G‹R‹fi
Karbapenemler P.aeruginosa infeksiyonlar›n›n teda-visinde kullan›lan güçlü antibiyotiklerdir(1,2). An-cak d›fl membran permeabilitesinin azalmas›, efflux pompalar›n›n up regülasyonu ve karbapenemaz üre-timi gibi mekanizmalar Pseudomonas sufllar›nda kar-bapenem direncine yol açabilmektedir(1,2,3). Karbapenemazlar içinde Ambler moleküler s›n›fla-mas›nda B s›n›f›n› oluflturan metallobetalaktamazlar (MBL) klinik aç›dan en önemli grubu oluflturmakta-d›r. MBL’lar›n substrat profilleri çok genifl olup ge-nifllemifl spektrumlu sefalosporinleri(
sefotak-sim,seftazidim, sefepim) ve karbapenemleri (imipe-nem,meropenem,panipenem)
içermektedir(4,5).1991 de Japonya’da S.marcescens de tan›mlanan IMP-1 ilk edinsel karbapenem direnç enzimidir(4). IMP-1’i kodlayan blaIMP genlerinin integronlarda yer almas› nedeniyle di¤er Gram ne-gatif bakterilere transfer olabildi¤i gösterilmifltir. Gerek spektrumunun geniflli¤i gerekse transfer ola-bilme özelli¤i nedeniyle, MBL üreten bakterilerin h›zla belirlenmesi hem klonal yay›l›m›n önlenmesi hem de bu direnç genlerinin hastane ortam›nda di¤er
Yo¤un Bak›m Ünitesinden
‹zole Edilen Karbapeneme Dirençli Pseudomonas aeruginosa
Sufllar›nda Metallobetalaktamaz Üretiminin Araflt›r›lmas›
(*) fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuar›, ‹stanbul (**) fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma Hastanesi Enfeksiyon Hastal›klar› ve Klinik Mikrobiyoloji Klini¤i, ‹stanbul
Banu BAYRAKTAR(*), Dilek YILDIZ(**), Emin BULUT(*)
ÖZET
Kas›m 2002-Kas›m 2003 tarihleri aras›nda fiiflli Etfal E¤itim ve Araflt›rma hastanesi yo¤un bak›m ünitesinden izole edilen karbapeneme dirençli Pseudomonas aeruginosa izolatlar› prospektif olarak toplanm›flt›r. Farkl› hastalardan izole edilen 27 sufl de¤erlendirilmifltir. Meropenem(MP) ve imipenem(IP) için minimal intibitör konsantrasyonlar› (M‹K) Etest ile saptan-m›flt›r. Sufllar›n, seftazidim (CAZ), aztreonam( ATM), piperasillin+tazobaktama (TZP) duyarl›l›klar› disk diffüzyon metoduy-la belirlenmifltir. Metallo beta-metoduy-laktamaz (MBL) taramas› Etest yöntemiyle yap›lm›fl ve 27 sufltan 17’sinde MBL pozitif bulun-mufltur.
Anahtar sözcükler: Metallobetalaktamaz (MBL), Pseudomonas, antibiyotik direnci
SUMMARY
Investigation of Metallo beta-lactamase Production in Carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa Strains Isolated in Intensive Care Unit
From November 2002 to November 2003 carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from intensive ca-re unit weca-re collected prospectively. Twenthy seven nonduplicated isolates weca-re evaluated. MIC values of meropenem (MP) and imipenem (IP) were detected by Etest. Ceftazidime( CAZ), aztreonam( ATM), piperasillin+tazobactam (TZP) susceptibi-lities of starins were determined by disk diffusion test. Screening for metallo beta-lactamase (MBL) production was carried out in these isolates by Etest. Seventen strains out of 27 were found as MBL producers.
y›sal de¤erler birbirine oranland›¤›nda 8 ve üzerinde bir de¤er elde edilmesi, baflka bir deyiflle IP M‹K de-¤erinin EDTA varl›¤›nda en az 3 log2 dilüsyon ve üzerinde azalmas› MBL pozitifli¤i olarak de¤erlen-dirilmifltir.
BULGULAR
Toplam 27 sufltan 17’sinde (%66.6) Etest metoduy-la MBL pozitif bulunmufltur. Suflmetoduy-lar›n 20’si (%74) CAZ, 20si (%74) ATM,16’s› (%59)TZP’ye dirençli bulunmufltur.
3 sufl (no:1,5,25) imipeneme orta duyarl› iken, mero-peneme dirençli; 2 sufl (no: 20,22) meromero-peneme orta duyarl› iken, imipeneme dirençli; 2 sufl (no:15,16) imipeneme dirençli iken meropeneme duyarl› bulun-mufltur.
TARTIfiMA
Son y›llarda birçok ülkeden edinsel MBL’lar›n yo-laçt›¤› karbapenem direncinin s›kl›¤›nda art›fl bildi-rilmifltir(4,10). Metallobetalaktamazlar IMP veya VIM serisinden enzimler olup, özellikle Akdeniz ül-kelerinde VIM serisi enzimlere daha s›k rastlanmak-tad›r(1,4). ‹lk tan›mlanan IMP-1 Japonya’da S. mar-cescens suflunda saptanm›flt›r(4).Daha sonra 1999 y›l›nda ‹talya’da P.aeruginosa sufllar›nda yine integron üzerinde kodlu, transfer olabilen ikinci bir metallobetalaktamaz VIM-1 tan›mlanm›flt›r(8). En s›k Güney Do¤u Asya ve Avrupa olmakla birlikte tüm dünyadan bildirilmifl MBL üreten izolatlar mev-cuttur.Yak›n zamanda IMP-1’e benzeyen MBL üre-ten Gram negatif bakteriler ‹ngiltere, ‹talya, Singa-pur’dan bildirilmifltir(5,10).
MBL’lar›n sefalosporinlere, sefamisinlere ve karba-penemlere karfl› dirence yol açmas› ve MBL genle-rinin integron üzerinde mobil gen kasetlerinde yer almas› nedeniyle farkl› Gram negatif bakteri türleri-ne h›zla yay›labilme potansiyeli tafl›mas›, metallo-betalaktamaz üreten Pseudomonas’lar› klinik bir teh-dit haline getirmifltir(5,6,7,8,9). MBL pozitif bakteri-lerin h›zla tan›mlanmas› infeksiyon kontrolü ve yay›-l›m›n önlenmesi aç›s›ndan önemlidir(5, 8,10). Rutin mikrobiyoloji laboratuar›nda kullan›lmak üze-re MBL’lar›n EDTA,a¤›r metal tuzlar› ve thiol bile-flikleriyle inhibe olmas›ndan yararlan›larak fenotipik bakteri türlerine aktar›lma olas›l›¤›n›n ortadan
kald›-r›lmas› aç›s›ndan önemlidir (5,6,7,8,9). Konvansiyo-nel duyarl›l›k testleri ile bu enzimlerin varl›¤›n›n gösterilmesi mümkün olmamakta,ilgili genin mole-küler tekniklerle aranmas› veya enzim testlerinin ya-p›lmas› gerekmektedir(4,9). Ancak bu metodlar ru-tin tarama için uygun de¤ildir. MBL’lar›n aktivitele-ri sulbaktam, klavulanikasit ve tazobaktam gibi kon-vansiyonel betalaktamaz inhibitörleriyle bask›lana-mazken, EDTA gibi flelasyon yapan maddelerce in-hibe edilebilmektedir(2,4,10). Bundan yararlan›la-rak disk diffüzyon prensibine dayal› fenotipik testler gelifltirilmeye çal›fl›lm›flt›r. Yine ayn› prensipten yo-la ç›karak gelifltirilen imipenem/imipenem+EDTA (IP/IPI)
E testleri kullan›ma girmifltir(5,9,10,11).
Bu çal›flmada prospektif olarak bir y›l süre ile fiiflli Etfal Hastanesi yo¤un bak›m ünitesinden izole edi-len karbapeneme dirençli P.aeruginosa sufllar›nda MBL s›kl›¤›n›n E test ile araflt›r›lmas› amaçlanm›fl-t›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bakteri sufllar›.Kas›m 2002-Kas›m 2003 tarihleri aras›nda prospektif olarak yo¤un bak›m ünitesinde yatan 27 hastadan izole edilen, disk diffüzyonla imi-penem ve meroimi-peneme dirençli bulunan 27 P. aeru-ginosasuflu çal›flmaya dahil edilmifltir. Tüm sufllar BBL Crsytal E/NF ID sistem ile P.aeruginosa olarak identifiye edilmifltir.
Duyarl›l›k testleri. Sufllar›n seftazidime(CAZ), az-treonama(ATM) ve piperasillin/ tazobaktama(TZP) duyarl›l›klar› disk diffüzyon yöntemiyle NCCLS’e uygun olarak yap›lm›flt›r. Meropenem ve imipenem için M‹K de¤erleri Etest ile saptanm›flt›r. Mueller-Hinton agar yüzeyine 0.5 McFarland bulan›kl›¤›nda ayarlanm›fl inokulum yay›larak üzerine E test fleritle-ri yerlefltifleritle-rilmifl, 35°C de 20 saat inkübasyonu taki-ben inhibisyon elipsinin fleridi kesti¤i noktadaki sa-y›sal de¤er M‹K de¤eri olarak kabul edilmifltir. Etest ile MBL saptanmas›.Bir taraf›nda imipenem (IP) ( 4-256 mg/ml), di¤er taraf›nda IP ( 1-64 mg/ml) ve sabit konsantrasyonda EDTA içeren, iki tarafl› Etest MBL fleritleri kullan›lm›flt›r. Birbirine z›t yön-de oluflan iki elipsin fleridle kesiflti¤i noktalardaki
sa-yöntemler gelifltirilmifltir (5,9,10,11). Arakawa ve ark.lar› (5) çift disk sinerji yöntemiyle, seftazidim ve 2 merkaptopropiyonikasit içeren diskleri yak›nlaflt›-rarak IMP-1 üreten sufllar›n inhibisyon zonunda bir geniflleme göstermifller ve bu yöntemin duyarl›l›k ve özgüllü¤ünün blaIMP spesifik primerler kullan›larak yap›lan PCR ile karfl›laflt›r›labilir oldu¤u ve günlük laboratuar çal›flmalar›nda kullan›labilece¤i sonucuna varm›fllard›r.
Yong ve arkadafllar› (10), ço¤u VIM-2 MBL üreten 102 P.aeruginosa, 14 P.putida, 20 A.baumanni-ive 3 Acinetobacter spp. suflu ile çal›flm›fllar; disk diffüzyonla imipenem ve imipenem art› 750 mikrog-ram EDTA içeren disklerin inhibisyon zon çaplar› aras›ndaki fark›n 7 mm üzerinde olmas›n› MBL po-zitifli¤i lehine kabul etmifllerdir. Yöntemin Pseudo-monaslar için mükemmel , Acinetobacter’ler için iyi sonuç verdi¤ini bildirmiflledir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 + + + NEG + NEG + NEG NEG + + + NEG + NEG NEG NEG + + + NEG NEG + + + + + 24 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 3 3 ≥32 ≥32 ≥32 8 ≥32 8 12 ≥32 16 ≥32 ≥32 12 ≥32 ≥32 24 12 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 24 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 ≥32 24 ≥32 ≥32 12 ≥32 ≥32
‹zolat no: M‹K de¤erleri Beta-laktam direnç fenotipi
MP IP Di Di Du Di Di Di Du Di Di Di Di Di Du Du Di Du Di Di Di Di Di Du Di Du Di Di Di CAZ Di Di Du Di Di Di Du Di Di Di Di Di Du O Di Di Di Di Di O Di Du Di Di Di O Di ATM Du Du Di O Du Du Di Di Du Di Du Di Di Di Di Du Du Di Du Di Di Du Di Di Di Di Di TZP Etest MBL sonuçlar›
Tablo1. Karbapenem dirençli 27 Pseudomonas aeruginosa suflunun özellikleri.
Migliavacca ve arkadafllar› (9), P.aeruginosa suflla-r›nda mikrodilüsyon metoduyla imipenem MIC de-¤erlerini; tekbafl›na ve EDTA/ 1,10-phenanthroline kar›fl›m› ile saptam›fllar, MIC de¤erinde 4 kat üzerin-de düflüflü MBL pozitifli¤i lehine üzerin- de¤erlendirmifller-dir. Testin disk diffüzyon testine göre daha standar-dize oldu¤u ve otomasyona uygun oldu¤unu bildir-mifllerdir.
Senda ve arkadafllar› (2)1992-1994 y›llar› aras›nda 17 hastaneden izole edilen 3700 P.aeruginosa suflu-nun 132’sinde blaIMP geni varl›¤›n› göstermifllerdir. blaIMP genlerinin integron veya benzer bir element-le çeflitli plasmid ve kromozomlara translokasyonu-nun olas› oldu¤u, böylece farkl› genetik geçmifle sa-hip Pseudomonas sufllar› aras›nda yay›ld›¤› ve bu sufllar›n Japonya’da multifokal ço¤alma göstedi¤i sonucuna varm›fllard›r.
Yunanistan’da1996-1998 y›llar› aras›nda izole edi-len her iki karbapeneme dirençli P.aeruginosa suflla-r› aras›ndan rastgele seçilen 6 izolat›n serotip O:12’ye ait oldu¤u ve pulse field jel elektroferez pa-ternlerinin ayn› oldu¤u gösterilmifltir. Bu sufllar›n hepsinin blaVIM pozitif oldu¤u ve direnç geninin yay›lmas›ndansa, O:12 suflunun yay›lmas›n›n söz konusu oldu¤u bildirilmifltir. Suflun yay›lmas›ndaki baflar›n›n karbapenemlerin çok kullan›l›yor olmas› ve/veya suflun patojen bakteri olarak kal›tsal tafl›d›¤› özelliklerine ba¤lanabilece¤i sonucuna var›lm›fl-t›r(7).
Yunanistan’dan 2001 y›l›nda 15 merkezden izole edilen Pseudomonas aeruginosa sufllar›n›n 36’s›nda blaVIM pozitif bulunmufl. Bunlardan 26’s›nda 2-mercaptoacetic acid ve imipenem kullan›larak siner-ji testi ile MBL varl›¤› gösterilebilmifltir. Di¤er çal›fl-man›n aksine, random amplified polymorphic DNA tiplemesi sufllar›n birbirinden farkl› kökenlerden kaynakland›¤›n› düflündürmüfltür(1). Lee ve arka-dafllar› da (6) Kore’de VIM-2 arac›l› direncin hem klonal hem de horizontal olarak yay›ld›¤›n› bildir-mifllerdir.
Bizim çal›flmam›zda, yo¤un bak›m ünitesinden izole edilen 27 Pseudomonas aeruginosa suflundan 17’sinde Etest IP/IPI fleritleri ile MBL pozitif olarak bulunmufltur. Sufllar›n ço¤unlukla di¤er
antipseudo-Di¤er betalaktamlara direnç fenotipi ile MBL pozi-tifli¤i aras›nda bir ba¤lant› gözlenmemifltir.Yaln›zca imipenem dirençli olup meropenem’e duyarl› iki suflta MBL varl›¤› saptanmam›flt›r. Walsh ve arka-dafllar› (11) IP ve IP-EDTA E testleri ve Mueller-Hinton agar kullan›ld›¤›nda MBL saptama duyarl›l›-¤›n %94, özgüllü¤ünün %95 oldu¤unu;MBL Etest fleritlerinin klinik mikrobiyoloji laboratuvarlar›nda MBL saptanmas›nda kullan›lmas›n›n kabul edilebilir oldu¤unu bildirmifllerdir.
Sonuç olarak;karbapenem kullan›m›n›n gerekli oldu-¤u ünitelerde h›zl›, basit, sonuçlar› tekrarlanabilir, sensitivite ve spesifitesi iyi bir fenotipik tarama me-toduna gereksinim vard›r. Birden çok mekanizma karbapenem direncine yol açabildi¤inden sonuçlar›n moleküler yöntemlerle do¤rulanmas›n›n gereklili¤i aç›kt›r. Epidemiyolojik aç›dan bak›ld›¤›nda bu izo-latlar›n kökenlerinin belirlenerek tek bir klonun ya-y›lmas›yla m› , yoksa direnç geninin sufllar aras›nda geçifliyle mi direncin ortaya ç›kt›¤› netlefltirilmelidir. Karbapenemlerin artan kullan›m›n›n, karbapenemaz üreten sufllar›n seleksiyonuna yol açaca¤› unutulma-mal›d›r.
KAYNAKLAR
1. Giakkoupi P, Petrikkos G, Tzouvelekis LS,Tsonas S,the WHONET GREECE study group,Legakis NJ, Vatopoulos AC:Spread of integron associated VIM-type metallo-B-lactamasegenes among imipenem-nonsuscep-tible Pseudomonas aeruginosa strains in Greek hospitals. J Clin Microbiol 41:822(2003).
2. Senda K,Arakawa Y,Naashima K,Ito H, Ichiyama S, Shimokata K, Kato N, Otha M: Multifocal outbreaks of metallo-B-lactamase-producing Pseudomonas aerugino-sa.resistant to broad-spectrum b-lactams,including carba-penems. Antimicrob Agents Chemother 40:349 (1996). 3. Livermore DM: Pseudomonas, porins, pumps and car-bapenems. J Antimicrob Chemother 47:247 (2001). 4. Nordman P, Poirel L: Emerging carbapenemases in Gram- negative aerobes. Clin Microbiol Infect 8:321 (2002).
5. Arakawa Y, Shibata N, Shibayama K, Kurokawa H, Yag› T, Fuj›wara H, Goto M: Convenient test for scree-ning metallo-B-lactamase-producing Gram negative
bacte-ria by using thiol compounds.J Clin Microbiol 38:40 (2000).
6. Lee K, Lim JB, Yum JH, Yong D, Chong Y, Kim JM, Livermore DM:blaVIM-2 cassette-containing novel in-tegrons in metallo-B-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida isolates disseminated in Korean Hospital. Antimicrob Agents Chemother 46:1053 (2002).
7. Tsakris A, Pournaras S, Woodford N, Palepou MFI, Babini GS, Douboyas J, Livermore DM: Outbreak of in-fections caused by Pseudomonas aeruginosa producing VIM-1 carbapenemase in Greece. J Clin Microbiol 38:1290 (2000).
8. Lauretti L, Riccio ML, Mazzariol A , Cornaglia G, Amicosante G, Fontana R, Rossolini GM:Cloning and characterization of blaVIM, a new integron-borne
metallo-B-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate.Antimicrob Agents Chemother 43:1584 (1999). 9. Migliavacca R, Docquier JD, Mugnaioli C, Amic›-sante G, Daturi R, Lee K, Rossolini GM, Pagani L: Simple microdilution test for detection of metallo-B-lac-tamase production in Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol 40:4388 (2002).
10. Yong D, Lee K, Yum JH, Shin HB,Rossolini GM,Chong Y: Imipenem-EDTA disk method for diffrer-rentiation of metallo-B-lactamase-producing clinical isola-tesof Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 38:3798 (2002).
11. Walsh TR, Bolmström A, Qwarnström A,GAles A: Evaluation of a new Etest for detecting metallo-B-lactama-ses in routine clinical testing. J Clin Microbiol 40:2755 (2002).
