Kolestaz Sonrası Testiste Oluşan Oksidatif Strese Karşı
Resveratrolün Etkisi
The Effect Of Resveratrol Agaınst Oxıdatıve Testıs Stress In Cholestasıs
Cengiz Ara*, Mehmet Yılmaz** , Vedat Sağır***, Hale Kırımlıoğlu****, Aysun Bay Karabulut*****, Sezai Yılmaz****** ÖZET
Amaç: Sıçanlarda kronik biliyer tıkanmanın
meydana getirdiği testis hasarında resveratrolün koruyucu etkisini araştırmayı amaçladık.
Metot: Safra kanalı 28 gün boyunca bağlanarak sekonder biliyer siroz oluşturuldu. Swiss-Albino sıçanlar üç gruba ayrıldı. Grup 1: Sham (n:7). Grup 2: Safra kanalı bağlanan grup (n:7), Grup 3: Safra kanalı bağlanan + resveratrol verilen grup (n:7). Grup 3’te 10 mg/kg resveratrol intraperitoneal yolla 28 gün boyunca verildi.
Bulgular: Testis hasarı ve kolestaz biyokimyasal ve patolojik bulgularla tespit edildi. Resveratrol verilen sıçanlarda nitrik oksit ve malondialdehit düzeyleri safra kanalı bağlanan gruptan anlamlı olarak daha düşüktü (p<0.002). Resveratrol verilen gruptaki GSH düzeyleri safra kanalı bağlanan gruba göre oldukça yüksekti (p<0.004).
Sonuçlar: Bu çalışma, safra kanalı bağlanan sıçanlarda intraperitoneal olarak resveratrol verilmesinin antioksidan düzeyini arttırdığını ve oksidatif testis hasarını azalttığını göstermiştir. Resveratrolün bu etkisi biliyer sirozlu hastalarda oksidatif testis hasarından korunmak için faydalı olabilir.
Anahtar Kelimeler: Safra kanalı bağlanması, testis, resveratrol, malondialdehit, redukte glutatyon, nitrik oksit.
SUMMARY
Background / aims: We investigated the
protective role of resveratrol on damage in rat testis induced by chronic biliary obstruction.
Material and Methods: Secondary biliary
cirrhosis was induced by bile duct ligation for 28 days. Swiss albino rats were divided into 3 groups. Group 1: Sham (n:7 ). Group 2: Bile duct ligation (n:7), Group 3: Bile duct ligation plus resveratrol (n: 7). Group 3 received 10 mg/kg dose of resveratrol intraperitoneally daily for 28 days.
Results: Testis damage and cholestasis were
determined by the biochemical and the pathologic examination. In the resveratrol treated rats, tissue levels of malondialdehyde and nitric oxide were significantly lower than those of the bile duct ligation group (p<0.002). The levels of GSH in the resveratrol treated rats were significantly higher than those of the bile duct ligation group (p<0.004).
Conclusion: The present study demonstrates
that intraperitoneal administration of resveratrol in bile duct ligated rats maintains antioxidant defenses and it reduces oxidative testis damage. This effect of resveratrol may be useful to preserve oxidative testis stress in patients with biliary cirrhosis.
Key words: Bile duct ligation, testis, resveratrol,
malondialdehyde, reduced glutathione, nitric oxide
.
C.Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 29 (3): 84-89, 2007
*Doç. Dr, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilimdalı **Doç. Dr, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilimdalı ***Op. Dr, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilimdalı ****Yrd. Doç. Dr, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilimdalı *****Doç. Dr, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilimdalı ******Prof. Dr, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilimdalı
GİRİŞ
Reaktif oksijen radikalleri sperm fonksiyonlarında önemli araçlardır (1). Süperoksit dismutaz (SOD) etkisiyle hidrojen peroksitten yapılan süperoksit anyon, spermatozoada oluşan önemli bir reaktif oksijen radikalidir. Spermatozoalar ayrıca, seminal plazmadan elde ettikleri demir ve bakır iyonlarıyla Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidroksi radikalleri oluştururlar. Hidrojen peroksit, insan spermatozoası için süperoksit anyonundan daha sitotoksiktir (2). Lipit peroksidasyonuyla oluşan indirgenmiş oksijene duyarlı spermatozoa membranı, doymamış yağ asitlerinden zengindir (3). Lipit peroksidasyonu membran lipitlerinin yıkımı ve çoğu zararlı olan endoperoksit ve aldehit yapımıyla sonuçlanır (4).
Sirotik sıçan testisi, spermatogenezi, maturasyonu ve fertilizasyonu etkileyen anormal oksidatif strese maruz kalmıştır (5,6).
Resveratrol (3, 5, 4’-trans-trihydroxystilbene) üzüm ve kırmızı şarapta bulunan doğal antioksidan, antikarsinojenik ve antiinflamatuar etkili bir maddedir (7,8,9). Resveratrol antioksidan özelliklere sahip olmasına rağmen deneysel biliyer sirozlu sıçanların testisine olan etkileri araştırılmamıştır.
Bu çalışmanın amacı, sıçanlarda deneysel safra yolu tıkanması sonucu oluşan oksidatif strese karşı resveratrol verilmesinin testis dokusunda koruyucu olup olmadığını değerlendirmektir.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çalışmaya ağırlıkları 300-350 gr arasında, 3 aylık, erkek, toplam 21 adet Swiss-Albino sıçan dahil edildi. Sıçanlar Fırat Üniversitesi hayvan laboratuvarından alındı. Çalışma İnönü Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylandı. Sıçanlar paslanmaz çelik kafeslerde su ve yiyecek serbest bırakılarak 14 gün tutuldu. Cerrahiden 8 saat önce yiyecek kesildi ancak su almaları kısıtlanmadı. Laboratuvarda ısı ve nem kontrolü yapıldı ve laboratuar ortamı, sıçanlar 12 saat gündüz 12 saat gece tutulacak şekilde ayarlandı.Tüm cerrahi işlemlerde 50 mg/kg ketamine ve 10 mg/kg xylazine HCl ile anestezi uygulandı.
Toplam 21 sıçan 3 gruba ayrıldı: Grup1: Sham (n=7)
Grup2: Safra kanalı bağlanan grup (SKBG) (n=7) Grup3: SKBG+resveratrol (n=7)
Sham gruba sadece laparotomi yapıldı. Sekonder biliyer siroz safra yolunun çift bağlanması ve kesilmesiyle sağlandı (10). Karın uygun dikiş materyali kullanılarak kapatıldı. Tüm sıçanlara cerrahiden sonra aynı şartlar sağlandı. Resveratrol grubuna antioksidan etkinliği iyi olan 10 mg/kg (11) resveratrol (Sigma Chemicals, USA) 28 gün boyunca intraperitoneal olarak verildi. Diurnal etkilerden kaynaklanan komplikasyonlardan kaçınmak için sıçanların tümü günün aynı saatlerinde sakrifiye edildi. Kan örnekleri vena cava inferiordan alındı. Daha sonra hızlı bir şekilde karaciğer ve testis çıkartıldı. Karaciğerin bir kısmı histolojik değerlendirme için formalinde muhafaza edildi.
BİYOKİMYASAL DEĞERLENDİRME
Hepatik fonksiyonları değerlendirmek için plazmada total bilirubin, aspartat amino transferaz ve alanin amino transferaz aktiviteleri tayin edildi (Olympus Diagnostica GmBH, Ireland). Testis dokusunun tamamı homojenize edildi ve homojenatlardaki malondialdehid (MDA) içeriği spektrofotometrik olarak belirlendi (12). Lipit peroksidasyon miktarı lipit peroksidasyonunun reaktif maddesi tiobarbiturik asit olarak ölçüldü ve nmol/gr doku olarak verildi.
Doku nitrit (NO2-) ve nitrat (NO3-) düzeyleri nitrik
oksit (NO) yapımının değerlendirilmesinde kullanıldığından , stabil NO oksidatif metabolitlerinin konsantrasyonları ölçüldü. NO2- ve NO3- niceliği,
naftiletilendiamin ve sulfanildiamidin karışımı ile NO2- reaksiyonu tarafından 545 nm da güçlü bir
absorbans olan Griess reaksiyonuna dayanır (13). Sonuçlar umol/gr doku olarak ifade edildi.
Glutathione (GSH) düzeyleri Elman’nın metotuna dayanan spektrofotometrik metotla belirlendi (14). Bulgular nmol/gr doku olarak ifade edildi.
HİSTOPATOLOJİK DEĞERLENDİRME
Karaciğer dokusu hematoksilen-eosin ve masson trikrom ile boyandı. Histolojik değişiklikler ışık mikroskobu altında gruplar hakkında bilgisi olmayan patolog tarafından değerlendirildi. Nekroz ve inflamasyonun değerlendirilmesi için İshak ve ark’nın tarif ettiği skala kullanıldı (15).
İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME
İstatistiksel değerlendirme için SPSS 10.0 versiyonu kullanıldı. Gruplar kendi içinde Mann-Whitney U testi ile değerlendirildi. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi, p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
MDA, GSH ve NO düzeyleri Tablo 1’de gösterilmiştir.
Tablo 1. Sham, SKB ve SKB+resveratrol verilen
sıçanlarda testis te GSH, NO ve MDA düzeyleri.
Gruplar GSH (nmol/g doku) NO (umol/g doku) MDA (nmol/g doku) 1.Sham 4.20 ± 0.18 169.64±1 2.70 168.75± 10.66 2.SKB 3.58 ±0.40 292.14 ± 22.70 298.74 ± 8.03 3.SKB+ Resveratrol 4.59 ± 0.43 182.07 ± 11.38 181.48± 11.92 p değeri 2 veya 3 0.004 0.002 0.002
Not: Veriler ortalama ± standard sapma olarak
verildi. Kısaltmalar: GSH: Redükte glutathione, NO: Nitrik oksit, MDA: Malon dialdehid, SKB: Safra kanalı bağlanması.
p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi
Resveratrol verilen sıçanlarda MDA ve NO düzeyleri safra kanalı bağlanan gruptan anlamlı olarak daha düşük bulundu (p<0.002). Resveratrol verilen sıçanlarda GSH düzeyleri safra kanalı bağlanan gruba göre anlamlı derecede yüksekti (p<0.004).
Safra kanalı bağlanan sıçanlarda total bilirubin, AST ve ALT düzeyleri (sırasıyla 2.7 ± 0.7, 53.6 ± 18.1, 140.5 ± 12.3) sham grubuna göre daha yüksekti (sırasıyla p<0.193, p < 0.001, p<0.017) (Tablo 2).
Tablo 2. Gruplarda plazma total bilirubin, AST,
ALT değerleri.
AST: aspartate aminotransferaz ALT: alanine aminotransferaz
*p<.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi
Sham grubunda hafif portal inflamasyon tek histopatolojik değişiklikti. Duktal proliferasyon ve fibrosis yoktu. Safra kanalı bağlanan ratlarda inkomplet nodül formasyonu ile safra kanalı proliferasyonu ve hafiften ortaya kadar portal lenfatik inflamasyon tespit edildi (skor 3,4) (resim 1).
TARTIŞMA
Bu çalışmada sekonder biliyer sirozun sıçan modelinde testis hasarına resveratrolün etkisi araştırıldı. Safra kanalı bağlanmasından sonra biliyer siroz oluşumu patolojik incelemeyle ortaya konuldu. Bulgular resveratrolün intraperitonel olarak günlük 10 mg/kg dozunda verilmesinin oksidatif stresi önemli derecede azalttığını göstermektedir. Birçok klinik çalışma aşırı reaktif oksijen radikallerinin yapımı ile erkek infertilitesi arasında negatif ilişki olduğunu göstermiştir (16,17). Resveratrol, -OH, oksijen ve peroksi radikalleri ve muhtemelen peroksinitrit anyonlarını etkisizleştiren güçlü bir antioksidandır. Bu etkileri birçok çalışmada (11,18) gösterilmiş olmasına rağmen, safra kanalı bağlanmasından sonra oluşan ekstrahepatik kolestazın neden olduğu testis hasarı üzerine olan koruyucu etkileri araştırılmamıştır.
GSH, lipit hidroperoksidaz ve hidrojen peroksitin eliminasyonunda katkıda bulunan glutatyon peroksidazın (selenyum bağımlı ve bağımsız) kofaktörü olarak oksidatif strese karşı defans mekanizmasında önemli bir rol oynar (19,20). Bu çalışmada safra kanalı bağlanan grupta GSH doku düzeyleri resveratrol verilen sıçanlara oranla anlamlı derecede daha düşüktü. SKB grubun testis
Gruplar Total
bilirubin (mg/dl)
AST (U/L) ALT (U/L) 1.Sham 1.8 ± 0.2 39 ± 4 96 ± 4 2.Safra kanalı bağlanan 2.7 ± 0.7 53 ± 18 140 ± 12 3.Resveratrol 2.3 ± 0.3 45 ± 13 110 ± 9 p değeri 1 veya 2 0.017 0.193 0.001
dokusunda GSH düzeylerindeki düşme daha önce Abul ve ark’nın yapmış olduğu çalışmayla uyumluydu (5). Diğer bir deyişle, resveratrol verilen sıçanlarda GSH düzeylerindeki önemli artışın nedeni resveratrolün oksidatif stres sırasında GSH’nın idamesinde rol oynayan γ-glutamil sistein sentetaz aktivitesini arttırmasına bağlıdır (21). Resveratrol verilen sıçanlardaki GSH düzeylerindeki artış onun antioksidan ve serbest radikalleri bağlama etkisine bağlı olabilir. GSH daki bu artış testis dokusunun oksidatif hasara karşı resveratrol tarafından daha iyi korunduğunu gösterir. Doku GSH düzeyinin azalması da oksidatif stres tarafından oluşturulan hücresel hasarı arttırır. Tsai ve ark (22) SKB sıçanlarda lipit peroksidasyonuna neden olan güçlü hidroksi radikal (-OH) oluştuğunu ve bu radikalin artan yapımının tıkanma sarılığına bağlı karaciğer hasarında anahtar rol oynadığını göstermiştir. Bu bulgular benzer metabolik hasarın SKB’sının bir sonucu olarak testiste görülebileceğini göstermektedir. Lipit peroksidasyonu MDA yapımıyla değerlendirildi. Çoğu dokuda MDA çoklu doymamış yağ asitlerinin peroksidatif yıkımı sonucu oluşur. Bu yüzden MDA miktarının ölçümü lipit peroksidasyon ve oksidatif stresin derecesinin tayinini sağlar (23).
Bu çalışmada SKBG’un MDA düzeyleri resveratrol verilen gruba göre anlamlı derecede yüksekti. Resveratrol verilen sıçanlarda MDA düzeylerinin azalması resveratrolün serbest radikalden koruyucu ve antioksidan etkilerine bağlı olabilir (24). Resveratrol hücre membranını koruyarak canlı hücrelerde oksidatif stresin zararlı etkilerini azaltır. Sun ve ark. (25) yapmış oldukları bir çalışmada resveratrolün, peroksidatif stres ve lipit peroksidasyonu sonucu oluşan hücre ölümüne karşı hücreleri koruduğunu göstermiştir.
NO, nitrik oksit sentaz enzimi etkisiyle L-argininden yapılır. Damar düz kaslarını gevşetici, nörotransmitter ve sitotoksik etkilere sahiptir (26). Endotoksin , interlökin 6 ve tümör nekroz faktör gibi sitokinler (27) NO’in endojen stimülatörleridir. Bu
çalışmada SKB+resveratrol grubunda NO düzeyleri SKB gruba göre anlamlı derecede düşüktü. Böylece bu maddelerin SKB grupta artan konsantrasyonları NO sentezinin artmasından sorumlu olabileceğini söyleyebiliriz. Resveratrol verilen gruptaki düşük NO düzeyleri NO, interlökin-6 ve tümör nekroz faktör alfa yapımının resveratrol tarafından baskılanmasına bağlı olabilir (28,29,30). Sonuç olarak, bu çalışmada sıçanlara intraperitonel resveratrol verilmesinin antioksidan etkinin idamesini sağladığı ve SKB sıçanlarda testiste oksidatif hasarı azalttığı gösterilmiştir. Resveratrolün bu etkisi biliyer sirozlu hastalarda testisi korumak için faydalı olabilir.
KAYNAKLAR
1. De Lamirande E, Gagnon C. Impact of reactive oxygen species on spermatozoa: a balancing act between beneficial and detrimental effects. Hum Reprod 1995; 1:15-21.
2. Aitken RJ, Buckingham D, Harkiss D. Use of a xanthine oxidase free radical generating system to investigate the cytotoxic effects of reactive oxygen species on human spermatozoa. J Reprod Fertil 1993; 97: 441-50.
3. Sikka SC. Oxidative stress and role of antioxidants in normal and abnormal sperm function. Front Biosci 1996; 1: 78-86.
4. Rosenblum ER, Gavaler JS, Van Thiel DH. Lipid peroxidation: a mechanism for alcohol-induced testicular injury. Free Radic Biol Med 1989; 7: 569-77.
5. Abul HT, Mathew TC, Abul F, Al-Sayer H, Dashti HM. Antioxidant enzyme level in the testes of cirrhotic rats. Nutrition 2002; 18: 56-59.
6. Ni DS, Wang TC. Action of nitric oxide on testicular dysfunction in cirrhotic rats. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2002; 10:294-96. Abstract.
7. Sgambato A, Ardito R, Faraglia B, Boninsegna A, Wolf FI, Cittadini A. Resveratrol, a natural phenolic compound, inhibits cell proliferation and prevents oxidative DNA damage. Mutat Res 2001; 496: 171-80.
8. Surh YJ, Hurh YJ, Kang JY, Lee E, Kong G, Lee SJ. Resveratrol, an antioxidant present in red wine, induces apoptosis in human promyelocytic
leukemia (HL-60) cells. Cancer Lett 1999; 140:1-10.
9. Burkitt MJ, Duncan J. Effects of trans-resveratrol on copper-dependent hydroxyl-radical formation and DNA damage: evidence for hydroxyl-radical scavenging and a novel, glutathione-sparing mechanism of action. Arch Biochem Biophys 2000; 381: 253-63.
10. Pastor A, Collado PS, Almar M, Gonzalez-Gallego J. Microsomal function in biliary
obstructed rats: effects of
S-adenosylmethionine. J Hepatol 1996 ;24: 353-59.
11. Hascalik S, Celik O, Turkoz Y, Hascalik M, Cigremis Y, Mizrak B, Yologlu S. Resveratrol, a red wine constituent polyphenol, protects from ischemia-reperfusion damage of the ovaries. Gynecol Obstet Invest 2004; 57: 218-23. 12. Mihara M, Uchiyama M. Determination of
malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem 1978; 86: 271-78.
13. Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium- reduction method. Clin Chem 1990; 36: 1440-43.
14. Sahna E, Parlakpinar H, Ozturk F, Cigremis Y, Acet A. The protective effects of physiological and pharmacological concentrations of melatonin on renal ischemia-reperfusion injury in rats. Urol Res 2003; 31: 188-93.
15. Ishak K, Baptista A, Bianchi L, Callea F, De Groote J, Gudat F, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995: 22: 696-699.
16. Iwasaki A, Gagnon C. Formation of reactive oxygen species in spermatozoa of infertile patients. Fertil Steril 1992; 57: 409-16.
17. D’ Agata R, Vicari E, Moncada ML, et al. Generation of reactive oxygen species in subgroups of infertile man. Int J Androl 1990; 13: 344-51.
18. Kiziltepe U, Turan NN, Han U, Ulus AT, Akar F. Resveratrol, a red wine polyphenol, protects spinal cord from ischemia-reperfusion injury. J Vasc Surg 2004 ; 40: 138-45.
19. Rushmore TH, Pickett CB. Glutathione S-transferases, structure, regulation, and
therapeutic implications. J Biol Chem 1993; 268: 11475-11478.
20. Spitz DR, Sullivan SJ, Malcolm RR, Roberts RJ. Glutathione dependent metabolism and detoxification of 4-hydroxy-2-nonenal. Free Radic Biol Med 1991; 11: 415-23.
21. Sekhar KR, Spitz DR, Harris S, Nguyen TT, Meredith MJ, Holt JT, et al. Redox-sensitive interaction between KIAA0132 and Nrf2 mediates indomethacin-induced expression of gamma-glutamylcysteine synthetase. Free Radic Biol Med 2002; 32: 650-62.
22. Tsai LY, Lee KT, Liu TZ. Evidence for accelerated generation of hydroxyl radicals in experimental obstructive jaundice of rats. Free Radic Biol Med 1998; 24: 732-7.
23. Halliwell B, Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am J Clin Nutr 1993; 57: 715S-724S.
24. Jang DS, Kang BS, Ryu SY, Chang IM, Min KR, Kim Y. Inhibitory effects of resveratrol analogs on unopsonized zymosan-induced oxygen radical production. Biochem Pharmacol 1999; 57: 705-12.
25. Sun AY, Chen YM, James-Kracke M, Wixom P, Cheng Y. Ethanol-induced cell death by lipid peroxidation in PC12 cells. Neurochem Res 1997; 22: 1187-92.
26. Kannan MS, Guiang S, Johnson DE. Nitric oxide: biological role and clinical uses. Indian J Pediatr 1998; 65: 333-45.
27. Curran RD, Billiar TR, Stuehr DJ, Ochoa JB, Harbrecht BG, Flint SG, Simmons RL. Multiple cytokines are required to induce hepatocyte nitric oxide production and inhibit total protein synthesis. Ann Surg 1990; 212: 462-71. 28. Cho DI, Koo NY, Chung WJ, Kim TS, Ryu SY,
Im SY, Kim KM. Effects of resveratrol-related hydroxystilbenes on the nitric oxide production in macrophage cells: structural requirements and mechanism of action. Life Sci 2002; 71: 2071-82.
29. Zhong M, Cheng GF, Wang WJ, Guo Y, Zhu XY, Zhang JT. Inhibitory effect of resveratrol on interleukin 6 release by stimulated peritoneal macrophages of mice. Phytomedicine 1999; 6: 79-84.
30. Bertelli AA, Baccalini R, Battaglia E, Falchi M, Ferrero ME. Resveratrol inhibits TNF alpha-induced endothelial cell activation. Therapie 2001; 56: 613-6
.
Yazışma Adresi :
Doç.Dr. Cengiz Ara
İnönü Üniversitesi Turgut Özal Tıp Merkezi Genel Cerrahi Anabilimdalı Malatya, Türkiye Tel: 0 422 3410660/3710 Fax: 0 422 3410728 E-mail: cara@inonu.edu.tr
