Ankara Univ. Vet. Fak. Derg:
30 (2) : 228-233, 1983
ÇtFTLİK HAYVANLARI:\'DA:\ tZOLE EDiLEN ESCl-IERICHIA COL! SUŞLARı.
NI!'\ ÇEŞtTLI :'vIETAı. BiLEŞtKLERi!'\E DtRENÇ DURUl\IU VE R-I'LAZMIDLERt ÜZERL\"DE ÇALIŞMALAR
Ersİn İstanbulluoğlu
*
Müjgan İzgür**Studies on Resistance to Various Metal Compounds and R Plasmids in Esche-richia coli Isolated From Farm Animals.
Sum.m.ary: The mercury and silver resistance of 205 strains of Esc-herichia coli isolated from faecal specimens of healthy and infected farm ani-mals were determined. Resistance to mercu~y was found in 15.1
%
of the iso-lates. R plasmids carrying mercuıy resistanee were demonstrated in 64.5%
of the mercury-resistant strains of E. coli. 75%
of E.coli strains were found resistant to 0.10 mM AgNO 3.But, attemps to demonstrate R plasmids carr-.ving silver resistance failed.Özet: Normal ve hastalıklı çiftlik hayvanlarının dışkı örneklerinden izole edilen 205 Escherichia coli suşunun civa ve gümüş' e direnci incelenmiş ve
%
15.1'nin civqya dirençli olduğu saptanmıştır. Dirençli suşlardan%
64.5' nin aktarılahilir tip direnç özelliği (R TF- Faktör) taşıdıkları belirlen-miştir. Suşlardan%
75'inin 0.10 mM AgN03'a dirençli olduğu saptanmış, ancak bu suşlarda R-plazmid varlığını ortqya koymak için yapılan deneyler olumlu sonuç vermemiştir.Giriş
AntibiyotikIere karşı oluşan dirençliliğin yanısıra, R-plazmidler diye tanımlanan ekstra-kromozomal genetik elementler toksik ağır metal iyonları na karşı da dirençliliği sağlayan genleri taşımakta-dırlar. (1,4). Staplz.ylococeus aureus türlerinin yapısındaki penisilinaz plazmidlcri antiman, arsenik, bizmut, kadmiyum, kurşun, civa ve çinko bileşiklerine karşı da mikroorganizmanın direnç göstermesini sağlamaktadır. N-grubu streptokokların laktoz plazmidleri arsenik
• Doç.Dr. A.Ü. Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara-Türkiye .. •• Dr. med. vet. .-\.0. Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
ve kromium bileşiklerine karşı bakteriye direnç özelliği kazandırmak-tadırlar. Enterobakterilerin R-plazmidleri, ayni zamanda, arsenik, kobalt, civa, nikel, gümüş ve tellirium tuzlarına kaqı mikroorganiz-mayı dirençli kılan genleri yapılarında bulundurmaktadırlar( 4',5,7). Yine, Pseudomonas aerugi1losa suşlarının civa ve tellirium bileşiklerine karşı dirençliliği yapılarındaki plazmidler tarafından sağlanmaktadır (10).
Bu çalışmanın amacı, normal ve hastalıklı çiftlik hayvanlarının dışkılarından izole edilen E.coli suşlarının civa ve gümüş iyoniarına karşı dirençliliğini incelemek ve bu özelliğin ne oranda aktarılabilir plazmidler aracılığıyla sağlandığını saptamaktadır.
Materyal ve Metot
E.coli suşları: Çalışmada kullanılan 205 adet E.coli suşu 1980-1981 yılları arasında Tarım ve Orman Bakanlığı Çiftc1er Zootekni Araştırma Enstitüsü, Ma1ya D.Ü.Ç., E.B.K. Ankara Mezbahasın-daki sağlıklı koyunların (118 adet) dışkı örneklerinden ve A. Ü. Ve-teriner Fakültesi Bakteriyoloji teşhis laboratuvarı na gönderilen has-talıklı 66 adet tavuk, 23 adet sığır barsak içeriğinden izole edildi.
lzolo.s.yon ve identifikasyon: Steril eküvyonlar ile alınan örnekler-den MacConkey (Difco) agar üzerine ekimler yapıldı. 37 °C'de 18-24 saatlik inkubasyon süresi sonunda tipik laktoz olumlu görünümdeki ko1oni1erin identifikasyonu "Norveç üçlü tüp" yönteminden yararlanı-larak yapıldı.
Civa dirençlilik deneyleri: Testlerde civa bileşiği olarak HgCl3
kullanıldı. HgC13 distilc suda eritildikten sonra, eriyik membran
filt-rasyon yöntemi (Millipore-0.45 mikrometre) ile sterilizc edildi. Steril solusyondan nutrient agar (Difco) besi yerine belirli konsantrasyon-larda i1avc edi1di(7).
Gümüş dirençlilik testleri: Deneylerde gümüş bileşiği olarak AgNO 3
un 0.01 N asetik asit ile hazırlanmış 0.1 veya 1.0 M luk stok solusyon-larından, otoklavda sterilize edilip 50°C'ye kadar ılıtılan trypton maya ekstrakt besiyerleri (NaCl katılmamış) içine son konsantras-yonlar 0.05, 0.10, 0.25 ve 0.50 mI\-I olacak miktarlarda ilave edi1di(4).
M/C de,ğer/erinin belirlenmesi : MIC değer hesaplanmalarında kul-lanılan mikroorganizma suspansiyon1arı özetle aşağıda açıklanan şekilde hazırlandı. Trypton maya ekstrak tı (TYE) buyyonunda üre-tilen mikroorganizmalar Log üreme devresindeyken 1/10 oranında
230 E. İSTANBULLUOGLU-M. İZGÜR
sulandırıldı ve bu örneklerin çeşitli konsantrasyonlarından HgCl3 ve
AgNO 3 içeren nutrient agar (Difco) ve TYE agar besi yerlerine 0.0i ml miktarında ekimler yapıldı. Kontrololarak bileşiminde metal iyon-ları bulunmayan besi yerlerine ekiIdi ve tüm plaklar 36 cC de 24 saat inkubasyona bırakıldı.
Konjugasyon deneyleri: 12.5 mcg!ml HgCI3 ile 0.10 mM AgN0.ı'a
dirençli bulunan E.coli suşlarından nalidiksik asite duyarlı olanlar plazmid aktarım deneylerine alındı.
Alıcı suşlar ve test suşları nutrient buyyonlara ayrı ayrı ekilerek 24 saat 37°C de inkube edildiler. Daha sonra alıcı suştan 0.5 ml ve verici suştan 0.1 ml 5 ml lik tripticase soy broth (Difco)'a ekim yapıldı. 37°C de 18 saat inkubasyona bırakılan tüpler zaman zaman çalkala-narak havalandırılmaları sağlandı. İnkubasyon süresi sonunda, trans-konjugat mikroorganizmaları belirlemek için 12.5 mcg/ml HgCI.ı
-+-
30 mcgımı
nalidiksik asit içeren nutrient agar ve 0.10 mM AgNO 3+
30 mcg. (mL. nalidiksikasit içeren TYE agar besi yerlerine ekimler yapılarak 37°C'de i gece inkube edildi. Kontrololarak alıcı ve verici suşlar, metal tuzlarını tek tek ve nalidiksik asitle beraber içeren nutri-ent agar ve TYE agar besi yerlerine ekiIdiler.Alıcı suşların metal tuzları na dirençliliklerinin farklı konsantras-yonlarda olabileceği düşünülerek çeşitli alıcı suşlar (E.coli Rg488, E.coli Rg176, E.coli Kl2 Nal+lac- ve E.coli]53.2) deneyleı'in başlangı-cında dirençlilik testlerine tabi tutuldu ve tüm alıcı suşlar metal tuzlarına aynı konsantrasyonlarda duyarlı oldukları için, E.col( Kl2 Kal+lac - suşu konjugasyon deneylerinde kullanılmak üzere ter-cih edildi.
Bulgular
Şekil i ve Şekil 2'de Hg ve Ag'e dirençli E.coli suşlarının direnç-lilik özelliklerinin dağılımı gösterilmiştir.
İncelenen E.coli suşlarının %6.0'sı 25 mcg
ımı,
%9.1 i 12.5 mcgımı,
%38.2 si 6.25 mcgImI
ve % 50 si 3.ı
2 megımı
civaya di-rençli bulundu. Yapılan ön çalışmalar sonucunda 6.25 mcgımı
civa içeren plaklarda üreyen suşlarda plazmid aktarımı görülmediğinden konjugasyon deneylerineı
2.5 ve 25 mcgImI civa klorürlü ortamda üreyen 3ı
],'.coli suşu (%ı
5.1) dahil edildi. Konjugasyon deneyleri, sonucunda 20 suşun aktarılabilir tip direnç özelliğine (RTF-Faktör) sahip olduğu belirlendi.70
~ 60
~
50
«
ın
40
o:::
LL Z30
o
~ 20
-..Jo
N10
\16
3.12 6.25 12.5 25
50
MıC tmcg/mll
~ekil ı. HgCl, e dirençli E.coli suşlarınııı dağılımı.
Şekil 2'de görüldüğü üzere, gümüş dirençliliği bimodal bir dağı-lım göstermiştir. İncelenen suşlardan %2i i 0.05 mM ve % 75 i O.iO mM AgNO 3a direnç göstermişlerdir. Gümüşc karşı oluşan (O. iO
mM da) dirençliliğin plazmid aracılı.~ıyla sağlandığını ortaya koymak için çeşitli alıcı suşlar kullanılai'ak yapılan konjugasyon deneylerin-den olumlu sonuç alınamamıştır.
Tartışma ve Sonuç
Ağır metaller, bilhassa endüstri bölgelerinde, çevreyi kirleten ar-tıkların belli başlılanndandır. Toksik ağır metal bilqiklerinin, en-düstriyel artıklarda, yüzeysel sularda, n'ehir, göl ve deniz sediment-lerinde bulunduğu ç'eşit!i araştırmacılar tarafından ortaya konulmuş-tur (3,9). Son yıllarda ağır metallerin, çevrede (göl, nehir gibi), doğal ve yapay yollarla yapılan artık suların arındırılması işlemleri sırasın-da, bakterilcr tarafından biyolojik transformasyona uğratılarak tok-sik metal bileşiklerine dönüştürüldükleri de açıklanmıştır (2,6,iI). Ayrıca,. antibiyotik ve metal dirençliliği fenomenlerinin birbirleriyle ilişkisi olduğu bazı araştırıcılar tarafından iddia edilmektedir.
Kont-232 E. İSTANBULLUOGLU-M. İZGÜR
80
-70
~ 60
LI)~ 50
~~ 40
u.B
30
>-~20
....Jo
N10
-0.05
0.10
025
0.50
MIC(mM)
Şekil 2. !\g;\Jo, c dirençli EJali sıı~larınııı da,ğ"ılımı.
rolsüz olarak tedavi ve fizyolojik amaçlarla kullanılan
antibiyotikler-den ziyade çevreyi kirleten metal kontaminantlann, dirençli
bakteri-lerin seleksiyonuna neden olduğu ileri sürülmcktedir (7, 8).
Bu çalışmada, hüyük şehirlerin çevresinde kurulmuş olan tavuk
işletmelerinden alınan örneklerden izole edilen E.coli suşlarının civa
ve gümüş'e dirençlilik oranı çok daha fazla bulunmuştur.
Türki-yede endüstriyel kirlenmenin f.'1zla olduğu bölgelerdeki antibiyotik
ve metal dirençlilik ilişkisinin incelenmesi insan ve hayvan sağlığı
yönünden büyük yararlar sağlayacak nitelikte görülmektedir.
MeHugh ve ark.(l) ve Annear ve ark.(5) insan or~jinli
entero-bakterilerde görülen gümüş dirençlili.~inin aktarılabilir tipte
olma-dığmı bildirmektedirler. Hayvan ür~jinli E.coli suşlarında da aynı
özelliğin bulunduğu tarafimızdan saptanmıştır. Tilton ve Rosenberg
(I 2) besi yerlerinin ya pısımi<:ki bazı nıaddeler ile ısı, ışık gibi çevre
vitro koşulların nötralize edici etkisinin dirençli suşların seçimiyle, konjugasyon sonuçlarını ne derecede etkili olduğu incelenmesi gereken önemli bir noktadır. Nakahara ve ark. (7) hastahane olgularından izole ettikleri 338 E.coli suşunun dirençlilik özelliğini incelemişlcr v
%
58.6 oranında bir dirençliliğin varlığını saptamışlardır. Bu çalışmada ise. incelenen s!-lşlardan
%
i5.1 i civaya dirençli bulunmuştur. İki araştırma sonucu arasında görülen farklılık gelişmiş endüstri nedeniy-le Japonya'da artık olarak doğaya çok fazla miktarda metal bileşik-lerinin atılması ve bunların dirençli suşların seleksiyonuna neden olması gerçeğine bağlanabilir.Literatür
1- Annear, D.I., Mee, B.J. and Bailey, M. (19jo): inslabilily mıd liııkage oL sihcr resis-lance, laclosefermenıalion and cnlonv slmriı'l" i,ı Eıılerobacler cloacaefrom btlm u;otlnds..1.Clin. Patlıo!., 29: 441-'443.
2-- Barth. E.F., Ettinger, M.B., Salotto, B.V. and McDermott G.N. (Ig05) : Summaı)'
reporı on ıh, iffccl of heavy melals niL Ihe biolo.~icnllımlmenl process. j.'Vaıer PoJlııt. Canırol
Fed., :n:86-g6.
3- Farmer, J.G., Swan, D.S. and Baxter, M.S. ('980): Records and sonrces of mdal jlOlluıanls iııa daled Loch Lomond sedimenis core. Sei. Total Em'iron., ı6: 1::11 14j.
4-- Hendry, A.T. and Stewart, 1.0. (I 9ig): Silva resisImıi l~'nlcrobacteriaceaefrom Iwspilal palimls. CanadJ .Mierobio!., 25: 915-92 ı.
5- McHugh, G.L., Moellering, R.C., Hopkins, C.C.and Swartz M.N (I 9j5): Sal-mOT/ellaIy/ıhimtlriımı '-esülanl In sil"", nitral, chlornmjıhel!icol and wıı/ıicilliıı. Laneeı, i: 235-239.
6- Morozzi, G.and Genci, G. (I 9j8): Comparison of Ihe loxicilics of SOıılemelals and ıheir lelracywıide comjılexes on ıi" res/ıiraliVlI0/ tlo,/(/ıclimaled acıimled slruigcs. Zh!.Uakt.Hyg., L AbI.Orig.B, 10j: 4j8-488.
j- Nakahara, H., Ishikawa, T.,Srai, Y., Kondo, I., Kozukue, H.and Mit&uhashi,
S.(19ii): A1ercıııy rcsislance and R jılasmids in /Cscherichia wli üolaled from clinical lesions
iıı Japan. Anıirnierob. Agent and Clıcmoılı .. iI: 999-1003.
8- Pohl, P. (19ii): Relaıionship bclwecıı aıılibinlic feediııg in mıimals and emergence q{ baclerial resislaııce iT/ man . .J.Antirnicrob. Clıernotlı., 3: fij-j2.
14:
Summers, A.O. and Jacoby, G.A. (I 9j8): I'laJmid delermiııed resiJlaııce lo bol'OlIaııd cll,-omiııııı compowıds iıı l'seudomonas aerııgiıınJa. Antimicrob. Agen! Chernoth. 13: G3j-.
°4°.
Summers, A.O. and Silver, S.(19j8): Microbiallrnrıifomıaliorı of mclals. Ann.Rev.
Microbio!.. ::12: 037- Gj2.
Tilton, R.C. and Rosenberg, B. (I 9j8): Reı'e.sal of ıhe silver inllibition of microorganisms b)' agar. AppI.Envil"On.l\licrobiol., 35:,ı ı 16-ı120.
Ya.:ı 29.i2.i982 giiııii altlllJ/l~ln.
9- Shepard, B.K., McIntosh, A.W., Atchison, G.J.and Nelson, A.P. (!98o): Aspecls
nf ıhe aguaıic chemist~v nf cadmiııiil aııd zinc' iıı herı<:vmda i coıılamiııaled lake. '''aı er Res.,
1061 -1066.
11-