Ankara Ecz. Fak. D e r .
15, 43 (1985)
J. Fac. Pharm. Ankara
15, 43 (1985)
B a r b i t ü r a t l a r ı n E k s t r a k t i f A l k i l l e n m e l e r i v e G a z
K r o m a t o g r a f i k T a y i n l e r i
Extractive Alkylation of Barbiturates a n d T h e i r D e t e r m i
-n a t i o -n b y G a s C h r o m a t o g r a p h y
Tülin SÖYLEMEZOĞLU*
ÖZET
Bu çalışmada, toksikolojik analizlerde u y g u l a n m a k üzere,
barbi-türatlarm gaz kromatografisinde ekstraktif alkilleme ile analizleri
için y ö n t e m geliştirilmiştir. Ele alınan 12 barbitüratın ekstraktif
alkilleme ile p e n t a f l u o r o b e n z i l türevleri oluşturulmuş, uygun gaz k r o
-matografik k o l o n ve iç standart seçimi amacıyla değişik d u r u c u faz
larda, a l ı k o n m a indeksleri b u l u n m u ş t u r . P e n t a f l u o r o b e n z i l türevleri
için en duyarlı d e t e k t ö r ; elektron yakalayan d e t e k t ö r d ü r . S E - 3 0 ise
en hızlı s o n u ç a l m a n gaz sıvı kromatografik d u r u c u fazdır.
Barbitü-ratlarm ekstraktif alkillenme hızları, t e t r a b u t i l a m o n y u m konsant
rasyonu ve pH değerlerine karşı araştırılmıştır. Barbitüratların
ekstrak-tif alkillenmeleri için en uygun pH 9 olarak b u l u n m u ş t u r . R e a k s i y o n
o r t a m d a k i t e t r a b u t i l a m o n y u m konsantrasyonu 0.2 M o l d u ğ u n d a
10 dakika i ç i n d e t a m a m l a n m a k t a d ı r . G a z kromatografik analizlerde
elektron yakalayan detektör kullanıldığında saptanabilen en düşük
m a d d e miktarı 1 p i k o g r a m / µ l dir.
SUMMARY
In this research, a new m e t h o d for barbiturates was d e v e l o p e d
w h i c h is a p p l i c a b l e to t o x i c o l o g i c a l analysis based on extractive
alkyla-tion a n d gas c h r o m a t o g r a p h y . T h e p e n t a f l u o r o b e n z y l derivatives of
twelwe barbiturates were p r e p a r e d and their r e t e n t i o n indices were
Redaksiyon verildiği tarih: 20.3.1985
44 Tülin S Ö Y L E M E Z O Ğ L U
PFBBr'le o l d u ğ u gibi metil i y o d ü r g i b i d a h a basit yapıdaki alkilleme reaktifleri ile de yürütülebilen ekstraktif alkillemenin diğer türevleme d e t e r m i n e d a n d c o m p a r e d w i t h these o f c o r r e s p o n d i n g barbiturates on different gas c h r o m a t o g r a p h i c stationary phases. Electron-capture d e t e c t o r is the most sensitive for the p e n t a f l u o r o b e n z i l derivatives a n d the gas-liquid c h r o m a t o g r a p h i c stationary phase S E - 3 0 g a v e the m o s t r a p i d results. T h e rate o f extractive alkylation o f barbiturates was studied with respect to the c o n c e n t r a t i o n of t e t r a b u t y l a m m o -n i u m a -n d p H . O p t i m a l p H for extractive alkylatio-n o f barbiturates was f o u n d t o b e 9 . T h e r e a c t i o n was c o m p l e t e d r a p i d l y w h e n the t e t r a b u t y l a m m o n i u m c o n c e n t r a t i o n was 0 . 2 M . T h e m i n i m u m d e -tectable quantity o f P F B derivatives o f barbiturates was f o u n d t o b e 1 p i c o g r a m / µ lusing E C D b y gas c h r o m a t o g r a p h y .
A n a h t a r K e l i m e l e r : (Barbitüratlar, Ekstraktif alkilleme, G a z k r o m a t o g r a f i k a n a l i z ) .
Barbitüratlar y a y g ı n kullanım alanı o l a n sedatif ve h i p n o t i k ilaç-lardır. K a z a i z e h i r l e n m e l e r d e ve intihar olaylarında birinci sırada yer almaları ( 1 , 2) ve bağımlılık y a p a n ilaçlardan oluşları n e d e n i y l e tok-sikolojik analizler açısından ö n e m taşırlar. T o k s i k o l o j i k analizlerde en y a y g ı n u y g u l a n a n y ö n t e m l e r d e n birisi o l a n g a z kromatografisinin barbitüratlar i ç i n uygulanabilirliğinin a n c a k türevleme işleminden sonra söz konusu o l a b i l e c e ğ i d ü ş ü n ü l m e k t e d i r ( 3 ) . Barbitüratların g a z k r o m a t o g r a f i k ayrımı sırasında h i d r o j e n bağları nedeniyle kro-m a t o g r a f i k k o l o n d a tutulkro-maları s o n u c u duyarlık düşkro-mekte, kuyruklu pikler elde edilmektedir ( 4 ) . A y r ı c a a l ı k o n m a süresinin de miktara bağlı olarak değişmesi nicel ve nitel analizlerin yeterince d o ğ r u s o n u ç -lar v e r m e m e s i n e n e d e n o l m a k t a d ı r ( 3 ) . Genellikle g a z k r o m a t o g r a f i k koşullara u y g u n ve d a h a duyarlı türevler h a z ı r l a m a k a m a c ı y l a b a r -bitüratların alkillenmesi y o l u n a gidilmektedir. Bu türevlerin serbest asitlerden d a h a az p o l a r olmaları nedeniyle g a z kromatografisinde d u r u c u faz ü z e r i n d e ayrılmaları kolaylaşmaktadır ( 3 ) . D i ğ e r taraftan elektron y a k a l a m a özelliği d a h a fazla o l a n halojenli alkil türevleri du-yarlığın elektron yakalayan detektörle ( E C D ) , p i k o g r a m d ü z e y i n e inmesini sağlamaktadır. T ü r e v l e r i n ve reaktifin dayanıklılığı, sulu o r t a m d a çalışılabilme o l a n a ğ ı ve elde edilen türevlerin diğer h a l o jenli türevlerden d a h a fazla duyarlıkta oluşu p e n t a f l u o r o b e n z i l b r o -m ü r ü n ( P F B B r ) yeğlenen bir reaktif ol-masına yol a ç -m a k t a d ı r ( 5 , 6 ) .
Barbitüratların Ekstraktif Alkillenmeleri ve G a z .
reaksiyonlarına üstünlüğü ise, basit bir y ö n t e m oluşu, kullanılan reak-tiflerin tehlikesizliği, b a z l a katalizlenen d i ğ e r alkilleme y ö n t e m l e r i n e g ö r e d a h a hızlı y ü r ü m e s i ve ç o ğ u n l u k l a ekstraksiyon işlemi ile türev-l e m e n i n b i r arada yürütütürev-lebitürev-lmesidir ( 7 ) . PFBBr, barbitürattürev-ların alkilenmesi i ç i n ilk kez W A L L E (8) tarafından, b a z katalisti olarak trietilamin v e p o t a s y u m k a r b o n a t varlığında kullanılmıştır. G Y L L E N -H A A L ve arkadaşları (9) ise, PFBBr'le ekstraktif alkilleme işlemini, karşıt i y o n olarak t e t r a b u t i l a m o n y u m i y o n u n u ( T B A ) kullanarak fe-n o b a r b i t a l e uygulamışlardır.
Biz toksikolojik analizlere u y g u l a m a k a m a c ı y l a ekstraktif alkille-m e y ö n t e alkille-m i n i , barbitüratların g a z k r o alkille-m a t o g r a f i k analizleri i ç i n geliş-tirmeyi u y g u n g ö r d ü k .
Ekstraktif alkilleme işlemi ilk kez o r g a n i k k i m y a d a u y g u l a n m a -sından (10) sonra çeşitli ilaç gruplarının b i y o l o j i k m a t e r y a l d e n duyarlı olarak saptanması a m a c ı y l a b i r ç o k araştırıcı tarafından kullanılan b i r y ö n t e m d i r . Y ö n t e m i n teorisi v e reaksiyonun y ü r ü m e m e k a n i z m a s ı ayrıntılı olarak açıklanmıştır ( 1 1 - 1 6 ) .
DENEY KISIM M a t e r y a l :
K i m y a s a l B i l e ş i k l e r : Barbitürat standartları yazılan ilaç f i r m a l a r ı n d a n sağlanmıştır; A l l o b a r b i t a l ( A t a b a y ) , A p r o b a r b i t a l ( F .
H o f f m a n n - L a R o c h e , i s v i ç r e ) , Barbital s o d y u m ( A a r h u s - D a n i m a r k a ) , Butalbital ( S a n d o z , i s v i ç r e ) , Butobarbital ( A b b o t t , A B D ) , F e n o b a r -bital s o d y u m ( B D H , İngiltere), H e k s o b a r b i t a l (Siegfield, İ s v i ç r e ) , H e p t a b a r b i t a l ( C i b a - G e i g y , İ s v i ç r e ) , Pentobarbital s o d y u m ( A b b o t t , A B D ) , Sekobarbital s o d y u m (E.Lilly, A B D ) , Siklobarbital kalsiyum ( W i n t r o p , A B D ) , V i n b a r b i t a l (Astra, İ s v e ç ) , ç ö z ü c ü v e kimyasal m a d d e l e r ise analitik niteliktedir.
Çözeltiler: T B A çözeltisi; T B A H S O4' ı n fosfat t a m p o n u ile
değişik p H değerlerine ayarlanmasıyla hazırlanarak G L C E C D ç a -lışmaları i ç i n ö n c e d i k l o r m e t a n sonra da distillenmiş n-heptanla yı-kandı. Barbitürat stok çözeltileri; mililitrede 2 5 0 µg o l a c a k şekilde suda, alkan standartları; ml de 100 µg o l a c a k şekilde n-hekzanda ha-zırlandı. 0 . 5 M h o r d e n i n sülfat; 0 . 1 M N a O H i ç i n d e haha-zırlandı.
46 Tülin S Ö Y L E M E Z O Ğ L U
Fosfat t a m p o n l a r ı n ı h a z ı r l a m a k i ç i n 0 . 1 M m o n o s o d y u m h i d r o j e n fosfat, 0 . 1 M d i s o d y u m h i d r o j e n fosfat ve 0 . 1 M t r i s o d y u m fosfat çözeltileri kullanıldı.
M e t o d :
G a z K r o m a t o g r a f i k K o ş u l l a r : P a c k a r d Becker 419 Gas C h r o m a t o g r a p h ' d a alev i y o n l a ş m a detektörü ( F I D ) v e elektron y a k a l a y a n detektörle ( E C D ) çalışıldı. % 3 O V 1 7 ve % 3 S E 3 0 ( C h r o -m o s o r b W HP 100-120 -mesh ü z e r i n d e ) ile d o l d u r u l -m u ş 2 -m x 4 -m -m lik c a m k o l o n l a r kullanıldı. K o l o n sıcaklığı 230 °C - 245 °C arasına, detektör ve enjeksiyon giriş sıcaklıkları 2 6 0 ° C ye ayarlandı. G a z akış hızları; a z o t 30 ml/dakika, h i d r o j e n 30 ml/dakika, h a v a 250 m l / d a k i -kaya, duyarlık d ü z e y i n e g ö r e (elektrometre alanı) x (attenuation) F I D i ç i n ; 1 0 X 16, E C D i ç i n ; 2 . 5 X 1 0- 1 1 A x 2 1 6 v e y a 512 y e
ayar-landı. K a ğ ı t hızı dakikada 0 . 5 c m dir.
A l ı k o n m a İ n d e k s i H e s a p l a r ı : Barbitüratların P F B türevleri-n i türevleri-n a l ı k o türevleri-n m a itürevleri-ndeksleri L E A C H ' ı türevleri-n (17) verdiği, Şekil 3 de g ö r ü l e türevleri-n f o r m ü l d e n yararlanılarak hesaplandı. B u f o r m ü l d e R I : a l ı k o n m a i n -deksi, R d : a l ı k o n m a uzaklığının logaritması, R d ( P z ) : k ü ç ü k n u m a r a l ı alkanın a l ı k o n m a uzaklığının logaritması, R d ( P z n ) : b ü y ü k n u m a -ralı alkanın a l ı k o n m a uzaklığının logaritması, z: k ü ç ü k n u m a r a l ı al-kandaki k a r b o n sayısı, n: iki alkanın k a r b o n sayıları arasındaki fark-tır.
E k s t r a k t i f A l k i l l e m e İ ş l e m i : B u a m a ç l a G Y L L E N H A A L v e arkadaşlarının (9) kullandığı y ö n t e m değiştirilerek u y g u l a n d ı . Ekst-raktif alkillemede p H ' n ı n reaksiyona etkisini saptamak a m a c ı y l a konik d i p l i santrifüj t ü p ü n e 0 . 2 m l (125 µ g / m l ) barbitürat çözeltisi k o n d u , üzerine değişik p H larda hazırlanmış 0 . 4 m l 0 . 5 M T B A çözeltisi ilave edildi, 0 . 4 m l u y g u n p H d a fosfat t a m p o n u , 0 . 5 m l d i k l o r m e t a n ve 10 µl P F B B r ilavesinden sonra çalkalayıcı da 10 dakika çalkalandı. Üstten sulu faz alınıp d i k l o r m e t a n fazı a z o t a k ı m ı n d a u ç u r u l d u k t a n sonra kalıntı iç standart olarak 0 . 1 mg /ml tetrakozan v e y a hekzako-z a n taşıyan 0 . 5 ml n-hekhekzako-zanda 2 dakika çalkalanarak ç ö hekzako-z ü l d ü . Bar-bitüratlardan her biri i ç i n bu a ş a m a d a kullanılan iç standartlar t a b l o 4 ' d e gösterilmiştir. Bu ç ö z e l t i d e n 1 µl g a z kromatografa enjekte edile-rek barbitürat P F B türevlerinin iç standart p i k yüksekliklerine oranı b u l u n d u v e p H değerlerine bağlı olarak reaksiyon v e r i m değişimini
Barbitüratların Ekstraktif Alkillenmeleri ve G a z . 47
gösteren grafikler hazırlandı. H e r bir o r a n i ç i n ü ç ayrı d e n e m e y a p ı -larak o r t a l a m a değerler grafikte kullanıldı. T B A konsantrasyonunun reaksiyon hızına etkisini b u l m a k a m a c ı y l a ise; 0 . 0 1 M , 0 . 1 M v e 0 . 2 M o l m a k üzere ü ç ayrı konsantrasyonda T A B çözeltisi, her birinin p H sı 9 o l a c a k şekilde hazırlandıktan sonra belirtilen z a m a n aralıklarında ö l ç ü m l e r yapılarak reaksiyon hız eğrileri çizildi. Bu çalışmalarda kul-lanılan iç standartlar tablo 2 de gösterilmiştir.
K a l i b r a s y o n Eğrilerinin Ç i z i l m e s i : A l e v i y o n l a ş m a detek-törü ile çalışılırken, 0 . 2 m l , 5 0 - 2 5 0 µg/ml konsantrasyonlar arasında hazırlanmış barbitürat çözeltileri üzerine 0 . 4 m l T A B çözeltisi ( 0 . 5 M , p H 9 ) v e 0 . 4 m l fosfat t a m p o n u ( p H 9 ) ilavesinden sonra 0 . 5 ml d i k l o r m e t a n ve 10 µl P F B B r ilave edildi. Çalkalayıcıda 10 dakika karıştırıldı. Sulu faz ayrıldıktan sonra d i k l o r m e t a n fazı a z o t a k ı m ı n d a u ç u r u l d u , kalıntı 0 . 1 mg /ml n-tetrakozan v e y a n-hekzakozan taşıyan 0 . 5 ml n-hekzanda ç ö z ü l d ü . Bu ç ö z e l t i d e n 1 µl g a z k r o m a t o g r a f a en-jekte edilerek kalibrasyon eğrileri çizildi. Elektron yakalayan detek-törle ise; yukarıdaki işlem a y n e n yürütülmekle birlikte son a ş a m a d a E C D i ç i n o r t a m d a b u l u n m a s ı u y g u n o l m a y a n P F B B r ' ü n fazlasını o r t a m d a n uzaklaştırma a m a c ı y l a G Y L L E N H A A L v e arkadaşlarının (18) serbest y a ğ asitlerinin türevlenmesinde uygulandıkları y ö n t e m u y g u l a n d ı . 1-10 µg/ml arasındaki konsantrasyonlarda barbitürat ve her b i r i n d e 5 µg /ml T a b l o 5 de gösterilen iç standart taşıyan 0 . 2 ml lik çözeltilerde reaksiyon y ü r ü t ü l d ü . A n c a k reaksiyon b i t i m i n d e P F B B r ' ü n fazlasını o r t a m d a n uzaklaştırmak a m a c ı y l a 10 µl 0 . 5 M h o r d e n i n sülfat ilave edildi. H o r d e n i n ' i n PFBBr'le t ü m ü y l e reaksiyona girmesi i ç i n 15 dakika çalkalandı. Sulu faz ayrılıp, d i k l o r m e t a n fazı kuru b i r tüpe aktarılarak o d a sıcaklığında, a z o t a k ı m ı n d a u ç u r u l d u , kalıntı 2 ml h e p t a n d a ç ö z ü l d ü k t e n sonra 2 ml 0 . 1 M sülfürik asitle o r t a m d a n h o r d e n i n P F B türevini uzaklaştırmak a m a c ı y l a çalkalandı. Santrifüj edildikten sonra g a z kromatografa h e p t a n fazından 1 µl enjekte edildi.
SONUÇ ve TARTIŞMA
A l ı k o n m a İ n d e k s l e r i : Ü z e r i n d e çalıştığımız barbitürat P F B türevlerinin ve barbitüratların S E - 3 0 ve O V - 1 7 d u r u c u fazlarla ha-zırlanmış k o l o n l a r i ç i n a l ı k o n m a indeksleri tablo 1 de gösterilmiştir.
Tülin S Ö Y L E M E Z O Ğ L U
Analitik toksikoloji açısından yapılan ilaç tarama testlerinde, g a z kromatografisinde a l ı k o n m a indeksi sağlam b i r veri olmakta, rölatif a l ı k o n m a süresi hesaplarına g ö r e birbirine ç o k yakın a l ı k o n m a süresi olan v e y a elde standardı o l m a y a n m a d d e l e r i n tanınmasına d a o l a n a k vermektedir. G a z k r o m a t o g r a f i k t a n ı m a m a c ı y l a ilaçlar v e toksikolo-j i k ö n e m i o l a n m a d d e l e r i ç i n a l ı k o n m a indeksi listeleri yayınlanmıştır
(19, 2 0 ) . A l ı k o n m a indeksi hesaplarını, barbitüratların P F B türev-leri i ç i n karşılaştırılabilecek başka b i r veri o l m a d ı ğ ı n d a n , u y g u n k o l o n ve iç standart s e ç i m i n d e y a r a r l a n m a k a m a c ı y l a yaptık. T a b l o 1 de gö-rüleceği g i b i P F B türevlerinin a l ı k o n m a indeksleri seçilen k o l o n l a r d a barbitüratlarınkinden ve b i r b i r i n d e n yeterince farklıdır.
E k s t r a k t i f A l k i l l e m e K o ş u l l a r ı : K i m y a s a l m a d d e l e r i n P F B B r ' le ekstraktif alkillenmesi i ç i n reaksiyon koşulları ç o k farklı gösteril-miştir (9, 19, 2 1 , 22, 23, 2 4 ) . Bu çalışmaların bazılarında en fazla ve-r i m i n alındığı koşullave-r belive-rlenmiştive-r. Biz de bave-rbitüve-ratlave-rm P F B B ve-r ' le ekstraktif alkillenmesi k o n u s u n d a tek y a y ı n o l a n ve fenobarbitalle yapılmış çalışmada ( 9 ) , koşulların reaksiyona etkisi b e l i r t i l m e d i ğ i n d e n öncelikle v e r i m i n en fazla o l d u ğ u koşulları inceledik. T a b l o 2 de ve-rilen değerler reaksiyon süresi 10 dakika olarak t u t u l d u ğ u n d a ve nu-m u n e l e r h e nu-m e n gaz k r o nu-m a t o g r a f a v e r i l d i ğ i n d e b u l u n a n sonuçlardır. A n c a k 9 d a n yüksek p H larda çalışıldığında a y ı r m a işleminde b u süre aşılırsa v e r i m i n düştüğü görülmüştür. Bu n e d e n l e barbitüratların ç o ğ u i ç i n m a k s i m u m v e r i m i n alındığı pH o l a n 9 çalışmalarda sürekli uy-gulanmıştır. B u s o n u ç G Y L L E N H A A L v e arkadaşlarının (9) v e r d i ğ i p H d e ğ e r i n e uymaktadır. A n c a k aynı araştırıcıların uyguladığı g i b i o r t a m d a 0 . 1 M T B A b u l u n d u ğ u n d a barbitüratların ç o ğ u n u n ekstrak-tif alkillenmesi için sürenin ç o k u z a d ı ğ ı ve barbitalle, p e n t o b a r b i t a l i ç i n b u konsantrasyonda T B A ile çalışıldığında reaksiyon v e r i m i n i n ç o k düşük o l d u ğ u görülmüştür. Bu çalışmalara ait s o n u ç l a r T a b l o 3 de g ö r ü l m e k t e d i r T B A konsantrasyonunun düşük olması h a l i n d e ç o k u z u n sürede bile reaksiyonun t a m a m l a n a m a m a s ı n e d e n i olarak G Y L L E N H A A L ( 2 5 ) , P F B B r ' ü n b a z i k o r t a m d a belli bir süre s o n u n d a b o z u n a r a k p e n t a f l u o r o b e n z i l alkol ve bispentafluorobenzil etere dö-nüşmesini göstermiştir. O r t a m d a 0 . 2 M T B A b u l u n d u ğ u n d a reaksi-y o n 10 dakika i ç i n d e t a m a m l a n m a k t a d ı r . Bu n e d e n l e ekstraktif alkil-l e m e reaksiyonu p H 9 d a v e 0 . 2 M T B A varalkil-lığında yürütüalkil-lmüştür. R e a k s i y o n koşulları araştırılırken fazla sayıda değişkenin etkimemesi 48
Barbitüratların Ekstraktif Alkilienmeleri ve G a z . 49 açısından alev i y o n l a ş m a detektörü kullanılmıştır. Bu a ş a m a d a reaksi-y o n koşullarından etkilenmemeleri n e d e n i reaksi-y l e iç standart olarak al-kanlar seçilmiştir. D a h a sonraki a ş a m a d a elektron yakalayan detek-törle çalışıldığında ise h e r b i r barbitürat i ç i n a l ı k o n m a süresi u y g u n o l a n d i ğ e r b i r barbitürat iç standart olarak kullanılmıştır. D e t e k t ö r -lerin, barbitürat P F B türevleri i ç i n doğrusal d i n a m i k sınırı ( L D R ) araştırılmış, alev i y o n l a ş m a detektörü i ç i n 2 0 - 1 0 0 n g / µ l d e korelasyon katsayısı r: 0 . 9 8 1 - 0 . 9 9 9 arasında ve elektron y a k a l a y a n detektör i ç i n 0 . 1 1 n g / µ l korelasyon katsayısı r : 0 . 9 9 1 0 . 9 9 9 arasında b u l u n m u ş -tur. Bu a m a ç l a çizilen kalibrasyon d e n k l e m l e r i n e ait sonuçlar t a b l o 4 ve 5 d e d i r .
Ekstraktif alkilleme işlemi t a m a m l a n d ı k t a n sonra o r t a m d a reaksiyona g i r m e m i ş P F B B r d e b u l u n m a k t a d ı r . Özellikle E C D i ç i n z a -rarlı o l a n ve detektörü kirleterek duyarlığının düşmesine n e d e n o l a n bu reaktifi o r t a d a n uzaklaştırmak a m a c ı y l a g a z kromatografa enjekte e t m e d e n ö n c e u ç u r m a (26, 2 7 ) , t ü r e v l e m e d e n sonra ekstraksiyonla a y ı r m a ( 2 1 , 22) v e y a g a z k r o m a t o g r a f a eklenen b i r b ö l ü m d e u ç m a y ı sağlama (9) g i b i çeşitli y ö n t e m l e r geliştirilmiştir. Biz, k a y n a m a nokta-s ı 1 7 4 ° C o l a n P F B B r ' ü n t a m a m ı n ı n uçurulmanokta-sı ç o k z o r o l d u ğ u n d a n
( 9 ) , g a z k r o m a t o g r a f a eklenen u ç u r m a b ö l ü m ü alette değişiklik ge-rektirdiğinden ekstraksiyonla a y ı r m a işleminde ise barbitürat P F B türevlerinin b ü y ü k bir kısmının P F B r ile aynı fazda kalması n e d e n i y l e serbest y a ğ asitleri ile ilgili ç a l ı ş m a d a (18) kullanılan y ö n t e m i u y g u -ladık. Bu y ö n t e m l e P F B B r ' ü n fazlası h o r d e n i n l e reaksiyona sokulmak-ta ve h o r d e n i n P F B türevi asitli o r t a m d a sulu faza alınarak organik ç ö z ü c ü d e n ayrılmaktadır. Şekil 26 d a d a g ö r ü l e b i l e c e ğ i g i b i b u y ö n -t e m l e F B B F r ' ü n uzaklaş-tırılması ile elde edilen k r o m a -t o g r a m l a r ye-te- yete-r i n c e t e m i z o l m a k t a ve bayete-rbitüyete-rat tüyete-revleyete-riyle, kullanılan yete-reaktifleyete-rin piklerinin karışması söz konusu o l m a m a k t a d ı r .
Y ö n t e m i m i z l e barbitüratların P F B türevleri i ç i n saptanabilen en düşük duyarlık 1 p i k o g r a m olarak bulunmuştur. B u s o n u ç G Y L L E N H A A L v e arkadaşlarının (9) fenobarbital i ç i n v e r d i ğ i d e ğ e r e u y m a k -tadır.
Tablo 1: Alıkonma İndeksleri
SE - 30 kolon O V - 1 7 kolon
Barbitürat PFB türevi Barbitürat PFB türevi
Allobarbital 1600 2360 1915 2565 Aprobarbital 1620 2375 1935 2575 Barbital 1495 2275 1795 2475 Butalbital 1670 2390 1955 2570 Butobarbital 1660 2410 1970 2585 Fenobarbital 1950 2640 2405 2800 Hekzobarbital 1850 2245 2210 2530 Heptabarbital 2100 2745 2445 3025 Pentobarbital 1750 2470 2020 2665 Sekobarbital 1775 2495 2070 2695 Siklobarbital 1950 2685 2350 2935 Vinbarbital 1750 2500 2030 2700
Tablo 2: pH Değişiminin Ekstraktif Alkilleme Verimine Etkisi (Kolon SE-30)
Barbitürat İç Standart
Pik yükseklikleri oranı (Numune /Çç standa Barbitürat İç Standart p H 6 p H 8 p H 9 pH10 p H l l pH12 Allobarbital n-Tetrakozan 0.50 0.82 0.87 0.87 0.84 0.78 Aprobarbital n-Hekzakozan 1.41 1.82 2.00 2.10 2.00 1.89 Barbital n-Tetrakozan 0.60 1.00 1.29 1.29 1.30 1.30 Butalbital n-Hekzakozan 0.02 0.78 1.56 1.50 1.50 1.50 Butobarbital n-Hekzakozan 1.34 1.63 1.72 1.76 1.72 1.69 Fenobarbital n-Hekzakozan 0.48 0.62 0.64 0.63 0.63 0.63 Hekzobarbital n-Tetrakozan 0.40 0.70 0.73 0.71 0.70 0.70 Heptabarbital n-Hekzakozan 0.31 0.55 0.62 0.59 0.58 0.58 Pentobarbital n-Hekzakozan 0.02 0.76 1.56 1.50 1.50 1.46 Sekobarbital n-Hekzakozan 0.77 0.95 1.14 1.08 1.06 1.04 Siklobarbital n-Hekzakozan 0.52 0.66 0.79 0.78 0.75 0.73 Vinbarbital n-Hekzakozan 0.50 1.10 1.29 1.35 1.32 1.25
Tablo 3: TBA Konsantrasyonunun Barbitüratların Türevlerine hızına etkisi (Kolon SE-30)
Barbitürat
Pik yüksekliği oranı (Numune/İç standart) 0.01 M T B A 0.1 M TBA 0.2 M TBA
Barbitürat
Dakika Dakika Dakika
Barbitürat 10 20 60 120 10 20 60 120 10 20 60 120 Allobarbital 0.23 0.28 0.39 0.40 0.76 0.80 0.81 0.79 0.81 0.82 0.82 0.76 Aprobarbital 0.88 1.63 1.80 1.86 1.92 1.96 1.94 1.94 2.00 2.00 2.00 2.00 Barbital 0.05 0.11 0.14 0.20 0.80 0.83 0.84 0.76 1.28 1.30 1.30 1.30 Butalbital 0.85 1.03 1.25 1.25 1.10 1.23 1.37 1.30 1.40 1.42 1.42 1.38 Butobarbital 1.00 1.10 1.20 1.20 1.56 1.60 1.60 1.60 1.78 1.80 1.80 1.80 Fenobarbital 0.30 0.50 0.53 0.56 0.50 0.60 0.65 0.65 0.65 0.68 0.68 0.68 Hekzobarbital 0.68 0.72 0.73 0.73 0.70 0.75 0.75 0.76 0.76 0.76 0.76 0.76 Heptabarbital 0.35 0.48 0.52 0.53 0.50 0.58 0.60 0.61 0.60 0.63 0.63 0.63 Pentobarbital 0.99 0.09 1.28 1.28 1.13 1.24 1.36 1.38 1.56 1.60 1.60 1.58 Sekobarbital 0.63 0.87 0.96 0.96 0.88 1.00 1.06 1.07 1.10 1.13 1.13 1.13 Siklobarbital 0.40 0.65 0.70 0.71 0.64 0.73 0.78 0.78 0.78 0.80 0.80 0.80 Vinbarbital 0.67 0.76 0.94 0.96 1.36 1.38 1.38 1.38 1.38 1.39 1.39 1.39
Barbitüratların Ekstraktif Alkillenmeleri ve G a z . . . 51 Tablo 4: Barbiturat PFB Türevlerinin Alev İyonlaşma Detektörü ile Kalibrasyon
Denk-lemleri ve Korelasyon Katsayıları
Barbiturat İç standart Kalibrasyon denkle Korelasyon katsayısı Allobarbital n-Tetrakozan Y:0.020X-0.070 r:0.996
Aprobarbital n-Hekzakozan Y:0.034X-0.162 r:0.982 Barbital n-Tetrakozan Y:0.021X-0.088 r:0.995 Butalbital n-Heksakozan Y:0.020X-0.101 r:0.993 Butobarbital n-Hekzakozan Y:0.029X-0.235 r:0.984 Fenobarbital n-Hekzokozan Y:0.031X-0.059 r:0.992 Hekzobarbital n-Tetrakozan Y:0.016X-0.010 r:0.999 Heptabarbital n-Hekzakozan Y:0.013X-0.068 r:0.997 Pentobarbital n-Hekzakozan Y:0.026X-0.016 r:0.999 Sekobarbital n-Hekzakozan Y:0.020X-0.061 r:0.999 Siklobarbital n-Hekzakozan Y:0.015X-0.001 r:0.999 Vinbarbital n-Hekzakozan Y:0.025X-0.004 r:0.999
Tablo 5: Barbitürat PFB Türevlerinin Elektren Yakalayan Detektörle Kalibrasyon Denk-lemleri ve Korelasyon Katsayıları
Barbitürat İç standart Kalibrasyon denklemi Korelasyon katsayısı Allobarbital Butobarbital Y:1.85X-0.125 r:0.991
Aprobarbital Vinbarbital Y : 3 . 0 2 X - 0 . 0 5 0 r:0.999 Barbital Butobarbital Y.-2.13X-0.007 r:0.999 Butalbital Vinbarbital Y:1.82X-0.083 r:0.999 Butobarbital Vinbarbital Y : 2 . 3 9 X - 0 . 2 4 0 r:0.997 Fenobarbital Heptabarbital Y:2.79-X0.068 r:0.999 Hekzobarbital Butobarbital Y-.1.69X-0.028 r :0.998 Heptabarbital Siklobarbital Y:1.28X-0.009 r:0.997 Pentobarbital Butobarbital Y:1.44X-0.077 r:0.999 Sekobarbital Butobarbital Y:.0.95X-0.002 r:0.998 Siklobarbital Heptabarbital Y:3.10X-0.148 r:0.998 Vinbarbital Butobarbital Y:1.20X-0.008 r:0.999
Rd (Bilinmeyen) — Rd (Pz) Rl = 100n
Rd Pz+n) - Rd (Pz)
+ 100z
Şekil 2. Ekstraktif alkilleme işleminden sonra elde edilen boş kromatogram (Kolon: % 3 SE-30, Kolon sıcaklığı: 230°C, detektör; E C D , attenuation; 216, 1 µl numune). 52 Tülin S Ö Y L E M E Z O Ğ L U 4 d a k i k a
c m
8 6 4 2Barbitüratların Ekstraktif Alkillerimden ve Gaz. 53
Şekil 3. Barbital PFB türevi gaz kromatogramı ( K o l o n : % 3 SE-30, kolon sıcaklığı: 230'C, detektör: E C D , attenuation: 216, 1 µl numunede 100 pikogram barbital ve iç standart)
4 8 d a k i k a c m 8 6 4 2 Barbita l Butobarbita l İS
54 Tülin S Ö Y L E M E Z O Ğ L U
Şekil 4. Butalbital PFB türevi gaz kromatodramı (Kolon: % 3 SE-30, kolon sıcaklığı: 230 C, detektör: E C D , attemıation: 216, 1 µl numunede 100 pikogram butalbital ve iç standart)
4 8 12 d a k i k a c m 6 4 2 B u t a l b i t a l Vinbarbita l
İS
Şekil 5. Fenobarbital PFB türevi gaz kromatogramı (Kolon: % 3 SE-30, kolon sıcaklığı: 245'C, detektör: E C D , attenuation: 216, 1 µl numunede 100 pikogram fenobarbital ve iç
standart)
Barbitüratların Ekstraktif Alkillenmeleri ve G a z . . . 55
4 8 dakika
c m 12 10 8 6 42
Hekzobarbita l Butobarbita l İSŞekil 6. Hekzobarbital PFB türevi gaz kromatogramı (Kolon: % 3 SE-30, kolon sıcaklığı: 230'C, detektör: E C D , attenuation: 216, 1 µl numunede 100 pikogram hekzobarbital ve iç
standart) 56 Tülin S Ö Y L E M E Z O Ğ L U 4 8 12 dakika Fenobarbita l Heptabarbita l İS
cm
8 6 4 2Barbitüratların Ekstraktif Alkillenmeleri ve G a z . . . 57 LITERATÜR
1- Gee D.J., The Poisoned Patient the Role of the Laboratory. Ciba Foundation Sym-posium 26, Elsevier Excerpta Medica, Amsterdam (1974)
2- Hine C.H., Hall. F.B., Türkei, H.W., Clin. Toxicol., 1 71-80 (1968)
3- Gudzinowicz B.J., Gas Chromatographic Analysis of Drugs and Pesticides. Marcel Dekker Inc., New York (1967)
4- Pillai D.N. Dilli, S., J. Chromatogr., 220 253-274 (1981)
5- McCaUum N.K., Armstrong R.J. J. Chromatogr. 78 303-307 (1973) 6- Wilkinson, G.R., Anal Letters, 3 289-298 (1970)
7- Nicholson, J.D., The Analyst, 103 1-27 (1978) 8- Walle T., J. Chromatogr., 114 345-350 (1975)
9- Gyllenhaal, O., Brötell. H., Sandgren, B., J. Chromatogr., 122 471:477 (1976) 10- Brandström, A., Junggren, U., Acta Chem. Scand., 23 2204-2205 (1969)
11- Hulshoff, A., Forch, A. D., J. Chromatogr. 120 275-311 (1981) 12- Jonkman, J.H.G., Pharm. Weekbl. 110 649-655 (1975)
13- Vessman, J., Johansson, M., Magnusson, P., Strömberg, S., Anal. Chem. 49 1545-1549 (1977)
14- Mordgren, T., Sjöden, E.K. Acta Pharm. Suec., 15 241-254 (1978)
15- Jansson, S.O., Nordgren, T., Schill, G., Acta Pharm. Suec, 14 435-450 (1977) 16- Fagerlund, C, Hartvig, P., Lindstrom, B.J. Chromatogr., 168 107-116 (1979 1 17- Leach, H., Gas Chromatography. Isolation of Drugs. V. 2 Ed. Clarke, E.G.C., The
Pharmaceutical Press, London (1975
18- Gyllenhaal, O., Brötell H. Hartvig P. J. Chromatogr., 129 295-302 (1976) 19- Berninger, H. Möller, M.R., Arch. Toxicol., 37: 295-305 (1977)
20- Moffat, A.C., J. Chromatogr. 113 69-95 (1975)
21- Arbin, A., Edlund, P.O., Acta Pharm. Suec, 12 119-126 (1975)
22- Brötell. H., Ehrsson, H., Gyllenhaal, Q., J. Chromatogr., 78 293-301 (1973) 23- Cole, W.J., Parkhouse, J.Y.Y., J. Chromatogr., 136 409-416 (1977)
24- Grevig, J.E., Jonkman, J.H.G., Fiks, F., de Zeeuw, R., van Bork, L.E., Orie, N. G.M., J. Chromatogr., 142 611-619 (1977)
25- Gyllenhal. O., J, Chromatogr., 153 517-520 (1978)
26- Kaiser, D.G., Shaw, S.R., Vangiessen, G.J., J. Pharm. Sci. 63 567-570 (19SS) 27- Wickramasinghe, J.A.F., Morosowich, W., Hamlin, W.E., Shaw, W.E.,J.Pharm.
