DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve saflıklarının belirlenmesi

DNA izolasyonu, Doyle ve Doyle (1987) ile Özkaya ve ark. (2009)’da belirtilen metodların birleştirilip tekrar modifiye edilmesiyle oluşturulan metoda göre yapılmıştır. İzole edilen DNA’lar, konsantrasyon ve saflıkları spektrofotometrede (Nanodrop ND-100) belirlenmiş ve sonuçlar tablo-14’de verilmiştir.

Tablo-14: İzole edilen DNA’lar, konsantrasyon ve saflıkları

Örnekler Konstr.(ng/ul) A230 A260 A280 A260/A280 A260/A230 Dişi(♀) Bitki 72.600 1.831 1.452 0.880 1.650 0.790 Erkek(♂) Bitki 44.850 1.176 0.896 0.509 1.765 0.765 J1 _{19.050 0.374 0.380 0.208 1.895 1.015} J2 _{17.000 0.367 0.339 0.192 1.800 0.925} J3 _{50.850 0.698 1.016 0.545 1.865 1.460} J4 _{59.950 0.641 1.198 0.619 1.935 1.845} J5 _{21.900 0.576 0.439 0.239 1.835 0.760} J6 _{23.750 0.503 0.475 0.287 1.655 0.945} J7 _{33.300 0.822 0.666 0.384 1.735 0.810} J8 _{42.850 0.566 0.857 0.435 1.970 1.515}

*J1-J8 ile gösterilen bireyler cinsiyeti bilinmeyen 8 ayrı jojoba bitkisine aittir.

DNA izolasyonu bir problemle karşılaşılmadan tüm bitkilerde başarıyla yapılmıştır. %1’lik agaroz jel elektroforezinde yürütülen ve görüntülenen DNA’ların izolasyon sırasında zarar görmediği ve çalışma için uygun oldukları tespit edilmiştir. Çalışmada kullanılan DNA’larla ilgili spekrofotometrik değerlere bakıldığında konsantrasyonların ve safiyetin istenilen oranlarda olduğu görülmektedir (Tablo-14). 260 nm dalga boyunda DNA örneklerinin nükleik asit değerleri, 280 nm’de protein, 230 nm’de içeriğe karışan diğer bileşiklerin miktarları belirlenmektedir. 260 nm ve 280 nm dalga boyunda elde edilen değerlerin oranı (A260/A280) ise DNA’nın

saflığının ölçüsünü vermektedir. Bu oranın ortalama olarak 1.7-1.9 aralığında olması idealdir. Elde edilen değerler de bu aralıkta ya da buna çok yakın değerlerdir. Bu örneklerin kullanıldığı PCR çalışmalarında bir problem yaşanmamıştır.

4.2.2. PCR Çalışmaları

Jojoba bitkilerinde cinsiyetin moleküler markör tekniği ile belirlenmesi amacıyla 3.2.2.2’de anlatıldığı gibi PCR yapılmıştır. Çalışmada Tablo-3’de dizilimleri ve bağlanma sıcaklıkları verilen 2 adet primer kullanılmıştır. Elde edilen amplifikasyon ürünleri %2’lik agaroz (Serva) jel elektroforezi ile yürütülmüş ve görüntüleme sistemiyle (Vilber Lourmat, Fransa) görüntülenmiştir (Şekil-10).

Şekil-10: UBC-807 primeri ile elde edilen PCR ürünlerine ait agaroz jel görüntüsü

PCR uygulamaları her iki primerde de en az iki tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir.

UBC-807 primeri ile elde edilen PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüleri incelendiğinde markörün 1200 bp uzunluğu ile kesişen erkek olduğu belli olan bireyde görüntülenen bant, cinsiyeti belli olmayan J5, J6 ve J7 bireylerinde de görüntülenmiştir. Bu bantın markör eşliğindeki karşılığı Sharma vd. 2008’de ifade edilen yer ile örtüşmektedir. Dişi olduğu bilinen bitkide ve diğer cinsiyeti belli olmayan bitkilerde ise bu bant oluşmamıştır.

OPG-5 primeri ile elde edilen PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüleri incelendiğinde Agrawal ve ark. (2007)’de cinsiyet teşhisinde kullanılan uzunlukta bantlar elde edilememiştir. Bu durum cinsiyet teşhisinde genotipik özelliklerin etkisi olabileceği, bu nedenle çalışmada kullandığımız genotipte primerin sonuç vermemiş olabileceği şeklinde yorumlanabilir.

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu tez çalışması, jojoba (Simmondsia chinensis) bitkisinin in vitro hızlı çoğaltımı ve moleküler işaretleyicilerle erkek ve dişi bitkilerin belirlenmesi amacıyla yürütülmüş ve elde edilen sonuçlar özet olarak aşağıda verilmiştir.

Simmondsia chinensis (Link) Schneider türünün yeşil aksam kısmı için uygulanan sterilizasyon işlemlerinde çamaşır suyu kullanılan uygulamalarda sterilizasyon yüzdesi düşük bulunmuştur (en yüksek %20). HgCl2 kullanılan

uygulamalarda ise bu oran % 45’e yükselmiş, yine eksplantların çoğu kontamine olmuşlardır. Ayrıca HgCl2 kullanılan eksplantlarda zamanla kararma ve canlılıklarını

yitirme gözlenmiştir. Bu sebeplerden dolayı mikroçoğaltım için in vitro da steril tohumlardan elde edilen steril fidelerin eksplant kaynağı olarak kullanılmasına karar verilmiştir.

Yeşil aksam sterilizasyonu için eksplantların daha steril koşullarda yetiştirilen bitkilerden ve bitkinin gelişme mevsiminin başlangıcında aktif büyüyen sürgünlerden alınması daha başarılı sonuçlar elde edilmesi için önerilebilir.

İn vitro hızlı çoğaltım için jojobaya ait in vitro steril fidelerden izole edilen nodal segmentler ilk olarak (0.5, 1.0, 2.0 mg l-1 )BAP, KİN ve (0.22, 0.44, 0.88 mg l-

1 _{)TDZ içeren MS besin ortamında kültüre alınarak büyüme düzenleyicileri ve}

konsantrasyonlarının tepkilerine bakılmıştır. Eksplantlar sekiz hafta süreyle bu ortamlarda kültüre alınmıştır. En iyi büyüme düzenleyici çeşidi ve konsantrasyonunu tespit etmek için eksplant başına sürgün sayıları belirlenmiştir. 0.5 mg l-1 _{KİN içeren}

besin ortamı dışındaki tüm ortamlarda eksplantların tamamı adventif sürgün oluşturmuştur. Eksplant başına en çok sürgün sayısı 5.40 adet ile 2 mg l-1BAP içeren MS besin ortamından elde edilmiştir.

Bu denemedeki sonuçlar dikkate alınarak kurulan yeni denemede nodal segmentler 1.5, 2.0 ve 2.5 mg l-1 BAP ve bunların bazı oksinlerle (1.25 mg l-1 IAA, IBA, NAA) kombinasyonlarını içeren besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Altıncı

hafta sonunda ölçümler yapılmış ve çoğalan sürgünler aynı ortamda alt kültüre alınarak altı hafta daha bekletilmiş ve on ikinci hafta sonunda tekrar sayım yapılmıştır. BAP konsantarsyonları arasında istatiktiksel olarak önemli bir farklılık bulunmazken oksinlerin ve BAPxOksin etkileşiminin eksplant başına sürgün sayısına etkisi 0.01 düzeyinde anlamlı bulunmuştur. Eksplant başına en çok sürgün sayısı her iki ölçümde de 2 mg l-1BAP içeren MS besin ortamından elde edilmiştir (3.53 ve 9.13 adet).

Mikroçoğaltım amacıyla kurulan denemelerimizde eksplant başına en yüksek sürgün sayısını elde ettiğimiz 2 mg l-1BAP içeren MS besin ortamında, cinsiyeti belli bitkilerden alınan ve steril kalan eksplantlar kültüre alınmıştır. 6. hafta sonunda ortalama olarak eksplant başına 4.5 sürgün elde edilmiştir. Dış ortamda yetişen bitkilerden alınan bu eksplantlarda in vitro’dan gelen steril eksplantlara göre sürgün gelişiminin daha iyi olduğu gözlemlenmiştir.

İn vitro da çoğalan sürgünler köklenme için, ilk olarak farklı oksinlerin (NAA, IAA, IBA) farklı konsantrasyonlarını içeren temel besin ortamına (MS) alınmışlardır. IBA ve NAA büyüme düzenleyicilerini içeren besin ortamlarından köklenme elde edilirken IAA içeren besin ortamlarında kök oluşumu gözlenmemiştir. Köklenme yüzdesi bakımından en iyi sonuç % 40 ile 3 mg l-1 NAA içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. En yüksek köklenme yüzdesine sahip ikinci ortam ise % 30 ile 1 mg l-1 _{IBA içeren MS ortamı olarak belirlenmiştir. Köklenme yüzdesini artırmak}

amacıyla adventif sürgünler NAA (3 mg l-1_{) ve IBA(1 mg l}-1_{) büyüme düzenleyicileri}

içeren ½ MS ve %1.5 veya 3 şeker temel besin ortamları ile ½ MS + %1.5 şeker +%0.5 Aktif karbon içeren ortamlarda kültüre alınarak yeni bir deneme kurulmuştur. Bu köklendirme denemesinde; en yüksek köklenme yüzdesi % 50 ile 1 mg l-1 IBA içeren ½ MS (% 1.5 şeker)+% 0.5AC (aktif karbon) besin ortamından elde edilmesine rağmen bir süre sonra sürgün yapraklarında hafif sararma meydana gelmiştir. Ancak dış ortama alıştırılan sürgünlerde bu problem ortadan kalkmıştır. Sararma sorununu ortadan kaldırmak amacıyla AC (aktif karbon) dozunun düşürülerek kullanılması veya sürgünlerin bu ortamda daha kısa süre tutulması önerilebilir.

Jojoba ekonomik değeri yüksek bir bitki olmasına rağmen ekonomik anlamda önem taşıyanlar dişi bitkilerdir. Jojobada cinsiyetin ortaya çıkması ise 1 ila 4 yıl gibi uzun bir süre alan bir durumdur. Bu nedenle cinsiyetin laboratuvar koşullarında moleküler teknikler ile belirlenmesi jojoba yetiştiriciliği için önem arz eder. UBC- 807’de elde edilen jel görüntüsünden dişi ve erkek birey ayrımı başarıyla gerçekleştirilmiştir. In vitro’da mikroçoğaltım yöntemi ile aynı bitkiden elde edilen yeni bitkilerin cinsiyeti aynı olacağından tek bir bireyde bu yöntem ile cinsiyet tespiti yapılarak diğer bitkilerinde cinsiyeti belirlenmiş olur.

OPG-5’de cinsiyet teşhisinde dikkate alınan bantlar elde edilememiştir. Bunun sebebinin genotiplerle ilgili olabileceği, literatürde geçen genotiplerde başarı elde edilebildiği halde çalışmamızdaki genotipte bunun olmadığı görülmüştür.

6. KAYNAKLAR

Abass, Neveen H. (2010). The Influence of Some Growth Regulators on Proliferation and Rooting in Vitro of Propagated Jojoba. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 4(1), 45-53.

Agrawal, Veena, Sharma, Kuldeep, Gupta, Sarika, Kumar, Ravindra, Prasad, Manoj (2007). Identification of sex in Simmondsia chinensis (Jojoba) using RAPD markers. Plant Biotechnol Rep, 1,207–210.

Ateş, Ali (2006). Moleküler Biyoloji. Konya:Damla Ofset, 367.

Babaoğlu, M., Yorgancılar, M., Akbudak, M.A. (2001). Bölüm 1 Doku Kültürü: Temel Laboratuvar Teknikleri.(Mehmet Babaoğlu vd.) Bitki Biyoteknolojisi: I- Doku Kültürü ve Uygulamaları. Konya: S.Ü. Vakfı Yayınları, 1-35

Bashir, M. Azhar, Anjum, M. Akbar ve Rashid, Hamid (2007). İn vitro root formation in micropropagated shhoots of jojoba (Simmondsia chinensis). Biotechnology, 6(3), 465-472.

Bashir, M. Azhar, Anjum, M. Akbar ve Rashid, Hamid (2008). In vitro propagation of some promising genotypes of jojoba (Simmondsia chinensis). African Journal of Biotechnology, 7 (21), 3878-3886.

Doyle, J.J. ve J. L. Doyle. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19, 11-15.

Greene, R.A. ve Foster, E.D. (1933). The liquid wax of seeds of Simmondsia californica. Bot. Gaz., 94:826–828.

Hamama, L., Baaziz, M., ve Letouze, R. (2001).Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf tissue of jojoba . Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65, 109–113.

Jacoboni, A., Standarti, A. (1987). Tissue culture of jojoba (Simmondsia chinensis Link). Acta Hort., 212: 557-560.

Llorente Berta E., Juarez, Leonardo M., Apostolo, Nancy M. (2007). Exogenous trehalose affects morphogenesis in vitro of jojoba. Plant Cell Tiss Organ Cult, 89, 193–201.

Mansuroğlu, S., Gürel, E. (2001). Bölüm 8 Mikroçoğaltım.(Mehmet Babaoğlu vd.)Bitki Biyoteknolojisi: I-Doku Kültürü ve Uygulamaları. S.Ü. Vakfı Yayınları, Konya, 262-281.

Mills, D., Wenkart, S. ve Benzioni, A. (1997) Micropropagation of Simmondsia chinensis (Jojoba). In: Bajaj YPS (ed) Biotechnology in Agriculture and Forestry, High-Tech and Micropropagation VI Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg,370– 393.

Mohasseb, Heba A. A, El-Bahr Mohamed K., Adam, Zakia M., Moursy, Hamdy A., ve Solliman, Mohei El-Din (2009). In Vitro Clonal Propagation of Jojoba (Simmondsia Chinensis (Link) Schn.). Australian Journal of Bas ic and Applied Sciences, 3(4), 3128-3136.

MSTAT-C. (1980). MStat User’s Quides Statistics (Version 5 ed.) Michigan State Universty, Michigan, USA.

Murashige, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-497.

National Research Council (2002). Jojoba: New Crop for Arid Lands, New Raw Material for Industry.National academy press, Washington, 17-76.

Özkaya, M. Taha, Ergülen, Erkan, Ülger, Salih ve Özilbey, Nejat (2009). Molecular Characterization of Some Selected Wild Olive (Olea oleaster L.) Ecotypes Grown in Turkey. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarım bilimleri dergisi,15 (1), 14- 19.

Rosengarten, Frederic (2004). The book of edible nuts. Dover Publications, New York,USA, 295.

Roussos, P.A., Tolia-Marioli, A., Pontikis, C.A.ve Kotsias, D. (1999). Rapid multiplication of Jojoba seedlings by in vitro culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 57, 133–137.

Roussos, P.A., Gasparatos, Dionisios, Tsantili, Eleni ve Pontikis, Constantine A.(2007). Mineral nutrition of jojoba explants in vitro under sodium chloride salinity. Scientia Horticulturae, 114, 59–66.

Sharma, Kuldeep, Agrawal, Veena, Gupta, Sarika, Kumar, Ravindra, Prasad, Manoj (2008). ISSR marker-assisted selection of male and female plants in a promising dioecious crop: jojoba (Simmondsia chinensis). Plant Biotechnol Rep, 2,239–243. Singh, A., Reddy, M.P., Patolıa, J.S. (2008). An improved protocol for

micropropagation of elite genotypes of Simmondsia chinensis (Link) Schneider. Biologia Plantarum, 52 (3), 538-542.

Tyagi, R.K., Prakash, S. (2004). Genotype- and sex-specific protocols for in vitro micropropagation and medium-term conservation of jojoba. Biologia Plantarum, 48 (1), 19-23.

Wisniak, Jaime (1987). The chemistry and technology of jojoba oil. The American Oil Chemists’ Society, USA, 1-2.

www.gencziraat.com (online erişim tarihi: 22.08.2009)

Yıldırım, A., Kandemir, N. (2001). Bölüm 23 Genetik markörler ve analiz metodları.(Sebahattin Özcan vd.) Bitki Biyoteknolojisi: II –Genetik Mühendisliği ve Uygulamaları. S.Ü. Vakfı Yayınları, Konya, 334-363.

7. ÖZGEÇMİŞ

T. C.

SELÇUK ÜNİVERSİTESİ Eğitim Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü

Özgeçmiş

Adı Soyadı: Zeynep ÖNCEL İmza:

Doğum Yeri: Konya Doğum Tarihi: 26.04.1986 Medeni Durumu: Bekar

Öğrenim Durumu

Derece Okulun Adı Program Yer Yıl

İlköğretim İhsan Özkaşıkçı İ.Ö.O Konya 1992-1997 Ortaöğretim Mareşal M.K. İ.Ö.O Konya 1997-2000

Lise Konya Lisesi Konya 2000-2003

Lisans S.Ü. Eğitim

Fak.

Biyoloji Öğretmenliği

Konya 2003-2008

Yüksek Lisans Selçuk Üniv. Eğitim Bil.Enst. Biyoloji Öğrt.

İlgi Alanları: İngilizce, fotoğraf çekmek, kitap okumak.

İş Deneyimi:

Özel Dershaneler, Yüksek Lisans boyunca Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi bünyesinde bulunan Bitki Biyoteknolojisi Laboratuvarında aktif olarak çalışmalarda bulundum.

Tel: 0536 478 15 59