığı U: unit-ünite
WPM: woody plant medium Zea: Zeatin
ZR: Zeatin ribozid µM: Mikromolar µm: Mikrometre
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo-1: Kullanılan büyüme düzenleyiciler, çözücüleri ve stok saklama
koşulları ... … 17 Tablo-2: Yeşil aksam için uygulanan sterilizasyon işlemleri ... … 18 Tablo-3: Çalışmada kullanılan primerlere ait bilgiler ... … 23 Tablo-4: Primerler için optimize edilmiş PCR reaksiyon
koşulları ve süreleri ... … 23 Tablo-5: Sterilizasyon uygulamalarına ait steril eksplant yüzdeleri ... … 24 Tablo-6: Jojoba nodal segmentlerinde BAP, KİN ve TDZ
konsantarasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına ait
varyans analizi ... … 26 Tablo-7: Jojoba nodal segmentlerinde BAP, KİN ve TDZ
konsantarasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına etkisi ... … 27 Tablo-8: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle
kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına ait
varyans analizi (6.hafta) ... … 28 Tablo-9: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle
kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına ait
varyans analizi (12.hafta) ... … 29 Tablo-10: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle
kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına etkisi
(6.hafta) ... … 29 Tablo-11: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle
kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına etkisi
(12.hafta) ... … 30 Tablo-12: İn vitro’da elde edilen sürgünlerin farklı büyüme düzenleyicileri
içeren besin ortamlarındaki köklenme yüzdeleri ... ….33 Tablo-13: İn vitro’da elde edilen sürgünlerin farklı köklenme
ortamlarındaki köklenme yüzdeleri ... ….34 Tablo-14: İzole edilen DNA’lar, konsantrasyon ve saflıkları ... ….37
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil-1: Jojoba bitkisinin genel görünüşü ... 4
Şekil-2: Jojoba bitkisinin çiçekleri ... 5
Şekil-3 : Jojoba bitkisinin tohumları ... 6
Şekil-4: İn vitro’da çimlendirilen steril jojoba tohumları ... 20
Şekil-5: 2 mg l-1 BAP içeren MS besin ortamında çoğalan sürgünler ... 31
Sekil-6: 2 mg l-1 BAP içeren besin ortamındaki cinsiyeti belli olan eksplantlar... 32
Şekil-7: İn vitro’da köklenen sürgünler ... 33
Şekil-8: İn vitro’da köklenen sürgünler ... 34
Şekil- 9: İn vitro’da gelişen bitkiciklerin dış ortama alıştırılması ... 36
Şekil-10: UBC-807 primeri ile elde edilen PCR ürünlerine ait agaroz jel görüntüsü ... 38
1. GİRİŞ
Yaygın olarak ‘jojoba’ veya ‘hohoba’ olarak bilinen, Simmondsia chinensis (Link) Schneider, Simmondsiaceae familyasına ait, herdem yeşil, dioik (iki evcikli) bir çöl çalısı olup, anavatanı; Kaliforniya Eyaleti ile kuzey batı Meksika’nın Sonoran Çölüdür (Aktaran: Tyagi ve Prakash, 2004: 19).
Jojoba bitkisi, tohumlarında ilaç, plastik sanayisinde ve kozmetikte kullanılan sıvı balmumu bulunduğundan iyi bir ekonomik potansiyele sahiptir (Jacoboni ve Standarti, 1987:557-560). Ayrıca jojoba yağı sperm balina yağı ile benzer özelliklere sahiptir (Greene ve Foster, 1933:826-828). Bu özelliğinden dolayı son otuz yıldır ilaç, köpürmeyen maddeler, yüksek sıcaklık ve basınca dayanıklı yağlayıcılar, reçineler, plastikleştiriciler olarak endüstriyel kullanım için bitkinin tarımı yoğun şekilde yapılmaktadır (Mills vd., 1997: 370-393).
Jojobanın çoğaltımı ağırlıklı olarak tohum aracılığıyla olmaktadır, rüzgarla tozlaşma nedeniyle yağ içeriği ve tohum veriminde yüksek derecede varyasyon olmakta ayrıca dişi ve erkek bitkileri belirlemek çiçek açana kadar mümkün olmamaktadır. İlk çiçek tomurcuklarının 1-4 yıl arasında görülmesi nedeniyle başlangıçta planlı bir ekim yapılamamaktadır. Jojoba bitkisinin ticari yetiştiriciliği için cinsiyeti belli, yüksek yağ kalitesine ve verime sahip klon üretimi oldukça önemlidir. Vejetatif çoğaltım istenilen cinsiyete özel klonların üretimi için alternatif bir yol olmakla birlikte uzun işlem ve yavaş büyüme sebebiyle geleneksel kök çelikleri yoluyla çoğaltımı etkili olamamıştır (Aktaran:Singh vd., 2008:538; Aktaran: Tyagi ve Prakash, 2004: 19).
Jojobanın doku kültürü teknikleri ile çoğaltımı bir diğer alternatif olabilmektedir. Günümüzde mikroçoğaltım yoluyla tarımsal üretim özellikle süs bitkilerinde etkin olarak kullanılmaktadır. Doku kültürü yöntemleriyle yağ kalitesi ve verimi yüksek jojoba bitkilerinin cinsiyeti belli klonları yeterince geniş ölçüde üretilebilir (Aktaran: Tyagi ve Prakash, 2004: 19; Mills vd., 1997: 370-393).
Bu tez çalışmasında jojoba bitkisinin doku kültürü yöntemleri ile klonal çoğaltım yeteneği ile moleküler işaretleyicilerle bitkilerin cinsiyetleri belirlenmeye çalışılmıştır. Böylece üstün jojoba bitkilerine ait cinsiyeti belli klonlarla yapılacak olan yetiştiricilikte verim ve kalite artışı ile başlangıçtan itibaren planlı dikim yapılmasına ve arazi planlanmasında başarı ve üretimde zaman kazanılmasına olanak sağlanabilecektir.
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Jojoba ile ilgili genel bilgiler
Alem: Plantae Bölüm: Magnoliophyta Sınıf: Magnoliopsida Takım: Euphorbiales Familya: Simmondsiaceae Cins: Simmondsia Tür: S. chinensis
Jojoba, Simmondsiaceae familyasından Simmondsia chinensis olarak adlandırılmıştır. Ancak bu adlandırma bir hata sonucu gerçekleşmiştir. 1822’de İngiliz doğabilimci H.F.Link Baja Kalifornia’ya gelmiş ve jojobanın bitki örneklerini toplamış. Bitkiye başka bir İngiliz Botanikçi olan T.W.Simmonds’un adını onur olarak vermiştir. Daha sonra Link farklı bitkiler için Çin’i ziyaret etmiş. Jojobanın bulunduğu paketi, Çin’den gelen bitki paketiyle yanlışlıkla karıştırmış, Kalifornia’dan gelen bitkiler Çin bitkisiymiş gibi tanımlanmıştır. Böylece jojobaya Simmondsia chinensis ismi verilmiştir (Rosengarten, 2004: 295).
Jojoba herdem yeşil, boyu 60 cm ile 4.5 metre uzunluğunda olabilen ve gri yeşil renginde yaklaşık 5 cm uzunluğunda oval yapraklara sahip bir çalı bitkisidir (şekil-1). Bazı çöl bitkilerinde olduğu gibi derin kök sistemine sahiptir (Rosengarten, 2004: 295).
Bitki kuraklığa karşı yer altındaki neme ulaşabilmek için derin bir kök sistemine sahiptir. Köklerin %80’i toprak yüzünden itibaren ilk 80 cm içerisinde ise de bir iki yılda 4-5 metreye ulaşabilir. Bazı olgun bitkilerde kökler 13 metre derine inebilir (National Research Council, 2002: 20-21). Bu özelliği ile erozyon ile mücadelede mükemmel bir bitkidir.
Şekil-1: Jojoba bitkisinin genel görünüşü
www.gencziraat.com
Olgun jojoba bitkisi -9˚C’ ye uzun vadede zarar görmeden dayanabilir, fakat çiçek tomurcukları ve bazı yeni tohumlar -2˚C’de zarar görebilir ve -6˚C’de ölürler. Doğal olarak daha çok yıllık yağışı 200-460 mm olan yerlerde yetişir. Kurak yer bitkisi denmesine rağmen iyi verim ve hızlı plantasyon kurulması için belli miktarda su gerekmektedir. Ticari başarı için yıllık nemin 460-610 mm olması en iyi plantasyonlar için gereklidir. Bitki iyi drenajın olduğu yerlerde yetişebilir, fakat suyun biriktiği yerlerde hayatta kalamaz (National Research Council, 2002: 23).
Sonoran çölünde en büyük ve güçlü jojoba bitkileri, alt toprak katmanlarında kil ve alüvyon içeren iyi drene olmuş topraklarda eğimli arazilerde bulunmaktadır. Ekili alanlarda, bazı bitkiler kumlu topraklarda bazıları ise alüvyonca zengin topraklarda daha iyi yetişmektedir. Bazı yerlerde çok killi toprak uygun olabilir ama iyi drenaja sahip olması şarttır. Bitki gözenekçe fakir toprağa dayanamayabilir. Örneğin sele meyilli topraklar bitki için uygun değildir (National Research Council, 2002: 23-24).
Tuzun birikimi kurak toprakların genel bir problemidir. Jojoba toprak drenajı yeterli olan ve uygulamalarının akıllıca yönetimi sağlanan düşük kaliteli suya toleranslıdır. Kaliforniya’da bitkiler 2000 ppm tuz içeren suyla yeterli derecede
büyümektedir. Bir çalışmada; jojobanın bir varyetesinde yaklaşık 7000 ppm tuzlu suya sahip toprakta çiçek oluşumunda bir gerileme olmadığı gösterilmiştir (National Research Council, 2002: 24).
Jojoba dioik bir bitkidir. Cinsiyetinin belirlenebilmesi için ilk çiçek tomurcuklarının görülmesi ve bunun içinde 1 ila 4 yıl geçmesi gerekmektedir (National Research Council,2002: 17). Erkek bitki polen üretir ve sadece stamenleri olan çiçekleri vardır. Dişi bitkinin üç yumurta hücresine sahip bir yumurtalığı olan çiçekleri vardır. Çiçek tomurcukları genelde yazın ve sonbaharda büyüme gösterir ve ilkbaharda açarlar.
Şekil-2: Jojoba bitkisinin çiçekleri
a:dişi, b:erkek çiçekler, www.gencziraat.com
Normalde çiçeklerin dallar üzerinde almaşık olarak bulunmasına karşın, bazı bitkilerde bunun her boğumda, bazılarında ise üç boğum da bir gerçekleştiği görülmüştür. Erkek çiçekler salkım halinde oluşurken, dişi çiçekler tek tektir (şekil-2).
Dişi çiçeklerde böcekleri çekecek taç yaprağı veya koku yoktur ve bitkinin tozlaşması tamamen rüzgara bağlıdır.
Dişi bitkiler çiçekleri tozlaştığında (genelde rüzgar ile) yağ içeren, kahverengi ve yaklaşık fındık tanesi kadar olan tohumlarını bulunduran meyvelerini verirler. Olgun bitkiler yılda 1.5 -5.5 kg tohum (kuru ağırlık) verimine sahiptirler, yıllık verim ortalama 2.3 kg civarındadır. Bitki yaklaşık 5 yıl sonra meyve vermeye başlar.
Hastalık veya böceklerle ciddi zarar görmeyen bir bitkinin ömrü 50 ila 200 yıl arasında değişmektedir (Rosengarten, 2004: 295).
Meyveleri meşe palamudunun boyutlarındadır, başta yeşilimsi iken olgulaştıkça kahverengiye döner (şekil-3). Genelde bir tohum içerirler bazen de iki veya üç içerdikleri olur (National Research Council, 2002: 20).
Şekil-3: Jojoba bitkisinin tohumları
a:olgunlaşmamış meyve, b:olgun meyve, www.gencziraat.com
Jojobanın tohumlarında %50 oranında yağ bulunmaktadır ve yağı sperm balina yağı ile benzer özelliklere sahiptir (National Research Council, 2002: 76; Greene ve Foster, 1933: 826-828).
Sperm balinaları ve diğer yedi balina türünün azalan dünya populasyonunu korumak amacıyla Birleşmiş Milletler 1970 yılında, Sperm balinalarını tehlikedeki türler listesine ekledi ve balinalardan elde edilen yağ, et ve diğer üretimlerin ithalatını yasakladı. Jojoba yağının sperm balina yağının alternatifi olduğuna dair birçok deneysel kanıt bulunmaktadır. Jojoba yağının sperm balina yağından fazla birkaç avantajı bulunmaktadır;
a)balık kokusu yok,
b)Jojobanın ham yağı donyağı içermiyor ve bazı endüstriyel amaçlar için herhangi bir işlem gerektirmiyor,
c)daha fazla kükürt alabilir,
d)kükürtleme işleminde kararmıyor,
e)yüksek kükürtlenmiş yağı bile sıvı halde, sperm balina yağının yüksek kükürtlenmiş halinin sıvı kalabilmesi için mineral eklenmesi gerekmektedir (Wisniak, 1987: 1-2).
Jojoba yağı yüksek sıcaklık ve basınçta kararlılığını ve viskositesini kaybetmeyen özellikte olması sebebiyle makinelerin yağlanmasında, E vitaminince zengin olmasından dolayı sağlık ve kozmetikte kullanılabilmektedir. Ayrıca penisilin üretiminde, besin endüstrisinde ve cilalama işlemlerinde de kullanılmaktadır.
2.2. Bitki doku kültürü ile ilgili genel bilgiler
Modern ıslah metotları olarak kabul edilen tekniklerden birisi olan doku kültürünün bitki ıslahında kullanılması hem zaman hem de uzun dönemde uygulandığı takdirde yapılacak masraflar açısından büyük kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki doku kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir. Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır (Babaoğlu vd., 2001: 2).
Bitkisel üretimde doku kültürü yöntemlerinin bir diğer kullanım alanı da ticari amaçlı klonal üretim (mikroçoğaltım) dir.
Mikroçoğaltım: Bir bitkiden alınan ve tam bir bitkiyi oluşturabilme potansiyeline sahip bitki kısımlarından (embriyo, tohum, gövde, sürgün, kök, kallus vb) yapay besin ortamlarında ve aseptik koşullar altında yeni bitkilerin elde
edilmesidir. Mansuroğlu ve Gürel (2001) mikroçoğaltımın bitki yetiştiriciliği ve genetiği yönünden önemi ve avantajlarını şöyle sıralamışlardır:
1.Hastalık ve zararlılardan arındırılmış bitkisel materyal elde edilmesi 2.Kitlesel üretimde aşağıdaki yararların sağlanması:
- üretilen bitkilerde fenotipik ve genotipik benzerlik (homojenite) - alışılagelen yöntemlerden daha kısa kültür süresi
- zor üretilen türlerin daha kolay üretimi - seçilen belirli/üstün genotiplerin hızlı üretimi - üretimde daha az anaç kullanılması
3. Somaklonal varyasyondan dolayı yeni çeşitlerin/genotiplerin elde edilmesi
Yukarıda sayılan yararlarına karşın mikroçoğaltım eğitimli personel, özel laboratuvar koşulları ve sürekli araştırmaya gereksinim duymaktadır. Bu nedenle, yapılan uygulamaların başarısı ekonomik faktörlerle büyük ölçüde sınırlanmaktadır. Doku kültürü ile bitkilerin çoğaltılması pahalı olmasına rağmen, iş gücünü azaltan otomasyon ve robotizasyon teknikleri kullanıldığında, kısa sürede fazla sayıda bitki ekonomik olarak elde edilebilmektedir. 1991 yılı verilerine göre dünyada saksılı bitkiler, kesme çiçekler, meyve ağaçları ve geofitlerde mikroçoğaltım yöntemleri kullanılarak yaklaşık 600 milyon bitki elde edilmiştir.
Başarılı bir mikroçoğaltım için sırasıyla şu aşamalar gerçekleştirilmelidir; 1. Hazırlık aşaması: Bu aşama esas olarak kontaminasyon problemlerinin en aza
indirilmesi amacıyla, anaç bitkilerin hijyenik koşullar altında yetiştirilmesini kapsamaktadır.
2. Kültür başlangıç aşaması
- Eksplant seçimi: Mikroçoğaltımda çoğunlukla eksplant olarak tepe ve koltuk altı tomurcuklar seçilmekle birlikte farklı organlarda eksplant olarak kullanılmaktadır.
- Sterilizasyon: Mikroçoğaltımda kullanılan eksplantlar aseptik koşullara konulmadan önce tam anlamıyla sterilize edilmelidir. Sterilizasyon yöntemleri bitkinin yetiştiği ortama ve eksplantın alındığı organa göre farklılık göstermektedir. Kullanılacak dezenfektan maddenin cinsi, konsantrasyonu ve uygulama süresi sterilizasyonun başarısını etkilemektedir. Ayrıca bitki dokularının zarar görmemesine dikkat edilmelidir.
- Başlangıç ortamları: Her bitki türü için kullanılan besin ortamları, inorganik maddeler (makro ve mikro besin elementleri), organik maddeler, bitki büyüme düzenleyicileri ve diğer (şeker, agar) maddeleri içermektedir. Kültür amacına ve bitki özelliğine bağlı olarak ortam bileşimi ve konsantrasyonlarında değişiklik olabilmektedir.
- Çevresel faktörler: Kültür odasındaki ışık, sıcaklık ve nem bitki türlerinin isteğine göre sürekli kontrol altında tutulmalıdır.
3. Sürgün çoğaltım aşamaları
- Besin ortamları: Başlangıç için kullanılan ortamlar çoğaltım aşamasında da kullanılabilmekte ve bazı durumlarda değişiklik yapılabilmektedir. Bitki dokularından organ farklılaşmasında oksin ve sitokininler önemli rol oynamaktadır.
- Kallus oluşumu: Kallustan sürgün çoğaltılması ile bazı bitkilerin üretimi yapılabilmektedir.
- Adventif tomurcuk oluşumu: Yaprak koltuk altı ya da sürgün tepelerinin dışında herhangi bir yerde oluşan tomurcuklar adventif tomurcuk olarak adlandırılır. Bitki türlerinin klonal üretiminde organlardan doğrudan adventif sürgün oluşumu kallus yönteminden daha iyi sonuçlar vermektedir.
- Aksillar (koltuk altı) tomurcuk oluşumu: Aksiller dallanma ile sürgün çoğaltımı yukarıda açıklanan diğer iki yönteme göre başlangıçta daha yavaştır. Fakat her alt kültürde sürgün sayısı logaritmik olarak artar.
4. Sürgün gelişimi ve köklendirme aşaması: Adventif ve aksiler sürgün gelişimi ortamlarında sitokinin varlığı köklenmeyi engellemektedir. Tam bir bitkiyi oluşturmak için sürgünler, farklı bir hormonal kompozisyona sahip olan yeni
bir ortama aktarılmaktadır. Sürgünler belli bir uzunluğa eriştikten sonra köklenmeleri amacıyla köklenme ortamına alınırlar.
5. Dış ortama alıştırma (aklimatizasyon) aşaması: Steril koşullarda, düşük ışık yoğunluğunda yüksek nem içeren ve tüm besin maddelerinin bulunduğu bir ortamda geliştirilen bitkilerin, daha düşük nem, daha yüksek ışık düzeyi ve steril olmayan koşullara sahip dış ortama aktarılması çok dikkatli ve aşamalı olarak yapılmalıdır. (Mansuroğlu ve Gürel, 2001: 262-275).
2.3. Jojobanın in vitro hızlı çoğaltımı ile ilgili araştırmalar
1999’da Roussos ve ark.’nın yaptıkları bir çalışmada; Jojoba eksplantları BAP’ın farklı konsantrasyonları ve bunun gümüş nitratla olan kombinasyonlarını içeren Driver Kuniyuki besin ortamında kültüre alınmıştır. Her ortamda sürgün çoğaltımı başarılmış, eksplant başına en çok sürgün sayısı 15,2 (26.6 μM BAP) olarak elde edilmiştir. Köklenme oranı49.2 μM IBA+ 53.7 μM NAA içeren ortamda %64’e ulaşmıştır.
Hamama ve ark. 2001’de; jojobanın yaprak dokusundan somatik embriyoların elde edilmesi, olgunlaşması ve çimlenmesi üzerine bir çalışma yapmışlardır. Eksplantlar ½ MS ortamı içeren petri kaplarına konmuş ve karanlıkta bekletilmişlerdir. 2,4-D (1.35–4.52 μM)’nin BAP ve 2 farklı sentetik sitokinin ile kombinasyonları somatik embriyo ve embriyogenik kültür oluşumunda sonuç vermiştir. Embriyogenik kültürler daha sonra farklı oksin ve sitokinin içeren ½ MS ortamına alınmıştır. 3.75μM NAA veya 3.44μM IBA’nın BAP (0.44 /1.33μM) veya F3iP (0.37/ 1.11μM) ile kombinasyonlarında somatik embriyonun olgunlaşması, çimlenmesi ve bitkiciklerin gelişimi sağlanmıştır.
Tyagi ve Prakash’ın 2004’de yaptıkları bir çalışmada; beş farklı jojoba genotipinin erkek ve dişi bireylerinden alınan nodal eksplantlar MS besin ortamında kültüre alınmıştır.10 μM BAP içeren MS ortamında eksplant başına en fazla sürgün (dişi bireyde 10,erkek bireyde 9) elde edilmiştir. Bazı genotiperde 10µM BAP içeren
ortamlardaki sürgünler daha fazla süre yaşamlarını sürdürürken, bazı genotiplerde ise 5µM BAP içeren ortamdakiler daha iyi sonuç vermiştir. Genel olarak dişi sürgünler, erkek sürgünlerden daha uzun süre hayatta kalmışlardır.
Roussos ve ark. 2007’de yaptıkları bir çalışmada; jojoba eksplantlarını 169 mM’a kadar sodyum klorid içeren temel besin ortamında in vitro da kültüre almışlardır. İkinci ve üçüncü ay eksplantların makro ve mikro elementleri değerlendirilmiştir. Eksplantların potasyum, manganez, fosfor ve nitrat konsantrasyonu düşük olduğu zamanlarda sodyum ve kloridin büyük bir miktarını biriktirdikleri gözlenmiştir. Diğer elementlerin konsantrasyonlarında önemli değişiklikler gözlenmemiştir. Tuz stresinin her seviyesinde eksplantların içeriğinin belirgin şekilde etkilendiği belirtilmiştir. Jojoba eksplantlarının, herhangi bir stres belirtisi göstermeden, 113 mM sodyum klorid konsantrasyonuna kadar toleranslı oldukları saptanmıştır. Bu konsantrasyonun üzerindeki tuzun ise yaprak ve sürgünlerde sararma ve sulanmaya neden olduğu gözlenmiştir
Bashir ve ark. 2007’de; jojobanın altı ırkının in vitro da gelişen sürgünlerinden köklendirme çalışmaları yapmışlardır. MS besin ortamına üç farklı oksinin (IBA, IAA ve NAA) farklı konsantrasyonları ile iki farklı deneme (1.25, 2.50, 5.0 mg L-1 ve 0.5, 1.0, 1.5 mg L-1) kurmuşlardır. Birinci denemede 2.50 ve 5.0 mg L-1 oksin içeren ortamlardaki köklenmelerde kallus oluştuğu gözlenmiş, 1.25 mg L-1 oksin içeren ortam daha iyi sonuçlar vermiştir. İkinci denemede ise her ortamda kök gelişimi yeterli olmuş, fakat en iyi sonuç 0.5 mg L-1 IBA içeren ortamda elde edilmiştir.
Llorente ve ark. 2007’de yaptıkları bir çalışmada; organizmalar için karbonhidrat kaynağı ve strese karşı koruyucu olan ‘trehalose’nin jojobanın mikroçoğaltımına etkisini araştırmışlardır. 1mM trehalose içeren MS besin ortamında sürgün çoğaltımında büyük oranda artış gözlemlemişlerdir. Sürgün çoğaltım oranı 4.44 mM BAP ve1 mM trehalose içeren MS besin ortamında 4.8 olarak elde edilmiştir. Köklenme oranı 14.7 μM IBA içeren ortamda %46.6 ya ulaşmıştır. Fakat sadece trehalose içeren ortamda kök gelişimi yetersiz kalmıştır.
Singh ve ark.’nın 2008 yılında yaptıkları bir çalışmada; nodal segmentler kullanılarak jojobanın elit dişi ve erkek genotipleri için etkili bir mikroçoğaltım protokolü geliştirilmiştir. Sürgün başlangıcı için en iyi ortam, 4,44µM BAP ve 88,8 μM adenine içeren MS besin ortamı olarak belirlenmiştir. Eksplant başına 10-15 sürgün elde edilmiş (4.44 μM BAP ve 74.0 μM adenine içeren MS), uzayan sürgünler 48 saat boyunca çeşitli oksin (IAA, IBA, NAA) içeren sıvı ortamlarda tutulduktan sonra chlorogenic asit ve aktif karbon içeren ½ MS ortamında köklendirilmişlerdir (%92). Köklenen bitkiler %99 başarı oranıyla seraya transfer edilmiştir.
Bashir ve ark. (2008)’nın bir çalışmasında jojobanın altı genotipinin 1,5-3cm uzunluktaki nodal segmentleri, BAP’ın, NAA, IAA ve IBA ile kombinasyonlarını içeren MS besin ortamında kültüre alınmıştır. Sürgün başlangıcı için en iyi kombinasyon 5.55 μM BAP + 7.1 μM IAA olarak belirlenmiştir. Gelişen sürgünler IAA(7.1 μM), IBA(6.1 μM), ve NAA(6.7 μM) içeren MS ortamında köklenmişlerdir. IBA içeren ortamda gelişen köklü bitkicikler seraya aktarmada en iyi hayatta kalma oranına (63,33) sahip olmuşlardır. Ancak bitkilerin hayatta kalmaları, onların genotipine ve yaşına bağlı olduğu ortaya konulmuştur.
Mohasseb ve ark. 2009’da; 5 yaşındaki jojoba ağaçlarından koltukaltı sürgünlerinin in vitro klonal çoğaltımını yapmışlardır. Nodal segmentler eksplat kaynağı bakımından en iyi dönem olan mart, mayıs aylarında toplanmıştır. MS+BAP (1 mg/l) + GA3 (0.5 mg/l) ortamında sürgün çoğaltımı gerçekleştirilmiştir.MS+BAP
(1 mg/l) + CH (500 mg/l) ortamına aktarılan kültürlerde sürgün sayısı daha da artmıştır. Ancak her iki ortamda da sürgün büyümesi sağlanamamış ve sürgünler küçük kalmışlardır. Dolayısıyla, uzama ve tekrar sürgün çoğaltımı için MS+BAP (1 mg/l) + CH (250 mg/l) ortamı kullanılmış her 5 haftada bir aynı ortamda alt kültüre alınarak nodal segment başına 7-8 sürgün elde edilmiştir. Köklenme ise %82 oranında 1/4 MS+IBA (0.5 μM) ortamında elde edilmiştir. Mikroçoğaltımı yapılan bitkicikler %70’den daha fazla başarıyla toprağa aktarılmışlardır.
Abass 2010’da yaptığı bir çalışmada; sürgün tipi eksplantı farklı tuz konsantrasyonları içeren MS, WPM ve B5 ortamlarında kültüre almıştır. Burada gelişen mikro sürgünleri hızlı çoğaltım amacıyla farklı konsantrasyon ve kombinasyonda 2ip, IAA, BAP, KİN içeren 0.170 mgl-1 ZnSo4.7H 2o + 0.170 N2H 2Po4+ 12.0 mgl-1 Boric acid + 0.25 mgl-1 CuSo4 eklenmiş MS ve 1.25 WPM
ortamlarında kültüre almıştır. Sonuçta; sürgün büyümesi için 1.25 WPM veya MS ortamlarının, sürgün çoğaltımı için ise 0.1 2ip mgl-1+ 0.5 mgL-1 IAA+2.0 mgl-1 Kin + 0.170 mgl-1 ZnSo4.7H 2o + 0.170 N2H2Po4+ 12.0 mgl-1 Boric acid + 0.25 mgl-1
CuSo4 içeren MS veya 7.0 mgl-1 BA +0.5 mgl-1 IAA+ 0.170 mgl-1 ZnSo4.7H2O+
0.170 N2H2Po4 + 12.0mgl-1 Boric acid + 0.25 mgl-1 CuSo4 içeren 1.25 WPM
ortamlarının en iyi sonucu (ortalama 2.5 adet sürgün) verdiğini bildirmiştir. IBA (4.9, 9.9 ve 15.9 mgl-1) içeren MS ortamında köklendirmeye aldığı rejenere sürgünlerin sadece 4.9 mgl-1 IBA içeren ortamda %15 oranında köklendiğini rapor etmiştir. Köklenen sürgünler %60 başarıyla aklimatize edilerek toprağa (torf:toprak 1:2 v/v) aktarılmıştır.
2.4. Genetik Markörler
Kalıtım şekilleri, morfolojik (çiçek rengi gibi), biyokimyasal (izoenzimler gibi) ve DNA düzeyinde (moleküler markörler) izlenebilen karakterlere genetik markörler denir. Bu karakterlerin markör (işaret) olarak isimlendirilmesinin nedeni, çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin genetiği hakkında, dolaylı da olsa, bilgi sağlamalarıdır. Moleküler markörler DNA’nın aktif bölgelerinden (genler) veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden geliştirilebilirler (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 334). Genetik markörler morfolojik markörler, protein markörleri ve DNA markörleri olmak üzere üç ana başlık altında toplanabilir.
Morfolojik markörler çok uzun zamandır bilinmelerine rağmen sayılarının az oluşu yanında çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmeleri nedeniyle fazlaca kullanılmamaktadırlar (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 349).
Protein markörleri, depo proteinleri ve enzim proteinleri olarak iki ana gruba ayrılırlar. Proteinler bir jel üzerinde hareket ettirilip boyandıklarında, farklı genotiplerde ortaya çıkan yapı farklılıkları genetik markör olarak kullanılabilir. En önemli avantajları analizlerinin çabuk, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasıdır. En büyük dezavantajları ise, sayıca çok az olmalarıdır.
DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörlerdir. Bunlar, a) DNA melezleme markörleri ve b) Polimeraz zincir reaksiyonu kullanımına dayalı DNA çoğaltım markörleri olmak üzere iki grup altında incelenirler (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 349-351).
1983 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilen ve günümüzde yaygın olarak kullanılan PCR, (Polymerase Chain Reaction) DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlarda DNA üretilmesini ifade etmektedir (Ateş, 2006: 367). Bu üretim için 6-25 nükleotid uzunluğunda başlatıcı DNA’lar (primerler) gerekir. Reaksiyon ortamında ayrıca pH’yı ve tuz konsantrasyonunu optimum hale getiren tampon çözelti, polimeraz enziminin ihtiyaç duyduğu MgSO4 ve DNA üretiminde
kullanılacak A, T, G, C nükleotidlerinden her biri bulunur. Polimeraz enzimi, bu başlatıcı DNA’nın bir kalıp DNA üzerine bağlanmasından sonra, onu bir uçtan uzatmaya başlar ve kalıp DNA’nın aynısını üretir. DNA üretim işlemi birbirini izleyen bir seri çok spesifik sıcaklık devrelerinde yapılır. Önce 95 ˚C civarında bir sıcaklık kullanımıyla kalıp DNA’nın çift sarmal yapısı açılır ve DNA tek iplik haline getirilir. Sonra 30-60 ˚C arasında bir sıcaklıkta başlatıcı DNA’nın kalıp DNA’ya yapışması sağlanır. Son olarak 72 ˚C DNA üretimi yapılır. Bu devrelerin her birinde sadece 1-2 dakika kullanılır. Bu üç devre isteğe bağlı olarak defalarca (normalde yaklaşık30-45 defa) tekrarlanır ve DNA üretimi tamamlanmış olur (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 354).
PCR yöntemi kolay uygulanabilir olması ve hızlı sonuç vermesi gibi avantajları nedeniyle; tür içi ve türler arası genetik varyasyonların belirlenmesinde, kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında, prenatal (doğum öncesi) tanıda, patojen (hastalık yapabilecek) organizmaların saptanmasında, adli tıpta, kanser yapan
hücrelerin oluşum evresinin araştırılmasında ve benzeri birçok farklı alanda kullanılabilmektedir.
Jojoba bitkisinde de cinsiyetin belirlenmesinde PCR yöntemi kullanılmıştır. Yapılan bazı çalışmalar aşağıda verilmiştir.
ISSR (Inter-simple sequence repeat) tekniği ile jojobanın cinsiyetini belirlemeye çalışan Sharma ve ark. (2008) araştırmalarında 42 ISSR primeri kullanmışlar ve bunlardan sadece birinde (UBC-807) erkek bireylerde yaklaşık 1200 baz çifti uzunluğunda bir parçacık üretildiğini tespit etmişlerdir. Çalışmada UBC-807 ile taranan erkek bitkilerin hepsinde bu parçanın sentezlendiği, buna rağmen dişi bitkilerde parçanın oluşmadığı, bu verilere göre UBC-807 primerinin jojobanın cinsiyet tayini için kullanılabileceği ifade edilmiştir.
Agrawal ve ark. (2007) jojobanın cinsiyet tayini için RAPD (random amplified polymorphic DNA) tekniğini kullanmışlar, denedikleri 72 primerden sadece bir tanesinde (OPG-5) erkek bireylerde yaklaşık 1400 baz çifti uzunluğunda bir parçacık üretildiğini tespit etmişlerdir. Çalışmada erkek bitkilerle birlikte dişi bitkilerde taranmış, OPG-5 primeri ile taranan bitkilerden sadece erkek bireylerde bu parçanın oluştuğu belirlenmiş, bu primerin jojobanın cinsiyet tayini için kullanılabileceğini vurgulanmıştır.
3. MATERYAL VE METOT
Tüm doku kültürü ve moleküler genetik çalışmalar Selçuk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileri Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı’nda gerçekleştirilmiştir.
3.1. Materyal
Tez çalışmasında materyal olarak, Simmondsia chinensis (Link) Schneider, türüne ait tohumlar ile Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü’nden temin edilen cinsiyeti belli fidanlara ait bitki örnekleri kullanılmıştır.
3.2. Metot
3.2.1. Bitki doku kültürü çalışmaları
3.2.1.1. Besin ortamlarının hazırlanışı ve sterilizasyonu
Bütün ortamlar ve stok solüsyonları, Sigma ve Merck’ten elde edilen analitik seviyede kimyasallar kullanılarak hazırlanmıştır. MS (Murashige ve Skoog, 1962) besin ortamı ticari olarak hazırlanmış toz preparatlar veya stok solüsyonları ile hazırlanmış çözeltilere karbon kaynağı olarak sakkaroz ve yarı-katı hale getirmek için agar ve bitki büyüme düzenleyicileri ilave edilerek hazırlanmıştır. Sakkaroz (%3) katı olarak ilave edilmiştir. Sakkaroz tamamen eritildikten sonra ortamın pH’sı 0.1-1 N KOH ya da 0.1-1 N HCl ile 5.8’e ayarlanmış, distile su ile istenilen hacme tamamlanmış, 8 g l-1agar ilave edilmiş ve ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra otoklava dayanıklı cam şişelere konularak 121 °C de 1.5 atm. basınç altında 20 dakika boyunca sterilize edilmiştir. Sterilize edilmiş ve aynı zamanda agarı tam olarak erimiş olan besin ortamları, içerisi % 96’lık etil alkolle silinmiş ve 20 dakika süreyle açık bırakılan ultra-viyole (U.V.) lambası ile sterilize edilmiş olan 0.22 µm porozitede hepa filtrelere sahip yatay hava akışlı (0.5 m sn-1) kabin içerisinde
önceden steril edilmiş olan Magenta kültür kaplarına dağıtılmıştır. Besin ortamları donduktan sonra kapakları sıkıca kapatılmış ve kullanıma hazır hale gelmişlerdir.
3.2.1.2. Bitki büyüme düzenleyicileri
Toz halindeki büyüme düzenleyiciler uygun çözücülerde çözülmüş, saf su ile istenilen miktarda ve oranda hacimleri ayarlanarak stok solüsyonları hazırlanmıştır. Kullanılan büyüme düzenleyicileri, çözücüleri ve saklama koşulları tablo-1’de verilmiştir. Temel besin ortamına (MS) çeşitli oksin (NAA, IAA, IBA) ve sitokinin (BAP, KİN, TDZ) büyüme düzenleyicileri ilave edilmiştir. Sürgün çoğaltımı için BAP, KİN,(0.5, 1, 2 mg l-1), TDZ(0.22, 0.44, 0.88mg l-1) ve BAP(1.5, 2, 2.5 mg l
-1)’ın NAA, IAA, IBA (1.25 mg l-1) ile kombinasyonları kullanılmıştır. Köklenme için
ise temel besin ortamına (MS, 1/2MS ve sakkarozu yarıya düşürülmüş 1/2MS) oksinlerin ( NAA, IAA, IBA) farklı konsantrasyonları eklenmiştir.
Tablo-1: Kullanılan büyüme düzenleyiciler, çözücüleri ve stok saklama koşulları Büyüme Düzenleyicileri Çözücü Saklama
Koşulları (oC)
Sterilizasyon şekli otoklav(O)-filtre(F) Oksinler
NAA (α-naftalenasetik asit) 1N KOH +4 O
IAA (Indol-3-asetik asit) 1N KOH +4 F
IBA(Indol-3-bütirik asit) 1N KOH +4 F
Sitokininler
BAP (6-benzilaminopürin) 1N NaOH +4 O
KIN (Kinetin) 1N NaOH +4 F
3.2.1.3. Yeşil aksamın sterilizasyonu
Bitki dalları yapraklarından ayrıldıktan sonra, nodal segmentleri zarar görmeyecek şekilde belli aralıklarla kesilerek farklı konsantrasyonlardaki alkol, ticari çamaşır suyu, HgCl2 (civa klorür) ve yayıcı-yapıştırıcı madde (Tween-20) içeren
çözeltiler ile muamele edildikten sonra steril saf su ile durulanarak sterilize edilmişlerdir. Yapılan uygulamalar tablo-2’de verilmiştir.
Tablo-2: Yeşil aksam için uygulanan sterilizasyon işlemleri
Uy. no Sterilizasyon öncesi Ön sterilizasyon aşaması Sterilizasyon aşaması Durulama aşaması 1 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %10 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı.
3 kez steril saf su ile durulandı.
2
yarım saat musluk suyu altında tutuldu
_ suyu+1-2 damla %30 çamaşır tween-20 de 15dk.
karıştırıldı.
3 kez steril saf su ile durulandı. 3 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %60 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı.
3 kez steril saf su ile durulandı. 4 yarım saat musluk suyu altında tutuldu %50’lik alkol de 30 sn bekletildi ve 1
kez steril saf sudan geçirildi.
%20 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 10dk.
karıştırıldı.
3 kez steril saf su ile durulandı.
5 musluk suyu yarım saat altında tutuldu
%50’lik alkol de 30 sn bekletildi ve 1
kez steril saf sudan geçirildi.
%30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk.
karıştırıldı.
3 kez steril saf su ile durulandı. 6 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 30dk. karıştırıldı ve %96’lık alkolde 2-4 sn bekletildi.
3 kez steril saf su ile durulandı.
7 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %40 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 20dk. karıştırıldı ve %96’lık alkolde 2-4 sn bekletildi
3 kez steril saf su ile durulandı. 8 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %50 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 20dk. karıştırıldı ve %96’lık alkolde 2-4 sn bekletildi.
3 kez steril saf su ile durulandı. 9 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %0,05 HgCl2’de 20dk. karıştırıldı.
4 kez steril saf ile durulandı. 10 yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %0,1 HgCl2’de 15dk. karıştırıldı.
4 kez steril saf ile durulandı. 11 musluk suyu yarım saat
altında tutuldu
_ %0,2 HgCl2’de
10dk. karıştırıldı.
4 kez steril saf su ile durulandı. 12 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda 15 dk karıştırıldı ve ardından 1 kez steril saf sudan
geçirildi
%70’lik alkol de 30 sn bekletildi ve 1
kez steril saf sudan geçirildi
%30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk.
karıştırıldı.
4 kez steril saf ile durulandı 13 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda 15 dk karıştırıldı ve ardından 1 kez steril saf sudan
geçirildi
%96’lık alkol de 30 sn bekletildi ve 1
kez steril saf sudan geçirildi
%30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk.
karıştırıldı.
4 kez steril saf ile durulandı 14 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda 15 dk karıştırıldı ve ardından 1 kez steril saf sudan
geçirildi
3.2.1.4. Tohumların sterilizasyonu ve çimlendirilmesi
Sterilizasyon işleminde ilk olarak 30 saniye süreyle % 50’lik (h/h) alkol ile muamele edilen tohumlar 1 kez steril saf sudan geçirildikten sonra, 1-2 damla yayıcı-yapıştırıcı madde (Tween-20) ihtiva eden % 30’luk (h/h) ticari hipoklorit çözeltisi (%50 NaOCl içeren HES) içinde 15 dakika çalkalanmıştır. Sürenin sonunda 3 defa steril saf su ile durulanarak sterilizasyon işlemi tamamlanmıştır.
Steril olan tohumlar bistüri yardımıyla çizilerek, 50 ml MS besin ortamı içeren magenta kültür kaplarında 24 oC’de 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyotta çimlendirmeye alınmışlardır (şekil-4).
Şekil-4: İn vitro’da çimlendirilen steril jojoba tohumları
3.2.1.5. İn vitro'da yetiştirilen fidelerden eksplant izolasyonu
İn vitro da çimlenen bitkilere ait nodal segment eksplantı 12 haftalık bitkilerden, bir nod bölgesi içerecek biçimde yaklaşık 1.5 cm uzunluğunda parçalara ayrılmış ve sürgün çoğaltımı için magenta kültür kaplarına 5’er eksplant içerecek şekilde yerleştirilmiştir. Tüm kültürler 16 saat fotoperiyot, % 62–64 oransal nem, 24±1°C ve 3000 lüks beyaz floresan ışık yoğunluğu koşullarında raflı kültür dolabında tutulmuştur.
3.2.1.6. Sürgünlerin köklendirilmesi ve dış ortama alıştırma
İn vitro da çoğalan sürgünler köklenme için temel besin ortamına (MS, 1/2MS ve sakkarozu yarıya düşürülmüş 1/2MS) oksinlerin ( NAA, IAA, IBA) farklı konsantrasyonları eklenerek oluşturulan ortamlara alınmışlardır. Köklenen sürgünler daha sonra iklim odasında steril torf içeren küçük saksılara aktarılmıştır. Saksılara naylon poşet geçirilmiş ve 1 hafta sonra poşet belli yerlerinden açılarak ve daha sonraki haftalar tamamen çıkartılarak bitkiciklerin hem dış şartlara uyumu hem de kök sisteminin gelişmesi sağlanmıştır.
3.2.1.7. Verilerin değerlendirilmesi
Mikroçoğaltım denemeleri her bir doz için Magenta kültür kaplarına 5’er eksplant olacak şekilde 3 tekerrürlü (toplam 15 eksplant), köklenme denemeleri ise her bir doz için 10 deney tüpüne 1’er eksplant konularak kurulmuştur. Mikroçoğaltım denemelerinde eksplantlardan oluşan sürgün sayıları (adet) sayılmıştır. Köklenme denemelerinde köklenen sürgün sayıları kayıt edilmiştir. Deneme sonunda elde edilen veriler bilgisayarda MSTAT-C istatistik programı kullanılarak analiz edilmiş, önemli bulunan sonuçlarda çoklu karşılaştırma testi olan LSD yapılmış ve literatür bilgileri ile kıyaslamalı olarak yorumlanmıştır.
3.2.2. Moleküler Genetik Çalışmalar
3.2.2.1. DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve saflıklarının belirlenmesi
DNA izolasyonu hassas terazide 0.2 g tartılarak toplam 10 bitkiden alınan örneklerle ayrı ayrı (bireysel) olarak gerçekleştirilmiştir.
DNA izolasyonu için Doyle ve Doyle (1987) ile Özkaya ve ark. (2009)’da belirtilen metodların birleştirilip tekrar modifiye edilmesiyle oluşturulan aşağıdaki metoda göre yapılmıştır.
1- Hassas terazide tartılan örnekler steril havan içerisinde sıvı azotta topuz yardımıyla ezilerek toz haline getirilmiş ve 2 ml’lik mini santrifüj tüplerine alınmıştır.
2 - Üzerine 1 ml çözelti (CTAB + %1 β-mercaptoethanol + %2 PVP) ilave edilmiş ve tüpler 65 ˚C’deki blok ısıtıcıda 30 dk bekletilmiştir.
3- Blok ısıtıcıdan çıkarılan tüplerin üzerine 500 µl kloroform ilave edilmiştir. 4- Tüpler, 7000 rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir.
5- Santrifüj işlemi sonrasında tüpün üst kısmındaki ayrılmış fazdan 600 µl çekilerek yeni bir 2 ml’lik mini santrifüj tüpüne konularak ve üzerine 400 µl isopropanol ilave edilerek DNA’nın ayrıştığı gözlenmiştir.
6- Tüpler, 14500 rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir.
7- Santrifüj sonrasında tüpün dip kısmına çökelen DNA’nın (DNA pelleti) düşmemesine dikkat edilerek üsteki faz tüpten uzaklaştırılmıştır.
8- Pelletin üzerine %70 ethanol+10 mM amonyum asetat çözeltisinden 1ml ilave edilmiş ve 14500 rpm’ de 5 dk santrifüj edilmiştir.
9- Santrifüj sonrasında pellet görülerek üsteki faz dökülmüş, tüplere %70’lik ethanol konulmuş ve yeniden 14500 rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir.
10- Üsteki sıvı uzaklaştırılıp DNA pelleti oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır. 11- Kuruyan pelletin üzerine 200 µl PCR suyu (ddH2O ) konulmuş, DNA
çözündürülmüş ve etiketlenerek -20°C’de muhafaza edilmiştir.
İzolasyon sonrasında elde edilen DNA’ların, konsantrasyon ve saflıkları spektrofotometrede (Nanodrop ND-100) belirlenmiştir.
DNA’lar % 1’lik agaroz jelinde yürütülmüş ve görüntüleme cihazında (Vilber Laurmat, Fransa) DNA’nın varlığı tespit edilmiştir.
3.2.2.2. PCR Çalışmaları
Agrawal vd.(2007) ve Sharma vd.(2008)’e göre jojoba bitkisi için cinsiyet teşhisinde başarılı sonuç elde edildiği ifade edilen iki primer OPG-5 ve UBC-807
çalışmadaki bitkilerin cinsiyet tespiti için kullanılmış ve primerlere ait bilgiler tablo-3’te verilmiştir.
Tablo-3: Çalışmada kullanılan primerlere ait bilgiler
Primer Primer sekans
(5’-3’) %G C oranları Tm (°C) OPG-5 5’ CTGAGACGGA 3’ 60.0 32 UBC-807 5’AGAGAGAGAGAGAGAGT 3’ 47.1 50
Reaksiyonlar ön denemeler ile optimize edildikten sonra, 1 µl DNA (20 ng µl
-1) ve 24 µl reaksiyon karışımı [2.5 µl x10 PCR tampon çözeltisi (Fermentas), 2.5 µl
25 mM Mg+2 (Fermentas), 0.4 µl 25 mM dNTP (Fermentas), 0.3 µl 500 U Taq DNA Polimeraz (Fermentas), 0.5 µl 50 pmol. µl-1 primer ve 17.8 µl PCR suyu] ile tablo-4’de verilen pcr koşullarına göre Eppendorf mastercycler gradient cihazında gerçekleştirilmiştir.
Tablo-4: Primerler için optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları ve süreleri
OPG-5 UBC-807 94 ˚C 3 dk 94 ˚C 3 dk 94 ˚C 1 dk x38 94 ˚C 20 sn x35 30 ˚C 1 dk 50 ˚C 1 dk 72 ˚C 2 dk 72 ˚C 1.5 dk 72˚ C 10 dk 72 ˚C 7 d
PCR ürünleri %2’lik agaroz (Serva) jel elektroforezi ile marker (Fermentas 200bp DNA ladder) eşliğinde yürütülmüş ve Vilber Lourmat (Fransa) görüntüleme sistemiyle görüntülenmiştir.
4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA 4.1. Bitki doku kültürü çalışmaları
4.1.1. Sterilizasyon çalışmaları
Simmondsia chinensis (Link) Schneider türünün yeşil aksam kısmı için uygulanan sterilizasyon işlemlerinde (tablo-2) istenilen sonuçlara ulaşılamamıştır. Bu denemelerden en iyi sonuç 11(önce yarım saat musluk suyu altıda tutulan eksplantlar %0,2 HgCl2’de 10dk. karıştırıldıktan sonra 4 kez steril saf sudan geçirildi) ve 14
(önce 15 dk. 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda tutulan eksplantlar %0,2 HgCl2’de 10dk. karıştırıldıktan sonra 4 kez steril saf sudan geçirildi) nolu
uygulamalarda elde edilmesine rağmen istenilen oranda bir sterilizasyon sağlanamamıştır. Ayrıca HgCl2 uygulanarak sterilizasyonu sağlanan eksplantların
çoğunda daha sonraki zamanlarda kahverengileşerek canlılıklarını yitirdikleri gözlemlenmiştir.
Tablo-5’te uygulanan sterilizasyon uygulamalarındaki 10. gün sonunda kontamine (bulaşma) olmayan yani steril kalan eksplant yüzdeleri verilmiştir. Her bir sterilizasyon uygulamasında 20 eksplant kullanılmıştır.
Tablo-5: Sterilizasyon uygulamalarına ait steril eksplant yüzdeleri
Uygulama No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Steril eksplant yüzdesi (%) 0 0 20 0 0 0 10 15 20 30 40 0 0 45
Uygulamalarımızdaki sterilizasyon yüzdelerinin genelde düşük olması ve % 40’ın üzerindeki sterilizasyon yüzdesine sahip uygulamalarda da HgCl2
kullanılmasının etkisiyle eksplantların çoğu canlılıklarını kaybettiklerinden dolayı mikroçoğaltım için in vitro da steril tohumlardan elde edilen steril fidelerin kullanılmasına karar verilmiştir.
Eksplantlar gelişme mevsiminin başlangıcında aktif büyüyen sürgünlerden alındığında daha başarılı sonuçlar elde edilmektedir (Mansuroğlu ve Gürel 2001:266). Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü’nden gelen bitki örneklerinin dallarının yaşlı olması ve bize ulaşımı sırasındaki olumsuz koşulların (nemli ve gazeteye sarılı olarak gelmesi) sterilizasyonu önemli derecede etkilediği düşünülmektedir. Ayrıca doku kültürü çalışmaları boyunca sera koşullarında saksılarda tohumdan yetiştirdiğimiz bitkilerin genç dallarından alınan eksplantlar en iyi sterilizasyon yöntemiyle sterilize edildiğinde sterilizasyon oranının % 80’ e ulaştığı belirlenmiştir.
4.1.2. Mikroçoğaltım çalışmaları
Tohumlarında %50 oranında yağ bulunan jojoba bitkisinin erkek ve dişi çiçekleri ayrı ayrı fertlerde bulunmakta ve yalnız dişi çiçekli olanlar meyve bağlayabilmektedir. Cinsiyetinin belirlenebilmesi için ilk çiçek tomurcuklarının (1-4 yıl) görülmesi gerekmektedir (National Research Council, 2002:17). Bu yüzden planlı bir şekilde ekimi yapılamamakta ve zaman kaybına neden olunmaktadır.
Son zamanlarda jojoba bitkisinin doku kültürü yöntemleri ile çoğaltımı cinsiyeti belli bitkilerin üretilmesinde uygun bir yöntem olarak uygulanmaktadır. Bu yöntemle kurulan plantasyonlarda, erkek ve dişi bitkiler yetiştiricinin bilgisi dahilinde olduğundan, tohumla üretmeye nazaran uzun zaman beklemeden planlı bir şekilde dikim yapılabilmektedir.
Doku kültürü çalışmalarında nodal segment eksplantı farklı büyüme düzenleyicileri içeren MS besin ortamında kültüre alınmıştır. Yapılan çalışmalar aşağıda verilmiştir.
4.1.2.1. Farklı sitokininlerin sürgün çoğaltımına etkisi
Mikroçoğaltımda sitokininler ve sitokinin benzeri bileşikler kullanılmaktadır. Bu denemede; jojobaya ait in vitro steril fidelerden izole edilen nodal segmentler (0.5, 1.0, 2.0 mg l-1 )BAP, KİN ve (0.22, 0.44, 0.88 mg l-1 )TDZ içeren MS besin ortamında kültüre alınarak büyüme düzenleyicileri ve konsantrasyonlarının tepkilerine bakılmıştır. Kültür başlangıcından 10 gün sonra eksplantların yanlarında adventif tomurcukların oluşmaya başladığı fakat sürgün gelişiminin yavaş olduğu gözlemlenmiştir. 0.5 mg l-1 KİN içeren besin ortamındaki bazı eksplantlar hariç tüm eksplantlar adventif sürgün oluşturmuş ve eksplant başına sürgün sayısı kültürden 8 hafta sonra belirlenmiştir. BAP, KİN ve TDZ konsantrasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analiz sonuçları tablo-6’ da verilmiştir.
Tablo-6: Jojoba nodal segmentlerinde BAP, KİN ve TDZ konsantarasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analizi
Varyasyon Kaynakları S.D. K.O. F.
Genel 26
Ortam 8 7.067 9.277*
Hata 16 0.762
*p<0.01düzeyinde önemli
Tablo-6’da görüldüğü gibi kullanılan ortamların eksplant başına sürgün sayısına etkisi 0.01 düzeyinde anlamlı bulunmuştur. Bu farklılıkların önem düzeyini belirlemek amacıyla LSD testi yapılmıştır. Sonuçlar tablo-7’de verilmiştir.
Tablo-7: Jojoba nodal segmentlerinde BAP, KİN ve TDZ konsantrasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına etkisi
Büyüme düzenleyiciler
(mg l-1)
Eksplant Başına Sürgün Sayısı
1.tekerrür 2.tekerrür 3.tekerrür Ort.
BAP 0.5 2.4 1.4 5.0 2.93bc 1.0 4.0 6.0 3.4 4.46ab 2.0 4.4 6.4 5.4 5.40a KIN 0.5 0.8 0.6 0.8 0.73d 1.0 1.8 1.8 2.0 1.86cd 2.0 2.0 1.8 2.0 1.93cd TDZ 0.22 1.6 1.4 1.6 1.53cd 0.44 1.4 1.4 1.2 1.33cd 0.88 2.0 2.0 2.0 2.0cd
Aynı sütun içerisinde küçük harflerle gösterilen ortalamalar arasında p<0.01 düzeyinde önemlidir. LSD: 2.082
Tablo-7’de görüldüğü gibi genel olarak BAP içeren ortamlardaki sonuçlar KİN veya TDZ içeren ortamlardaki sonuçlardan daha başarılı bulunmuştur. Eksplant başına en çok sürgün sayısı 5.40 adet ile 2 mg l-1BAP içeren MS besin ortamından, ardından ikinci olarak (4.46 adet) 1 mg l-1BAP’lı ortamdan elde edilmiştir. Eksplant başına en düşük sürgün sayısı ise; 0.73 adet ile 0.5 mg l-1KİN içeren ortamdan elde edilmiştir.
Literatür taramasındaki verilerde de benzer sonuçlara ulaşılmıştır. Eksplant kaynağı olarak nodal segmentlerin ve farklı konsantrasyonlarda BAP içeren besin ortamlarının kullanıldığı çalışmalarda; Roussos ve ark’ı (1999); 26.6µM (~6 mg l-1 )
BAP içeren, Tyagi ve Prakash 2004’de; 10µM (~2.25 mg l-1 ) BAP içeren, Singh ve ark.’ı (2006); 4.44µM (~1 mg l-1 ) BAP ve 74.0 μM adenine içeren besin
ortamlarında sürgün sayısı açısından en iyi sonuçları elde ettiklerini bildirmişlerdir.
4.1.2.2. BAP’ın farklı oksinlerle kombinasyonunun sürgün çoğaltımına etkisi
Farklı sitokinin kaynaklarının kullanıldığı çalışmada en iyi sonucun sırasıyla 2.0 ve 1.0 mg l-1 BAP içeren besin ortamından elde edilmesinden dolayı, eksplantlar 1.5, 2.0 ve 2.5 mg l-1 BAP ve bunların bazı oksinlerle (1.25 mg l-1 IAA, IBA, NAA) kombinasyonlarını içeren besin ortamlarında kültüre alınarak yeni bir deneme kurulmuştur.
Kültüre alınan eksplantlar 6. hafta sonunda eksplant başına sürgün sayıları belirlenerek kendi ortamları ile aynı ortamda alt kültüre alınmış ve 6. hafta sonunda tekrar sürgün sayıları belirlenmiştir. Eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analiz sonuçları tablo-8’ ve 9 da verilmiştir.
Tablo-8: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle kombinasyonunun
eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analizi (6.hafta)
Varyasyon Kaynakları S.D. K.O. F.
Genel 35 BAP konsantrasyonları 2 0.190 1.660 Oksin çeşidi 3 3.574 31.233* BAPxOksin 6 2.097 18.320* Hata 24 0.114 *p<0.01düzeyinde önemli
Tablo-9: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle kombinasyonunun
eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analizi (12.hafta)
Varyasyon Kaynakları S.D. K.O. F.
Genel 35 BAP konsantrasyonları 2 2.194 1771 Oksin çeşidi 3 24.511 19.785* BAPxOksin 6 10.274 8.293* Hata 24 1.239 *p<0.01düzeyinde önemli
Tablo-8 ve 9’da görüldüğü gibi kullanılan ortamlardan BAP konsantarsyonları arasında istatiktiksel olarak önemli bir farklılık bulunmazken oksinlerin ve BAPxOksin etkileşiminin eksplant başına sürgün sayısına etkisi 0.01 düzeyinde anlamlı bulunmuştur. Bu farklılıkların önem düzeyini belirlemek amacıyla LSD testi yapılmıştır. Sonuçlar tablo-10 ve 11’de verilmiştir.
Tablo-10: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle kombinasyonunun
eksplant başına sürgün sayısına etkisi (6.hafta)
Sitokinin Oksin (1.25 mg l-1)
BAP (mg l-1)
- IAA IBA NAA
1.5 2.26 bc* 3.46 a 2.26 bc 1.26 d
2 3.53 a 2.60 b 1.00 d 1.13 d
2.5 2.73 b 1.73 cd 1.66 cd 2.53 b
Ort. 2.84 A** 2.60 A 1.64 B 1.64B
Aynı sütun içerisinde küçük harflerle, aynı satır içerisinde büyük harflerle gösterilen ortalamalar arasında p<0.01 düzeyinde önemlidir.* LSD:0.77 ** LSD:0.44
Tablo-11: Jojoba nodal segmentlerinde BAP’ın farklı oksinlerle kombinasyonunun
eksplant başına sürgün sayısına etkisi (12.hafta)
Sitokinin
Oksin (1.25 mg l-1)
BAP (mg l-1)
- IAA IBA NAA
1.5 3.13 cde* 6.26 b 6.33 b 2.33 de
2 9.13 a 6.06 b 4.40 bcd 1.80 e
2.5 5.80 b 4.93 bc 5.13 bc 3.20 cde
Ort. 6.02 A** 5.76 A 5.29 A 2.44 B
Aynı sütun içerisinde küçük harflerle, aynı satır içerisinde büyük harflerle gösterilen ortalamalar arasında p<0.01 düzeyinde önemlidir.* LSD:2.54 ** LSD: 1.46
Tablo-10 ve 11’de görüldüğü gibi; 6. hafta ve 12. hafta sonunda elde edilen sonuçlara göre; eksplant başına en yüksek sürgün sayısı (3.53 adet ve 9.13 adet) 2 mg l-1 BAP içeren besin ortamlarından elde edilmiştir (şekil-5). 6. hafta sonunda elde edilen sonuçlara göre eksplant başına en düşük sürgün sayısı (1.00 adet) 2 mg l-1 BAP + 1.25 mg l-1 IBA içeren ortamdan elde edilirken, 12. hafta sonunda elde edilen sonuçlara göre ise eksplant başına en düşük sürgün sayısı 1.80 adet ile 2 mg l-1 BAP + 1.25 mg l-1 NAA içeren besin ortamından elde edilmiştir.
Oksin çeşidinin etkisine bakıldığında ise; oksin içermeyen ortamlarda 6. ve 12. hafta sonunda 2.84 ve 6.02 adet ile en iyi sonuçlar elde edilmiştir. BAP’ın oksinlerle kombinasyonları arasında ise IAA kombinasyonundan elde edilen sonuçlar NAA ve IBA ile olan kombinasyonlarına göre daha iyi sonuç vermiştir. Ayrıca bu sonuçlar (2.60 ve 5.76 adet) oksin içermeyen ortamdan elde edilen sonuçla aynı istatistiksel
grupta yer almaktadır. 12. haftada IBA kombinasyonundan elde edilen sonuçta istatistiksel olarak bu grupta yer almaktadır.
Şekil-5: 2 mg l-1 BAP içeren MS besin ortamında çoğalan sürgünler
a:6.hafta, b:12.hafta görünümleri
Literatür taramalarında jojoba bitkisinde mikroçoğaltım çalışmaları içerisinde sitokinin ve oksin kombinasyonlarının kullanıldığı sadece bir çalışmaya ulaşılmıştır (Bashir ve ark., 2008). Yapılan bu çalışmada benzer şekilde IAA’in en iyi sonucu verdiği belirtilmiş ve sürgün başlangıcı ve sayısı bakımından en iyi ortamın 5.55 μM BA + 7.1 μM IAA (1.25 mg l-1 BAP + 1.25 mg l-1 IAA) içeren besin ortamı olduğu rapor edilmiştir.
Yapılan mikroçoğaltım çalışmalarında elde edilen sonuçlara göre; tüm denemelerimizde eksplant başına en yüksek sürgün sayısı 2 mg l-1 BAP içeren besin ortamlarından elde edilmiştir. Cinsiyeti belli olan bitkilerden alınan ve sterilite sağlanan eksplantlar 2 mg l-1 BAP içeren besin ortamında kültüre alınmış ve 6. hafta sonunda ortalama olarak eksplant başına 4.5 sürgün elde edilmiştir (Şekil-6). Ayrıca bu eksplantlardan elde edilen sürgünlerin gelişiminin aseptik fidelere ait eksplantlardan elde edilen sürgünlerin gelişimine göre daha iyi olduğu gözlenmiştir.
Sekil-6: 2 mg l-1 BAP içeren besin ortamındaki cinsiyeti belli olan eksplantlar
4.1.2.3. Köklendirme çalışmaları
İn vitro da çoğalan sürgünler köklenme için, ilk olarak farklı oksinlerin (NAA, IAA, IBA) farklı konsantrasyonlarını içeren temel besin ortamına (MS) alınmışlardır (Tablo-12). Her bir ortama 10’ar eksplant konulmuş ve kök oluşumu sürgünün köklendirme ortamına aktarılmasından sonra 4-7 hafta içerisinde gerçekleşmiştir. Sekiz haftanın sonunda köklenen sürgün sayıları kaydedilmiş ve tablo-12’de bu sayılar yüzde olarak verilmştir. IBA ve NAA büyüme düzenleyicilerini içeren besin ortamlarından köklenme elde edilirken IAA içeren besin ortamlarında kök oluşumu gözlenmemiştir. Köklenme yüzdesi bakımından en iyi sonuç % 40 ile 3 mg l-1 NAA içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. En yüksek köklenme yüzdesine sahip ikinci ortam ise % 30 ile 1 mg l-1 IBA içeren MS ortamıdır (şekil-7). 10, 15 mg l-1 IBA ve 1, 5, 9 mg l-1 NAA içeren MS besin ortamlarında da köklenme gerçekleşmiştir. Fakat büyüme düzenleyici içermeyen kontrol grubu ile 3, 5 mg l-1 IBA, 7 mg l-1 NAA ve 1, 3 mg l-1 IAA içeren MS besin ortamlarında köklenme gerçekleşmemiştir.
Tablo-12: İn vitro’da elde edilen sürgünlerin farklı büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamlarındaki köklenme yüzdeleri
Büyüme düzenleyicisi
(mg l-1)
IBA NAA IAA
- 1.0 3.0 5.0 10.0 15.0 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 1.0 3.0 Köklenme
yüzdesi (%) 0 30 0 0 10 10 20 40 10 0 10 0 0
Köklenme yüzdesini artırmak amacıyla adventif sürgünler NAA (3 mg l-1 ) ve
IBA(1 mg l-1 ) büyüme düzenleyicileri içeren ½ MS ve %1.5 veya 3 şeker temel
besin ortamları ile ½ MS + %1.5 şeker +%0.5 Aktif karbon içeren ortamlarda kültüre alınarak yeni bir deneme kurulmuştur. Sonuçlar tablo-13’de verilmiştir.
Şekil-7: İn vitro’da köklenen sürgünler
a: 3 mg l-1 NAA içeren MS, b: 1 mg l-1 IBA içeren MS besin ortamındaki görünümleri
Tablo-13: İn vitro’da elde edilen sürgünlerin farklı köklenme ortamlarındaki köklenme yüzdeleri
Temel besin ortamı Büyüme düzenleyiciler Köklenme Yüzdesi
½ MS (%3 şeker) - 0 1 mg l-1 IBA 20 3 mg l-1 NAA 30 ½ MS (%1.5 şeker) - 0 1 mg l-1 IBA 30 3 mg l-1 NAA 40 ½ MS (%1.5 şeker) +%0.5AC 1 mg l-1 IBA 50 3 mg l-1 NAA 10
Bu denemede kök oluşumu sürgünün köklendirme ortamına aktarılmasından sonra 4-6 hafta içerisinde gerçekleşmiştir. Bu köklendirme denemesinde; en yüksek köklenme yüzdesi % 50 ile 1 mg l-1 IBA içeren ½ MS (% 1.5 şeker)+% 0.5AC (aktif
karbon) besin ortamından elde edilmiştir (şekil-8). Bu ortamda köklendirilen sürgünlerin bir süre sonra yapraklarında hafif sararma meydana gelmiştir. Ancak bu sararma bitki dış ortama aktarıldıktan sonra durmuş ve bitki normal gelişimine devam etmiştir.
Şekil-8: İn vitro’da köklenen sürgünler
a:1/2 MS(%1.5 şeker)+%0.5AC+1 mg l-1 IBA, b: 1/2 MS (%1.5 şeker)+3 mg l-1 NAA
b
a
Bashir ve ark.’ı 2007’de jojobanın köklendirilmesinde IBA, IAA, NAA’in farklı dozlarıyla yaptıkları çalışmalarda köklenme için en iyi ortamın 0.5 mg l-1 IBA
olduğunu belirtmişlerdir. Bashir ve ark. (2008) farklı bir çalışmada yine jojobanın köklendirilmesinde IBA, IAA, NAA’in farklı dozlarını kullanmışlar ve IBA içeren ortamda gelişen köklü bitkicikler seraya aktarmada en iyi hayatta kalma oranına sahip olduklarını belirtmişlerdir. Abass (2010)’da yaptığı bir çalışmada, IBA (4.9, 9.9 ve 15.9 mgl-1) içeren MS ortamında köklendirmeye aldığı rejenere sürgünlerin sadece 4.9 mgl-1 IBA içeren ortamda %15 oranında köklendiğini rapor etmiştir.
Köklenen sürgünleri besin ortamından arındırma işleminde NAA içeren ortamdan gelen bitkiciklerin çoğunun köklerinin sürgünden ayrıldığı gözlenmiştir. Bu ayrılma veya kopmaların, kök oluşumundan önce kallus oluştuğu ve daha sonra bu kallustan kök oluştuğu için gerçekleştiği görülmüştür. IBA içeren ortamda köklenen sürgünlerde kallus gelişimi gözlenmemiş ve aktarımda herhangi bir sorunla karşılaşılmamıştır. Bashir ve ark. (2008)’de belirttiği gibi bu çalışmada da IBA içeren ortamdan gelen köklü sürgünlerin aklimatizasyonu daha başarılı olmuştur.
Köklenen sürgünler musluk suyu altında besin ortamının uzaklaştırılması için yıkandıktan sonra iklim odasında steril torf içeren küçük saksılara aktarılmıştır. Saksılara naylon poşet geçirilmiş ve 1 hafta sonra poşet belli yerlerinden açılmış ve ikinci hafta tamamen çıkartılarak bitkiciklerin hem dış şartlara uyumu hem de kök sisteminin gelişmesi sağlanmıştır (şekil-9). Bu şekilde aklimatizasyonu yapılan ve IBA içeren ortamdan gelen bitkiciklerin %75’inin hayatta kaldığı gözlemlenmiştir.
Şekil -9: İn vitro’da gelişen bitkiciklerin dış ortama alıştırılması
Dış ortama alıştırılan jojoba bitkisi, a:1 haftalık, b:3 haftalık, c:2 aylık, d:3 aylık
a b
