Streptococcus pneumoniae’da mef(A)/(E) Denetimindeki
Aktif Makrolid Pompas›n›n, erm(B) Denetimindeki
Makrolid Direncine Katk›s›: Marmara Üniversitesi
Hastanesi 2009 Sonuçlar›
The Contribution of mef(A)/(E) Mediated Active Macrolide
Efflux to the erm(B) Mediated Macrolide Resistance in
Streptococcus pneumoniae: 2009 Results of
Marmara University Hospital
Burçin Karaçanl›, Burak Aksu, Ufuk Hasdemir
Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Kad›köy-‹stanbul ÖZET
Amaç: Bu çal›flmada enfeksiyon etkeni olarak izole edilen Streptococcus pneumoniae izolatlar›nda, makrolid direncinin fenotipik özelliklerinin ve genetik belirleyicilerinin saptanmas› amaçland›.
Gereç ve Yöntem: Eritromisin direnci gösteren 50 S. pneumoniae izolat›n›n 14-, 15- üyeli makrolid ve linkozamid duyarl›l›klar› disk difüzyon ve s›v› mikrodilüsyon yöntemleriyle saptand›. Makrolid direnç fenotiplerini belirlemek üzere eritromisin-klindamisin çift disk testi kullan›ld›. Makrolid direncinin genetik belirleyicileri olan, mef(E)/(A), erm(B) ve erm(TR)’nin saptanmas›nda PZR yöntemi kullan›ld›.
Bulgular: ‹zolatlar›m›z›n %70’i cMLSB, %28’i M ve %2’si iMLSB fenotipi gösterdi. PZR sonuçlar›na göre 20 izolatta (%40) tek bafl›na erm(B); 15 izolatta (%30) tek bafl›na mef(E)/(A) geni; geri kalan 15 (%30) izolatta ise her iki gen birlikte saptand›. erm(B) geni tafl›yan tüm izolatlar (%70), yüksek düzey makrolid ve linkozamid direnci gösterdi. Yaln›z mef(E)/(A) geni tafl›yan izolatlar›n (%30) makrolid M‹K’leri ise göreceli olarak düflük bulundu. Bu izolatlar›n klindamisin M‹K’leri duyarl›l›k s›n›rlar› içinde kald›.
Sonuç: Çal›flmam›zda mef(A)/(E) geninin izolatlar›n %60’› taraf›ndan tafl›nd›¤›n›n gösterilmesi ayr›ca M fenotipine sahip izolatlar›n oran›n›n da oldukça yüksek (28%) bulunmas›, aktif makrolid pompas›n›n, ribozomal hedef mutasyonuyla birlikte hastanemiz pnömokok izolatlar›n›n makrolid direncinde çok önemli rolü oldu¤unu ortaya koymaktad›r.
Anahtar Kelimeler: Streptococcus pneumoniae, makrolid direnci
G‹R‹fi
Streptococcus pneumoniae, toplum kaynakl› pnömoni baflta olmak üzere akut otitis media, akut bakteriyel sinüzit ve kronik bronflit alev-lenmelerinin önde gelen etkenlerinden biri olup menenjit ve bakteriyemi gibi morbiditesi ve mortalitesi yüksek enfeksiyonlara da yol açan çok önemli bir patojendir. Bu patojenin neden oldu¤u enfeksiyonlar›n tedavisinde uzun y›llar baflar› ile kullan›lan penisiline karfl› direnç gös-teren pnömokok izolatlar›n›n tüm dünyada h›zla yay›lmas›, alternatif antibiyotiklerin tedavi pro-tokoluna girmesini zorunlu k›lm›fl ve bunlar aras›nda makrolid grubu antibiyotikler, yüksek etkinlikleri, düflük yan etkileri, doku ve serum-da yüksek konsantrasyona ulaflma özellikleri ile ön s›rada yerlerini alm›fllard›r (1). Ne var ki, pnömokoklar makrolidlere karfl› direnç gelifltir-mekte de gecikmemifller ve özellikle son 20 y›l-dan bu yana dünyan›n birçok bölgesinde mak-rolidlere dirençli pnömokok izolatlar›n›n say›s›-n›n giderek artt›¤› bildirilmifltir (2). Pnömokok-larda makrolid direncinin en yüksek oldu¤u uzak-do¤u Asya’dan %80-90’lara ulaflan mak-rolid direnç oranlar› bildirilmektedir (3).
Bölge-mize gelince Avrupa Antimikrobiyal Direnç ‹z-leme Sistemi’nin (EARSS) 2007 y›l› raporuna göre invaziv örneklerden (kan, BOS) izole edi-len pnömokoklarda makrolid direnç oranlar›, Fransa, ‹talya, Macaristan, Finlandiya ve K›b-r›s’ta % 25-50; ‹zlanda, ‹rlanda, Portekiz, Belçi-ka, Avusturya, ‹sviçre, H›rvatistan, Bulgaristan, Romanya ve Türkiye’de % 10-25; ‹ngiltere, Norveç, ‹sveç, Almanya, Hollanda, Çek Cum-huriyeti ve Litvanya’da % 5-10 aras›ndad›r (4). EARSS’›n 2008 y›l› raporunda Türkiye, %29’luk oranla, pnömokok izolatlar›nda mak-rolid direncinin % 25-50 aras›nda bildirildi¤i ‹talya, Fransa, Macaristan ve K›br›s ile ayn› grupta yerini alm›flt›r (5).
S. pneumoniae’nin klinikte önem tafl›yan mak-rolid direncinden sorumlu olan iki ana mekaniz-ma tan›mlanm›flt›r. Bunlardan birincisinde transpozonlarla (Tn917, Tn6002 vb) tafl›nan ‘erythromycin ribosomal methylase B’ [erm(B)] geninin kodlad›¤› metilaz enzimi arac›l›¤› ile 23S rRNA’daki adeninin metilasyonu sonucu antibiyoti¤in hedefinde de¤ifliklik ortaya ç›k-maktad›r. Bu genin yap›sal ifadesi yüksek
dü-SUMMARY
Objective: In this study, we aimed to determine phenotypic characteristics and genetic determinants of macrolide resistance in clinical isolates of Streptococcus pneumoniae.
Materials and Methods: In 50 erythromycin resistant S. pneumoniae isolates, 14-, 15- membered macrolides and lincosamide susceptibilities were determined by both disk diffusion and broth microdilution methods. Erythromycin -clindamycin double disk method was applied for the detection of macrolide resistance phenotypes. Genetic determinants of macrolide resistance, erm(B), erm(TR) and mef(A)/(E) were investigated by PCR.
Results: The percentages of the isolates presenting cMLSB, M and iMLSB phenotypes were 70%, 28%, and 2%, respectively. According to the PCR results, 20 isolates (40%) had erm(B) alone and 15 isolates (30%) had mef(E)/(A) alone. In the remaining 15 (%30) isolates, erm(B) and mef(A)/(E) genes were found concomitant. All erm(B) positive isolates (70%) presented high level macrolide and lincosamide resistance. In contrast, macrolide MICs of the isolates carrying mef(A)/(E) gene alone (30%), were relatively low while their clindamycin MICs remained in the susceptible ranges.
Conclusion: Demonstration of mef(A)/(E) gene and M phenotype in the 60% and 28% of the isolates, respectively in this study suggests that active macrolide efflux together with the ribosomal target mutation has significant role in the macrolide resistance of our pneumococcal isolates.
zey makrolid, linkozamid, streptogramin B di-renciyle iliflkili olup cMLSB fenotipinin ortaya
ç›kmas›na yol açar. ‹ndüklenebilir tipte ifadesi ise iMLSBfenotipinin ortaya ç›kmas›na;
indük-leyici makrolid ajan›n varl›¤›nda direnç gelifl-mesine yol açar (6,7). erm(TR) geni taraf›ndan kodlanan metilaz enzimi de nadir olarak S. pne-umoniae’da makrolid, linkozamid, streptogra-min B direncine neden olabilir (8). Pnömokok-larda MLSB fenotipi Asya, Avrupa ve Güney
Afrika’da yayg›n görülen bir fenotiptir (2). Ül-kemizde yap›lan baz› çal›flmalar da, makrolid dirençli pnömokoklarda MLSB fenotipinin
bas-k›n oldu¤unu göstermektedir (9-11). S. pneumo-niae’da ikinci ana makrolid direnç mekanizma-s›, ilk kez Streptococcus pyogenes’te bulunan daha sonra S. pneumoniae’da da gösterilen mef(A) ile varl›¤› ilk kez S. pneumoniae’da gös-terilen mef(E) geninin kodlad›¤› aktif pompa proteinleri taraf›ndan 14- ve 15- üyeli makrolid-lerin hücre d›fl›na pompalanmas› ile ortaya ç›-kan direnç meç›-kanizmas›d›r. Bu meç›-kanizmaya sahip pnömokoklar M fenotipi gösterir ve 16-üyeli makrolidlere, linkozamidlere ve streptog-ramin B’ye duyarl› kal›r (12,13). M fenotipine sahip pnömokok izolatlar›n›n oran› Amerika ve Japonya’da %60-80’lere ulafl›rken Avrupa’da %20’lerin alt›nda kalmaktad›r (14). Pnömokok-larda aralar›nda %90’›n üzerinde homoloji bu-lunan bu iki genden mef(A), Tn1207.1 üzerinde; mef(E) ise ‘macrolide efflux genetic assembly’ (mega) olarak adland›r›lan genetik element tara-f›ndan tafl›nmaktad›r (6). mef(E) tafl›yan pnömo-koklara Kuzey ve Güney Amerika ile Asya’da; mef(A) tafl›yanlara ise Avrupa’da daha s›k rast-lanmaktad›r (15).
Pnömokoklarda makrolid direncinden sorumlu mekanizmalar›n bilinmesi, bu tür kökenlerin yol açt›¤› enfeksiyonlardan korunmada ve tedavi yaklafl›mlar›n›n düzenlemesinde büyük öneme
sahiptir. Bu çal›flmada hastanemizde enfeksiyon etkeni olarak izole edilen ve makrolidlere di-rençli bulunan S. pneumoniae izolatlar›nda, makrolid direncinin fenotipik özelliklerini ve genetik belirleyicilerinin saptanmas›n› amaçlad›k.
GEREÇ ve YÖNTEM
Ocak-Aral›k 2009 tarihleri aras›nda Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi Hastanesi Mikrobi-yoloji Laboratuvar›’na gönderilen çeflitli klinik örneklerden, enfeksiyon etkeni olarak izole edi-len 118 S. pneumoniae kökeni aras›ndan rutin disk difüzyon testi ile eritromisine dirençli bu-lunan 50 köken çal›flmaya dahil edildi. ‹zolatlar›n tan›mlanmas› standart yöntemlerle yap›ld› (16). Elli S. pneumoniae izolat›n›n % 94’ü solunum yolu örneklerinden, % 4’ü beyin omurilik s›v›s› (BOS), % 2’si kan örneklerinden izole edildi. ‹zolatlar›n eritromisin, klaritromisin, azitromi-sin ve klindamiazitromi-sin duyarl›l›klar› disk difüzyon yöntemiyle belirlendi. Ayr›ca ayn› antibiyotikle-rin minimum inhibitör konsantrasyonlar›n›n (M‹K) saptanmas›nda s›v› mikrodilüsyon yön-temi kullan›ld› (17,18). ‹zolatlar›n makrolid grubu antibiyotiklere direnç fenotiplerini sapta-mada eritromisin ve klindamisin çift disk meto-du kullan›ld› (17). Makrolid direncinden sorum-lu genetik determinantlar, erm(B), erm(TR), mef(A)/(E) varl›¤› PZR yöntemi ile araflt›r›ld›. Bu amaçla, bakteri DNA izolasyonu ‘Roche High Pure PCR template Preparation’ kiti (Roche, Almanya) ile üretici firman›n önerileri do¤rultusunda yap›ld›. Ard›ndan her gene özgü primerler kullan›larak polimeraz zincir reaksi-yonu ile hedef bölge amplifikasreaksi-yonu yap›ld›. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullan›lan pri-merler, erm(B) için f 5’-ATTGGAACAGGTA-AAGGGC-3’ ve r 5’-GAACATCTGTGG-TATGGCG-3’; erm(TR) için f 5’-ACAGAAA-AACCCGAAAAATACG-3’ ve r
5’-TTGGA-TAATTTATCAAGATCAG-3’; mef(A)/(E) geni tespiti için iki farkl› primer seti kullan›lm›flt›r. Bunlardan biri mef(A)’ya özgü oldu¤u bildiri-len, f 5’-TGGTTCGGTGCTTACTATTGT-3’ ve r 5’-CCCCTATCAACATTCCAGA-3’ dizisine sahip primer çifti; di¤eri ise mef(E)’ye özgü ol-du¤u bildirilen, f 5’-GGGAGATGAAAAGA-AGGAGT-3’ ve r 5’-TAAAATGGCACCGA-AAG-3’ dizisine sahip primer çiftidir. Amplifi-kasyon için PZR koflullar›, bafllang›ç denatüras-yonu için 94°C’de 4’, 1 siklus; denatürasyon için 94°C’de 1’, primer ba¤lanma için 55°C’de 1’, [erm(TR) için 50°C], uzama (elongasyon) için 72°C’de 1’, 30 siklus ve son uzama (final elongasyon) için 72°C’de 7’, 1 siklus olarak uy-guland› (19-22).
Polimeraz zincir reaksiyonu testlerinde, erm(B) pozitif S. pneumoniae ATCC 700677, mef(A) pozitif S. pneumoniae ATCC 700676, mef(E) pozitif S. pneumoniae KTL spn-237 ve erm(TR) pozitif Streptococcus pyogenes A200, pozitif kontrol kökenler olarak; bu genlerin hiç birini tafl›mayan S. pneumoniae ATCC 700675 ise ne-gatif kontrol köken olarak kullan›ld› (23,24).
BULGULAR
Çal›flmaya dahil edilen S. pneumoniae izolatla-r›n›n hepsi disk difüzyon yöntemiyle test edilen 14- ve 15- üyeli makrolidlerin hepsine
(eritro-misin, klaritro(eritro-misin, azitromisin) dirençli bu-lunmufltur. Klindamisin direnci ise izolatlar›n %70’inde belirlenmifl olup, 15 izolat (%30), disk difüzyon testinde klindamisine duyarl› sap-tanm›flt›r. Makrolid direnç fenotipini belirlemek üzere eritromisin-klindamisinle yap›lan çift disk testinde de, izolatlar›n %70’i (n:35) cMLSB;
%2’si (n:1) iMLSB, %28’i (n:14) ise M
fenoti-pinde bulunmufltur (Tablo 1). cMLSBfenotipine
sahip izolatlar›n hepsinin s›v› mikrodilüsyon testinde tüm antibiyotiklere karfl› yüksek düzey direnç gösterdi¤i saptanm›fl olup makrolid ve linkozamid M‹K50/M‹K90 de¤erleri Tablo 1’de
verilmifltir. M fenotipi gösteren izolatlar›n (%28) makrolid M‹K de¤erleri göreceli olarak düflük olup, klindamisin M‹K’leri duyarl›l›k s›-n›rlar› dahilinde saptanm›flt›r (Tablo 1).
Makrolid direnç genlerini saptamak üzere yap›-lan PZR testi sonuçlar›na göre erm(B) geni tek bafl›na izolatlar›n %40’›nda, mef(A)/(E) geni tek bafl›na izolatlar›n %30’unda, her iki gen birlikte izolatlar›n %30’unda saptanm›flt›r (Tablo 1). erm(B)’yi tek bafl›na ya da mef(A)/(E) ile birlik-te tafl›yan izolatlar›n tümü (%70), cMLSB
feno-tipine sahip olup, makrolid ve linkozamid M‹K’leri yüksek düzeydedir (Tablo 1). Tek ba-fl›na mef(A)/(E) tafl›yan 15 izolat›n 14’ü, M fe-notipi göstermifl olup, makrolid M‹K’leri, cMLSB fenotipindekilere k›yasla düflük olarak
Tablo 1. Streptococcus pneumoniae izolatlar›n›n makrolid-linkozamid direnç fenotipi ve genotipi
Makrolid direnç genleri da¤›l›m› (%) Eritromisin Azitromisin Klaritromisin Klindamisin µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml Makrolid fenotip ermB mefA/E ermB+mefA/E Toplam M‹K50 M‹K90 M‹K50 M‹K90 M‹K50 M‹K90 M‹K50 M‹K90
da¤›l›m› cMLSB a 20 (40) - 15 (30) 35 (70) >512 >512 >512 >512 512 512 256 512 iMLSBb - 1 (2) - 1 (2) -c - - - -M - 14 (28) - 14 (28) 4 16 8 32 2 4 0.06 0.06 Toplam 20 (40) 15 (30) 15 (30) 50 (100) a konstititüf MLSB fenotipi bindüklenebilir MLSB fenotipi c
saptanm›flt›r. Klindamisin M‹K’leri ise duyarl›-l›k s›n›rlar› dahilinde kalm›flt›r. mef(A)/(E) tafl›-yan 15 izolattan iMLSBfenotipi gösteren birinin
makrolid M‹K de¤erleri M fenotipindeki izolat-lara benzer flekilde göreceli oizolat-larak düflüktür. Bu izolat›n da klindamisin M‹K’i duyarl›l›k s›n›rlar› içindedir. Araflt›r›lan di¤er makrolid direnç geni, erm(TR), izolatlar›n hiç birinde saptanmam›flt›r. Polimeraz zincir reaksiyonunda makrolid pom-pa genini saptamak üzere mef(A) ve mef(E)’ye özgü olduklar› bildirilen iki farkl› primer seti kullan›lm›flt›r. Bu iki setten mef(A)’ya özgü ol-du¤u ileri sürülen primer çiftiyle yap›lan PZR testlerinde pozitif sonuç elde edilmemifltir. ‹zo-latlarda aktif makrolid pompa geni varl›¤›, mef(E)’ye özgü primer çifti ile yap›lan PZR test-leriyle gösterilmiflitir. Bu primer çiftiyle elde edi-len PZR pozitifli¤i, mef(A) ve mef(E) genleri ara-s›ndaki yüksek homolojiden ötürü spesifiye etme-den mef(A)/(E) pozitifli¤i olarak ifade edilmifltir.
TARTIfiMA
S. pneumoniae izolatlar› aras›nda makrolid gru-bu antibiyotiklere karfl› direncin h›zla yay›lma-s›, bu grup antibiyotiklerin pnömokok enfeksi-yonlar›n›n tedavisinde uzun vadeli olarak kulla-n›m›n› tehdit eder niteliktedir. Son 10 y›ldan bu yana yap›lan çal›flmalar, dünyan›n bir çok böl-gesinde oldu¤u gibi ülkemizde de makrolidlere direnç gösteren pnömokoklar›n insidans›n›n gi-derek artt›¤›n› ortaya koymaktad›r (9-11). Has-tanemize ait direnç sürveyans verileri, makrolid dirençli pnömokoklar›n oran›n›n bir y›l içinde %14.6 oran›nda art›fl göstererek 2009’da %43.2’ye yükseldi¤ini göstermektedir (25). Hastanemizde 2009 y›l›nda izole edilen makro-lid dirençli 50 pnömokok izolat›nda makromakro-lid direncinin fenotipik ve genotipik karakteristik-lerini belirlemek üzere yapt›¤›m›z bu çal›flmada,
izolatlar›m›z›n %70’inin cMLSB fenotipinde,
%28’inin M fenotipinde ve %2’sinin de iMLSB
fenotipinde oldu¤unu saptad›k. cMLSB
fenoti-pindeki izolatlar, beklenildi¤i gibi s›v› mikrodi-lüsyon testinde 14- ve 15- üyeli makrolidlerin (eritromisin, azitromisin, klaritromisin) hepsine ve klindamisine karfl› yüksek düzeyde dirençli bulundular (Tablo 1). Buna karfl›n M fenotipine sahip izolatlar›n makrolidlere düflük düzeyde direnç gösterdikleri, klindamisin M‹K’lerinin ise duyarl›l›k s›n›rlar› içinde kald›¤› tespit edildi (Tablo 1). Bu sonuçlar cMLSB fenotipini,
mak-rolid dirençli pnömokok izolatlar›m›zda yayg›n fenotip olarak karfl›m›za ç›kartmakta ve ribozo-mal hedef de¤iflikli¤inin, izolatlar›m›z›n yüksek düzey makrolid direncinden sorumlu ana meka-nizmas› oldu¤unu kuvvetle düflündürmektedir. Bununla birlikte, çal›flmam›zda M fenotipinin %28 gibi az›msanmayacak bir oranda tespit edilmesi, ribozomal hedef de¤iflikli¤inin yan› s›ra aktif makrolid pompas›n›n da, izolatlar›m›-z›n makrolidlere karfl› direncinde etkin rolü ol-du¤unu göstermektedir. Fenotipik test sonuçla-r›m›z ayr›ca M fenotipine sahip pnömokok izo-latlar›n›n oran›n›n bir y›lda belirgin olarak artt›-¤›n› da ortaya koymaktad›r. Hastanemizde 2008 y›l›nda izole edilen makrolid dirençli pnömo-koklarda M fenotipi %7.9 olarak tespit edilmifl-ken; bu oran›n 2009’da %28’lere ç›kmas›, aktif pompaya ba¤l› makrolid direncinin bölgemizde pnömokoklar aras›nda h›zla yay›ld›¤›na iflaret etmektedir (25). Ülkemizde yap›lan di¤er çal›fl-malar, MLSB fenotipine sahip pnömokoklar›n
bizdekine k›yasla çok daha yüksek (>%95) oranlarda oldu¤unu ve M fenotipine sahip pnö-mokoklar›n oran›n›n ise %5-18 aras›nda oldu¤u göstermektedir (9-11).
Makrolid direncinin genetik determinantlar›n› belirlemek üzere yap›lan PZR testiyle, izolatla-r›n %40’›nda erm(B) genini, %30’unda
mef(A)/(E) genini tek bafllar›na, %30’unda da her iki geni birlikte saptad›k (Tablo 1). ‹zolatla-r›m›zda mef(A)/(E) geninin toplamda %60’l›k bir oranla, erm(B) geninin saptanma oran›na (%70) yak›n bir oranda tespit edilmifl olmas› ça-l›flmam›z›n en çarp›c› sonuçlar›ndan biridir. 2008 y›l›nda hastanemizde izole edilen makro-lid dirençli pnömokoklarda da mef(A)/(E) geni, benzer oranda (%61.5) bulunmufltur. Bu sonuç-lar, hastanemiz pnömokok izolatlar›nda mef(A)/(E) bask›nl›¤›n›n süreklili¤ine iflaret et-mektedir (25). mef(A)/(E)’nin makrolid direnci-nin tek genetik determinant› olarak bulundu¤u izolatlar›n (%28) biri hariç tamam›, beklenildi¤i üzere M fenotipinde bulunmufltur. Ancak mef(A)/(E)’nin erm(B) ile birlikte saptand›¤› izolatlarda (%30), aktif makrolid pompa geni kendini fenotipte ifade edememifl, erm(B)‘nin varl›¤›, yüksek düzey makrolid ve linkozamid direncine yol açarak, bu izolatlarda M fenotipi geliflimini engellemifltir.
Son y›llarda makrolid direnci gösteren pnömo-kok izolatlar›nda erm(B) ve mef(A)/(E) genleri-nin birlikte bulunma s›kl›¤›n›n giderek artt›¤›na dikkat çekilmektedir. Bu iki geni bir arada tafl›-yan izolatlara özellikle Rusya, Güney Afrika, Asya ve Amerika Birleflik Devletleri’nde rast-lanmaktad›r (2). Ülkemizin de¤iflik bölgelerinde yap›lan çal›flmalarda, her iki geni birlikte tafl›-yan izolatlar›n oran›n›n % 2.5’u geçmedi¤i gö-rülmektedir (10,11). Çal›flmam›zda her iki mak-rolid direnç genini birlikte tafl›yan izolatlar›n oran› %30 olarak bulunmufltur ve bu yönüyle ülkemizde saptanm›fl en yüksek orand›r. Yap›lan çal›flmalarda, erm(B) ve mef(A)/(E) genlerinin, tetrasiklin direncinden sorumlu tetM ile birlikte Tn2010 üzerinde yer ald›¤› ve bu genleri tafl›-yan izolatlar›n ço¤unlukla serotip 19A ve klonal kompleks 320’de yer alan ve çoklu ilaç direnci gösteren kökenler olduklar› gösterilmifltir (2,4).
Pnömokoklarda aktif makrolid pompas›na ba¤l› direnç esas olarak iki genin kontrolu alt›ndad›r: Bunlardan biri mef(A), di¤eri ise mef(E)’dir. DNA hibridizasyonu, restriksiyon enzimleri ile kesim, PCR-RFLP gibi ileri moleküler yöntem-ler kullan›larak yap›lan çal›flmalar bu iki genin da¤›l›m›n›n da co¤rafik farkl›l›klar gösterdi¤ini ortaya koymaktad›r. Her iki gen aras›nda %90’›n üzerinde homoloji olmas›, bu genlerin PZR yöntemiyle ay›rt edilmesini zorlaflt›rmak-tad›r (26). Biz çal›flmam›zda iki gen aras›ndaki yüksek homolojiyi dikkate alarak, izolatlar›m›z-daki sorumlu aktif makrolid pompa genini sap-tama duyarl›l›¤›n› artt›rmak üzere, mef(A) ve mef(E)’ye özgü olduklar› bildirilen iki farkl› primer seti kulland›k. Bunlardan mef(A)’ya öz-gü primer çifti ile hiçbir izolatta pozitif sonuç elde edemedik. Buna karfl›n, mef(E)’ye özgü primer çifti ile yap›lan PZR’de, izolatlar›m›z›n %60’›nda mef geni varl›¤›n› gösterdik. Bu du-rum, PZR ile mef genini saptamaya yönelik araflt›rmalarda uygun primer çiftlerinin seçimi-nin önemini ortaya koymaktad›r. Öte yandan her ne kadar PZR testinin, mef(A) ve mef(E) ay›r›m›nda yetersiz kald›¤› ileri sürülüyorsa da, erm(B) olmaks›z›n sadece mef(A)/(E) geni tafl›-yan izolatlar›m›z›n makrolid M‹K de¤erlerinin, literatürde bildirilen mef(E) fenotipine benze-mesi, kökenlerimizdeki aktif pompa geninin mef(E) olabilece¤ini destekleyen bir bulgudur (19). Bu izolatlarda ileri moleküler analizlerle mef(A), mef(E) kesin ay›r›m›n›n yap›lmas›, böl-gemizde pnömokoklarda bask›n olan aktif mak-rolid pompa geninin belirlenmesi aç›s›ndan önemlidir.
iMLSB fenotipi gösteren bir izolatta, sadece
mef(A)/mef(E) geninin bulunmufl olmas› ve erm geninin saptanmam›fl olmas› çal›flmam›z›n di¤er bir ilginç bulgusudur. Bu izolat›n makrolid ve linkozamid M‹K de¤erleri, M fenotipindeki
izo-latlar›n M‹K de¤erleri gibi düflük bulunmufltur (Tablo 1). Literatürde iMLSB fenotipe sahip
olup da erm geni tafl›mayan ve sadece mef(A)/mef(E) geni bulunduran bir izolat bildi-rilmemifltir. Bu izolattaki makrolid direnç me-kanizmas›n›n ayd›nlat›lmas›na yönelik daha ile-ri çal›flmalara ihtiyaç vard›r.
Son olarak izolatlar›m›z›n % 28’inin M fenotipi göstermesi ve %60’›n›n mef(A)/(E) geni tafl›ma-s› dolay›tafl›ma-s›yla rutin laboratuvarda pnömokok izolatlar›n›n makrolid duyarl›l›klar›na ilaveten linkozamid duyarl›l›klar›n›n da test edilmesi ge-rekti¤ini düflünmekteyiz. Böylece makrolidlere direnç gösteren pnömokoklar›n neden oldu¤u enfeksiyonlar›n bir k›sm›nda linkozamid grubu antibiyotiklerin kullan›m flans› olabilecektir.
TEfiEKKÜR
Bu çal›flma, Marmara Üniversitesi Bilimsel Araflt›rma Projeleri Komisyonu taraf›ndan des-teklenmifltir. (Proje No: SAG-C-YLP-211009-0308, 2009).
‹letiflim / Correspondence
Ufuk Hasdemir
Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Haydarpafla Kampusü, T›bbiye Cad, 34668 Kad›köy-‹stanbul ‹fl Tel: 0216 414 4732 Cep Tel: 0533 351 8076 Faks: 0216 414 4732 e-posta:ufukhasdemir@marmara.edu.tr Kaynaklar
1. Musher, DM. Streptococcus pneumoniae. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Mandell, Douglass and Bennett' s Principles and Practice of Infectious Diseases. New York: John Wiley & Sons, 2004:2392-2411. 2. Linares J, Ardanuy C, Pallares R, Fenoll A. Changes in
antimicrobial resistance, serotypes and genotypes in Streptococcus pneumoniae over a 30-year period. Clin Microbiol Infect 2010; 16:402-10.
3. Farrell DJ, Couturier C, Hryniewicz W. Distribution and antibacterial susceptibility of macrolide resistance genotypes in Streptococcus pneumoniae: PROTEKT year 5 (2003–2004). Int J Antimicrob Agents 2008; 31:245–9.
4. The European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) Annual Report. 2007 [http://www. rivm.nl/earss/result/Monitoring_reports/Annual_reports. Jsp]
5. The European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) Annual Report. 2008 [http://www.rivm. nl/earss/result/Monitoring_reports/Annual_reports. Jsp].
6. Varaldo PE, Montanari MP, Giovanetti E. Genetic elements responsible for erythromycin resistance in streptococci. AAC 2009; 53:343-53.
7. Leclercq R, Courvalin P. Resistance to macrolides and related antibiotics in Streptococcus pneumoniae. AAC 2002; 46: 2727-34.
8. Camilli R, Del Grosso M, Iannelli F, Pantosti A. New genetic element carrying the erythromycin resistance determinant erm(TR) in Streptococcus pneumoniae: insertion sites and association with other genetic elements. AAC 2008; 52:619–25.
9. Sener B, Köseoglu O, Gür D, Bryskier A. Mechanisms of macrolide resistance in clinical pneumococcal isolates in a university hospital, Ankara, Turkey. J Chemother 2005; 17:31-5.
10. Gür D, Mülaz›mo¤lu L, Ünal S. In vitro susceptibility of respiratory isolates of Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes to telithromycin and 11 other antimicrobial agents: Turkish results of e-BASKETT II Surveillance Study. Mikrobiyol Bült 2007; 41:1-9.
11. Gülay Z, Özbek ÖA, Biçmen M, Gür D. Macrolide resistance determinants in erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae in Turkey. Jpn J Infect Dis 2008; 61:490-3.
12. Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin Infect Dis 2002; 34:482–92.
13. Hasdemir U. Çoklu ilaç direncinde bakteri hücre duvar› organizasyonunun ve aktif pompa sistemlerinin rolü. Mikrobiyol Bült 2007; 41: 309-27.
14. Lynch III JP, Martinez FJ. Clinical relevance of macrolide -resistant Streptococcus pneumoniae for community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2002; 34 (Suppl 1): S27-S46.
15. Daly MM, Doktor S, Flamm R, Shortridge D. Characterization and prevalence of MefA, MefE, and the associated msr(D) gene in Streptococcus pneumoniae clinical isolates. J Clin Microbiol 2004; 42:3570-4.
16. Streptococci and related genera. In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM, eds. Bailey and Scotts Diagnostic Microbiology. 9th ed. St Louis MO: Mosby, 1994; 333–52.
17. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 16th informational supplement: M100-S19. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2009.
18. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: approved Standard. 7th ed. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006.
19. Amezaga MR., Carter PE, Cash P, McKenzie H. Molecular epidemiology of erythromycin resistance in Streptococcus pneumoniae isolates from blood and noninvasive sites. J Clin Microbiol 2002; 40:3313–8. 20. Seppälä H, Skurnik M, Soini H, Roberts MC, Huovinen
P. A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes. AAC 1998; 42:257-62.
21. Clancy J, Petitpas J, Dib-Hajj F, et al. Molecular cloning and functional analysis of a novel macrolide-resistance determinant, mefA, from Streptococcus pyogenes. Mol Microbiol 1996; 22:867-79.
22. Tait-Kamradt A, Clancy J, Cronan M, et al. mefE is necessary for the erythromycin-resistant M phenotype in Streptococcus pneumoniae. AAC 1997; 41:2251-5. 23. Reinert RR, Lütticken R, Bryskier A, Al-Lahham A.
Macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes in the pediatric population in Germany. AAC 2003; 47:489-93.
24. Kataja J, Huovinen P, Seppala H. Erythromycin resistance genes in group A streptococci of different geographical origins. J Clin Microbiol 2000; 46:789-92. 25. Sa¤›ro¤lu P. Klinik Streptococcus pneumoniae izolatlar›nda makrolid direnç mekanizmalar›n›n araflt›r›lmas› [uzmanl›k]. ‹stanbul: Marmara Üniversitesi, 2009.
26. Klaassen CH, Mouton JW. Molecular detection of the macrolide efflux gene: to discriminate or not to discriminate between mef(A) and mef(E). AAC 2005; 49:1271-8.
