Selülaz Üreticisi Bacillus Suşlarının Enzimatik Özelliklerinin Araştırılması

(1)

KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 10(2), 2007 KSU Journal of Science and Engineering, 10(2), 2007

₁₃

Selülaz Üreticisi Bacillus Suşlarının Enzimatik Özelliklerinin Araştırılması

Ural TOPUZ, Özlem EREN KIRAN, Uğur ÇÖMLEKÇĐOĞLU

Kahramanmaraş Sütçü Đmam Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Kahramanmaraş

Geliş Tarihi: 21.09.2006 Kabul Tarihi: 09.01.2007

ÖZET: Kağıt atık materyallerinin geriye dönüşümünü arttırmada kağıtlarla muamele edilen farklı selülaz sistemleri

kullanılmaktadır. Bu araştırmada, bazı endüstriyel işlemlerde ve atık maddelerin yeniden kullanılabilir hale getirilmesinde önem arz eden mikrobiyal selülaz enzimi ele alınmıştır. Bu amaçla toprak örneklerinden selülaz enzimi üreticisi olan 42 Bacillus suşu izole edilmiştir. Đzolasyonu yapılan suşlardan, üreme sıcaklık ve pH aralığı, enzim üretme yeteneği, ve enzim sentezinin gerçekleştiği sıcaklık ve pH aralıkları bakımından en iyi sonucu veren Bacillus B23 suşu seçilmiştir. Bu suşun enzim üretimi besi ortamında test edilmiştir. En yüksek selülaz üretimini 42

o_{C’de ve pH 8.5’de gerekleştirmiştir.}

Anahtar Kelimeler: Kağıt atıklar, selülaz, Bacillus spp., enzim üretimi.

Isolation of Cellulase Producing Bacillus sp. Strains and Investigation Their Enzymatic Characteristics ABSTRACT: Different cellulase systems are used for increasing efficiency of recycling of paper wastes. Microbial

cellulase, which is important for some industrial processes and recovery of wastes, was used in this research. For this purpose, 42 cellulase producing Bacillus were isolated and Bacillus B23 was selected for further investigation according to growth temperature and pH, enzyme producing capability, and optimum growth temperature and pH. Enzyme synthesis of this strain was tested in growth medium. Maximum enzyme synthesis was obtained at 42 oC and 8.5 pH.

Key Words: Paper wastes, cellulase, Bacillus, enzyme synthesis. GĐRĐŞ

Dünya üzerinde en çok bulunan doğal organik kaynak olan selüloz, bitkisel kaynaklı olup basit bir disakkarit olan seluloz tekrarlanan ünitelerinden oluşmaktadır (Lamed ve Bayer, 1998). Selüloz fibriler yapıda, sert bir madde olup, bitkilerin hücre duvarında yer almakta ve bitki biyokütlesinin yaklaşık % 40’ını oluşturmaktadır. Yaklaşık 15 000 glikoz biriminin ß-1,4-glikozidik bağlar ile linear bir şekilde bağlanması ile oluşan selülozun suya karşı afinitesi yüksek olmasına rağmen, suda hiç çözünmemektedir. Selüloz, endoglukanaz, ekzoglukanaz ve ß-glukosidaz enzimleri ile monomeri olan glikoza hidroliz olabilmektedir (Niehaus ve ark., 1999).

Tabiatta endüstri açısından önemli olan bir kaç çeşit selülaz vardır. Ticari olarak en çok kullanılan selülaz, Trichoderma sp. Teeri ve ark (1998) Aspergillus, Penicillium ve Bacillus suşları tarafından üretilmektedir (Tomme ve ark., 1995; Ito 1997). Selülozu hidrolize eden selülaz enzimleri büyük ölçüde fungus ve bakterilerden elde edilmekte ve çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılmaktadır. Selülolitik enzimler, alkol üretiminde de sıvı kazancını arttırmak ve iyi bir renk elde etmek için kullanılmaktadır.

Selülazın diğer kullanım alanları, selülozik biyokütlenin ve yemlerin besin değerini ve sindirilebilirliğini arttırmak, zirai ve endüstriyel atıkların enzimatik olarak daha basit bileşenlere parçalanmasını sağlamaktadır (Niehaus ve ark., 1999). Biyolojik atıklar, evsel ve endüstriyel kökenli olup bu materyalin esas bileşenini kağıt atıkları oluşturmaktadır. Kağıt atık materyallerinin geriye dönüşümünü

arttırmada kağıtlarla muamele edilen farklı selülaz sistemleri kullanılmaktadır (Yu, 1996) .

Bacillus cinsine ait türlerden elde edilen bazı ekstrasellüler enzimlerin, endüstriyel öneme sahip olduğu belirtilmektedir (Ito 1997; Mawadza ve ark., 2000). Ancak, bazı Bacillus suşları tarafından üretilen alkali selülazların genel olarak ısı kararlı olmadığı belirtilmektedir (Horikoshi ve ark., 1984). Bu özellikte olan alkali selülazların ise, yüksek sıcaklık gerektiren deterjan endüstrisi için uygun ve ekonomik olmadığı ifade edilmektedir. (Hakamada ve ark., 1997).

Bu nedenle bu araştırmada, atık maddelerin yeniden kullanılabilir hale dönüştürülmesinde ve bazı endüstriyel işlemlerde önem arz eden mikrobiyal selülaz üreticisi mikroorganizma izolasyonu ve bunların enzim üretme kapasitesi araştırılmıştır. Maliyetinin ucuz, eldesinin kolay olması ve selülaz üretebilmesi nedeniyle Kahramanmaraş Sütçü Đmam Üniversitesi Çiftliği’nden toprak örnekleri alınmış ve Bacillus suşlarının izolasyonu yapılmıştır. Đzolasyonu ve tanımlanması yapılan bu suşların selülaz enzimi üretme yetenekleri, çeşitli pH ve sıcaklık aralıklarında test edilmiş, besi ortamının selülaz üretimi üzerine etkisi incelenmiştir. Böylece izolasyonu ve tanımlanması yapılan Bacillus suşlarından elde edilecek olan selülaz enziminin endüstriyel olarak kullanılabilme imkanları ülke endüstrisine (gıda, tekstil, deterjan, kağıt, vs.) ve daha sonra yapılacak olan çalışmalara veri sağlaması hedeflenmiştir.

(2)

₁₄

MATERYAL ve METOT

Bakteri Đzolasyonu ve Kültür Koşulları

Kahramanmaraş Sütçü Đmam Üniversitesi

Çiftliğinden alınan toprak örnekleri steril tüplere konularak laboratuara getirilmiştir. Bu örneklerden 1 g tartılarak 4.5 ml steril distile su ile süspansiyon haline getirilmiştir. Đzole edilmek istenen mikroorganizma (Bacillus sp.) endosporlu bir bakteri olduğu için elde edilen süspansiyon 60 oC’de 30 dakika süre ile inkübe edilmiştir. Saf halde Bacillus sp. kolonileri elde etmek amacıyla seri seyreltmeler yapılarak (10-1,10-2,....) nutrient agarlı besiyerine yayma şeklinde ekim yapılmış ve 37 oC de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır.

Đnkübasyon süresi sonunda besiyeri üzerinde gelişen

farklı morfolojik görünüşe sahip koloniler seçilerek selülaz aktivitelerinin araştırılması amacı ile 4 oC de muhafaza edilmiştir (Kıran, 2001).

Katı Besiyerinde Selülaz Aktivitesi

Đzolasyonu yapılan Bacillus suşlarında selülaz

aktivitesini araştırmak için % 1 CMC

(Karboksimetilselüloz), % 1 maya ekstraktı, % 1 NaCl, % 1 Tripton ve % 1.5 agar içeren besiyerine ekim yapılmıştır (Özcan ve ark., 1992). Selülaz aktivitesini belirlemek için besiyeri Kongo kırmızısı ile boyanarak 15 dakika beklemeye bırakılmıştır ve 1 M NaCl ile yıkanmıştır. Besiyeri ortamı kırmızı renge boyanırken, selülaz üreten kolonilerin çevresinde boyanmayan şeffaf zonlar meydana gelmiştir (Hols ve ark., 1994). Bu

şekilde selülaz aktivitesi fazla olan suşlar belirlenmiş ve

enzim aktivitelerinin belirlenmesi için 4 οCde muhafaza edilmiştir.

Selülaz Aktivitesi

Selülazın pH 5-11 aralığında rölatif aktivitesinin belirlenmesi için Bacillus sp. B23 suşu % 0.1 CMC, % 1 Et özütü, % 2 pepton, % 0.15 K2HPO4, % 0.02

MgSO4.7H2O, %0.001 FeSO4.7H2O, % 0.0001

MnSO4.4H2O, % 0.01 CaCl2.H2O, % 0.5 Na2CO3 içeren

alkali besiyerinde üretilmiştir. Na2CO3 ortama ayrıca

steril edilerek ilave edilmiştir (Hakamada ve ark., 1997).

Optimum Üreme pH’sı

Bacillus B23 suşu pH’sı 5-11 arasında değişiklik gösteren yukarıda tanımlanan besiyerine ekim yapılmış ve 37 oC de 24 saat süre ile inkübasyona bırakılmış ve rölatif selülaz aktivite değerleri hesaplanmıştır (Hols ve ark., 1994).

Optimum Üreme Sıcaklığı

Bacillus B23 suşunun optimum olarak ürediği sıcaklığı bulmak için 30, 37, 42, 50, 55 oC gibi sıcaklıklarda 24 saat süre ile çalkalanarak inkübasyona bırakılmış ve rölatif selülaz aktiviteleri hesaplanmıştır (Hols ve ark., 1994 ).

Enzimin Kısmi Saflaştırılması

Ekim yapılan besiyerleri inkübasyon süresi tamamlandıktan sonra 0 oC de 6000 rpm’de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatanta % 70 oranında soğuk etanol eklenmiş ve 24 saat -33 oC’de bekletilmiştir. Süre sonunda, çözelti +4 oC de 6000 rpm’de tekrar santrifüj edilerek elde edilen çökelti glisin-NaOH tamponunda çözülmüştür (Hakamada ve ark., 1997).

Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi

Bacillus B23 suşundan elde edilen selülaz enzim aktivitesi Bernfeld (1955)’e göre belirlenmiştir. Reaksiyon karışımı 1 ml substrat solusyonu (40 mM potasyum fosfat tamponu (pH 6) kullanılarak % 1 oranında CMC ile hazırlanmıştır) ve 1 ml enzim solusyonu içermektedir (Aiba ve ark., 1983). Bu karışım 42 oC’de 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Reaksiyonu durdurmak için 2 ml DNS (dinitrosalisilik asit solusyonu) ilave edilerek 5 dakika kaynatılmıştır (Bernfeld 1955; Lin ve ark.1997). Renk değişimi 600 nm de okunmuştur (Hakamada ve ark., 1997).

BULGULAR ve TARTIŞMA

Kahramanmaraş Sütçü Đmam Üniversitesi çiftliği etrafındaki 7 farklı bölgeden alınan toprak örneklerinden morfolojik özellikleri birbirinden farklı olan 42 Bacillus suşu izole edilmiştir. Đzolasyonu yapılan bakteriler stok kültürlere alınarak, pH toleransı, üreme sıcaklık aralığının belirlenmesi ve enzim aktivitesi için 4 oC de muhafaza edilmişlerdir. Toplam 42 bakteri suşunun üreme sıcaklık aralığı ve pH aralığı çalışılmış ve enzim üretme yeteneği en iyi olan (iyi üreme, geniş zon çapı ve pH aralığı gibi) izolatın 23 nolu suş olduğu tespit edilmiş ve Bacillus B23 suşu olarak isimlendirilmiştir.

Bacillus B23 suşunun, besi ortamında enzim üretme kapasiteleri gözlenmiştir. Buna göre, besi ortamında pH 5–11 arasında enzim üretiminin gerçekleştiği ve pH 8,5’da en yüksek seviyeye ulaştığı gözlenmiştir. pH 8,5 değerinin üstünde ve altında enzim üretiminde azalma olduğu görülmüştür (Şekil 1). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 pH R ö la ti f A k ti v it e ( % )

Şekil 1. Farklı pH’larda Bacillus. B23 suşunun rölatif

(3)

₁₅

Besi ortamında yetiştirilen Bacillus B23 suşu 30–55

o_C _değerleri _arasında _enzim _üretme _yeteneği

göstermiştir. Enzim üretiminin 42 oC’de en yüksek olduğu tespit edilmiştir. 42 oC’nin altında ve üstündeki sıcaklıklarda ise enzim üretme miktarında azalma olduğu görülmüştür (Şekil 2). 50 60 70 80 90 100 30 37 42 50 55 Sıcaklık R ö la tif A k tiv it e (% )

Şekil 2. Farklı sıcaklıklarda Bacillus B23 suşunun

rölatif enzim aktivitesi.

Bacillus cinsine ait üyelerin çeşitli ekstrasellüler enzimlerinin endüstriyel öneme sahip olduğu daha önce yapılan çalışmalarda belirtilmektedir (Ito, 1997; Mawadza ve ark., 2000). Çoğu durumlarda prokaryotik

β-1,4-glukanazlar, selülozun sadece çözünebilir

formlarına (Karboksimetilselüloz ve

hidroksimetilselüloz) ait glikosidik bağların hidrolizini katalizlemektedir. Hücre dışı mikrobiyal β-glukanaz, bira endüstrisinde (Enari ve Markanken, 1975), zirai atıkların dönüşümünde (Ryu ve Mandels, 1980) ve fungal bitki patojenlerinin biyolojik olarak kontrolünde (Mauch ve ark., 1988) kullanılmaktadır (Reyes ve ark., 1997). Ayrıca anaerob bakteri olan Clostridium thermocellum’un selülozu etanol ve asetik aside parçaladığını belirtmiş ve organizmanın endüstriyel olarak kullanılabileceğini önermişlerdir (Lamed ve ark., 1983).

Günümüzde endüstriyel selülaz kaynağı olarak genellikle fungus kullanılmaktadır. Örnek olarak Trichoderma reesei gibi selülolitik mantarlar, kristal selülozu parçalayan ve sinerjistik olarak etki gösteren enzim serisi üretebileceğini göstermişlerdir (Beguin, 1990). Bu organizmalar selülaz enzim komplekslerini, genellikle yüksek protein ürünleri ile birlikte üretmektedir. Fakat selülaz enziminin düşük spesifik aktivite ve istenmeyen biyokimyasal özellikler taşımaları nedeniyle, selülaz üretiminde bakterilerin kullanılması ile ilgili çalışmalar yoğunlaşmıştır. Özellikle bazı Clostridium türleri (Giallo ve ark.,1985), rumen bakterileri (Coughan ve Ljungdahl, 1988) ve Acetovibrio cellulolyticus (Saddler ve Khan, 1981) üzerinde yapılmaktadır.

Bu çalışmada izole edilen Bacillus B23 suşunun enzim üretimi pH 5-11 aralığında gerçekleşmiştir. Bununla beraber enzim üretimi için optimum pH değerinin 8,5 olduğu tespit edilmiştir. Diğer taraftan bakteri üremesi ve enzim üretimi 30–55 oC arasında

gerçekleşmiş, optimum sıcaklığın 42 oC olduğu bulunmuştur. Bajpai ve Bajpai (1987) tarafından yapılan çalışmada Bacillus licheniformis TCRDC-B13 suşunun üremesinin pH 3-11 arasında olduğunu, besiyeri pH’sının arttırılması ile üremenin azaldığını, enzim üretiminin pH 5-10 arasında devam ettiğini, ancak maksimum selülaz aktivitesinin pH 6-9 arasında olduğunu belirtmişlerdir. B. licheniformis TCRDC-B13 suşu 25-50 oC’de üreme göstermiş ancak maksimum enzim üretiminin 35 oC’de gerçekleştiğini tespit etmişlerdir.

Mawadze ve ark. (2000)’ın yaptıkları çalışmada ise izole ettikleri Bacillus sp. CH43 suşunun selülaz ürettiği optimum pH aralığını 5-7, Bacillus sp. HR68 suşunun ise 5-6.5 olduğunu belirlemişlerdir. Optimum sıcaklığı ise Bacillus sp. CH43 için 70 oC ve Bacillus

sp HR68 için ise 65 oC olarak bulmuşlardır. Ito (1997)

yaptığı çalışmada izole ettiği Bacillus sp. KSM-635 suşunun pH 3 ile pH 13 değerleri arasında selülaz ürettiğini, en yüksek üretim pH’sının ise 9,5 olduğunu bildirmiştir. Yapılan bu çalışmada Bacillus B23 suşundan elde edilen selülaz enziminin pH 8,5’da ve 42

o

C’de yüksek miktarda ürettiği ve daha önce yapılan çalışmalara uygunluk sağladığı tespit edilmiştir.

Bu çalışmada elde edilen veriler Bacillus türlerinden elde edilecek olan selülaz enziminin pek çok ürünün (kullanılmış peçete, tuvalet kağıtları, fotokopi kağıtları, çeşitli yiyeceklerin kabukları) geri dönüşümünde kullanılabileceğini göstermektedir. Diğer taraftan atıklardan biyoteknolojik uygulamalar ile biyoenerji sağlanması güncel araştırma konusudur. Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi ile evsel ve endüstriyel atıkların biyolojik olarak geri dönüştürülmesi veya bunlardan biyoenerji elde edilmesi bu maddelerin oluşturacağı çevre kirliliğinin giderilmesinde de oldukça iyi bir çözüm oluşturacaktır.

KAYNAKLAR

Aiba, S., Kıtai, K., Imanaka, A. 1983. Cloning and expression of thermostable α- amylase gene from

Bacillus stearothermophilus in Bacillus

stearothermophilus and Bacillus subtilis. Applied and Environ. Microbiol, 1059-1065.

Beguin, P. 1990. Molecular biology of cellulase degradation. Annu Rev Microbiol, 44: 219-248. Bajbai, P., Bajbai, K.P. 1987. High temperature

Alkaline α amylase from Bacillus licheniformis TCRDC-B13. Biotechnology and Bioengineeria, 33: 72-78.

Bernfeld, P. 1955. Amylases α and β. Methods Enzymol, 1: 149-158.

Coughlan, M.O., Ljungdahl, L.G. 1988. Comparative Biochemistry of fungal and bacterial celluloytic enzyme systems. Journal System Bacterology, 44: 11-30.

Enari, T.M., Markanken, P.H. 1975. Microbial β -glucananes in brewing . Proc. Am. Society Brewing Chemistry, 33: 13-17.

(4)

₁₆

Giallo, J., Gaudin, C., Belaich, J.P. 1985. Metabolism and solubization of cellulose by Clostridium celluloyticum H10. Application Environmental Microbiolgy, 49: 1216- 1221.

Hakamada, Y., Koike, K., Yoshimatsu, T., Mori, H., Kobayashi, T., Ito, S. 1997. Thermostable alkaline cellulase from an alkaliphilic isolate, Bacillus sp. KSM-S237. Extremophiles, 1: 151-156.

Hols, P., Ferain, T., Garmyn, D., Bernard, N., Delcour, J. 1994. Use of expression secretion signals and vector free stable chromosomal integration in engineering of Lactobacillus plantarum for alfa amylase and levanase expression. Application and Environment Microbiology, 30: 774-779.

Horikoshi, K., Nakano, Y., Kurono, Y., Sashihara, N. 1984. Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil. Can. Journal Microbiolgy, 30: 774-779.

Ito, S. 1997. Alkaline cellulases from alkaliphilic Bacillus Enzymatic properties, genetics, and application to detergents. Extremophiles, 1: 61-66. Kıran, Ö. 2001. Doğal ortamdan izole edilen alkalifilik

Bacillus sp. suşlarında α-amilaz üretimi, enzimin

pH ve sıcaklık stabilitesinin araştırılması. Doktora Tezi, 40s

Lamed, R., Seter, E., Kening, R., Bayer, E.A. 1983. The cellulosome a Discrete cell surface organelle of Clostridium thermocellum which exhibits separete antigenic cellulose-binding and various catalytic activities. Biotechnology Bioengineering Symp, 13: 163-181.

Lamed, R., Bayer, E.A. 1998. The cellulosome concept exocellular/extracellular enzyme reactor centers for efficient binding and cellulolysis. SEMS symp, 43: London Academic.

Lin, L.L, Hsu, W.H., Chu, W.S. 1997. A gene encoding for an α-amylase from thermophilic Bacillus sp. Strain TS-23 and its expression in Escherichia coli. J. Appl. Microbiol, 82: 325-334.

Mauch, F., Mauch, M.B., Boller, T. 1988. Antifungal hydrolases in pea tissue 2. inhibition of fungal growth by combination of chitinase and β -1,3-glucanase. Plant Physiol, 88: 936-942.

Mawadza, C., Kaul, R.H., Zvauya, R., Mattiason, B. 2000. Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains. Journal of Biotechnology, 83: 177-187.

Nıehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M., Antranikian, G. 1999. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Microbiology Biotechnology, 51: 711-729.

Özcan, N. 1992. Cloning and sequencing of a cellulose gene from Fibrobacter succinogenes. Doktora tezi Aberdeen Üniversitesi, Đngiltere , 35s Reyes, M.P., Corona, F.G. 1997. The biofunctional

enzyme chitosanase-cellulase produced by th gram-negative microorganism Myxobacter sp. AL-1 is highly similar to Bacillus subtilis endoglucanases. Arch. Microbiology, 168: 321-327.

Ryu, D.D.Y., Mandels, M. 1980. Cellulases:

biosynthesis and applications. Enzyme

Microbiology Technology, 2: 91-102.

Saddler, J.N., Khan, A.W. 1981. Celluloytic enzyme system of Acetovibrio celluloyticus. Can. Journal Microbiolgy , 1730-1736.

Teeri, T.T., Koivula, A., Linder, M., Wohlfahrt, G., Divne, C., Jones, T.A. 1998. Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficent on crystalline cellulose. Biochemistry Society Trans, 26: 173-178.

Tommme, P., Warren, R.A., Gilkes, N.R. 1995. Cellulose hydrolis this bacteria and fungi. Adv. Microbiolgy Physiol, 37: 1-81.

Yu, P. 1996. Analysis of a municipal recyclable material recycling program. Resour. Conserv. Recy, 17: 47-56.