Helicobacter pylori gastriti ve nonspesifik gastritlerde erken intestinal metaplazideki hücresel değişikliklerin CDX2 ile gösterilmesi ve bulguların histokimyasal yöntemlerle karşılaştırılması

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

PATOLOJİ ANABİLİM DALI

Tez Yöneticisi

Yrd. Doç. Dr. Şemsi ALTANER

HELICOBACTER PYLORI GASTRİTİ VE

NONSPESİFİK GASTRİTLERDE ERKEN

İNTESTİNAL METAPLAZİDEKİ HÜCRESEL

DEĞİŞİKLİKLERİN CDX2 İLE GÖSTERİLMESİ VE

BULGULARIN HİSTOKİMYASAL YÖNTEMLERLE

KARŞILAŞTIRILMASI

(Uzmanlık Tezi)

Dr. Çiğdem ÖZDEMİR

TEŞEKKÜR

Eğitimimde ve tezimin hazırlanmasında yakın ilgi ve yardımlarını eksik etmeyen Hocam Sayın Prof. Dr. A.Kemal Kutlu’ya, eğitimim ve tez çalışmamda derin bir özveri ile beni yönlendiren Yrd. Doç. Dr. Şemsi Altaner’e ayrıca eğitimim ve çalışmalarımda bana destek veren Anabilim Dalımız öğretim üyelerinden Prof. Dr. Filiz Özyılmaz’a, Yrd. Doç. Dr. Ömer Yalçın’a, Yrd. Doç. Dr. Ufuk Usta’ya, Yrd. Doç. Dr. Fulya Öz Puyan’a, ayrıca immünohistokimyasal boyamalarda yardımcı olan Yük. Biyolog Muzaffer Tudan’a, asistan ve teknisyen arkadaşlarıma, tezimin istatistik analizinde yardımlarını esirgemeyen Halk Sağlığı Anabilim Dalı’ndan Yrd. Doç. Dr. Burcu Tokuç’a saygılarımla ayrı ayrı teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ

GENEL BİLGİLER

MİDENİN ANATOMİSİ VE HİSTOLOJİSİ... 3

İNTESTİNAL METAPLAZİ... 5

MUC2... 8

MUC5AC... 9

HELICOBACTER PYLORI GASTRİTİ... 9

CDX2... 10

GEREÇ VE YÖNTEMLER

BULGULAR

22

TARTIŞMA

45

SONUÇLAR

51

ÖZET

53

SUMMARY

55

KAYNAKLAR

57

EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR

AB : Alcian Blue

H. Pylori : Helicobacter Pylori

HE : Hematoksilen Eosin İM : İntestinal Metaplazi

LPH : Lactase-Phlorizin Hydrolase PAS : Periodic Acid –Schiff

PAS-AB : Periodic Scid-Schiff-Alcian Blue

RT- PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SI : Sucrase-Isomaltase

GİRİŞ VE AMAÇ

Helicobacter Pylori ( H. Pylori) gram negatif bir bakteri olup, sadece insan midesinde kolonize olma yeteneğine sahiptir. Gelişmekte olan ülkelerde H. Pylori enfeksiyonu

yaygınlığı %90’ın üzerindedir (1). H. Pylori enfeksiyonu başlangıçta kronik gasrit ve

nonatrofik gastritin nedeni olup, daha sonraki aşamada atrofik gastrit ve intestinal metaplaziye yol açmaktadır. Atrofik gastrit ve intestinal metaplazinin intestinal tip gastrik kanserin öncü lezyonları olduğu kabul edilmektedir (2,3).

İntestinal metaplazi (İM), gastrik mukozanın ışık ve elektron mikroskopik olarak intestinal epitelin bütün özelliklerini taşıyan epitel ile yer değiştirmesidir (4). İM çeşitli gruplara ayrılmıştır. Bu gruplandırma temelde histopatolojik ve histokimyasal özelliklere dayanmaktadır (5). Son zamanlarda İM’deki müsin değişimleri immünohistokimyasal yöntemlerle gösterilmiş ve buna göre sınıflandırılmıştır (6).

‘Reverse transcriptase- polymerase chain reaction’ (RT- PCR) yöntemi kullanılarak mide biyopsilerinde yapılan bir çalışmada, H. Pylori ile enfekte olmuş hem İM’li hem de İM’siz mide mukozasında CDX2 varlığı tespit edilmiştir (7). H. Pylori ile enfekte mide mukozasında İM olsun ya da olmasın, CDX2’nin İM’li mukozada nükleer, metaplazi dışındaki inflamasyonlu mukozada ise sitoplazmik reaksiyon verdiği immunohistokimyasal olarak gösterilmiştir (8).

Helicobacter Pylori’nin İM’deki rolü, hangi mekanizmalarla bu değişimi yaptığı ve İM’yi sınıflamaya yönelik çok sayıda immünohistokimyasal çalışma yapılmaktadır. Bu amaçla; intestinal epitelin oluşumu ve diferansiasyonunu sağlayan gen olan CDX2’nin (9), İM’de oluşup oluşmadığı; H. Pylori’nin yaptığı gastritin CDX2 salgılanmasına etkisinin olup olmadığı ve acaba İM’ye dönüşecek mide epitelini öncesinde tanımanın mümkün olup

olmadığını belirlemeyi hedefledik.

Ayrıca İM’deki müsin değişimlerinin immünohistokimyasal belirteçler ile tespit edilip edilmediğini ve immünohistokimyasal yöntemlerin histokimyasal yöntemler kadar seçici olup olmadığını araştırmak istedik.

Bu çalışmada Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’ında 2000-2006 yılları arasında 85 hastanın aynı anda alınan mide antrum ve korpus endoskopik biyopsilerinde immünohistokimyasal yöntem ile CDX2, MUC2, MU5AC ekspresyonlarına bakılıp histokimyasal bulgularla karşılaştırılmıştır.

GENEL BİLGİLER

MİDENİN ANATOMİSİ VE HİSTOLOJİSİ

Mide, abdominal boşlukta epigastrik, umbilikal ve sol hipokondriak bölge boyunca yerleşim gösterir. Hacmi doğumda 30 ml iken yetişkinde 1000 ml hacime kadar ulaşır.

Mide dört anatomik bölgeden oluşur. Kardia, kardiak orifis çevresindeki bölge olup sınırları keskin değildir. Fundus, kardia boyunca çekilen yatay çizginin yukarısında kalan bölgedir. Korpus, fundus ve antrum arasında kalan bölgedir. Antrum, midenin distal üçte bir kısmı ve dar pilorik kanaldan oluşan bölgesidir ki buradan duodenuma açılır.

Mide duvar kalınlığı, yetişkinlerde 3-7 mm arasında değişmektedir. Histolojik olarak dört tabakadan oluşmaktadır. Birinci tabaka mukoz membran ya da mukozadır. Bu da luminal yüzey tabaka ya da epitelden oluşur. İkinci tabaka gastrik pitler ve bezlerden oluşur. Üçüncü tabaka lamina propriadan oluşur. Dördüncü tabaka ise lamina muskularis mukozadır.

Midenin yüzeyini döşeyen epitel, midenin tüm bölgelerinde aynı niteliktedir. Bu epitel basit kolumnar epitel olup, bazalda yerleşim gösteren belirgin olmayan nükleolusa sahip nükleuslu, berrak ya da soluk eozinofilik, müsin içeren vakuollü sitoplazmalıdır. Yüzey epitel hücreleri nötral müsin salgılar periodic acid–Schiff (PAS) ile pozitif reaksiyon verir (10). Yüzey epiteli mukozanın destek dokusu içine girerek mide pitlerini, kript ya da foveola denen yapıları oluşturur. Mide pitleri tübüler yapıdadır. Bu pitler daha sonra midenin bölgesine göre özelleşmiş mide bezleri ile devam eder. Bu bezlerin ve pitlerin özelliklerine dayanılarak midede üç tip mukoza tanımlanmıştır. Kardia mukozası, korpus ya da fundus mukozası, pilor ya da antrum mukozası (11).

Kardia Mukozası

Kardia mukozası özofagial skuamo-kolumnar bileşkeden başlayıp mide içerisinde 0,5-4 cm’lik alanı içerir. Pit derinliği tüm mukoza kalınlığının yaklaşık yarısını oluşturur. Derin tabakadaki bezler basit tübüler veya birleşik tübülo-resamöz yapıdadır. Birbirleriyle birleşmiş muskularis mukoza çıkıntıları ile gruplara ayrılmış olup, kistik genişleme sık olarak gözlemlenir. Bezleri döşeyen epitel, yüzey epiteli gibi nötral müsin salgılayan hücrelerden oluşur. Bunların arasında endokrin hücreler, daha az olarak parietal ve çok nadir de esas hücreler içerirler.

Korpus Mukozası

Mide mukozasının en geniş kısmını oluşturur. Hem fundus hem de korpusu döşemektedir. Pitlerin derinliği mukoza kalınlığının dörtte biri kadardır. Bezler basit, düzgün tübüler yapı gösterir. Bezlerde kistik genişleme nadirdir. Üç ile yedi arasında bez hafif bir dallanma veya boyun bölgesi ile her bir pitin tabanına açılır. Dört tip hücre tanımlanmıştır, müsin salgılayan boyun hücreleri, parietal ya da oksintik hücreler, esas ya da zimojen hücreler ve endokrin hücreler.

Pilor Mukozası

Antrum mukozası da denir. Midenin 1/3 alt kısmını oluşturur. Pitlerin derinliği mukoza kalınlığının yaklaşık yarısı kadardır. Bezler basit ya da dallanmış tübüler yapı yaparlar. Kardia mukozasına benzer şekilde nötral müsin salgılayan hücrelerle döşelidir. Bazen az miktarda sulfomüsin salgıladıkları da gözlenir. Antrum bezlerinde seyrek olarak parietal hücrelere ve az sayıda endokrin hücrelere rastlanır. Antrum mukozasını korpus mukozasından ayıran en önemli özellik zimojen hücrelerin olmayışıdır.

Midenin Epitelyal Hücre Tipleri

Parietal (Oxyntic ) hücreler: Bu hücreler büyük, siferik veya piramidal şekilde olup çekirdekleri hücre merkezinde, sitoplazmaları eozinofilik ve vakuollüdür. Golgi çekirdeğin ya altında ya da bir yanındadır. Sitoplazmalarında kristası belirgin çok sayıda mitokondri vardır. Bu hücreler özellikle glandların boyun ve isthmus bölgesinde yerleşim gösterir. Parietal hücreler hidroklorik asid, intrensek faktör, kan grubu maddeleri, potasyum klorür salgılar.

Esas (Chief, Zymogenic) hücreler: Bu hücre tipi gastrik bezlerin tabanında yer alır ve tipik olarak protein salınımı yapan hücre görünümüne sahiptir. Piramidalden kolumnara kadar olana değişik şekillere, bazalda yerleşen bir ya da daha çok nükleol bulunduran

çekirdeğe sahiptirler. Bu hücreler pepsinojen, proteolitik enzimler ve çeşitli elektrolitler salgılar.

Mukus boyun hücreleri: Bu hücreler gastrik bezlerin boyun bölgesinde nadiren bazal bölümünde parietal hücreler arasında küçük gruplar halinde ya da tek tek yerleşim gösterirler. Hemotoksilen eozin (HE) boyamada belirsizdir, fakat PAS ile çok kolay saptanabilir. Nükleusları bazalde olup sitoplazmaları hafif bazofilik ve granülerdir. Sitoplazmik müsinleri yüzey epitelinden farklı olarak göreceli dağınıklık gösterir, genelde apekste sınırlıdır. Bu hücreler asidik müsin sekrete ederler, sekrete ettikleri müsin yüzey epiteli müsininden daha koyu kıvamlıdır. Bu hücrelerin sekresyon haricinde proliferasyon ve mukozal rejenerasyon görevleri vardır (10).

Endokrin hücreler: Pilorik antrum ve genellikle bezlerin tabanında (11) zimojen hücreler ve bazal membran arasına dağılmış küçük yuvarlak, piramidal şekilli, gümüş tuzları ile boyanan granüllere sahip hücrelerdir. Bu hücreler gümüş ve kromiyum tuzlarını indirgeyen enterokromaffin hücrelerdir. Serotonin, gastrin, somatostatin gibi biyolojik aminleri sekrete ederler. Midede yedi tip endokrin hücre varlığından söz edilmektedir. Ürettikleri maddelere göre en çok rastlanan hücreler şunlardır: G hücreleri gastrin üretir, D hücreleri somatostatin üretir, enterokromaffin hücreler serotonin üretir ve enterokromaffin benzeri hücreler histamin üretir (12).

İNTESTİNAL METAPLAZİ

İntestinal metaplazi mide mukozasının ışık ve elektron mikroskopik olarak bütün özelliklerini taşıyan intestinal epitel ile yer değiştirmesidir (4). İM normalde mide mukozasında bulunmayan, barsak epitelinde bulunan goblet hücreleri, emici hücreler, Paneth hücreleri ve endokrin hücrelerin varlığı ile tanınır (13). Silialı hücreler de bulunabilir (4). Ancak her zaman bu elemanların tümünü metaplastik epitelde görmek mümkün değildir. İM her zaman barsak epitelinin bütün özelliklerini göstermez. Tüm bu nedenlerden dolayı İM çeşitli gruplara ayrılmıştır. Bu gruplandırma temelde histopatolojik ve histokimyasal özelliklere dayanmaktadır (5).

Tüm mide-barsak kanalında epitel hücrelerinin büyük bir kısmı epitelyal müsin dediğimiz mukopolisakkarit yapısında bir tür madde üretir ve salgılar. Epitelyal müsin kimyasal yapısına göre, histokimyasal boyanma yöntemleri ile farklı boyanma özelliğinde olan, nötral ve asidik müsin olmak üzere iki temel gruba ayrılır. Midede baskın olarak nötral müsin, ince ve kalın barsaklarda ise baskın olarak asidik müsin mevcuttur. Asidik müsinin baskın olduğu ince ve kalın barsak epitelinde de farklılıklar vardır. İnce barsakta asidik

müsinlerin alt grubu sialomüsinler ön planda iken kalın barsakta ise sülfomüsinler ve o-asetil sialomüsinler ön plana çıkar (14).

Çeşitli özel boya yöntemleri ile mide barsak kanalındaki müsinlerin boyanma özellikleri Tablo 1 (5,14,15) ve Tablo 2’de görülmektedir (16).

Tablo 1. Histokimyasal boyama yöntemleri ile mide barsak kanalındaki epiteliyal müsinlerin boyanma özellikleri (5,14,15)

Boya Yöntemleri Nötral Müsin

N-asetil Sialomüsin

O-asetil

Sialomüsin Sülfomüsin

Alcian Blue pH2.5/Periodic Acid Schiff (ABpH2.5/PAS) Koyu Pembe* Mavi Mavi Mavi

High Iron Daimine/ Alcian Blue pH2.5

(HID/ABpH2.5)

Boyanmaz Mavi Mavi Kahverengi Siyah**

Periodic Acid Borohydride/Potassium Hydroxide (saponification)/

Periodic Acid Schiff (PB/KOH/PAS)

Boyanmaz Boyanmaz Koyu Pembe Boyanmaz

* Aynı hücrede nötral ve asidik müsinler bir arada ise, hücrede mor renkte boyanma görülür.

** Aynı hücrede sulfomüsin ve sulfatsız asidik müsinler bir arada bulunuyorsa hücrede kahverengi ve mavi boyanma birlikte görülür.

Tablo 2. Müsin tiplerinin Alcian Blue pH2.5-0.5/Periodic Acid Schiff ile boyanma özellikleri (16)

Müsin Tipleri Boyama Yöntemleri

Nötral Müsin Sialomüsin Sulfomüsin Alcian Blue pH2.5/Periodic Acid Schiff AB(-) PAS(+) AB(+) PAS(+) AB(+) PAS(zayıf +) Alcian Blue pH0.5/Periodic Acid Schiff AB(-) PAS(+) AB(-) PAS(+) AB(+) PAS(zayıf +)

İntestinal metaplazi bir çok araştırmacı tarafından komplet tip ya da Tip I ve inkomplet tip ya da Tip II olarak iki gruba ayrılmıştır. Bu sınıflama müsin tiplerine, histopatolojik görünüme göre yapılmıştır. İnkomplet tip intestinal metaplazi de kendi arasında iki gruba ayrılmıştır Tip IIA ya da Tip II, TipIIB ya da TipIII (5,17-18).

Tip I (Komplet Tip)

Genellikle ince barsağa benzer, kriptler düz ve düzenli bir yapıya sahiptir. Kriptleri matur absortif hücreler ve goblet hücreleri döşer. Bazen goblet hücreleri kriptin 1/2 yarısında yoğunlaşmış olarak izlenir. Müsin histokimyası olarak ince barsağa benzer, goblet hücreleri N-acetyl sialomüsin sekrete eder nadiren sülfomüsin içerebilir. Goblet hücreleri arasında kalan absorptif hücreler sekresyon yapmaz. Paneth hücreleri sıklıkla vardır.

TipII, Tip IIA (İnkomplet Tip)

Kriptlerde hafif biçim bozukluğu, hafif düzensizlik olup kriptleri goblet hücreleri ve farklılaşmasının değişik evrelerinde kolumnar mukus hücreleri oluşturmuştur. Absorbtif ya da emici hücreler çok azdır ya da yoktur. Kriptleri oluşturan hücreler karışık özellikte nötral ve sialomüsin sekrete ederler. Goblet hücreleri sialomüsin nadiren sülfomüsin sekrete ederler. Tıp I İM’den farklı olarak ya kolumnar hücrelerde ya da goblet hücrelerinde O-acylated sialomüsin izlenmez. Kolumnar hücreler başlıca nötral müsin sekrete ederler. Sekrete edilen materyal ya hücrenin en yukarısında ya da bütün hücrenin tamamını kaplar şekilde izlenir. Bazen küçük miktarlarda N-acetyl sialomüsin de olabilir, ancak sülfomüsine çok az rastlanır. Paneth hücreleri ise çok çok nadir bulunabilir.

TipIII, Tip IIB (İnkomplet Tip)

Bu tip İM’de bezlerin yapısında farklı derecelerde biçim bozukluğu görülür. Hücresel atipi ve farklılaşmadaki bozukluk TipII İM’den daha fazladır. Kolumnar hücreler baskın olarak sülfomüsin salgılar. Bu hücreler çoğunlukla müsin ile dolu olarak izlenir. Goblet hücreleri ise sialomüsin ya da sulfomüsin salgılarlar. HE ile yapılan mikroskopik incelemede epitel çoğunlukla hiperplastik kolon mukozasına benzer. Paneth hücrelerinin sayısı azalmıştır.

İntestinal metaplazide görülen değişiklikler sadece müsin tipleri ile sınırlı değildir. Işık mikroskobu, elektron mikroskobu düzeyinde yapısal farklılıkların bulunduğu, enzim özelliklerinin ve immünohistokimyasal yöntemler ile çeşitli antijenik özelliklerinin de farklı olduğu saptanmıştır (5,19).

Müsinler yüksek oligosakkarit içerikli (%50–90), yüksek moleküler ağırlıklı epitelyal glikoproteinlerdir. Bu oligosakkaritler serin ve/veya treoninle O-glikozit bağı yapmış N-asetil galaktozaminden oluşan nisbeten kısa oligosakkaritlerdir. Pek çok organ birden fazla müsin salgılamakla birlikte belirli bir organda belirli bir müsin tipi yoğunluk gösterir. Günümüzde

bilinen müsin türleri (MUC1-MUC16) ‘salgılanan müsinler’ ve ‘membrana bağlı müsinler’ olarak iki ana gruba ayrılırlar. Membrana bağlı müsinler ailesi üyelerinin tümü bir transmembran bir de sitoplazmik domainden oluşur (20). Müsinler, mukus tabakasının major komponenti olup gastrik epiteli kimsayal ve mekanik etkilerden korur (21). Salgılanan müsinler MUC2, MUC5AC, MUC5B ve MUC6 olup ve bu genlerin ürünlerini içerirler, kromozom 11p15’de, yer almaktadırlar (22). Membrana bağlı müsinler ise MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC12 ve MUC 17 olup genlerinin ürünlerini içerirler (21). Bunlardan MUC1 haricindekiler kromozom 7q22 de MUC1 ise 1q21 de lokalize olmuştur (23).

Normal mide mukozası MUC1, MUC5AC, MUC6 salınımı ile karakterizedir. MUC2, MUC3, MUC4 salınımı yoktur. MUC1 ve MUC5AC süperfisial foveolar epitelde salgılanmasına karşın MUC6 korpusun boyun mukus hücrelerinde, antrumun derin bezlerinde salgılanmaktadır (6).

İntestinal metaplazide müsin salınımı şu şekilde tanımlanmıştır: Komplet tip İM’de MUC1, MUC5AC, MUC6 salınımı azalırken veya olmazken MUC2’nin de novo salınımı görülür. İnkomplet tip İM’de ise MUC1, MUC5AC, MUC6 ve MUC2’nin birlikte salınımı bulunmaktadır (6,21,24).

MUC2

Salgılanan müsinlerden olup spesifik olarak gastrointestinal mukozanın goblet hücrelerinde salgılanmaktadır. MUC2 serin ve treoninden zengin tandem ve düzensiz tekrarlayan sekanslarla karakterizedir, bu sekanslar oligosakkarit zincirlerinin bağlandığı noktalardır. MUC2 gen ürünü en sık görüldüğü allelic formda 5100 amino asitten oluşmaktadır. Bu miktar müsin glikoproteininin beşte birini oluşturur. MUC2 proteini disülfit bağları ile uç uca polimerize olup büyük sekrete edilen polimerik jel oluşturan müsinleri yapar. Mukozal yüzeylerde koruyucu bariyer olarak görev yapar. MUC2 diğer müsinlerden saflaştırılabileceği gibi, intestinal mukus sekresyonunun ana bileşenidir. MUC2’nin dimer glikolizasyonu golgide gerçekleşir. MUC2’de kollojen ve heparin bağlayan bölümler bulunması MUC2’nin hücre dışı makro moleküllerle etkileşiminin olabileceğinin kanıtıdır (25).

MUC2 salınımı homeobox genler olan CDX1 ve CDX2 tarafından düzenlenir (7-8,26). Ayrıca MUC2 salınımı p53 tarafından da düzenlenmektedir. MUC2 geni p53 bağlayan bölgeye sahiptir (27). Hücresel stres durumlarında p53 hücresel çoğalmayı ve DNA onarımını aktive eder. p53 apoptozisi tetiklediğinde tamir çabaları boşa gider (28). Gerçekte p53, MUC2 salınımını tetikler, bu stresten sorumlu programın parçasıdır (27).

MUC2, İM programının parçasıdır. MUC2 gastrik, özofagiyal ve biliyer mukozanın stres durumlarında artar. Tek başına onkojonik olmayabilir fakat koruyucu mekanizmalarda rol oynayabilir. MUC2 karsinojenlerin etkisini önlemede aktif rol oynar (29). Müsin sekresyonu ve MUC2 salınımı birçok stresten sorumlu olayların parçasıdır. Bunlar; solunum yolları, mide ve biliyer sistemdir. Bunun tersine kolorektal kanserlerde sıklıkla MUC2 salınım kaybı vardır (6).

MUC5AC

MUC5AC salgılanan müsinlerden olup (22), normal midede yüzey epiteli ve trakeobronşial hücrelerde salgılanırken, normal kolon mukozasında salgılanmaz (30). MUC5AC, MUC2 de olduğu gibi değişik sayıda tekrar eden tandemlerden oluşan santral bir bölgeye sahiptir ve bu bölgeler treonin, serin ve prolinden zengin tekrar eden peptitleri kodlarlar (20). Mide kanserlerinde müsin polipeptitinde değişiklikler rapor edilmiştir. MUC5AC’nin salınımının kaybı müsin çeşitliliğinde artmaya neden olmaktadır (6). Bu gözlemler müsin değişikliklerinin mide mukozasının malign değişiminin moleküler markerleri olarak hesaba katılabileceğini düşündürmektedir. H. Pylori ekstraselüler ve epiteliyal hücrelerde MUC5AC üretimi ile oldukça yakından ilişkilidir. Bu da MUC5AC’nin H. Pylori’nin gastrik mukozaya yapışmasında rol oynadığını göstermektedir (31).

HELICOBAKTER PYLORI GASTRİTİ

Helicobacter Pylori gram negatif bir bakteri olup, sadece insan midesinde kolonize olma yeteneğine sahiptir. Bazı gelişmekte olan ülkelerde H. Pylori enfeksiyonu yaygınlığı %90’ın üzerindedir (1). H. Pylori enfeksiyonu kronik gasrit ve nonatrofik gastritin nedeni olup bu gastrit, atrofik gastrit ve İM’ye ilerler. İM’nin intestinal tip gastrik kanserin öncü lezyonu olduğu kabul edilir (2,3). H. Pylori mide epitelinde kolonize olduğunda inflamatuar bir reaksiyon oluşturur ve hastanın yaşamı boyunca devam eden kuvvetli yerel immün reaksiyona neden olur. Mide mukozasındaki bu inflamasyonun yaygınlığı ve şiddeti bakterinin virulansı, konağın genetik yapısı, immün cevap, enfeksiyonun başlangıç zamanının hangi yaşta olduğu ve çevresel faktörlere bağlıdır (32). H. Pylori’nin normalde yaşadığı ortam midenin mukus jel tabakasıdır. Ancak bazı vakalarda epitelyal yüzeye girdiği görülmektedir (33). H. Pylori gastrik müsinlere bağlanma yeteneğine sahip olması bakterinin gastrik epitele yapışmasını destekleyebilir ya da baskılayabilir (30). H. Pylori normal yolunda gitmesi gereken dinamik bir denge olan hücresel proliferasyonu ve programlı hücre ölümü olan apopitozis dengesini değiştirmektedir: Hücresel proliferasyonu artırırken, apopitotik indeksi

azaltmaktadır (34). Apopitozisin inhibisyonu karsinogenezisin erken safhasıyla yakından ilişkilidir (35). Atrofik gastrit vakalarının %80’ inde H. Pylori infeksiyonu görülmüş iken, %10’ unda H. Pylori infeksiyonu varlığı izlenmemiştir (36). İM gelişimi ve H. Pylori arasındaki sebepsel ilişki karşıt-seçilmiş (37), takip eden (38) ve Mongolian gerbil model çalışmalarında gösterilmiştir (39).

CDX2

Hücresel proliferasyon, diferansiasyon ve yaşlanmanın tam anlamıyla düzenlenmesi intestinal epitelin sürekli yenilenmesi ve doku yapısının korunması ile sonuçlanır. Barsak epiteli hücrelerinde hem proliferasyon hem de farklılaşmayı düzenleyen ve bir transkripsiyon faktörü olan intestin spesifik homeobox gen CDX2’dir (9). Homeobox genler, metazoanların gelişimi sırasında biçimlendirilme ve hücre faklılaşmasında yer alan nükleer transkripsiyon faktörleridir (40). Bunlar aynı zamanda yeni bir grup protoonkogen olarak tanımlanmışlardır (41). Çeşitli çalışmalar homeobox gen değişimlerinin tümör genezisinde de yer aldığını göstermiştir. Homeobox genlerin fonksiyonunu anlamadaki önemli süreç hücre adezyon molekülleri ve ekstraselüler matriks komponentleri gibi hücresel ilişkilerde yer alan molekülleri düzenlediklerine dair bulgudan ortaya çıkmıştır (42). Homeobox genler kendi kendileri ve diğer homeobox genler (43), retinoidler (44) ve/veya büyüme faktörleri tarafından regüle edilirler (45). Caudal familyanın homeobox genleri olan CDX1 ve CDX2 intestinal epitelden salgılanırlar. CDX1 ve CDX2 ile ilgili ilk çalışmalar farelerde yapılmıştır. Farelerde barsak epiteli 14-15 arası embriyonik günlerde başlayan ve dört haftalık doğum sonrası dönemde de devam eden sütten kesilmeyle sonuçlanan karmaşık geçişler serisi boyunca visseral endodermden gelişmektedir (9). Tamamiyle gelişmiş barsak epiteli intestinal kriptlerde yer alan kök hücreden sürekli yenilenmektedir. Bu hücreler dört adet morfolojik ve biyokimyasal olarak büyüme tipi içerir. Bunlar, enterositler, değişik tipteki endokrin hücreler, mukus sekrete eden goblet hücreleri ve paneth hücreleridir (46). Proliferasyonun, farklılaşmanın, gen salınımının, hücre geçişinin ve yaşlanmanın alansal belirlenen yapıları epitelin hızlı yenilenmesi esnasında korunmaktadır. Çoğu sistemdeki işleyişten fazlasıyla belli oluyor ki hücresel fenotip herhangi verilen bir zamanda hücrede var olan transkipsiyon faktörlerinin tümü tarafından düzenlenmektedir. Bundan yola çıkarak bu genler ya da başka genlerle ilgili çok detaylı bilgileri insan genom yapısına çok yakın olan Drosophilia melanogaster adı verilen bakteriden elde edilmiştir (47). Bu genler, bu bakterinin caudal, anterior posterior yapılanmasını içermektedir ve intestinal farklılaşmayı düzenlemektedir (48). Bu genlerden memelilerde ilk bulunan CDX1’dir ve endodermde bulunmuştur (49). Bu

gen barsağın dikey ekseni (aksisi) boyunca artan bir gradientte salgılanmaktadır. Bu salgılanma baskın olarak indiferansiye kript hücrelerinde olmaktadır (50). Barsakta bulunan diğer cauda ile ilişkili gen CDX2 olup, nükleer transkripsiyonel faktör tarafından kodlanır ve diferansiye enterositlerde salgılanır (47).

CDX1 ve CDX2 fare embriyosu gelişirken barsak gelişiminde kritik transformasyon olan visseral endodermin nascent villili basit kolumnar epitele dönüşümü sırasında salgılanır. Transgenik farelerde yapılan deneyler, epitelyal hücre silsilesinde ve intestinal traktın kranio kaudal ekseni ve kript-villus boyunca gen traskripsiyonu yapılarını yönlendirmek için karmaşık programlar olduğu hakkında kanıt sunmaktadır. İşte CDX2 intestinal epitelde barsak hücre morfogenezisinde ve farklılaşmış fenotipin korunmasında farklı gen ürünlerinin transkripsiyonunu destekleyerek erken safhaları yönlendirmede önemli bir rol almaktadır. Buradan da anlaşıldığı üzere CDX2 intestinal epitelde gen salınımının, proliferasyonun, morfogenezisin orkestra şefidir. CDX2 çok sayıda intestinal genin transkripsiyonunu regule etmektedir.

Farelerde CDX2 geninin gelişimsel paternine ek olarak intestinal diferansiasyondaki rolü olan intestin spesifik genler (enterositik markerler) CDX2 için hedeftir (9).

CDX2 enterositik markerlerin gen promoterlerde var olan cis elementelerine bağlıdır. Bu enterositik markerler sucrase-isomaltase (SI), Lactase-phlorizin hydrolase (LPH), apolipoprotein B, carbonik anhidrase 1 ve calbindin D9K’dur (48). CDX2 özellikle Sİ gen promoterinin transkripsiyonal aktivasyonu için çok önemlidir (47).

CDX2 invitro çalışmalarında IEC (indiferansiye intestinal hücre dizileri) hücrelerinde polarizasyonu ve SI ekspresyonunu tetiklemektedir (9). Caudal familyaya ait bu genler ile yapılan daha geniş çalışmalarda bu genler intestinal diferansiasyona katılmaktadırlar ve onların ekspresyonu epitel konnetif doku etkileşimine bağlıdır. Ayrıca intestinal ontogeny sırasında hücresel diferansiasyonun kontrolunde, matür organda devam eden hücresel yenilenmesinin sırasında epitelial–mezenkimal hücre etkileşimleri gösterilmiştir (48). Bu karşılıklı etkileşimler değişik doku rekombinantlarının deneysel graftingleri ile kanıtlanmıştır.

Bazal membran, epitelial ve mezenkimal hücreler arası ilişkiye yüzey olarak katılmaktadır.

Hem mezenkimal hemde epitelyal hücrelerce salgılanan laminin -1 invitro olarak barsak hücre diferansiasyonunun prometeri olarak bulunmuştur (51). Laminin -1’in üretimi antisensRNA’sı ile inhibe edildiği zaman intestinal epitelin diferansiasyonu tamamen durmaktadır (SI ve LPH yokluğunda oluşan değerlendirmeler gibi). Bir dizi kolonadenokarsinom hücrelerinde yapılan çalışmalara göre CDX2 overekspresyonu

farklılaşan enterositlerin özellikleri ile ilgilidir.

Matür enterositlerden salgılanan SI ve LPH, CDX2 varlığında yükselme göstermektedirler. Bunlarda Beta 4 integrin subünitini stimüle etmektedirler. Bunun ile bağlantılı olarak invivo olarak bu bazal membran reseptörü kript-villus aksisi boyunca artan bir gradyent sergiler. CDX2 overekspresyonu desmosomların yapısında bulunan integrinlerin salgılınmasını ve toplanmasını uyarmaktadır (48). Laminin 1 tarafından verilen ekstraselluler sinyaller CDX2 homeoproteininin salınımında modifikasyona yol açar ki bu da sekrete bazal membran moleküllerinde değişimi provoke eder (laminin α1’in bozulması ve laminin γ2 mRNA’sının artması). Ayrıca CDX2, selüler bağlanma özelliklerini ve transduksiyon sinyallerininde değişimini sağlar ki bunlar ise integrinlerin repertuarında modifikasyona yol açar. İntegrin β1’de bozulma integrin β4 subünitinde stimulasyon ile sonuçlanır (52). Birkaç laminin 1 zinciri ve integrin sub ünitleri kript –villus aksisi boyunca spesifik dağılım göstermektedir. Bunun sonucunda sürekli yenilenen intestinal epitelin bu sürecinde proliferasyon artık diferansiasyon yönüne kaymaktadır.

Diferansiasyonun başladığı gibi bir yerde de durması lazımdır. Bunu sağlayan faktörler nelerdir? Bu amaçla neonatal rat ileumundan elde edilen IEC-6 hücreleri üzerinde çalışma yapılmıştır. Bu hücreler kript tip intestinal hücre özelliğini göstermekte fakat gen ekspresyonu ve farklılaşan morfolojiyi sağlamamaktadır ve ayrıca CDX1 veya CDX2’yi eksprese etmemektedirler. Bu hücreler CDX2 salgılamak için zorlandığı zaman hem diferansiasyonda hem de proliferasyonda kayda değer değişiklikler oluşmuştur. Bu hücre kültürlerinde özellikle diferansiasyonun moleküler markeri olan Sİ’nin RNA’sını eksprese etmişlerdir (9). Bu hücrelerde oluşan proliferasyon birkaç gün sonra arreste uğramakta bu da myoD (53), C/ERB (54), Pit1/GHF1’i (55) de içine alan diferansiasyonu uyaran transkripsiyon faktörlerinin habercisidir.

İlginç olarak karmaşık ekstrasellüler matriks üzerindeki bu hücrelerin kültüründe diferansiasyonun bazı göstergeleri ile ilişkisinin olduğuna yol açmaktadır. Hücre-hücre, hücre–matriks ilişkilerinin hücre morfogenezisinde önemli olduğu düşünülmüştür. Çünkü bunlar CDX2 salgılamaktadırlar. Bu ilişkilerdeki proteinler CDX2 için hedef (target) olmuşlardır. Farklılaşmanın en önemli markeri olan SI’nın prometeri ise CDX2 dir. SI ise farklılaşmanın terminal olarak korunmasında önemli bir gendir (9).

CDX2 overeksprese eden hücrelerde ayrıca APC, E-cadherin’nin salınımının arttığı (up regülasyon) görülmektedir. Bunlar ise tümör ya da invazyon süpressörüdür (56). Yine CDX2 overekspresyonu izlenen Caco2 hücre kültürlerinde (bu hücreler kolon adenokarsinom hücreleridir), bcl-2 mRNA düzeylerinde önemli azalmalar gözlemlenmiştir (48). Ayrıca

CDX2 birçok kanserde anti–apopitotik protoonkogenleri deregüle etmiştir (57). İnsan kolon tümörlerinde ve ratlarda yapılan indüklenmiş tümörlerde CDX2 bozulmasının dramatik sonuçlara yol açtığı bulunmuştur (58). CDX2’nin tümör süpressör rolünün olduğu gösterilmiştir (48). Heterozigot CDX2 knock-out farelerde kolonda çok sayıda adenomatöz polipler ve metaplazi gelişmiştir (59).

CDX2 nin salınımının azaldığı kolon kanserleri yüksek dereceli karsinomlardır. CDX2, IEC6 ve HT-29 ki bunlar human kolon kanser hücre dizileridir, bu hücrelerde proliferasyonu inhibe etmiştir. Onkojenik Ras’ın HT-29, Caco-2 hücrelerinde CDX2’yi azalttığı bilinir (48, 60).

Fakat bir yandan da nude micelere CDX2 over eksprese eden hücreler enjekte edildiğinde kontrol gruplarına göre daha büyük tümörler oluşmaktadır. Bu beklenmedik sonuçların nedeni ise bu hücrelerde yüksek düzeyde bulunan laminin γ2 zincirlerinin β4 integrinlere bağlanmasıdır. Bu molekül gerçekte tümör formasyonu ve invazyonu ile muhtemelen bağlantılıdır (48).

CDX2’nin intestinal yapıların gelişiminde ve hücre fenotipinde özel rolü olmasından dolayı çok sayıda çalışma bu genin kolorektal tümöregenezis ile olan ilişkisine odaklanmıştır. CDX2 kaybı gösteren knockout fareler kullanılan modellerde kolorektal tümör gelişimi önemlidir. CDX2’nin total kaybı embriyogenezis sırasında ölümcüldür (59).

Diğer bir çalışma ise mutant farelerde Apc gen ve CDX2 heterozigositesi birlikte değerlendirilmiştir. Apc delesyonları tek başına sadece ince barsakta çok sayıda adenomlara yol açmıştır. Fakat iki genin eskpresyonunun azalması ise distal kolonda artmış sayıda adenomotöz poliplere neden olmuştur. Bu çalışmalar CDX2’nin, kalın barsakta tümör süpressör rolünü düşündürür. CDX2 salınımının kaybı kolorektal tümör ilerlemesi ve gelişmesinde çok önemli rol oynayabileceğini gösterir (3).

CDX2 mRNA’sı normalda çekum ve kolonda yüksek seviyelerde, intestinal kanalın diğer bölgelerinde düşük düzeylerde bulunmuş, midede ise bulunamamıştır (61). CDX2 transgenik farelerde mide epitelini intestinal epitele transforme etmektedir (62). CDX2’nin ektopik olarak intestinal metaplazide overeksprese edildiği ve normal gastrik epitelin intestinal epitele transforme olmasında rol aldığı bulunmuştur (7,63). Reflü özefajit (64) ve kronik H. Pylori enfeksiyonu gibi kronik inflamasyonun CDX2 salınımını indüklediği gösterilmiştir (7,8,65)

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul’un onayı alınarak çalışmaya başlandı (Ek 1). Bu çalışmada Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda 2000-2006 yılları arasındaki hem antrum hem de korpus bölgesinden alınan mide endoskopik biyopsileri incelendi. Bu vakalar arasından mide karsinomu, mide peptik ülseri olmayan, H. Pylori için hiçbir tedavi almayan, aynı anda hem antrum hem korpusa ait endoskopik biyopsileri bulunan 85 olgu çalışmaya alındı.

Çalışmaya alınan 85 olgunun hem antrum hem de korpus endoskopik biyopsilerine ait HE kesitleri retrospektif olarak Sydney Update sisteme (66) göre yeniden değerlendirildi. Bu sistemde bütün parametreler ki bunlar ( inflamasyon, aktivite, metaplazi, atrofi, displazi, H. Pylori’dir), yok (0), az (+)/(+++), orta (++)/(+++) ve çok (+++)/(+++) olarak değerlendirilmektedir. Çalışmamızda istatistiksel sonuçların sağlıklı değerlendirilebilmesi için bütün parametreler var ya da yok şeklinde birleştirilmiştir.

Çalışmamızda, hem antrum hem de korpusdan alınan biyopsilerin bu parametreleri en iyi yansıtan bir kesite ait parafin bloktan hem immünohistokimyasal hem de histokimyasal inceleme için 4μm kalınlığında seri kesitler alındı. Gerek seçilen kesitlerde gerekse ayrıca konulan kontrol dokularından elde edilen kesitlerde immünohistokimyasal ve histokimyasal belirleyiciler için pozitif ve/veya negatif kontrol oluşturacak doku alanı bulunmasına dikkat edildi. Tüm olgularda immünohistokimyasal olarak Avidin Biotin Peroksidaz yöntemi kullanılarak CDX2, MUC2, MUC5AC antikorlarının ekspresyonları araştırıldı. Kullanılan antikorlar ve özellikleri (Tablo 3)’dedir. Ayrıca tüm olgularda histokimyasal olarak periodic acid-Schiff-Alcian Blue (PAS-AB) PH 2,5 ve PAS-AB PH 0,5’da müsin varlığı araştırıldı. Kullanılan histokimyasal boyaların özellikleri (Tablo 4)’dedir.

Helicobacter Pylori değerlendirmesi HE boyalı preparatlarda immersiyon yağı damlatılarak yapıldı.

İMMÜNOHİSTOKİMYASAL YÖNTEM

İmmünohistokimya; immünolojik ilkelere dayanılarak, varlığı araştırılan antijenlere karşı geliştirilmiş, poliklonal veya monoklonal antikorlar aracılığıyla dokudaki antijeni göstermek amacıyla kullanılan bir yöntemdir (67). Çalışmamızda indirekt immunperoksidaz yöntemi uygulanmıştır.

Yöntemin Uygulanışı CDX2 ve MUC5AC için:

1. Tüm parametreleri en iyi örnekleyen kesite ait parafin bloklardan 1/10’luk Poly-L-Lysine ile muamele edilmiş lamlara 4μm kalınlıkta kesitler alındı.

2. Kesitler 12 saat süreyle 56°C etüvde bekletilerek deparafinize edildi.

3. Boyama öncesi deparafinizasyona ksilen ile devam edildi. Bu işlem 60°C etüvde 3 kez 10’ar dakika bekletme ve her 10 dakikanın ardından 5’er dakika dışarıda soğumaya bırakma şeklinde uygulandı.

4. Ksilenin giderilmesi için %96’lık alkol muamelesine geçildi. Kesitler 60°C etüvde 4 kez 10’ar dakika tutuldu.

5. Lamlar 3 kez distile sudan geçirildi.

6. Antijen geri kazanımı için ‘DAKO ChemMate tm Buffer for Antigen Retrieval ‘(kod no. S2031 DAKO, Carpinteria, CA, ABD) solüsyonu kullanıldı. 90 ml distile suya 10 ml bu solüsyondan eklenerek sitrat buffer solüsyonu hazırlandı.

7. Kesitler hazırlanan solüsyon içerisine konularak mikrodalga fırında önce 700 watta 25 dakika daha sonra 350 watta 20 dakika kaynatıldı

8. Kesitler dışarıda oda sıcaklığına gelinceye kadar 20 dakika bekletildi.

9. Dört kez 1’er dakika distile sudan geçirilen lamlara, dokularda bulunan endojen peroksiti bloke etmek için 37°C etüvde 20 dakika, 100 cc distile su içerisine 8,7 cc H2O2 katılarak hazırlanmış %8,7’lük H2O2 uygulaması yapıldı.

10. Üç kez distile sudan geçirilen lamlar pH 7.4 olan PBS solüsyonunda 10 dakika bekletildi. 11. Lamlardaki kesitlerin etrafı reaktiflerin kesit dışına taşmasını engellemek için

‘’DAKO-Pen’’ (Kod No. S2002)ile çizildi.

12. Her bir lama Large Volume Ultra V Blok (Kod No: TA-125-UB, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) damlatıldı ve 7 dakika bekletildi. Sonra solüsyon lamlar üzerinden uzaklaştırıldı.

13. Her bir vaka için ayrı ayrı numaralandırılmış lamlara, oda sıcaklığında, ancak nemli ortamda Anti CDX2 (CDX2-88), (Kod No. MU392A-UC, BioGenex , San Ramon, CA, ABD) konsantre antikoru Antibody Dilue ile 1/10 oranında dilue edilerek, MUC5AC (Kod No. NCL-MUC-5AC, CLH2, Novocastra,) toz halindeki konsantre antikoru 1 ml bidistile su ile sulandırıldı daha sonra Antibody Dilue ile 1/20 oranında dilue edilerek damlatıldı. Antikorun her alana eşit dağılması için lamların üzeri lamelle kapatıldı. Bir saat bekletildi.

14. Lamlar üzerindeki antikorlar distile su ile uzaklaştırılıp PBS solüsyonuna alınarak 5 dakika bekletildi.

15. UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP kitinin (Kod No. TA 125-HL, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) 1 nolu Biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Kod No. TP-125_BN, Neomarkers, Fremont , CA, ABD) solüsyonu damlatıldı ve 15 dakika bekletildi.

16. PBS solüsyonu ile 5 dakika yıkanan lamlara, 2 nolu biotine bağlanacak olan işaretleyici ‘Streptavidin Peroxidase’ (Kod No. TS-125-HR, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) damlatıldı ve 15 dakika daha bekletildi.

17. Distile su ile yıkanan lamlar PBS solüsyonunda 5 dakika bekletildi.

18. UltraVision Detection System Large Volume AEC Substrate System (RTU) (Kod No. TA-125-HA, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) kitinden karıştırılarak hazırlanan renklendirici solüsyon kesitler üzerine damlatılarak 10 dakika bekletildi.

19. Distile su ile yıkanan lamlar Mayer hematoksilen solüsyonunda 1 dakika tutularak zıt boyama yapıldı.

20. Musluk suyunda yıkandı.

21. Lamlar %5’lik amonyak solüsyonuna bir kez batırılarak morartma işlemine tabi tutuldu. 22. Musluk suyunda yıkandı.

23. Gliserol jel kullanılarak lamelle kapatıldı.

MUC2 için:

1. Tüm parametreleri en iyi örnekleyen kesite ait parafin bloklardan 1/10’luk Poly-L-Lysine ile muamele edilmiş lamlara 4μm kalınlıkta kesitler alındı.

2. Kesitler 12 saat süreyle 56°C etüvde bekletilerek deparafinize edildi.

3. Boyama öncesi deparafinizasyona ksilen ile devam edildi. Bu işlem 60°C etüvde 3 kez 10’ar dakika bekletme ve her 10 dakikanın ardından 5’er dakika dışarıda soğumaya bırakma şeklinde uygulandı.

4. Ksilenin giderilmesi için %96’lık alkol muamelesine geçildi. Kesitler 60°C etüvde 4 kez 10’ar dakika tutuldu.

5. Lamlar 3 kez distile sudan geçirildi.

6. Antijen geri kazanımı için ‘TRİSBACE DAKO ChemMate tm Buffer for Antigen Retrieval ‘(kod no. S2031 DAKO, Carpinteria, CA, ABD) solüsyonu kullanıldı. 1000 ml distile suya 1,21gr TrisHCl eklenerek tris buffer solüsyonu hazırlandı.

7. Kesitler hazırlanan solüsyon içerisine konularak mikrodalga fırında önce 700 watta 20 dakika kaynatıldı.

8. Kesitler dışarıda oda sıcaklığına gelinceye dek 20 dakika bekletildi.

9. Dört kez 1’er dakika distile sudan geçirilen lamlara, dokularda bulunan endojen peroksiti bloke etmek için 37°C etüvde 20 dakika, 100 cc distile su içerisine 8,7 cc H2O2 katılarak hazırlanmış distile suda %8,7’lük H2O2 uygulaması yapıldı.

10. Üç kez distile sudan geçirilen lamlar pH 7.4 olan PBS solüsyonunda 10 dakika bekletildi. 11. Lamlardaki kesitlerin etrafı reaktiflerin kesit dışına taşmasını engellemek için

‘’DAKO-Pen’’ (Kod No. S2002) ile çizildi.

12. Her bir lama Large Volume Ultra V Blok (Kod No: TA-125-UB, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) damlatıldı ve 7 dakika bekletildi. Sonra solüsyon lamlar üzerinden uzaklaştırıldı.

13. Her bir vaka için ayrı ayrı numaralandırılmış lamlara, oda sıcaklığında, ancak nemli ortamda Anti-Mucin-2 (MUC2), (Kod No. MU358-UC, BioGenex, San Ramon, CA, ABD) konsantre antikoru Antibady Dilue ile 1/20 oranında dilue edilerek damlatıldı. Antikorun her alana eşit dağılması için lamların üzeri lamelle kapatıldı. Bir saat bekletildi. 14. Lamlar üzerindeki antikorlar distile su ile uzaklaştırılıp PBS solüsyonuna alınarak 5

dakika bekletildi.

15. UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP kitinin (Kod No. TA 125-HL, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) 1 nolu Biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Kod No. TP-125-BN, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) solüsyonu damlatıldı ve 15 dakika bekletildi.

16. PBS solüsyonu ile 5 dakika yıkanan lamlara, 2 nolu biotine bağlanacak olan işaretleyici ‘Streptavidin Peroxidase’ (Kod No. TS-125-HR, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) damlatıldı ve 15 dakika daha bekletildi.

18. UltraVision Detection System Large Volume AEC Substrate System (RTU) (Kod No. TA-125-HA, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) kitinden karıştırılarak hazırlanan renklendirici solüsyon kesitler üzerine damlatılarak 10 dakika bekletildi.

19. Distile su ile yıkanan lamlar Mayer hematoksilen solüsyonunda 1 dakika tutularak zıt boyama yapıldı.

20. Musluk suyunda yıkandı.

21. Lamlar %5’lik amonyak solüsyonuna bir kez batırılarak morartma işlemine tabi tutuldu. 22. Musluk suyunda yıkandı.

23. Gliserol jel kullanılarak lamelle kapatıldı.

Tablo 3. Kullanılan antikorlar ve özellikleri

Antikor Cinsi Klon Kaynak Katolog No Uygulama

Süresi

CDX-2 MKL-fare CDX2-88 BioGenex MU392A-UC 30 dk

MUC2 MKL-fare CCP58 BioGenex MU358-UC 30 dk

MUC-5AC MKL-fare CLH2 Novocastra NCL-MUC-5AC 30 dk MKL;monoklonal

İmmunohistokimyasal Değerlendirme

Çalışmaya alınan vakalar boyanmadan önce antikorların çalışıp çalışmadığını kontrol amacıyla her antikor için katalogda belirtilen kontrol dokuları arşivden temin edilerek boyama yapıldı. Bu amaçla CDX2 için kolon (Şekil 5 A), MUC2 için kolon karsinomu, ince barsak (Şekil 2 A), MUC5AC için mide (Şekil 3 A) blokları kullanıldı. Boyamalar sonucunda antikorların çalıştığı görüldü. Bu antikorlardan CDX2 nükleer ve sitoplazmik, MUC2 ve MUC-5AC sitoplazmik boyama gösterdi.

Çalışmaya alınan vakalarda CDX2 ile oluşan immünohistokimyasal boyanma paternlerinin ölçülmesinde kriter olarak Satoh ve ark. (8), MUC2 ve MUC5AC için ise Reis ve ark. (24) yaptığı çalışmalar esas alınmıştır. Buna göre CDX2’nin nükleer boyanmasının değerlendirilmesinde boyanma yaygınlığı 0-3 arasında skorlanmıştır: yok ise 0, 0-1/3’ünde varsa 1, 1/3-2/3’ünde varsa 2, 2/3’den fazla ise 3 puan almıştır. Vakalarımızda CDX2 nükleer boyanmasının değerlendirilmesi yapıldığında hem antrumda hem de korpustaki ekspresyonları 3 puan almıştır. Bu nedenle istatistik yapılırken boyanma olan vakalar var olmayanlar yok olarak değerlendirilmişti

r.

değerledirilmiştir. MUC2 VE MUC5AC’de ise değerlendirme boyanma var ise 1, yok ise 0 puan almıştır.

HİSTOKİMYASAL YÖNTEM

Histokimyasal metod veya reaksiyon, aranan maddenin dokuda bulunduğu yere, bir sıra kimyasal olaylar sonucunda renkli bir bileşiğin çöktürülmesinden ibaret bir yöntemdir. (68). Histokimyasal boyalar içinde kontrol dokuları olarak PAS-AB PH2,5 için ince barsak (Şekil 6 A), PAS-AB PH0,5 için kolon (Şekil 7 A) kullanıldı.

Yöntemin Uygulanışı PAS-AB PH2,5 için:

1. Tüm parametreleri en iyi örnekleyen kesite ait parafin bloklardan 1/10’luk Poly-L-Lysine ile muamele edilmiş lamlara 4μm kalınlıkta kesitler alındı.

2. Kesitler 12 saat süreyle 56°C etüvde bekletilerek deparafinize edildi. 3. Kesitler distile sudan geçirildi.

4. Reaget A (Alcian Blue PH 2,5) damlatıldı ve 30 dakika bekletildi.

5. Lamlar hızlı yıkama yapmadan musluk suyundan geçirildi ve Reagent B (Sodium tetraborat) solusyonu damlatıldı, 10 dakika bekletildi.

6. Lamlar 5 dakika musluk suyunda yıkandı ve 2 dakika distile suda bekletildi. 7. Kesitlere Reagent C (Periodic asit ) solusyonu damlatıldı 10 dakika bekletildi. 8. Lamlar distile su ile yıkandı.

9. Kesitlere Reagent D (Schiff’s Reagent ) damlatıldı 20 dakika bekletildi. 10. Lamlar distile su ile yıkandı.

11. Kesitlere Reagent E (Potasyum methabisülfit) damlatıldı.

12. Kesitlerin üzerindeki solusyon yıkanmadan silkelenerek uzaklaştırıldıktan sonra Reagent F (Fiksatif solusyon) damlatıldı ve 3 dakika bekletildi.

13. Kesitler distile su ile yıkandı.

14. Kesitlere Reagent G (Mayer’s Hemalum) damlatıldı ve 2 dakika bekletildi. 15. Kesitler çeşme suyunda 5 dakika bekletildi.

16. Kesitler daha sonra alkol serilerinden geçirildi, ksilenden geçirildi ve lamel ile kapatıldı

PAS-AB pH 0,5 için:

1. Tüm parametreleri en iyi örnekleyen kesite ait parafin bloklardan 1/10’luk Poly-L-Lysine ile muamele edilmiş lamlara 4μm kalınlıkta kesitler alındı.

2. Kesitler 12 saat süreyle 56°C etüvde bekletilerek deparafinize edildi. 3. Kesitler distile sudan geçirildi.

4. Kesitlere Reaget A (Asid buffer) damlatıldı 3 dakika bekletildi.

5. Kesitler üzerindeki solusyon yıkama yapılmadan silkelenerek uzaklaştırıldı ve Reaget B (Alcian blue solusyon pH 0,5) damlatılıp 30 dakika bekletildi.

6. Kesitler üzerindeki solusyon yıkama yapılmadan silkelenerek uzaklaştırıldı ve Reaget C (Sodium tetraborat solusyon) damlatıldı, 10 dakika bekletildi.

7. Kesitler distile sudan geçirildi.

8. Kesitler üzerine Reaget D (Nükleeer fast red solusyon) damlatıldı 5 dakika bekletildi. 9. Kesitler distile sudan geçirildi.

10. Kesitler daha sonra alkol serilerinden ve ksilenden geçirildi ve lamel ile kapatıldı.

Tablo 4. Kullanılan Histokimyasal Kitler ve Özellikleri

Kit İsmi Kaynak Katolog no Uygulama süresi

ALCİAN BLUE

PH2,5 P. A. S Bio-Optica 04-163802 85 dk

ALCİAN BLUE

PH0,5 Bio-Optica 165812 50 dk

PAS: Periodic Acid Schiff

İSTATİSTİKSEL YÖNTEM

Olgular, inflamasyon, aktivite, İM, displazi, atrofi, H. Pylori, CDX2, MUC2, MUC5AC antikorları ile ekspresyon özellikleri, PAS -AB Ph2,5, PAS-AB Ph 0,5’de müsin varlığının araştırılması açısından karşılaştırılarak istatistiksel analize tabi tutuldu. İstatistiksel analizler Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı Bilgi İşlem Merkezin’de bulunan Statistica 7.0 (Lisans No:AXF507C775406FAN2) programı ile yapıldı.

Bağımlı ve bağımsız değişkenler arasındaki ilişkilerin önemlilik derecesini belirlemek için Fisher Keskin Ki Kare testi, Ki-kare testi kullanıldı. Elde edilen p değerinin 0.05 ve altında olduğu değerler anlamlı olarak kabul edildi.

İstatistiksel analizin ikinci aşamasında intestinal metaplazi ile CDX2, MUC2 ve MUC5AC ekspresyonları arasında sensitivite (duyarlık), Spesifite (özgüllük), prediktif (kestirim) değeri oranları hesaplandı. Bu uygulamada histokimyasal metod altın standart olarak kabul edildi.

Sensitivite; kullanılan antikorlar ile gerçek pozitif boyanma gösteren olgu sayısının, kaynak testteki gerçek olumlu olgulara oranı olarak tanımlandı, [Duyarlık= (gerçek pozitif / gerçek pozitif + yanlış negatif) X 100].

Spesifisite; antikorlar ile gerçek negatif boyanma olgu sayısının, kaynak testteki gerçek olumsuz olgulara oranı olarak tanımlandı, [Seçicilik= (gerçek negatif / yalancı pozitif + gerçek negatif) X 100].

Pozitif ve negatif kestirim değerleri sırasıyla [Pozitif Kestirim Değeri= (gerçek pozitif / yalancı pozitif + gerçek pozitif) X 100] ve [Negatif Kestirim Değeri= (gerçek negatif / yalancı negatif + gerçek negatif) X 100] olarak tanımlandı.

BULGULAR

KLİNİK VE PATOLOJİK BULGULAR

Çalışma grubunu hem antrum hemde korpus biyopsileri bulunan 85 vaka oluşturmaktaydı. Vakaların 44 (%51,8)’ü erkek, 41 (%48,2)’i kadındı. Bunların yaş dağılımı 16-86 arasında değişmekte olup yaş ortalaması 47,4±17,8 idi. Bu vakalar Sydney Update sisteme (66) göre yeniden değerlendirilmiştir. Vaka sayılarının azlığından dolayı incelenen parametrelerin alt sınıfları birleştirilmiş, var ya da yok olarak yorumlanmıştır. Buna göre antrumdan alınan biyopsilerin 81 (%95,3)’inde inflamasyon, 28 (%32,9)’inde aktivite, 23 (%27,1)’ünde İM, 35 (%41,2)’inde H. Pylori, 44 (%51,8)’ünde atrofi varlığı tespit edilmiş, hiçbirinde displazi izlenmemiştir (Tablo 5). Korpustan alınan biyopsilerin 74 (%87,1)’ünde inflamasyon, 28 (%32,9)’inde aktivite, 13 (%15,3)’ünde İM, 42 (%49,4)’sinde H.Pilori, 14 (%16,5)’ünde atrofi tespit edilmiş, hiçbirinde displazi izlenmemiştir (Tablo 6). Sırası ile inflamasyonun, aktivite ve metaplazinin HE mikroskopik görünümü şekil 1 A-B-C-D’ de izlenmektedir.

Tablo 5. Antrum-Morfolojik bulgular İNF (%) AKT (%) İM (%) DSP (%) ATR (%) HP (%) VAR _(95,3) 81 _(32,9) 28 23 (27,1) ₍₀₎ 0 _(51,8) 44 _(41,2) 35 YOK 4 (4,7) _(67,1) 57 _(72,9) 62 ₍₁₀₀₎ 85 _(48,2) 41 _(58,8) 50 İNF: İnflamasyon; AKT: Aktivite; İM: İntestinal Metaplazi; DSP: Displazi; ATR: Atrofi; HP: Helicobacter Pylori.

Tablo 6. Korpus-Morfolojik bulgular İNF (%) AKT (%) İM (%) DSP (%) ATR (%) HP (%) VAR 74 (87,1) 28 (32,9) 13 (15,3) 0 (0) 14 (16,5) 42 (49,4) YOK 11 (12,9) 57 (67,1) 72 (84,7) 85 (100) 71 (83,5) 43 (50,6) İNF: İnflamasyon; AKT: Aktivite; İM: İntestinal Metaplazi; DSP: Displazi; ATR: Atrofi; HP: Helicobacter Pylori.

Hem antrumda hemde korpusta, bütün bu parametrelerin H. Pylori arasındaki ilişkiye sırasıyla önce antrumda sonra da korpusta bakıldığında şu sonuçlar elde edilmiştir:

Antrum ve korpusta tüm vakalar ele alınınca H. Pylori ile inflamasyon arasında istatistiksel olarak anlamlı fark izlenmedi. Buna rağmen antrumda H. Pylori izlenen 35 hastanın tamamında inflamasyon görülmüştür (Tablo 7) (Fisher Exact test). Korpusta ise 42 hastada H. Pylori varlığı izlenmiş olup bunların 39’una (%92,9) inflamasyon eşlik etmiştir (X²=2,478) (Tablo 8).

Tablo 7. Antrum-Helicobacter Pylori ve inflamasyon ilişkisi* İNFLAMASYON H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 4 ₍₈₎ 46 _(92,0) 50 Var 0 ₍₀₎ 35 _(100,0) 35 TOPLAM 4 _(4,7) 81 _(95,3) 85

*Fisher Exact test, p=0.140; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

Tablo 8.Korpus- Helicobacter Pylori ve inflamasyon ilişkisi* İNFLAMASYON H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 8 _(18,6) 35 _(81,4) 43 Var 3 _(7,1) 39 _(92,9) 42 TOPLAM 11 _(12.9) 74 _(87.1) 85

Hem antrumda hemde korpusta H. Pylori ve aktivite arasında istatistiksel olarak anlamlı fark vardı. Aktivite varlığında H. Pylori varlığının arttığı görüldü. 85 vakanın antrumda 43’ünde aktivite izlenmedi. Bu olgularda H. Pylori de izlenmedi . (X²=19,721), (Tablo 9). Korpusta ise 34 vakada aktivite yokken H. Pylori de yoktu (X²=5,683), (Tablo 10).

Tablo 9. Helicobacter Pylori aktivite ilişkisi (Antrum)* AKTİVİTE H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 43 _(86,0) 7 _(14,0) 50 Var 14 (40,0) 21 (60,0) 35 TOPLAM 57 _(67,1) 28 _(32,9) 85

*X²=19,721 p=0,000; H. PYLORI: Helikobakter. Pilori

Tablo 10. Helicobacter Pylori aktivite ilişkisi (Korpus)* AKTİVİTE H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 34 _(79,1) 9 _(20,9) 43 Var 23 _(54,8) 19 _(45,2) 42 TOPLAM 57 _(67,1) 28 _(32,9) 85

*X²=5,683 p=0,017; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

Antrumda H. Pylori ve metaplazi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki görülmedi (X²=1,502). Antrumda H. Pylori pozitif vakaların ancak 7’sinde İM tesbit edilmiştir. 23 İM vakasının 16’sında (%69,6) H. Pylori yoktu (Tablo 11).

Tablo 11. Helicobacter Pylori ve intestinal metaplazi birlikteliği (Antrum)* İNTESTİNAL METAPLAZİ H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 34 (68,0) 16 (32,0) 50 Var 28 _(80,0) 7 _(20,0) 35 Toplam 62 _(72,9) 23 _(27,1) 85 *X²=1,502 p=0,220; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

Korpusta H. Pylori ve metaplazi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki izlendi (X²=4,258). H. Pylori Pozitif vakaların %92,9’unda metaplazi yoktu. Metaplazi izlenen 13 vakadan sadece 3’ünde H. Pylori vardı. Antrumda olduğu gibi korpusta da H. Pylori bulunan olgularda İM izlenmeme oranı yüksekti (Tablo 12).

Tablo 12. Helicobacter Pylori ve intestinal metaplazi birlikteliği (Korpus)* İNTESTİNAL METAPLAZİ H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 33 _(76,7) 10 _(23,3) 43 Var 39 (92,9) 3 (7,1) 42 Toplam 72 _(84,7) 13 _(15,3) 85

*X²=4,258 p=0,039; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

Hem antrum hem de korpusta H. Pylori ve atrofi arasında istatiksel olarak anlamlı bir ilişki izlenmedi (Tablo 13,14).

Tablo 13. Helicobacter Pylori ve atrofi birlikteliği (Antrum)* ATROFİ H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 23 _(46,0) 27 _(54,0) 50 Var 18 _(51,4) 17 _(48,6) 35 Toplam 41 (48,2) 44 (51,8) 85

Tablo 14. Helicobacter Pylori ve atrofi birlikteliği (Korpus)* ATROFİ H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 34 (79,1) 9 (20,9) 43 Var 37 (88,1) 5 (11,9) 42 Toplam 71 _(83,5) 14 _(16,5) 85

*X²=1,258 p=0,262 ; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

İMMUNOHİSTOKİMYASAL BULGULAR

85 vakanın antrum biyopsilerinin 23 (%27,1)’ünde, korpus biyopsilerinin 13 (%15,3)’ünde İM saptandı. Hem antrum hem de korpusta izlenen intestinal metaplazinin tamamında MUC2 pozitif reaksiyon verdi ve istatistiksel olarak anlamlı sonuç elde edildi, (Fisher Exact test), (Tablo 15 ve Tablo 16), (Şekil 2 B-C-D). Antrumda izlenen intestinal metaplazinin 18 (%78,2)’inde MUC5AC negatif (Şekil 3 B, Şekil 4 B), 5 (%22,8)’inde pozitif reaksiyon verdi. Bu oranlar istatiksel olarak anlamlı olarak yorumlandı (Fisher Exact test) (Tablo 17). Antrumda izlenen MUC5AC pozitifliği 4 vakada kolunmar hücrelerde izlenirken, (Tablo 18), 3 vakada ise goblet hücrelerinde pozitiflik saptandı (Tablo 19). Bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (Fisher Exact test). 2 vakada hem kolumnar hemde goblet hücrelerinde pozitiflik izlendi (Şekil 4 A). Korpusta tesbit edilen intestinal metaplazinin tamamında MUC5AC negatifti ve bu istatistiksel olarak anlamlıydı (Fisher Exact test, p=0.000) (Tablo 20). Antrumda 23 vakada izlenen intestinal metaplazinin 20 (%86,9)’sinde nükleuslarda CDX2 pozitif iken, 3 (%14,1)’ünde CDX2 negatif olarak tespit edilmiştir (Fisher Exact test) (Tablo 21). Korpusta ise saptanan 13 intestinal metaplazinin 12 (%92,3)’sinde CDX2 ile nükleer pozitiflik saptanmıştır, (X²=70,263) (Tablo 22) (Şekil 5 B-C).

Tablo 15. İntestinal metaplazide MUC2 ekspresyonu (Antrum)* İNTESTİNAL METAPLAZİ MUC2 Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 62 (100) 0 (0) 62 Var 0 (0) 23 (100) 23 TOPLAM 62 (72,9) 23 (27,1) 85

Tablo 16. İntestinal metaplazide MUC2 ekspresyonu (Korpus)* İNTESTİNAL METAPLAZİ MUC2 Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 72 (100) 0 (0) 72 Var 0 (0) 13 (100) 13 TOPLAM 72 (84,7) 13 (15,3) 85 *Fisher Exact test p=0.000

Tablo 17. İntestinal metaplazide MUC5ACekspresyonu (Antrum)* İNTESTİNAL METAPLAZİ MUC5AC Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 0 (0) 18 (100) 18 Var 62 (92,5) 5 (7,5) 67 TOPLAM 62 (72,9) 23 (27,1) 85 *Fisher Exact test p=0,000

Tablo 18. İntestinal metaplazide kolumnar hücrelerde MUC5ACekspresyonu (Antrum)*

İNTESTİNAL METAPLAZİ MUC5AC

KOLUMNAR Yok _(%) Var _(%) TOPLAM

Yok 62 (76,5) 19 (23,5) 81 Var 0 ₍₀₎ 4 ₍₁₀₀₎ 4 TOPLAM 62 _(72,9) 23 _(27,1) 85

Tablo 19. İntestinal metaplazide goblet hücrelerinde MUC5ACekspresyonu (Antrum)* İNTESTİNAL METAPLAZİ MUC5AC GOBLET Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 62 (75,6) 20 (24,4) 82 Var 0 (0) 3 (100) 3 TOPLAM 62 _(72,9) 23 _(27,1) 85

*Fisher Exact test p=0,018

Tablo 20. İntestinal metaplazide MUC5ACekspresyonu (Korpus)* İNTESTİNAL METAPLAZİ MUC5AC Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 0 ₍₀₎ 13 ₍₁₀₀₎ 13 Var 72 ₍₁₀₀₎ 0 ₍₀₎ 72 TOPLAM 72 _(84,7) 13 _(15,3) 85

*Fisher Exact test p=0,000

Tablo 21. İntestinal metaplazide CDX2 nükleer ekspresyonu (Antrum)* İNTESTİNAL METAPLAZİ CDX2 NÜKLEER BOYANMASI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 62 _(95,4) 3 _(4,6) 65 Var 0 ₍₀₎ 20 ₍₁₀₀₎ 20 TOPLAM 62 _(72,9) 23 _(27,1) 85

Tablo 22. İntestinal metaplazide CDX2 nükleer ekspresyonu ( Korpus)* İNTESTİNAL METAPLAZİ CDX2 NÜKLEER BOYANMASI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 71 (98,6) 1 (1,4) 72 Var 1 (7,7) 12 (92,3) 13 TOPLAM 72 _(84,7) 13 _(15,3) 85 *X²=70,263 p=0,000

Antrumda saptanan 23 intestinal metaplazinin 20 (%87)’sinde, korpusta saptanan 13 intestinal metaplazinin 12 (%92,3)’sinde CDX2 ile nükleer pozitiflik saptanmıştır (Tablo 23).

Tablo 23. Lokalizasyonlara göre metaplazide CDX2 nükleer Pozitifliği Negatif (%) Pozitif (%) TOPLAM Metaplazi (korpus) 1 (7,7) 12 (92,3) 13 Metaplazi (antrum) 3 (13) 20 (87) 23

Antrumda CDX2 sitoplazmik ekspresyonu ile İM arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı. 23 İM vakasından 3’ünde sitoplazmik boyanma tespit edildi (Fisher Exact test), (Tablo 24).

Tablo 24. İntestinal metaplazide CDX2’nin sitoplazmik ekspresyonu (Antrum)*

İNTESTİNAL METAPLAZİ CDX2

SİTOPLAZMİK

BOYANMASI Yok (%) Var (%)

TOPLAM Yok 17 (45,9) 20 (54,1) 37 Var 45 (93,8) 3 (6.2) 48 TOPLAM 62 _(72,9) 23 _(27,1) 85

Korpusta CDX2 sitoplazmik ekspresyonu ile İM arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı. İM varlığında CDX2 sitoplazmik ekspresyonu olmamamaktadır. İM görülen 2 vakada sitoplazmik boyanma tespit edildi (Fisher Exact test), (Tablo 25).

Tablo 25. İntestinal metaplazide CDX2’nin sitoplazmik ekspresyonu (Korpus)* İNTESTİNAL METAPLAZİ

CDX2

SİTOPLAZMİK

BOYANMASI Yok (%) Var (%)

TOPLAM

Yok 25 _(69,4) 11 _(30,6) 36

Var 47 _(95,9) 2 _(4,1) 49

TOPLAM 72 _(84,7) 13 _(15,3) 85

*Fisher Exact test p=0,001

Antrumda inflamasyon ile CDX2 sitoplazmik boyanma varlığı arasında vaka sayısının azlığı nedeni ile istatistiksel değerlendirme yapılamadı. Fakat 85 vakanın 46’sında inflamasyon varlığında CDX2’nin sitoplazmik ekspresyonunu saptadık (Tablo 26).

Tablo 26. İnflamasyonda CDX2 sitoplazmik ekspresyonu (Antrum)* CDX2 SİTOPLAZMİK BOYANMASI İNFLAMASYON Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 2 ₍₅₀₎ 2 ₍₅₀₎ 4 Var 35 _(43,2) 46 _(56,8) 81 TOPLAM 37 _(43,2) 48 _(56,5) 85

Korpusta inflamasyon ile CDX2 sitoplazmik boyanma varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı (Fisher Exact test) , (Tablo 27) (Şekil 5 D).

Tablo 27. İnflamasyonda CDX2 sitoplazmik ekspresyonu (Korpus)* CDX2 SİTOPLAZMİK BOYANMASI İNFLAMASYON Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 9 (81,8) 2 (18,2) 11 Var 27 (36,5) 47 (63,5) 74 TOPLAM 36 _(42,4) 49 _(57,6) 85

*Fisher Exact test p=0,007

Antrumda aktivite ile CDX2 sitoplazmik boyanma varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (X²=3,801). Fakat aktivite saptanan 28 vakanın 20 (%71,4)’sinde CDX2 sitoplazmik boyanması tespit edildi, (Tablo 28).

Tablo 28. Aktivite ile CDX2 sitoplazmik ekspresyonu arasındaki ilişki (Antrum)* CDX2 SİTOPLAZMİK BOYANMASI AKTİVİTE Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 29 _(50,9) 28 _(49,1) 57 Var 8 _(28,6) 20 _(71,4) 28 TOPLAM 37 _(43,5) 48 _(56,5) 85 *X²=3,801 p=0,051

Korpusta aktivite ile CDX2 sitoplazmik boyanma varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmadı (X²=3,248). Fakat aktivite saptanan 28 vakanın 20 (%71,4)’sinde CDX2 sitoplazmik boyanması tespit edildi, (Tablo 29).

Tablo 29. Aktivite ile CDX2 sitoplazmik ekspresyonu arasındaki ilişki (Korpus)* CDX2 SİTOPLAZMİK BOYANMASI AKTİVİTE Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 28 (49,1) 29 (50,9) 57 Var 8 (28,6) 20 (71,4) 28 TOPLAM 36 _(43,4) 49 _(57,6) 85 *X²=3,248 p=0,072

Antrumda, H. Pylori ile CDX2 sitoplazmik boyanma varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı (X²=7,68). H. Pylori pozitif 35 vakanın 26 (%74,3)’sında CDX2 sitoplazmik pozitiflik tespit edildi, (Tablo 30).

Tablo 30. Helicobacter Pylori ile CDX2 sitoplazmik ekspresyonu arasındaki ilişki (Antrum)* CDX2 SİTOPLAZMİK BOYANMASI H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 28 _(56,0) 22 _(44,0) 50 Var 9 _(25,7) 26 _(74,3) 35 TOPLAM 37 _(43,5) 48 _(56,5) 85

*X²=7,68 p=0,006; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

Korpusta, H. Pylori ile CDX2 sitoplazmik boyanma varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı (X²=11,96). H. Pylori pozitif 42 vakanın 32 (%76,2)’sinde CDX2 sitoplazmik boyanması tespit edildi, (Tablo 31).

Tablo 31. Helicobacter Pylori ile CDX2 sitoplazmik ekspresyonu arasındaki ilişki (Korpus)* CDX2 SİTOPLAZMİK BOYANMASI H. PYLORI Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 26 _(60,5) 27 _(39,5) 43 Var 10 _(23,8) 32 _(76,2) 42 TOPLAM 36 (42,4) 49 (57,6) 85

*X²=11,96 p=0,001; H. PYLORI: Helicobacter Pylori.

HİSTOKİMYASAL BULGULAR

Çalışmamıza aldığımız 85 olguda hem antrumda izlenen hemde korpusta izlenen İM histopatolojik ve histokimsayal olarak komplet tip özellikte idi. Hem korpusta hem de antrumda izlenen İM’de kolumnar hücrelerde müsin sekresyonu izlemedik, goblet hücrelerinin tamamında ise PAS-AB pozitif asidik müsin sekresyonu izledik, (antrum için Tablo 32, korpus için Tablo 33), (Şekil 6 B, Şekil 7 B).

Tablo 32. İntestinal Metaplazide PAS-AB PH 2.5 salınımı (Antrum)* İNTESTİNAL METAPLAZİ PAS-AB PH 2.5 Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 62 (100) 0 (0) 62 Var 0 (0) 23 (100) 23 TOPLAM 62 (72,9) 23 (27,1) 85 *Fisher Exact test, p=0,000

Tablo 33. İntestinal Metaplazide PAS-AB PH 2.5 salınımı (Korpus)* İNTESTİNAL METAPLAZİ PAS-AB PH 2.5 Yok (%) Var (%) TOPLAM Yok 72 (100) 0 (0) 72 Var 0 (0) 13 (100) 13 TOPLAM 72 (84,7) 13 (15,3) 85 * (Fisher Exact test, p=0.000)

ANTRUM VE KORPUS İÇİN BÜTÜN PARAMETRELERİN KARŞILAŞTIRILMASI

85 vakada histopatolojik parametrelerin, immünohistokimyasal ve histokimyasal bulguların antrum ve korpus arasında istatistiksel olarak karşılaştırması yapıldı. Sydney Update sisteme (65) göre değerlendirdiğimiz parametrelerden sadece atrofide istatistiksel olarak anlamlı fark izlendi (X²=23,553, p=0,000), (Tablo 34). Bunun dışındaki diğer parametreler, immünohistokimyasal ve histokimyasal sonuçların hiç birisinde istatistiksel olarak fark görülmedi.

Tablo 34. Atrofinin korpus ve antrumda varlığının karşılaştırılması ATROFİ BÖLGE Yok (%) Var (%) TOPLAM Korpus 71 (83,5) 14 (16,5) 85 Antrum 41 (48,2) 44 (51,8) 85 TOPLAM 112 (65,9) 58 (34,1) 170 *X²=23,553, p=0,000

CDX2, MUC2 ve MUC5AC ekspresyonlarının intestinal epiteli yakalama ve intestinal metaplazide, histokimyasal yöntem ile karşılaştırılmasında duyarlık, seçicilik, pozitif ve negatif kestirim değerleri hesaplandı. Vakalarımızda izlenen intestinal metaplazinin tamamı komplet tip olduğu için bu değerler hem intestinal metaplazi tipi hem intetinal epiteli yakalayabilme gücü hem de histokimyasal tekniklerle karşılaştırma sonuçları birbirleriyle örtüşmekteydi (Antrum için Tablo 35, korpus için Tablo 36).

Tablo 35. İntestinal metaplazide MUC2, CDX2 VE MUC5AC Ekspresyonunun duyarlık, seçicilik ve prediktifite açısından kıyaslanması (Antrum)

EKSPRESYON DUYARLIK (%) SEÇİCİLİK (%) PPD NPD

MUC2 100 100 100 100

CDX2 86,9 100 100 95,3

MUC5AC 78,2 100 100 92

Tablo 36. İntestinal metaplazide MUC2, CDX2 VE MUC5AC Ekspresyonunun duyarlık, seçicilik ve prediktifite açısından kıyaslanması (Korpus)

EKSPRESYON DUYARLIK (%) SEÇİCİLİK (%) PPD NPD MUC2 100 100 100 100 CDX2 92,3 98,6 92,3 98,6 MUC5AC 100 100 100 92

PPD; Pozitif prediktif değer, NPD; Negatif prediktif değer.

Çalışma kapsamına alınan 85 olguya ait demografik ve morfolojik bulgular antrum için (Tablo 37), korpus için (Tablo 38)’de verilmiştir.