• Sonuç bulunamadı

Bakteriyemi etkeni gram negatif bakterilerin ve direnç genlerinin hızlı tanımlanmasında mikroarray ve lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF MS yöntemlerinin karşılaştırılması

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Bakteriyemi etkeni gram negatif bakterilerin ve direnç genlerinin hızlı tanımlanmasında mikroarray ve lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF MS yöntemlerinin karşılaştırılması"

Copied!
56
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

I

T.C.

EGE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ

TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Prof. Dr. Rüçhan Sertöz

BAKTERİYEMİ ETKENİ GRAM NEGATİF BAKTERİLERİN VE

DİRENÇ GENLERİNİN HIZLI TANIMLANMASINDA MİKROARRAY

VE LİZİS FİLTRASYON SONRASI MALDI TOF MS

YÖNTEMLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI

UZMANLIK TEZİ

Dr. Mehmet Soylu

TEZ DANIŞMANI

Prof. Dr. Alper Tünger

İZMİR

2016

(2)

II

ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR

Tez çalışmamda yardımı, anlayışı ve desteklerinden dolayı Sayın Prof. Dr. Alper Tünger’e ve bana her yönden harika bir asistanlık süreci yaşatan, bilgileri ile yolumu aydınlatan anabilim dalımızda görev yapan çok değerli tüm hocalarıma, istatistiksel konulardaki desteklerinden dolayı Prof. Dr. Raika Durusoy ve Dr. Orhun Mut’a, asistanlık sürecimin verimli geçmesine olan desteklerinden dolayı bölümümüzdeki tüm asistan arkadaşlarım, teknisyenlerimiz ve yardımcı personelimize, önce erdemli bir insan sonra da iyi bir hekim olmayı öğütleyen anne babama ve son olarak hayatıma girdikleri andan bu yana hayatımı güzelleştiren, bir saniye bile kesmedikleri sonsuz destek ve sabırlarıyla değerli eşim Nur Soylu ve canım oğlum Emre Soylu’ya teşekkürlerimi bir borç bilirim.

(3)

III

ÖZET

Bakteriyemi etkeni Gram negatif bakterilerin ve direnç genlerinin hızlı tanımlanmasında mikroarray ve lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF MS yöntemlerinin karşılaştırılması

Giriş ve Amaç: Kanda bakteri bulunması bakteriyemi olarak ifade edilirken, immünolojik mekanizmaların da olaya katılmasıyla beliren tablo sepsis olarak tanımlanır. Sepsis olgularında yanlış antimikrobiyal tedavi alan veya tedavi almayan olgularda ölüm oranları kaybedilen her saat başına artış göstermektedir. Bu çalışmada, etkenin konvansiyonel kültür yöntemine oranla daha hızlı tanımlanabilmesi amacıyla konvansiyonel kan kültürü/MALDI TOF yöntemi ile lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF MS ve mikroarray yönteminin karşılaştırılması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem: Kasım 2015-Şubat 2016 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi erişkin yoğun bakım ünitelerinde izlenen hastalardan alınan kan örneklerindeki tür düzeyinde tanımlanmış olan 39 gram negatif etken Nanosphere Verigene System BC-GN mikroarray ve eş zamanlı lizis filtrasyon işlemi uygulanıp, ardından Vitek MS MALDI TOF sistemi ile çalışıldı. Bakteri kolonisinden yapılan MALDI TOF tür düzeyinde tanımlama ile lizis filtrasyon sonrası uygulanan MALDI TOF ve mikroarray test yöntemlerinin sonuçları karşılaştırıldı. İstatistikler analiz yöntemi olarak Cohen’in Kappa katsayısı ile SPSS 18.0 kullanılarak gerçekleştirildi.

Bulgular: Çalışmaya alınan kan örneklerinin kan kültürü cihazındaki pozitif sinyal süreleri en kısa yedi saat 55 dakika, en uzun 31 saat 22 dakika, ortalama pozitiflik süresi 12 saat 55 dakika olarak belirlendi. Kültür sonrası MALDI TOF identifikasyonu ile lizis filtrasyon sonrası uygulanan MALDI TOF identifikasyonun duyarlılığı %82 (32/39), mikroarray yönteminin ise duyarlılığı %87,1 olarak hesaplandı. Lizis filtrasyon sonrası uygulanan MALDI TOF ile mikroarray yöntemlerinin birbirleri ile benzerliği %79,4 (31/39), her üç yöntemin birlikte tutarlı sonuç verdiği örneklerin oranı ise %76,9 (30/39) olarak hesaplandı. En sık saptanan üç etkenin kültür sonrası MALDI TOF ve LFM yöntemi ile uyumu Cohen’in kappa katsayısı sırası ile 0,715, 0,843, 0,938; mikroarray yöntemi ile uyumu 0,935, 0,753, 0,938 olarak hesaplanmış ve her üç bakteri için de yüksek uyumluluk elde edilmiştir.

Sonuç ve Tartışma: Elde edilen verilere dayanılarak, hem lizis filtrasyon hem de mikroarray platformunun sepsis tanısını kısaltmaları açısından yararlı olduğu düşünülmüştür. Her iki yöntemin birbirlerine karşı avantajları ve dezavantajları vardır. Sunulan bu tez çalışmasının sonucunda, lizis filtrasyon yönteminin maliyet etkinlik, hız, geniş veritabanı MALDI TOF kütle spektrofotometri uygulayabilen laboratuvarlar için rutin kullanıma girebilecek bir yöntem olduğunu düşünülmüştür.

Anahtar kelimeler: Sepsis, Matrix-yardımlı Laser Desorpsiyon-Ionizasyon Kütle Spektrometrisi, Filtrasyon, Mikroarray analizi

(4)

IV

ABSTRACT

Comparison of microarray and lysis filtration combined MALDI TOF MS procedures for the identification of bacteremia causing gram negative bacteria and their resistance genes

Aim of the study: The presence of bacteria in blood is known as bacteremia and sepsis was defined as the presence of the systemic immun response in proven bacteremia. In sepsis cases administration of appropriate antimicrobials is very important. each hour’s delay to antibiotics administration was associated with increase in mortality. In this study two methods were compared with conventional culture method: Microarray and lysis filtration combined MALDI TOF MS. The aim of the study is to decrease the bacteria identification duration to initiate appropriate antibiotic treatment as soon as possible.

Material and methods: We tested 39 gram negative bacteria isolated from blood cultures sent to the Ege University Medical Faculty Clinical Microbiology laboratory from the intensive care units between the dates November 2015- February 2016 and identified at species level on MALDI TOF MS system. The results of bacteria tested on both Nanosphere Verigene System BC-GN microarray test device and lysis filtration combined MALDI TOF method were compared.

Results: In this study; blood culture positive signals were detected at minimum seven hours and 55 minutes and at maximum 31 hours and 22 minutes, while the average signal detection duration was defined as 12 hours and 55 minutes. When the results of MALDI TOF MS after culture, MALDI TOF after lysis centrifugation and microarray methods were compared, it was determined that lysis filtration method has sensitivity of 82% (32/39) and microarray method 87,1% (34/39). All three methods had 76,9% (30/39) concordant results. Most detected three bacterias with MALDI TOF after culture and LFM method showed good correlation (Cohen’s kappa values: 0,715, 0,843, 0,938), MALDI TOF after culture and microarray method also showed good correlation (Cohen’s kappa values: 0,935, 0,753, 0,938).

Conclusion: As a result; both lysis centrifugation and microarray platforms decrease the identification time in blood culture processing. In this study it is concluded that in laboratories which can perform MALDI TOF mass spectrophotometer, lysis filtration method is a fast and cost effective method that may be suitable for routine usage.

Key words: Sepsis, Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Mass Spectrometry, Filtration, Microarray analysis

(5)

V

İÇİNDEKİLER

ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR ... II ÖZET ... III ABSTRACT ... IV TABLOLAR ... VII KISALTMALAR ... VIII 1. GİRİŞ VE AMAÇ ... 1 2. GENEL BİLGİLER ... 2 2.1. Tanımlar ... 2 2.2. Patogenez ... 4 2.3. Etiyoloji ... 5 2.4. Epidemiyoloji ... 6

2.5. Klinik Belirti ve Bulgular ... 6

2.6. Sepsis Etkenini Tanımlayıcı Testler ... 7

2.6.1. Kan kültürü ... 7

2.6.1.1. Konvansiyonel yöntemler, identifikasyon ve duyarlılık testleri ... 8

2.6.2. Direkt taze kan örneğinden yapılan moleküler testler ... 10

2.7. Gram Negatif Bakterilerde antibiyotik direnci ... 11

2.7.1. Beta-laktamazlar ... 11

2.7.2. Gram negatif bakterilerde karbapenem direnci ... 11

2.7.2.1. Dış membran proteinleri ... 12

2.7.2.1.1. Porinler ... 12

2.7.2.1.2. Atım pompaları ... 12

2.7.2.2. Penisilin bağlayan proteinler (PBP’ler) ... 12

2.7.2.3. Karbapenemazlar ... 12

2.7.2.3.1. Sınıf A Karbapenemazlar ... 13

2.7.2.3.1.1. KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) enzimi ... 13

2.7.2.3.1.2. Kromozomal kodlanan SME, NMC ve IMI enzimleri ... 13

2.7.2.3.2. Sınıf B karbapenemazlar ... 14

2.7.2.3.2.2. NDM (New Delhi metallo-β-lactamase) ... 14

2.7.2.3.2.3. VIM (Verona integron-encoded metallo-β-lactamase) ... 14

2.7.2.3.3. Sınıf D karbapenamazlar ... 15

3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 16

3.1. Gereçler ve Kimyasallar ... 17

(6)

VI

3.2.2. Pozitif kan kültürünün işlenmesi ... 18

3.3.4. Lizis filtrasyon için 1 litre yıkama solüsyonu hazırlanması ... 20

3.3.5. MALDI TOF destekli lizis filtrasyon işleminin uygulanması ... 20

3.3.6. VerigeneBlood Culture Assay (Nanosphere Inc. Northbrook, USA) ... 20

3.3.7. İstatiksel Analiz Yöntemi: ... 22

4. BULGULAR ... 23

4.1. Pozitif sinyal süreleri ... 23

4.2. İdentifikasyon sonuçları ... 24

4.3. Duyarlılık testi sonuçları ... 27

5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 31

(7)

VII

TABLOLAR

Tablo 1. Sepsis Kriterleri

Tablo 2. Sepsis oluşumunda predispozan faktörler

Tablo 3. VerigeneBlood Culture Assay veritabanındaki bakteriler ve direnç genleri

Tablo 4. Kappa katsayısı değerlendirme tablosu

Tablo 5. Kan kültürünün pozitiflik verme süreleri

Tablo 6. Kültür sonrası MALDI TOF MS yöntemi ile elde edilen sayı ve oranlar

Tablo 7. Lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF MS ile elde edilen sayı ve oranlar

Tablo 8. Mikroarray ile saptanan etkenlerin sayı ve oranları

Tablo 9. Her üç yöntemle elde edilen identifikasyon sonuçları karşılaştımalı tablosu

Tablo 10. Kültür ve LFM yöntemleri ile saptanmış en sık üç etkenin Cohen’in kappa

değeri ve uyum değerlendirilmeleri

Tablo 11. Kültür ve mikroarray yöntemleri ile saptanmış en sık üç etkenin Cohen’in

kappa değeri ve uyum değerlendirilmeleri

Tablo 12. Duyarlılık test sonuçları, karşılaştırmalı tablo

(8)

VIII

KISALTMALAR

MALDI TOF: Matrix assisted laser desorption ionization time of flight

MS: Kütle spektrofotometrisi

LFM: Lizis filtrasyon sonrası uygulanan MS MALDI TOF

SIRS: Sistemik inflamatuar yanıt sendromu

MODS: Multipl organ disfonksiyon sendromu

ARDS: Erişkin solunum yetmezliği sendromu

DM: Diabetes Mellitus

KBY: Kronik Böbrek Yetmezliği

KKY: Konjestif Kalp Yetmezliği

LPS: Lipopolisakkarit

IL: İnterlökin

TNF: Tümör nekrozis faktör

PAF: Platelet aktive edici faktör

MHC: Major histokompatibilite kompleksi

KNS: Koagülaz negatif stafilokoklar

CHCA: 4-hydroxy-α-cyanocinnamic asit

(9)

1

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Kanda bakteri bulunması bakteriyemi olarak ifade edilirken, bakteriyemi tablosunun uzun süreli devamı sonucu, immünolojik mekanizmaların da olaya katılmasıyla beliren tablo sepsis olarak tanımlanır. Sepsis, yüksek mortalite ve morbidite ile seyreden, her yıl dünya çapında yaklaşık 18 milyon olguya ve %30 olguda da ölüme neden olan bir klinik tablodur (1-3).

Sepsis, septik şok gibi klinik tablolarda kesin insidansı vermek olası değildir. Sepsis görülme sıklığında ve bakım maliyetlerinde son yıllarda önemli artışlar olduğu dikkati çekmektedir. ABD’de yılda 750.000 sepsis olgusu görüldüğü ve yaklaşık 215.000 olgunun sepsis nedeniyle kaybedildiği belirtilmektedir. ABD’de yıllık ortalama 16,7 milyar dolar kaynak ciddi septik hastaların bakımı için harcanmakta ve bu rakam her yıl %1,5 oranında artış göstermektedir. Avrupa’da da her gün 1.400 hasta septik şok ile kaybedilmekte ve bu hastaların Avrupa ülkelerine 7,6 milyar Euro yıllık bakım maliyeti bulunmaktadır (1). Sepsise bağlı ölümlerde yaş, enfeksiyon etkeni, enfeksiyonun kazanıldığı yer ve altta yatan primer hastalık önemlidir (4).

Sepsis olgularında ilk 24 saat uygun antimikrobiyal tedaviye başlanması prognoz açısından çok önemli olmakla birlikte, yanlış antimikrobiyal tedavi alan veya tedavi almayan olgularda ölüm oranları kaybedilen her saat başına %7 oranında artış göstermektedir. Sepsiste etken saptanana kadar geçen sürede genellikle ampirik tedavi protokolleri uygulanır. Ancak etkene yönelik etkin antibiyotik tedavisine ne kadar çabuk başlanır ise prognozun da o derecede iyi olduğu birçok çalışma ile desteklenmiştir (5, 6).

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında bakteriyeminin kesin tanısı, etkenin kan kültüründe üretilmesiyle konulur. Bu tanı yöntemi halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, kan kültüründe etkenin üretilmesi ve antibiyotik duyarlılık testlerinin çalışılması için en az 48-72 saatlik bir süre gerektiğinden, günümüzde spesifik etkeni aynı gün içerisinde saptayabilen ve saptanan etkenin önemli direnç paternlerinin çalışılabileceği moleküler tabanlı testler kullanılmaya başlanmıştır (7, 8).

Bu çalışmada, lizis filtrasyon ve matrix assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI TOF MS) kombinasyonuyla, konvansiyonel kan kültürü/MALDI TOF ile etkenin identifikasyonunun karşılaştırılması ve ayrıca tanımlanan etkenin mikroarray yöntemi ile direnç paternlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

(10)

2

2. GENEL BİLGİLER

Bakteriyemi ve/veya sepsis birbiriyle ilgili ancak farklı klinik tablolardır. Sepsis tanımlamasındaki karışıklığın giderilmesi amacıyla 1991 yılında Society of Critical Care Medicine ve American Collage of Chest Physicians’ın konsensus toplantısında enfeksiyon, bakteriyemi, sepsis, septik sok, sistemik inflamatuar yanıt sendromu (SIRS), ve multipl organ disfonksiyon sendromuna (MODS) tanımlar geliştirilmiştir (9).

2.1. Tanımlar

Enfeksiyon, mikroorganizmaların varlığına ya da bunların normalde steril olan konak dokusuna invazyonuna karşı oluşan inflamatuar yanıtla karakterize bir tablodur.

Bakteriyemi, kanda bakteri bulunması durumudur.

Sistemik inflamatuar yanıt sendromu (SIRS) aşağıdaki durumların iki ya da daha fazlasıyla kendini gösterir:

 Vücut ısısı > 38 °C ya da < 36 °C  Kalp hızı > 90 atım/dk

 Solunum sayısı > 20/dk ya da PaCO2 < 32mmHg  Lökosit sayısı > 12.000 hücre/mm3

,< 4.000 hücre/mm3 ya da > %10 immatür hücre formların görülmesi

Sepsis, enfeksiyona karşı oluşan sistemik inflamatuar yanıttır ve enfeksiyon sonucu SIRS bulgularının iki veya daha fazlasının bulunması olarak kabul edilir.

Ciddi sepsis, birlikte organ disfonksiyonu, dolaşım yetmezliği ya da hipotansiyonun bulunduğu sepsis durumudur.

Septik şok, uygun sıvı replasmanına karşın hipotansiyon ve şokun gözlendiği sepsis tablosudur.

Multipl organ yetmezliği (MODS), sepsis, septik şok ile birlikte bozulmuş organ fonksiyonu, erişkin solunum yetmezliği sendromu (ARDS), böbrek yetmezliği, karaciğer yetmezliği ve yaygın damar içi pıhtılaşma (dissemine intravasküler koagülasyon - DİK) gibi klinik durumların bulunmasıdır (9).

(11)

3 ACCP/SCCM uzlaşı konferansındaki (1991) tanımlar üzerindeki farklı görüşler, sepsis fizyopatolojisini daha iyi yansıtan tanımalamalara ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. 2001 ve 2012 yılında Society of Critical Care Medicine (SCCM), European Society of Intensive Care Medicine (ESICM), American College of Chest Physicians (ACCP), American Thoracic Society (ATS) ve Surgical Infection Society (SIS) katılımıyla sepsis tanımları konferansı yapılmıştır. 2001 konferansında, 1992 yılında belirlenmiş tanımlar geçerli olmakla birlikte, sepsis tanı kriterleri arasına C-reaktif protein, prokalsitonin, laktik asit, kreatinin, bilirubin gibi birçok biyokimyasal ölçütte artışın da dâhil edilmesi önerilmiştir (10). 2012 konferansı sonucunda ise 2001’de kabul edilen kriterler üzerinde küçük değişiklikler yapılmıştır (Tablo 1) (11).

Tablo 1. Sepsis Kriterleri (11)

Enfeksiyon: Gösterilmiş veya şüphe edilen enfeksiyon ve aşağıdakilerden bazıları Genel parametreler

Ateş (vücut ısısı > 38.3°C) veya hipotermi (vücut ısısı < 36°C)

Kalp atım hızı > 90/dk veya yaş için normal değerden > 2 standart sapma Takipne > 30/dk

Mental durum değişikliği

Belirgin ödem veya pozitif sıvı dengesi (24 saatte > 20ml/kg)

Hiperglisemi (diyabetin olmadığı durumlarda plazma glukozu >110 mg/dl veya 7,7 mM/l) İnflamatuar parametreler

Lökositoz (beyaz küre sayısı >12000/mm3) Lökopeni (beyaz küre sayısı < 4000/ mm3)

>%10 immatür formun olduğu normal beyaz küre sayısı Plazma CRP’nin normal değerden > 2 standart sapma

Plazma prokalsitonin (PCT) değerinin normal değerden > 2 standart sapma Hemodinamik parametreler

Arteriyel hipotansiyon (sistolik basıncın < 90 mmHg, ortalama arteriyel basıncın < 70 mmHg veya sistolik basıncının yetişkinlerde > 40 mmHg düşmesi veya yaşa göre normal değerden < 20 standart sapma olması)

Organ disfonksiyon parametreleri Arteriyel hipoksemi (PaO2/FIO2 <300)

Akut oligüri (en az iki saat idrar çıkışı <0.5 mL/kg-1h-1 veya 45 mM/l Kreatininde ≥ 0,5 mg/dl artış

Koagülasyon anormallikleri (internasyonel normalizasyon oranı (INR) > 1.5 veya aktive parsiyel tromboplastin zamanı > 60 s)

İleus (bağırsak seslerinin olmaması)

Trombositopeni (trombosit sayısı < 100000 /mm3)

Hiperbilirubinemi (plazma total bilirubin > 4 mg/dl veya 70 mmol/l) Doku perfüzyon parametreleri

Hiperlaktatemi (>1 mmol/l)

(12)

4 2.2. Patogenez

Sepsis patogenezinde öncelikle bakterinin organizmaya yerleşmesi ve konak savunması ile etkileşimi rol oynar. Hastalığın ortaya çıkışını, konağın immün sistemi ve bakteriyel virülans faktörleri belirler. Sepsis için predispozan faktörler Tablo 2’de özetlenmiştir (3). Sepsis, bakterilerin dolaşıma damar dışı bir enfeksiyon odağından yayılım sonucu girmesiyle veya damar içi kateter, septik tromboflebit, endokardit, mikotik anevrizmalar ve benzeri intravasküler sebeplerden kaynaklanabilir. Sepsiste en sık primer enfeksiyon odağını üriner sistem, genital sistem, solunum sistemi, deri ve yumuşak doku, karın içi ve damar içi kateterler oluşturur. Toplum kökenli sepsislerde en sık giriş kapısı solunum sistemi ve üriner sistem, nozokomiyal sepsislerde ise intravasküler ve üriner kateterlerdir. Yoğun bakım ünitelerinde ise nozokomiyal pnömoniler ön plandadır (3).

Tablo 2. Sepsis oluşumunda predispozan faktörler (3)

Konağa ait faktörler Terapötik faktörler

Altta yatan ciddi hastalık Yaş (yenidoğan, > 65 yaş) Primer hastalık (Siroz, DM, KBY, KKY vb.)

Konak savunma mekanizmalarının zayıflaması (nötropeni, malignite, disproteinemiler, kortikosteroid ve diğer immunosupressif tedaviler)

Geniş travma ve yanıklar Lokal enfeksiyonlar Septik abortus, lohusalık Yakın geçmişte uygun olmayan antibiyoterapi

YBÜ’nde bakım

İnvaziv damar kateterleri Fazla miktarda parenteral sıvı

veya kan ve kan ürünleri verilmesi

Hemodiyaliz

Diğer invaziv kateter ve

girişimler (üriner kateter ve girişim, entübasyon, endotrakeal tüp, mekanik ventilatör)

Büyük cerrahi girişimler

(13)

5 2.2.1. Mikrobiyal faktörler

Sepsis ve onun sonucu olarak gelişen klinik tabloların oluşmasında, bakteriyel invazyonun, hücresel yapıların ve toksinlerin önemli rolü vardır. Bu hücresel yapılar ve toksinler organizmada değişik biyolojik sistemleri aktive ederler. Gram negatif bakterilerin hücre duvarındaki lipopolisakkarit yapısındaki endotoksinler sepsise neden olurken, gram pozitif bakterilerin ekzotoksinleri, hemolizinleri, enterotoksinleri, peptidoglikanlar ve lipoteikoik asit yapıları immün sistemi tetiklerler (12).

Bakteriyel endotoksinler arasında etkisi en iyi bilinen yapı gram negatif bakterilerin dış membranının bir bileşeni olan lipopolisakkarit (LPS) yapısındaki endotoksinlerdir. LPS, nötrofil, makrofaj ve monositlerin yüzeyindeki CD14 reseptörlerine bağlanarak aktive olmalarını sağlar ve inflamatuar mediatörlerin salınımına neden olarak sepsis tablosunu oluşturur. Kompleman ve koagülasyon sistemini de aktive edebilir. Aynı zamanda lökositler tarafından sitokin üretimi (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, PAF gibi), bunların da prostaglandin ve lökotrienlerin salınımını uyarması da LPS kaynaklı aktivasyona bağlanabilir (12).

Gram pozitif bakterilerde bulunan ekzotoksinler süperantijen özelliği gösterip, ayırım yapmadan major histokompatibilite kompleksi (MHC) Sınıf II ile ve T-lenfosit 10 reseptörü (TCR-10) alanının kısıtlı bir bölümüyle bağlanabilmektedir. Gram pozitif ya da negatif bakterilerin neden olduğu sepsis tablosu klinik olarak birbirinden farklı değildir (12,13).

2.3. Etiyoloji

Antibiyotiklerin kullanıma girmesinden önceki 1950’li yıllarda gram pozitif bakteriler ön sıralarda iken, antibiyotiklerin kullanıma girmesi ile gram negatif bakteriler giderek artan sıklıkta sepsis etkeni olarak izole edilmeye başlanmıştır (14). Yıllar içerisinde gram negatif baskınlığı oluşmuş, fakat günümüzde yoğun bakımlarda damar içi kateter gibi invaziv girişimlerin çoğalmasıyla, gram pozitif etkenler yeniden artış göstermiştir. Son yıllarda gram negatif ve gram pozitif etkenler birbirilerine yakın sıklıkta izlenmektedir. Çeşitli çalışmalarda, sepsislerin %27-74’ünde gram pozitif bakterilerin, %20-64’ünde gram negatif bakterilerin etken olduğu, %15 ve daha az oranda ise polimikrobiyal etken izole edildiği gösterilmiştir (15, 16).

Gram negatif bakteriyel sepsislerde en sık etkenler ülkelere ve bildirilen merkezlere göre değişkenlik göstermekle birlikte, ülkemizde yapılan çalışmalarda Acinetobacter spp, Klebsiella spp. Escherichia coli, Pseudomonas spp, Enterobacter spp, Proteus spp

(14)

6 en sık bildirilen bakterilerdir (17). Gram-pozitif bakteriyel sepsislerde ise en sık etkenler koagülaz negatif stafilokoklar (KNS), Staphylococcus aureus ve enterokok türleridir.

Bacteroides fragilis ve Fusobacterium türleri de en sık izole edilen anaerop bakterilerdir

(15, 16). Candida türlerinin sıklığı genellikle bakterilerin ardından gelmektedir. Özellikle yoğun bakım ünitelerindeki fungemilerde en sık rastlanan mantarlar

C.albicans, C. glabrata ve C. parapsilosis’tir (18). Candida dışında Trichosporon

türleri de sepsis etkeni olarak izole edilmektedir. Küf mantarlarından başta Aspergillus olmak üzere, Zygomycetes ve Fusarium türleri de etken olarak görülebilmektedir (18-20).

2.4. Epidemiyoloji

Sepsis, koroner dışı yoğun bakımlarda en sık ölüm sebebidir. Her yıl ABD’de görülme sıklığının giderek artmakta olduğu, mevcut durumda 300/100.000 görüldüğü ve mortalitenin çeşitli çalışmalarda %50 seviyelerinde bulunduğu bildirilmiştir (20). Sepsis insidansının artışında antibiyotiklerin yaygın ve uygun olmayan şekilde kullanımı, geriatrik popülasyonda ve organ transplant hastalarında, HIV ile enfekte kişilerde, malignite gibi sepsise zemin hazırlayan duruma sahip hastaların insidansında artış, intravasküler kateterler ve üriner kateterler gibi tıbbi protezlerin kullanımının yaygınlaşması gibi faktörler etkili olmaktadır (20).

Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda 750.000 sepsis olgusu görüldüğü ve yaklaşık 215.000 olgunun sepsis nedeniyle kaybedildiği belirtilmektedir, kaba ölüm oranı %35’tir. Yine Avrupa’da da her gün 1.400 hasta septik şok ile kaybedilmekte ve bu hastaların Avrupa ülkelerine 7,6 milyar Euro yıllık bakım maliyeti bulunmaktadır (1). Ülkemizde yoğun bakım ünitelerinde yapılan çalışmalarda ise hastane kaynaklı bakteriyemi ve sepsis insidansı %7,6 – 17,2 arasında bildirilmektedir (21, 22).

2.5. Klinik Belirti ve Bulgular

Sepsisli olgularda, değişkenlik göstermekle birlikte genellikle ateş veya hipotermi, taşikardi, hiperventilasyon, deri lezyonları ve bilinç bozukluğu daha yaygın saptanan klinik bulgulardır (23, 24).

Sepsis tablosu her zaman beklenilen bulgularla seyir göstermeyebilir. Sepsiste hipotermi çok sık gözlenmez, fakat varlığı özellikle bebeklerde, yaşlılarda veya altta yatan kronik hastalığı olan hastalarda kötü prognoza işaret eder (23). Nötropenik ve immün yetmezlikli hastalarda da ateş görülmeden sepsis gelişebilir. Yoğun bakımlarda

(15)

7 izlenen hastalarda hiperventilasyon ve respiratuvar alkaloz gözlenmesi akla sepsisi getirmelidir. Santral sinir sistemi tutulumu olmaksızın oryantasyon-kooperasyon bozukluğu, letarji, ajitasyon ve benzeri nörolojik bulgular da görülebilmektedir. Çoklu organ yetmezliğine ek olarak hipotansiyon, oligüri, trombositopeni ve kanamanın gözlenmesi ise sepsisin geç komplikasyonlarıdır (24, 25).

2.6. Sepsis Etkenini Tanımlayıcı Testler 2.6.1. Kan kültürü

Kan kültürü bakteriyemi etkenini saptamak ve uygun tedavi konusunda klinisyeni yönlendirmek açısından en önemli ve altın standart tanı yöntemidir. Pozitif kan kültürlerinin büyük kısmı gerçek kan dolaşımı enfeksiyonlarına bağlıdır. Üreyen mikroorganizmaların en kısa sürede tanımlanarak etken veya kontaminasyon olduğuna karar verilmesi, etken olarak kabul edilenlerin duyarlılık testlerinin yapılarak tedavinin doğru yönlendirilmesi mortalite ve morbiditenin azaltılmasında çok önemlidir.

Kan kültürü alırken doğru zamanda, yeterli miktarda örnek alınmalı ve laboratuvara uygun koşullarda ulaştırılmalıdır (26). Vücut sıcaklığı normalin dışında olduğu durumlarda, solunum sayısı ve parametreleri değişkenlik göstermeye başladığında, hastanın bilinç durumu değiştiğinde, lökopeni veya lökositoz izlendiğinde kan kültürleri alınmalıdır. Sepsisli olgularda ateş olmazsa olmaz bulgu değildir. Yenidoğanlar, ileri yaştaki hastalarda ateş yanıtı görülmeyebilir. Ayrıca yoğun bakımda açıklanamayan pulmoner, renal veya hepatik fonksiyon bozukluğu olan, menenjit, osteomiyelit gibi lokal enfeksiyonu bulunan, immün sistemi bozulmuş veya açıklanamayan hemodinamik bozuklukları olan, kapak replasmanlı veya endokarditli hastalardan kan kültürü ateş yüksekliği beklenmeksizin alınabilir (26, 27).

Kan kültürü, rutin bir tetkik olarak görülmemeli, klinik gereklilikler doğrultusunda alınmalıdır. Kateterler gibi enfeksiyöz olabilecek odaktan kan kültürü alınması, ilişkili enfeksiyon şüphesi durumunda uygulanmalıdır. Bakteriyemi veya fungemi kuşkusunda erişkinlerde ayrı venlerden iki set kan kültürü alınmalıdır.

Floradaki koagülaz negatif stafilokoklar gibi mikroorganizmalar bakteriyemi etkeni de olabileceğinden, özellikle intravenöz kateteri olan hastalardan izole edildiğinde yanlış bakteriyemi tanısına ve gereksiz antibiyotik kullanımına sebep olabilir. Standart uygulama olarak önce %70 propil alkol ile temizlik, ardından %1-2’lik iyot tentürü veya bir iodofor ile silinmesi önerilir. Maksimum antiseptik etki için 1,5-2 dakika temas süresi gereklidir (28).

(16)

8 Kanın içerisindeki bazı inhibitörlerin besiyerine oranı mikroorganizmanın üretilmesinde etkili olduğu için, alınan kan miktarı da önemlidir. BACTEC 9240 otomatize kan kültür sistemi ile gerçekleştirilen çalışmada (26), kan miktarının 10 ml’den başlayarak 40 ml’ye kadar artırıldığında alınan sonuçlar değerlendirilmiş ve 20 ml örneğin 10 ml’ye göre %30, 30 ml’nin ise yine 10 ml’ye göre %47 oranında kültür pozitifliği artışı sağladığı belirlenmiştir. Örnek 40 ml’ye çıkarıldığında ise 30 ml’ye göre sadece %7’lik pozitiflik artışı gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre, erişkinlerde her kültür için 20-30 ml örnek alınması önerilmiştir. Günümüzde klasik olarak kabul edilen kural, rutinde erişkinlerde her bir kan kültürü şişesi için 8-10 ml, pediatrik yaş grubunda ise 5-6 ml alınmasıdır (26, 29). Kan kültürü örnekleri alındıktan sonra en geç iki saat içerisinde laboratuvara ulaştırılmalıdır (26).

Grace ve arkadaşlarının (30) çalışmasında antibiyotik tedavisi alan hastalarda bakteriyemi etkenlerinin üreme yüzdesinin yaklaşık %50 düşüş gösterdiği bildirilmiştir. Bu nedenle, kan kültürleri olası sepsis veya bakteriyemi durumunda antibiyotik tedavisi başlanmadan önce, eğer hasta antibiyotik kullanıyorsa, antibiyotik dozundan hemen önce alınmalıdır. Otomatize sistemlerde kullanılan besiyerleri klinik kullanımda olan antibiyotiklerin çoğunun nötralizasyonu için gerekli ikili reçine kombinasyonları içermektedir. Bu nedenle hasta antibiyotik tedavisini almış olsa da, kültür alma endikasyonları mevcut ise kan kültürü yapılmalıdır. Hızla antibiyotik tedavisi başlanması gereken acil hastalarda, kültür için kan örnekleri eş zamanlı veya kısa zaman (< 1) saat içinde alınmalıdır (30).

2.6.1.1. Konvansiyonel yöntemler, identifikasyon ve duyarlılık testleri

Modern kan kültürü sistemleri ile kültür şişesinde üremenin olduğunu işaret eden pozitif sinyal, ekim sonrası kısa bir süre sonra alınabilmektedir. Üreme olmadığını anlamak için ise en az beş günlük bir zaman dilimine ihtiyaç vardır (26). Olguların yaklaşık %90’ında kan kültürü sistemlerinde ilk 48 saat içinde pozitif üreme sinyali gözlenmektedir. Kan kültürü inkübasyonu amacıyla günümüzde bilgisayar destekli sistemler kullanılmaktadır (27). İnkübatör ve çalkalama prensibi ile çalışan otomatize sistemde şişeler sürekli takip edilir. Şişedeki O2 veya CO2 miktarlarının değişimi kolorimetrik veya florometrik olarak ölçülür. Şişede üreme saptanması durumunda cihaz alarm ile uyarır. Şişelerden laboratuvarın çalışma prensipleri doğrultusunda boyama ve subkültürler yapılır, etkenin idendifikasyon ve antibiyotik duyarlılık testleri yapılır. Ancak, pozitif sinyal sonrası üretilen mikroorganizmanın klasik yöntemlerle

(17)

9 identifikasyonu ve antibiyotik duyarlılık testleri için en az 48-72 saatlik bir zaman dilimine ihtiyaç duyulmaktadır (26).

2.6.1.2. Pozitif sinyal veren kan kültürü şişesinden yapılan moleküler tabanlı testler (MALDI TOF ve mikroarray)

Son yıllarda kütle spektrometri yönteminde yapılan çalışmalar sonucunda çeşitli ilerlemeler kaydedilmiştir. Günümüzde, Bruker Biotyper (Bruker-Daltonik, ABD), Axima/Saramis (Shimadzu, Japonya), VITEK MS (bioMėrieux, Fransa) ve Andromas (Andromas SAS, Fransa) olmak üzere dört MALDI TOF MS sistemi mevcuttur (31). Bu sistemlerde tanımlanmak istenen mikroorganizmaya ait koloni kimyasal bir matriksle bir araya getirilir. hydroxy-α-cyanocinnamic acid (“alphacyano” veya 4-HCCA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) MALDI TOF MS sisteminde kullanılabilecek matrikslerdir. Tanımlanmak istenen koloni veya ekstraktı ‘target slayt’ adı verilen metal slayta yayılır, üzerine matriks solüsyonu eklenir kristalize olduktan sonra cihaza yerleştirilerek lazer atışlarına maruz bırakılır. Lazer enerjisi matriks moleküllerinin aktivasyonunu sağlayarak mikroorganizma-matriks kompleksinde mikro patlamalar meydana getirir. Ardından bu moleküller iyonlaşır ve slayttan ayrılarak serbest hale geçerler. Cihaz içindeki elektrotlar sayesinde 20 kV civarında elektrik potansiyeline maruz bırakılarak iyonize moleküller detektöre doğru hızlandırılır. Spektrofotometredeki vakum, iyonlarla hava moleküllerinin çarpışmasını engeller. Bu nedenle iyonların hızı sadece kütle/yük (m/z) oranıyla gösterilen kütle ve molekülün yüküne bağlı hale gelir. MALDI TOF MS uygulamalarında hemen her zaman moleküller benzer şekilde yüklendikleri için uçuş süresi temelde kütleye bağlıdır. İyonlar kütlelerine göre dedektöre çarparlar, dolayısıyla küçük kütleye sahip iyonlar dedektöre önce ulaşır. Bir MALDI TOF MS spektrumunda x ekseni proteinlerin m/z oranını, y ekseni de bu proteinlerin yoğunluğunu gösterir. Sonuçta mikroorganizmaya ait proteinlerin, çarpma zamanına göre kütle spektrumu oluşturulur ve kaydedilir. MALDI TOF MS ile tanımlama yapan sistemlerde, yeni kaydedilen spektrum, mevcut veri tabanındaki spektrumlarla karşılaştırılır ve sonucun güvenilirliği yüzde değeri ile belirlenir (31).

DNA mikroarray’i cam, plastik veya silikon çip gibi katı bir yüzeye tutturularak sıralı bir şekilde (array) oluşturulmuş mikroskobik DNA spotlarıdır. Yüzeye tutturulan DNA parçaları (genellikle 20-100 nükleotid uzunluğunda) prob olarak belirlenmiştir.

(18)

10 Mikroarray teknolojisi, DNA’nın bir substrata bağlanıp bilinen bir gen ya da fragment ile prob hazırlanması şeklinde tanımlanabilecek ‘Southern Blotting’ tekniğinden türetilmiştir. Bu yeni teknikte membran yerine camın kullanılması, radyoaktivitenin yerini fluoresan işaretlerin alması ve bağlanmayı sağlayacak yöntemlerin hassaslaşmasıyla çalışmaların verimi ve elde edilen bilgilerin miktarı artmıştır. Komplementer oligonükleotidler kullanarak çok sayıda hedef nükleik asit dizisini aynı anda saptama potansiyelinden dolayı mikroarray teknolojisi, antimikrobiyal direncinin tanısında da umut verici bir yöntemdir. Sepsiste etiyolojik tanıya olanak sağlayan mikroarray yöntemi ticari olarak da mevcuttur (32).

2.6.2. Direkt taze kan örneğinden yapılan moleküler testler

Sepsisli olgularda mortalitenin kaybedilen her saatte yükseldiği öngörüldüğünde hızlı tanımlama günümüzde daha fazla önem kazanmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) teknikleri kullanılarak etkenin aynı gün içerisinde direkt olarak taze kandan tespit edilmesi ve bazı direnç paternlerinin moleküler olarak saptanması mümkündür (33). Direkt kan örneğinden yapılan PZR temelli yöntemler konvansiyonel kültüre göre çok daha kısa sürede sonuç vermesi, çeşitli çalışmalarda duyarlılık ve özgüllüğünün yüksek olduğunun gösterilmesi, hem bakteri hem de mantarların saptanabilmesi, klinisyenin doğru antibiyoterapiye başlamasının daha çabuk sağlanması gibi avantajları mevcuttur (34).

PZR, DNA içerisinde yer alan ve dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak (amplifikasyon) için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. 94-98°C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 37-65°C aralığında gerçekleştirilen bağlanma (annealing) ve 72°C’de gerçekleştirilen uzama (elongasyon) aşamalarından oluşur. Bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanması ile çok sayıda hedef DNA elde edilir. Multipleks PZR’de çoklu primer setleri kullanılarak aynı anda birden fazla hedef DNA’nın çoğaltılabilmesine imkan sağlanmış olunur. Multipleks PZR daha az zamanda daha çok hedef bölge amplifikasyonu gerçekleştirebildiğinden kullanışlı bir inceleme yöntemidir. Ancak önemli derecede optimizasyon gerektirir. Bu nedenle çalışma prosedürünün standardizasyonu için çok sayıda deneme yapılması gerekmektedir (33).

Çoğaltılan PZR ürünlerinin görüntülenmesi klasik olarak jel elektroforezi ile yapılmaktadır. Jel elektroforezi nispeten yavaş olduğundan, daha hızlı ve kantitatif ölçümler yapabilen gerçek zamanlı PZR (real time PZR) yöntemleri kullanılmaya

(19)

11 başlanmıştır. Gerçek zamanlı PZR’de DNA amplifikasyonu oluştukça, reaksiyonda kullanılan floresan işaretli problardan ışınlar yayılır. Yayılan bu ışınlar da özel dedektörler vasıtasıyla değerlendirilir (33).

2.7. Gram negatif bakterilerde antibiyotik direnci

Günümüzde antibiyotik direnci enfeksiyonla ilişkili hastalıkların hemen tamamında büyük sorun oluşturmaktadır. Gram negatif bakteriler söz konusu olduğunda akla önce genişlemiş spektrumlu beta laktamazlara bağlı direnç gelmektedir. Beta laktamaz direncinin bir basamak ötesi kabul edilen karbapenemaz direnci ise toplum sağlığı açısından büyük tehdit oluşturmaktadır.

2.7.1. Beta-laktamazlar

Beta-laktamaz direnci günümüzde antibiyotik direnç çeşitleri içerisinde en yüksek oranda görülenidir ve saptanması mikrobiyoloji laboratuvarlarının günlük iş akışında önemli yer tutmaktadır. Beta laktamaz enzimleri tarafından β-laktam antibiyotiklerin β-laktam halkasını hidrolize edilir ve antibiyotiğin bakterisit özelliğini ortadan kaldırırlar. β-laktamazların sınıflandırılması fonksiyonel ve moleküler olmak üzere genel olarak iki özellik altında yapılmaktadır (35, 36). Gen sekanslama öncesi dönemde laktamaz enzimleriyle yapılan ilk çalışmalarda, yeni keşfedilen bir β-laktamaz; izoelektrik noktasına, substrat hidroliz ve inhibisyon özelliklerine, proteinin izolasyonuna yönelik yapılan enzim çalışmalarına göre sınıflandırılmıştır. Bu fonksiyonel sınıflandırmada; β-laktamazlar dört fonksiyonel gruba ayrılmıştır (35, 36). Moleküler yapılarına göre yapılan β-laktamaz sınıflandırmasında da proteinlerin aminoasit dizileri temel alınarak β-laktamazlar A, B, C ve D olmak üzere dört gruba ayrılmıştır. Aminoasit homolojisi esas alınarak yapılan bu sınıflandırmaya göre β-laktamazlar sınıf A, C ve D aktif bölgelerinde serin aminoasiti taşıyan β- laktamazları, sınıf B ise aktif bölgelerinde çinko bulunan metallo-enzimleri temsil eder (35-37).

2.7.2. Gram negatif bakterilerde karbapenem direnci

Karbapenemler ilk olarak Streptomyces cattleya’dan elde edilmiş ve tienamisin, tüm karbapenemler için model olmuştur. Karbapenemlerdeki temel yapı penisilinin β-laktam halkasına benzemektedir. Ancak, 1. pozisyonda sülfür yerine karbon gelmiştir ve 2. ve 3. karbon atomları arasında doymamış bağ mevcuttur. Karbapenemlerin

(20)

12 birçok β-laktamaz enzimine direnci, hidroksietil yan zincirindeki farklı konfigürasyondan kaynaklanmaktadır (38, 39). Acinetobacter spp, Pseudomonas spp,

Stenotrophomonas spp gibi nonfermentatif gram negatifler ve Escherichia coli, Klebsiella spp ve Enterobacter spp gibi Enterobacteriaceae türlerinde karbapenem

direnci gözlenebilir (38, 39). Karbapenemlere direnç mekanizmaları β-laktamazların üretimi, atım pompaları, porin ve PBP’lerin ekspresyonlarını ve/veya fonksiyonlarını değiştiren mutasyonlardır.

2.7.2.1. Dış membran proteinleri

İki büyük grupta toplanırlar; porinler ve atım pompaları. 2.7.2.1.1. Porinler

Atım pompaları dışındaki porinlerin yer değiştirmeleri ya da azalmış ekspresyonları, karbapenemlerin periplazmik alana geçişinin azalmasına yol açmaktadır. Bu durum P. aeruginosa, , A. baumannii, K. pneumoniae, Enterobacter

aerogenes, E. coli, Serratia marcescens ve bazı diğer Enterobacteriacea türlerinde

görülmektedir (38).

2.7.2.1.2. Atım pompaları

Atım pompalarının aşırı ekspresyonuna bağlı gelişen karbapenem direnci, en sık olarak A. baumannii, P. Aeruginosa ve E. aerogenes türlerinde bildirilmiştir. Bu pompalar bazı karbapenemleri dışarı atabilirken bazıları atılamamaktadır (36, 38). 2.7.2.2. Penisilin bağlayan proteinler (PBP’ler)

A. baumannii, P. aeruginosa, P. mirabilis’te PBP ekspresyonunun azalması,

karbapenem direncine neden olur. Ayrıca aminoasitlerdeki yer değişiklikleri sonucu yeni bir PBP kazanılması E. faecium, E. coli, P. aeruginosa, P. mirabilis,

Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus,

karbapenem direncine yol açmaktadır (36, 38, 39). 2.7.2.3. Karbapenemazlar

β-laktamaz ailesi içinde en geniş etki spektruma sahip karbapenemaz enzimleridir. Bu enzimler, karbapenemlerin yanı sıra pek çok başka β- laktam grubu antibiyotikleri de hidrolize edebilirler. Hemen hemen tüm β-laktamaz inhibitörlerine dirençlidirler (38). Ambler sınıflandırmasına göre (35) karbapenemazlar Sınıf A, Sınıf B ve Sınıf D olmak üzere üç ana grupta yer almaktadır.

(21)

13 2.7.2.3.1. Sınıf A karbapenemazlar

Sınıf A serin karbapenemazlar geniş bir spektrumda β-laktam hidrolizi yapabilmekte ve spektrumlarının içine karbapenemlerin yanı sıra sefalosporinler, penisilinler ve aztreonam da girmektedir. Sınıf A karbapenemazlar klavulanat ve tazobaktam tarafından inhibe olmaktadırlar ve fonksiyonel sınıflandırmada Grup 2f’de yer alırlar (41).

En sık rastlananı KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) olup, SME (Serratia marcescens enzyme), IMI (Imipenem- hydrolyzing β-lactamase) ve NMC (Not metallo-enzyme carbapenemase) gibi başka üyeleri de vardır. Bu enzimleri eksprese eden bakteriler, imipeneme düşük duyarlılıkla karakterizedir, fakat minimum inhibitor konsantrasyonları tamamen dirençliye kadar değişebilmektedir (39).

2.7.2.3.1.1. KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) enzimi

KPC-1 plazmid karbapenemaz taşıyan ilk suş ABD’de 1996 yılında saptanmıştır ve daha sonra hızlı şekilde tüm dünyaya yayılım göstermiştir (40). KPC, aslında yetersiz bir terimdir. Bu enzimleri kodlayan genler K. pneumoniae ile sınırlı değildir ve diğer Enterobacteriaceae üyelerine de transfer edilebilir. KPC sentezleyen suşlar tüm β-laktamlara dirençlidir ve bu organizmalarla gelişen kan dolaşımı enfeksiyonları yüksek mortalite göstermektedir. Tedavi seçenekleri genellikle kolistin, tigesiklin ya da aminoglikozitlerle sınırldır. Kolistine dirençli KPC suşlarının da bildirilmeye başlanması endişe verici olarak kabul edilmektedir (40,41).

2.7.2.3.1.2. Kromozomal kodlanan SME, NMC ve IMI enzimleri

SME-1; 1980’li yılların başında İngiltere’de klinik örneklerden izole edilen iki S.

marcescens izolatında saptanmış, bunu da ABD’de sporadik olarak bulunan ve SME-1

ile neredeyse aynı yapıya sahip SME-2 ve SME-3 enzimlerinin keşfi izlemiştir (39). IMI ve NMC-A. birbirilerine %97 oranında benzerlik göstermektedir. NMC-A ise %70 oranında SME-1 ile benzerlik gösterir. SME, NMC ve IMI enzimleri; penisilinler, geniş spektrumlu sefalosporinler, aztreonam ve karbapenemleri de içine alan geniş bir hidroliz spektrumuna ve imipenem ve sefoksitin ile indüklenebilme yeteneğine sahiptir (41, 42).

(22)

14 2.7.2.3.2. Sınıf B karbapenemazlar

İlk metallo-β-laktamazlar, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus gibi türlerin kromozomal enzimleridir. Bu β-laktamazlar, karbapenemleri hidrolize eder, inhibitörlere dirençlidir ve metal iyon şelatörleri ile inhibisyona duyarlıdır. Çoğu sefalosporinleri ve penisilinleri de hidrolize ederken, aztreonamı hidrolize edemezler (39, 41, 43).

Varlığı, direkt olarak enzimi üreten türün prevalansı ile bağlantılı olan kromozomal metallo-β-laktamazların dışında, kazanılmış ve transfer edilebilir metallo-enzim aileleri de önemli bir yayılım göstermiştir. Bu metallo-β-laktamaz ailesinin en sık görülen tipleri VIM, IMP ve NDM enzimleridir. Bunlar, plazmid ya da transpozonlarla bakteriler arasında transfer edilebilirler (38, 40).

2.7.2.3.2.1. IMP (imipenemase) enzimi

Bu enzimler imipenem, penisilinler ve geniş spektrumlu sefalosporinleri hidrolize ederken aztreonamı hidrolize edemezler. Transfer edilebilir imipenem direnci, ilk olarak 1990 yılında Japonyada P. aureginosa izolatında saptanmış, bunu bir B.

fragilis suşunda transfer edilebilir direnç geni saptanması izlemiştir (41). Avrupa’da

ilk saptanan IMP sentezleyen izolat İtalya'dan bir A. baumanii suşudur ve IMP-2 olarak adlandırılmıştır. Şu anda 50 farklı IMP literatürde yer almaktadır (41, 43).

2.7.2.3.2.2. NDM (New Delhi metallo-β-lactamase)

Metallo-β-laktamazlar arasında en önemlilerinden biri de NDM-1’dir. Bu enzimi üreten bakterileri genellikle tigesiklin ve kolistin hariç bütün antibiyotiklere dirençlidir. Çok hızlı ve dünya genelinde bir yayılım gösteren NDM, Enterobacteriaceae’nin yanı sıra A. baumannii, P. aeruginosa ve hatta Hindistan’daki kuyu sularında S. maltophilia ve Vibrio choleare suşlarında da saptanmıştır (44-46). 2.7.2.3.2.3. VIM (Verona integron-encoded metallo-β-lactamase)

İlk olarak 1997 yılında Verona’da bir P. aeruginosa suşunda tanımlanan VIM-1, daha sonra Enterobacteriaceae’ye, özellikle de K. pneumoniae türüne yayılım göstermiş, aynı yıl VIM-2 enzimi de Fransa’dan bildirilmiştir (41, 44). VIM üreten K.

pneumoniae izolatları, KPC üreticileri kadar olmasa da dünya genelinde giderek artan

(23)

15 2.7.2.3.3. Sınıf D karbapenamazlar

Sınıf D beta laktamazlar sulbaktam, klavulanik asit ve tazobaktam ile inhibe olmayan

in vitro ortamda NaCl ile inhibe edilebilen beta laktamaz grubudur ilk saptanmaları

1970’li yılların sonları 1980’li yılların başlarına denk gelmektedir (41, 48). OXA-48 başta olmak üzere bazı sınıf D β-laktamazlar karbapenemleri de hidrolize edebilmektedir. Bu enzimler penisilinlere yüksek düzeyde etki ederken, karbapenem grubu antibiyotiklere düşük düzeyde etkili, geniş spektrumlu sefalosporinlere ise etkisizdirler. Bakteri zarlarında geçirgenlik azaldığında özellikle OXA-48 ve benzeri karbapenemazlar, karbapenem grubu antibiyotiklere yüksek düzeyde direnç gelişimine sebep olabilmektedir. Plazmid kökenli olan bu enzimlere sahip izolatlar sıklıkla Kuzey Afrika ve Orta Doğu ülkeleri, Türkiye ve Hindistan’dan bildirilmiştir (41, 48, 49).

(24)

16

3. GEREÇ VE YÖNTEM

Kasım 2015-Şubat 2016 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi erişkin yoğun bakım ünitelerinde takip edilen hastalardan alınan ve pozitif sinyal veren kan kültürü şişeleri rutin laboratuvar işlemleri sırasında kontrol edildi. Pozitif sinyal sonrası kan kültürü şişelerinden alınan örnek %5 koyun kanlı agar ve EMB agar besiyerlerine inoküle edildi ve Gram ile boyalı preparatları hazırlandı. Gram boyama sonuçları not edilip, gram negatif bakteri görülen örneklerden 24 saatlik inkübasyon sonucu oluşan koloniler MALDI TOF MS sistemi ile tür düzeyinde tanımlandı. Sonraki aşamada Vitek 2™ (Biòmerieux, Fransa) otomatize duyarlılık cihazı ile etkenin antibiyotik duyarlılık testleri yapıldı.

Rutin laboratuvar iş akışında gram negatif bakteri tanımlaması yapılan ve antibiyotik absorban içermeyen kan kültürü şişeleri (BacT/Alert FA-FN Plus, Biòmerieux, Fransa) erişkin yoğun bakım hasta grubuna ait ise bu çalışmada kullanılmak üzere +40C’de (en fazla 24 saat olmak koşuluyla) saklandı. Erişkin yoğun bakım ünitelerinden gelen kan kültürü şişelerindeki tür düzeyinde tanımlanmış olan gram negatif etken Nanosphere Verigene System BC-GN mikroarray sisteminin (Nanosphere Inc. Northbrook, ABD) veri tabanında bulunan bakteri grubunun içerisinde ise çalışmaya dâhil edildi.

Eş zamanlı olarak yönergelere uygun yöntemlerle hazırlanmış solüsyonlar ve gereçler ile lizis filtrasyon işlemi uygulanıp ardından Vitek MS MALDI TOF (Biòmerieux, Fransa) ile tür düzeyinde tanımlama işlemi yapıldı.

Son olarak aynı kan kültürü şişelerinden alınan 0,7 mL kan kültürü örneği kullanılarak kapalı sistem nükleik asit ekstraksiyon ve amplifikasyon sonrasında nanopartikül probları ile çalışan Nanosphere Verigene System BC-GN mikroarray (Nanosphere Inc. Northbrook, ABD) test yöntemi kullanılarak Gram negatif etkenin ve direnç genlerinin tanımlanması gerçekleştirildi.

Ardından, rutin olarak uygulanan ve bakteri kolonisinden yapılan MALDI TOF tür düzeyinde tanımlama ile lizis filtrasyon sonrası uygulanan MS MALDI TOF (LFM) ve mikroarray test yöntemlerinin sonuçları karşılaştırıldı.

(25)

17 3.1. Gereçler ve Kimyasallar

BacT/Alert 3D otomatik kan kültürü cihazı (bioMėrieux, Fransa) Previ Color Gram boyama cihazı (bioMėrieux, Fransa)

Vitek MS MALDI TOF MS cihazı (bioMėrieux, Fransa) Vitek MS MALDI TOF MS plate (bioMėrieux, Fransa)

Vitek MS MALDI TOF MS CHCA matrix (bioMėrieux, Fransa) %5 Koyun Kanlı Agar (bioMėrieux, Fransa)

Eozin Metilen Blue Agar (bioMėrieux, Fransa)

Verigene System BC-GN test kartuşları (Nanosphere Inc. Northbrook, ABD) Brij O10 [Polioksietilen (10) oleil eter] (Amresco, ABD, Kat. No: 1B1335) Sodyum Klorid (NaCl) (Amresco, ABD, Kat. No:0241)

3-[Sikloheksilamino]-1-Propan-Sulfonik Asit (CAPS) (Amresco, ABD, Kat. No: 0365)

Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4) (Sigma-Aldrich, ABD, Kat. No: 71636)

Sodyum hidroksit (NaOH) (Sigma-Aldrich, ABD, Kat. No: S5881) Hidroklorik asit (HCl) (Sigma-Aldrich, ABD, Kat. No: H1758)

Enjektör uçlu 0,2 µm porlu polietersülfon filtre (Minisart®, Sartorius. Almanya Kat. No:16532)

Polyester başlıklı eküvyon (Cleanmo Corp, Çin, Kat. No: CM-PS743) (Texwipe TX743 muadili)

Millipore Express PLUS Membran Filtre, polietersulfon, 0.45 µm, 25 mm (HPWP02500) Merck-Millipore, ABD.

Vakum aspiratör (El yapımı)

(26)

18

3.2. Yöntemler

3.2.1. Kan kültürü sistemi

Kan kültürü örnekleri BacT-Alert 3D (bioMėrieux, Fransa) tam otomatik kan kültürü sisteminde inkübe edildi. BacT/Alert 3D mikrobiyal saptama sistemi, örneklerdeki üremeyi sürekli izleyen, inkübe eden ve çalkalayan kolorimetrik bir sistemdir. Örnek cihaza yerleştirildikten sonra, pozitif veya negatif olarak saptanana kadar periyodik olarak izlenir. BacT/Alert FA-FN Plus (bioMėrieux, Fransa) kan kültürü şişeleri, katı-faz reflektometrelerle sürekli izlenen karbondioksit sensörlerine sahiptirler. BacT/Alert bilgi işlem sistemi sensör okumalarını denetler ve hangi örneklerin negatif, hangilerinin pozitif olduğuna karar veren bir veritabanına sahiptir. Üreme olduğunun saptanması durumunda, cihaz tarafından sesli ve görüntülü alarm verilir. Bir örnekte yedi günlük süre içerisinde herhangi bir üreme görülmez ise negatif olarak bildirilir.

Çalışmada erişkin yoğun bakım ünitelerinde (Anesteziyoloji ve Reanimasyon, Kalp Damar Cerrahisi, İç Hastalıkları, Göğüs Hastalıkları, Nöroloji, Beyin ve Sinir Cerrahisi) yatan hastalardan alınan ve belirli gram negatif bakteri üremesi saptanan kan kültürü şişeleri kullanıldı.

3.2.2. Pozitif kan kültürünün işlenmesi

Pozitif olarak saptanan kan kültürü şişelerinden enjektör yardımıyla alınan 3 cc örnekten, 1 cc %5 koyun kanlı agar besiyeri (bioMėrieux, Fransa) ve 1 cc EMB agar besiyerine (bioMėrieux, Fransa) subkültürler yapıldı. Kalan 1 cc kan kültürü sıvısı lama yayılarak Previ-Color (bioMėrieux, Fransa) Gram boyama cihazı ile boyanarak gram negatif kok veya basil formu izlenen erişkin yoğun bakım hastalarından alınan kan kültürü şişeleri çalışmada kullanılmak üzere +4oC’de saklandı.

12-24 saat sonra, etkenin tür düzeyinde isimlendirilebilmesi için MALDI TOF MS cihazının örnek tablasına koloniden alınan çok az miktarda örnek aktarıldı ve üzerine CHCA matrix damlatılarak fiksasyonu ve kristalizasyonu sağlandı. MALDI TOF MS cihazında tür düzeyinde tanımlanan patojen Nanosphere Verigene System BC-GN (Nanosphere Inc. Northbrook, ABD) cihazının veritabanındaki patojen bakteriler içerisinde ise kan kültürü şişesi çalışmaya dâhil edildi. Bakterilerin antibiyotik duyarlılık testleri Vitek 2 (bioMėrieux, Fransa) otomatize sistem ile yapıldı ve elde edilen sonuçlar EUCAST 2015 (http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/) tablolarındaki öneriler doğrultusunda raporlandı.

(27)

19 3.3.3. Lizis filtrasyon için 1 litre lizis solüsyonu hazırlanması

“%0,6 Brij 97+ 0,4M CAPS, pH: 11,7” Gereçler

60 mL %10’luk Brij 97 [Polioksietilen ( 10) oleil eter] Stok solüsyonu*

88,5 gram [3- (sikloheksilamino ) -1- propansülfonik asit (CAPS)] 2 litre distile su

5N NaOH (yaklaşık 60 mL yeterli) (20,25 gram NaOH 100 mL’de çözülür) 1N NaOH (çok az miktar yeterli) (4 gram NaOH 100 mL’de çözülür) 0,2 µm porlu polietersülfon filtre (MiniSart® enjektör filtre)

*%10’luk Stok solüsyon hazırlanması (200mL)

Brij 97 şişesi +4oC’den çıkartılıp 36oC inkübatörde 30 dakika bekletildi. 200 mL’lik cam kap içerisine 20 gram Brij 97 tartıldı. Bu kaba 160 mL distile su eklenip, manyetik karıştırıcıda orta hızda üzeri alüminyum folyo ile kapatılarak iki saat karışmaya bırakıldı. İki saat sonunda distile su 200 mL’ye tamamlanarak, tekrar manyetik karıştırıcı ile yavaş devirde dönmeye bırakıldı. Bu solüsyon, homojenize olduktan sonra steril bir başka kap içerisine 0,2 µm porlu polietersülfon filtreden süzülerek +4oC’de saklandı.

Lizis solüsyonunun hazırlanması

Bir litrelik dereceli silindirik kaba 88,5 gram CAPS, üzerine 400 mL distile su ve ardından 40 mL 5N NaOH eklendi. Alüminyum folyo ile üzeri kapatılarak manyetik karıştırıcıda orta hızda tamamen çözünene dek karışmaya bırakıldı, 100 mL daha distile su eklenerek karıştırılmaya devam edildi. pH metre probu karışıma daldırıldı ve pH 11,7±0,01 düzeyine ulaşana kadar 5N NaOH eklenip, pH stabilize olana dek, beş dakika daha probla takip edilerek karıştırılmaya devam edildi. Daha sonra pH metre probu içinden çıkartılarak ve solüsyon iyice berrak hale gelene kadar karışmaya bırakıldı. Solüsyonun içerisine 60 mL %10’luk Brij 97 stok solüsyonu eklendi. 10 dakika karışmaya bırakıldı, tekrar pH ölçümü yapıldı ve pH 11,7±0,01 düzeyine ulaşana kadar 5N veya 1N NaOH eklendi. Elde edilen solüsyon yeterli büyüklükteki bir dereceli cam kaba aktarıldıktan sonra, bir litre olana kadar distile su ile tamamlanarak 10 dakika daha karıştırıldı. Bu sırada pH metre ile ölçüm yapılarak pH 11,7±0,01 düzeyine ulaşana kadar NaOH eklendi. Son olarak elde edilen solüsyon 0,2 µm porlu polietersülfon filtreden süzüleerek 50 cc’lik steril kaplara üzerlerine tarih yazılarak bölüştürüldü.

(28)

20 3.3.4. Lizis filtrasyon için 1 litre yıkama solüsyonu hazırlanması

“20nM Sodyum fosfat + %0,05 Brij 97+ %0,45 NaCl, pH:7,2” Gereçler

Na2HPO4 (Sodyum fosfat, dibazik, anhidröz)

%10’luk Brij 97 Stok solüsyonu (lizis solüsyonunda kullanılan stok solüsyonu) %0,45 NaCl (500 mL %0,9’luk NaCl 1000 cc distile su ile tamamlanarak) 5N ve 1N HCl [1N HCl:8.98mL HCl 100 mL distile su ile tamamlanarak, dansite:1,16, ağırlık oranı:%35]

0,2 µm porlu polietersülfon filtre (MiniSart® enjektör filtre) 50 cc’lik steril kaplar

Yıkama solüsyonunun hazırlanması

900 mL %0,45’lik NaCl içine 5 mL %10’luk stok solüsyonu, elde edilen karışıma da 2,84 gram Na2HPO4 eklenerek ve manyetik karıştırıcıya konuldu. Karışım pH metre ile sürekli ölçülerek ve HCl eklenerek pH 7,2’ye ayarlandı. %0,45’lik NaCl ile solüsyon 1000 cc’ye tamamlandı. 0,2 µm porlu polietersülfon filtreden süzülerek 50 cc’lik steril kaplara, üzerlerine tarih yazılarak bölüştürüldü.

3.3.5. MALDI TOF destekli lizis filtrasyon işleminin uygulanması

Lizis filtrasyon sırasında pozitif kan kültürü şişesinden alınan 2 ml kan kültürü sıvısına 1 mL lizis solüsyonu (%0,6 Brij 97+ 0,4M CAPS, pH: 11,7) eklenip beş saniye vortekslendi. Elde edilen lizat iki dakika beklendikten sonra 2 cm çapında 0.45 µm’lik kalınlıktaki polietersülfon filtreden 40 sn boyunca vakum aspirasyon cihazı yardımıyla filtre edildi. Kalan pellet 3 ml yıkama solüsyonu (20 nM Sodyum fosfat + %0,05 Brij 97+ %0,45 NaCl, pH 7,2) ile üç kez yıkandı. Filtrede kalan rezidü pellet polyester başlıklı sürüntü çubuğuyla (Cleanmo TX743) Vitek MS tanımlama tablasına aktarıldı ve CHCA (α-Siyano-4-hidroksisinnamik asit) matriks uygulaması sonrası tanımlama gerçekleştirildi.

3.3.6. VerigeneBlood Culture Assay (Nanosphere Inc. Northbrook, ABD) Çalışmada, kan dolaşımı enfeksiyonuna sebep olabilecek gram negatif bakterilerin eş zamanlı tanımlanması için kalitatif ve multipleks bir yöntem olan Verigene sistemi kullanıldı. Bu test kan kültürü sistemi tarafından pozitif olarak saptanan ve gram negatif bakteri içerdiği belirlenen BacT/Alert Plus FN-FA kan kültürü şişeleri kullanılarak gerçekleştirildi. Kan kültürü cihazında pozitif sinyal verdikten sonra çıkarılan şişelerden alınan örnekler, Gram ile boyanarak uygun olan testle çalışıldı. Testin veritabanında bulunan bakteriler ve direnç genleri Tablo 3’te gösterilmiştir.

(29)

21 Tablo 3. “VerigeneBlood Culture Assay” veritabanındaki bakteriler ve direnç genleri

Organizma/Direnç geni Hedef gen Cins Tür Direnç belirteci Acinetobacter spp . rpsA Acinetobacter - - Citrobacter spp. ompA/mrkC Citrobacter - - Enterobacter spp. gyrB/metB Enterobacter - - Proteus spp. atpD Proteus - - Escherichia coli oppA - E. coli - Klebsiella pneumoniae yggE - K. pneumoniae - Klebsiella oxytoca ompA - K. oxytoca - Pseudomonas aeruginosa sodA - P. aeruginosa - Serratia marcescens chiC/ampC - S. marcescens -

CTX-M CTX-M - - CTX-M

KPC KPC - - KPC

NDM NDM - - NDM

VIM VIM - - VIM

IMP IMP - - IMP

OXA OXA - - OXA

Bu sistem Verigene Processor SP ve Verigene Reader olmak üzere iki modülden oluşmaktadır. Verigene Processor SP test protokolünü iki adımda gerçekleştirir.

(i) Örnek hazırlama: Pozitif kan kültürü şişelerinden hücre lizisi ve manyetik boncuk tabanlı nükleik asit ekstraksiyonu.

(ii) Hibridizasyon: Bir mikroarray formatındaki ve aracı hedefe özel yakalama DNA'sının bakteriyel DNA hibridizasyonu ve yakalanmış bakteriyel nükleik asitlere altın nanopartiküllü prob hibridizasyonu. Yakalama sahalarında bağlı altın nanopartikül problarının gümüş ile güçlendirmesi, okuyucu tarafından optik olarak değerlendirilebilen altın-gümüş agregatlar ile sonuçlanmaktadır.

Her ekstraksiyon tepsisi lizis/bağlayıcı tampon, parçalayıcı enzimleri, yıkama solüsyonları ve tampon solüsyonları gibi nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve test sonucu elde etmek için gerekli tüm solüsyonlarla önceden doldurulmuş halde gelmektedir ve bu malzemeler 2-8 °C sıcaklıkta tutulmaktadır. Her bir kullanım tepsisi (utility tray) nükleik asitlerin ekstraksiyonu için gerekli çözeltiler ile önceden yüklenmiş olarak gelmiş ve üretici talimatlarına uygun olarak -20°C’de saklanmıştır.

Test çalışmasında, 10 dakikada oda ısısında bekletilen tek kullanımlık materyaller (ekstraksiyon tepsisi, kullanım tepsisi, pipetler) Verigene Processor SP'ye yüklenerek, 700 µL pozitif kan kültürü örneği ekstraksiyon tepsisine pipetlendi. Daha sonra test kartuşu numarası ile örnek bilgileri girilerek Verigene Reader'da test başlatıldı.

(30)

22 Otomatize ve kapalı sistemde ekstraksiyon, amplifikasyon ve sinyal güçlendirimi basamakları iki saat içinde tamamlanıktan sonra test kartuşunun substrat slaytı Verigene Reader'a yerleştirilerek test sonuçları değerlendirildi.

3.3.7. İstatiksel Analiz Yöntemi

İstatiksel analiz yöntemi olarak Cohen’nin Kappa katsayısı SPSS 18.0 programı ile hesaplandı. Cohen'in kappa katsayısı iki değerleyici arasındaki karşılaştırmalı uyuşmanın güvenirliğini ölçen bir istatistik yöntemidir (50). Cohen'in kappa ölçüsü her biri N tane maddeyi C tane birbirinden karşılıklı hariç olan kategoriye ayıran iki değerleyicinin arasında bulunan uyuşmayı ölçer. Ortaya çıkan kategorik değişken olduğu için bir parametrik olmayan istatistik türüdür. Cohen'in kappa ölçüsü bu uyuşmanın bir şans eseri olabileceğini de ele aldığı için basit yüzde orantı olarak bulunan uyuşmadan daha güçlü bir sonuç verdiği kabul edilir. Cohen'in kappa ölçüsü sadece iki tane değerleyiciyi ele alır (50). En sık saptanan üç bakteri olan Klebsiella,

Acinetobacter ve Escherichia türlerinin kültür sonuçları ile lizis filtrasyon ve

mikroarray testleri ile uyumu hesaplandı. Cohen’in kappa değerinin değerlendirilmesinde Landis ve Koch’un tablosu kullanıldı (51) (Tablo 4).

Kültür sonrası MALDI TOF MS yöntemi ile elde edilen sonuç altın standart kabul edilerek duyarlılık hesaplandı. Altın standart olarak kulanılan kültür sonrası MALDI TOF yönteminin moleküler bir yöntemle verifikasyonu yapılamadığı için özgüllük hesaplanmadı.

Tablo 4. Kappa katsayısı değerlendirme tablosu (51)

Katsayı Yorum

< 0 Hiç uyuşma olmamasi 0.0 — 0.20 Önemsiz uyuşma olması 0.21 — 0.40 Orta derecede uyuşma olması 0.41 — 0.60 Ekseriyetle uyuşma olması 0.61 — 0.80 Önemli derecede uyuşma olması 0.81 — 1.00 Neredeyse mükemmel uyuşma

(31)

23

4. BULGULAR

Bu çalışmada Kasım 2015-Şubat 2016 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi erişkin yoğun bakım ünitelerinde izlenen hastalardan alınan ve belli gram negatif bakteri üremesi saptanan 39 kan kültürü şişesi değerlendirildi. Gram pozitif üreme saptanan, birden fazla üreme gözlenen, pediatrik ve serviste yatmakta olan hastalardan alınan kan kültür örnekleri çalışmaya dâhil edilmedi. Çalışmaya alınan tüm kan kültürü örnekleri dört kategoride incelendi:

 Kan kültürü pozitif sinyal verme süreleri

 Pozitif sinyal sonrası konvansiyonel ve MALDI TOF MS yöntemleri ile kombine identifikasyon ve otomatize duyarlılık testleri

 Lizis filtrasyon ve MALDI TOF MS kombine edildiği identifikasyon yöntemi  Mikroarray yöntemiyle etken identifikasyonu ve direnç geni belirlenmesi

4.1. Pozitif sinyal süreleri

Kan kültürü cihazındaki pozitif sinyal alınma süreleri dakika bazında Tablo 5’de gösterilmiştir. En kısa 7 saat 55 dakika, en uzun 31 saat 22 dakika, ortalama pozitiflik süresi 12 saat 55 dakika olarak belirlenmiştir.

Tablo 5. Kan kültürünün pozitiflik verme süreleri (dakika)

SIRA NO KÜLTÜR SONUCU KÜLTÜR SONUÇ SÜRESİ (DAKİKA) SIRA NO KÜLTÜR SONUCU KÜLTÜR SONUÇ SÜRESİ (DAKİKA) 1 A.baumanii 651 21 P.aureginosa 583 2 A.baumanii 654 22 E.coli 1334 3 K.pneumoniae 560 23 A.baumanii 754 4 S.marcescens 747 24 A.baumanii 662 5 K.pneumoniae 915 25 K.pneumoniae 940 6 C.freundii 667 26 E.cloaceae 538 7 A.baumanii 590 27 E.coli 1064 8 E.coli 475 28 C.freundii 688 9 A.baumanii 505 29 K.pneumoniae 694 10 K.oxytoca 630 30 A.baumanii 928 11 E.coli 1902 31 E.coli 535 12 E.cloaceae 481 32 P.aureginosa 970 13 C.koseri 724 33 E.coli 1271 14 K.pneumoniae 691 34 K.pneumoniae 508 15 K.pneumoniae 624 35 A.baumanii 821 16 A.baumanii 910 36 A.baumanii 1744 17 K.pneumoniae 683 37 E.coli 693 18 K.pneumoniae 749 38 K.pneumoniae 508 19 K.pneumoniae 538 39 K.pneumoniae 582 20 A.baumanii 714

(32)

24 4.2. İdentifikasyon sonuçları

Çalışmaya alınan toplam 39 bakteriyemi etkeninin konvansiyonel kültür ve MALDI TOF MS yöntemiyle yapılan identifikasyonunda en sık saptanan üç etken K.

pneumoniae (12, %30.76), A. baumanii (11, %28.2) ve E. coli (7,%17.94) olarak

sıralanmıştır. Kültür sonrası MALDI TOF yöntemi, Lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF yöntemi ve mikroarray yöntemleri ile elde edilen identifikasyon sonuçları ayrı tablolar halinde Tablo 6, 7 ve 8’de sırasıyla paylaşılmıştır.

Subkültür sonrası oluşan kolonilerden lizis filtrasyon ve MALDI TOF MS kombinasyonu (LFM) yöntemi ile ve pozitif sinyal sonrası, direkt kan kültürü şişesinden uygulanan mikroarray yöntemi ile elde edilen bakteri tanımlama sonuçları da Tablo 9’da karşılaştırmalı olarak sunulmuştur. Kültür sonrası MALDI TOF identifikasyonu ile LFM identifikasyonu karşılaştırıldığında %82 (32/39) benzerlik saptanmıştır. Kültür ile kombine MALDI TOF MS altın standart olarak kabul edildiğinde, duyarlılık %82 olarak hesaplanmıştır. Mikroarray ile kültür yönteminin sonuçları birbiriyle %87.1 (34/39) oranında benzerlik göstermiştir. Kültür ile kombine MALDI TOF MS altın standart olarak kabul edildiğinde, duyarlılık %87.1 hesaplanmıştır. LFM ile mikroarray yöntemlerinin birbirleri ile benzerliği % 79.4 (31/39) bulunmuştur. Her üç yöntemin birlikte tutarlı sonuç verdiği örneklerin oranı ise %76.9 (30/39) olarak hesaplanmıştır. Kültür yöntemi ile LFM yöntemleri ile en sık saptanan üç etken olan Acinetobacter, Escherichia ve Klebsiella cinsleri ele alınarak iki yöntem arasındaki uyum Cohen’nin kappa katsayısı ile hesaplanmış sonuçlar ve uyum değerleri Tablo 10’da gösterilmiştir. Aynı şekilde en sık saptanan üç etken ele alındığında, kültür yöntemi ile mikroarray yönteminin uyumu Cohen’in kappa katsayısı ile hesaplanmış ve Tablo 11’de sunulmuştur.

Dört kültür şişesinden yapılan lizis filtrasyon MALDI TOF kombinasyonlu tanı yöntemiyle sonuç elde edilemezken, iki kan kültürü şişesinden yapılan çalışmada konvansiyonel kültür yöntemiyle elde edilenden farklı bakteri tanımlanması yapılmıştır. Lizis filtrasyon yöntemi kullanılarak tanımlama yapılamayan dört şişenin üçünün kültüründe A. baumannii, bir örnekte de Citrobacter freundii identifiye edilmiştir. Farklı cins tayini yapılan iki örnekten birincisinde konvansiyonel yöntemle A. baumanii olarak identifiye edilen bakteri Clostridium perfiringens, ikincisinde ise konvansiyonel yöntemle K. pneumoniae, olarak identifiye edilen bakteri E. coli olarak tanımlanmıştır.

Çalışmaya alınan 39 örneğin üçünde (%7,69) mikroarray yönteminde “NO_CALL” hatası alınmış ve bu örnekler “tanımlama yapılamadı” olarak kabul edilmiştir.

(33)

25 Mikroarray yöntemiyle tanımlanamayan etkenler kültür ve ardından MALDI TOF yöntemiyle sırasıyla A. baumanii, S. marcescens ve E. coli olarak identifiye edilmiştir.

Tablo 6. Kültür sonrası MALDI TOF MS yöntemi ile elde edilen sayı ve oranlar

Etken Sayı Oran (%)

A.baumanii 11 28,2 C.freundii 2 5,1 C.koseri 1 2,6 E.cloaceae 2 5,1 E.coli 7 17,9 K.oxytoca 1 2,6 K.pneumoniae 12 30,8 P.aureginosa 2 5,1 S.marcescens 1 2,6 Toplam 39 100,0

Tablo 7. Lizis filtrasyon sonrası MALDI TOF MS ile elde edilen sayı ve oranlar

Etken Sayı Oran (%)

A.baumanii 7 17,9 C.freundii 1 2,6 C.koseri 1 2,6 C.perfringens 1 2,6 E.cloaceae 2 5,1 E.coli 9 23,1 K.pneumoniae 11 28,2 P.aureginosa 2 5,1 S.marcescens 1 2,6 yok 4 10,3 Toplam 39 100,0

Tablo 8. Mikroarray ile saptanan etkenlerin sayı ve oranları

Etken Sayı Oran (%)

Acinetobacter spp. 10 25,6 C.freundii+Enterobacter 1 2,6 Citrobacter spp. 2 5,1 E.coli 8 20,5 Enterobacter spp. 2 5,1 K.pneumoniae 11 28,2 NO_CALL HATASI 3 7,7 P.aureginosa 2 5,1 Toplam 39 100,0

Şekil

Tablo 2. Sepsis oluşumunda predispozan faktörler (3)
Tablo 4. Kappa katsayısı değerlendirme tablosu (51)
Tablo 5. Kan kültürünün pozitiflik verme süreleri (dakika)
Tablo 6. Kültür sonrası MALDI TOF MS yöntemi ile elde edilen sayı ve oranlar
+2

Referanslar

Benzer Belgeler

By co-operating with different laser induced light, it can be applied to different substance analysis, and b y the scattering light excited by laser, substances can be corresponded

Ek olarak MALDI-TOF MS yöntemiyle idrar örneğinden direkt bakteri tanımlanması öncesinde Gram boyama uygulamasının etkinliği araştırılmış ve Gram boyamanın

Bu çalışmada, deterjan bir madde olan Tween ® 80 kullanımı ile doğrudan pozitif sinyal veren kan kültürü şişesinden etkenin tanımlanmasına yönelik basit, kolay

Sonuç olarak; bla OXA-51-benzeri gen varlığı ile ARDRA sonuçları uyumlu bulunmuş (179/180, %99.4) ve A.baumannii tür düzeyinde tanımlanması için referans

EMB agar besiyerinden direkt okumada, çalışılan 468 izolatın 382’si (%81.6) tür düzeyinde doğru olarak tanımlanmıştır, 80 (%17) izolat tanımlanamamış ve 6 (%1.2)

Çalışmamızda, Candida türlerinin tanımlamasında altın standart yöntem olarak DNA dizi analizi yöntemi referans alınarak, tam otomatize tanımlama sistemi Phoenix™ Yeast

Enfektif endokardit etkeni olarak sıklıkla karşımıza çıkan viridans grup streptokoklar (VGS)’ın doğ- ru tanımlanması her zaman klinik mikrobiyoloji laboratuvarı

MALDI- TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) sistemi direkt olarak pozitif kan kültür şişelerinden bakteri tanımlamasına imkan