Os experimentos realizados consideram a execução de uma etapa de interpolação, que possui a função de converter o formato dos voxels, que inicialmente apresentam aspecto anisotrópico, para um formato próximo de cubos perfeitos. Outra característica importante do processo de interpolação é reduzir a resolução das imagens e, consequentemente, demandar menor poder computacional, possibilitando a geração e o processamento das superfícies poligonais em tempo satisfatório apesar do alto custo computacional dos algoritmos. Testou- se a influencia das etapas de pré-processamento sobre as imagens 3D.
Primeiramente, testaram-se diferentes algoritmos de interpolação em uma imagem 3D gerada artificialmente: (A) baseada em vizinhos mais próximos; (B) interpolação tri-linear, e (C) tri-cúbico. A imagem artificial possui 81×81×81 pixels nos eixos X-Y-Z e foi subamostrada ao longo do eixo Z por um fator de 6×, ou seja, os voxels são 6 vezes maior ao longo do eixo Z do que ao longo de X-Y. A Figura 4.21 mostra os resultados dos três tipos de interpolação em todas as seis imagens.
Na sequência, selecionou-se por inspeção visual nas imagens da Figura 4.21, o algoritmo de interpolação tri-cúbica que resultou uma imagem mais suave e nítida. O resultado da interpolação por Spline resultou em alguns artefatos próximos de Z=0, além de apresentar maior custo computacional. Dessa forma o método de reamostragem pelo algoritmo de interpolação tri-cúbica foi aplicado sobre as imagens volumétricas resultantes da filtragem por médias não locais no domínio de Anscombe, conforme descrito na Seção 4.7.1.
Figura 4.21: Teste realizado sobre uma imagem artificial, subamostrada ao longo do eixo Z, com o objetivo de definir o melhor algoritmo de interpolação a ser utilizado pelo método proposto. (A) Visão dos eixos X-Y. (B) Visão dos eixos Y-Z. (C) Visão dos eixos X-Z. (D)
Reconstrução das superfícies. (E) Sistema de coordenadas.
O sistema de coordenadas utilizado para representar as imagens volumétricas é mais bem compreendido quando se entende a sua relação com a aquisição das imagens 3D. Conforme descrito na Seção 3.2, utilizou-se um microscópio invertido para obtenção das imagens. Dessa forma, o espécime é posicionado acima das lentes objetivas. A luz de
transmissão é emitida de cima do espécime, atravessando-o e atingindo a lente objetiva, enquanto a luz de fluorescência é emitida a partir da própria lente, e a fluorescência emitida pelo espécime retorna para a lente objetiva. A Figura 4.22 ilustra a relação entre a cultura na MEA e o sistema de coordenadas definido pelo processo de aquisição. (A) Ilustração da visão lateral em que é possível observar a cultura depositada na MEA e a numeração das seções ópticas na imagem volumétrica adquirida. (B) Visão diagonal da MEA em que se observa a relação entre as coordenadas de X, Y e Z.
Figura 4.22: Relação entre o processo de aquisição das imagens volumétricas pelo microscópio confocal invertido e o sistema de coordenadas das imagens obtidas. (A) Visão lateral do processo de imageamento, em que se observam as coordenadas do eixo-Z. (B) Visão diagonal
em que pode se observar as relações entres as coordenadas X, Y e Z.
A Figura 4.23 ilustra os resultados das etapas de filtragem de ruído e de reamostragem por interpolação tri-cúbica aplicadas sobre a imagem volumétrica obtida da cultura MEA_02. (A) A imagem volumétrica original. (B) Após a aplicação da filtragem de ruído conforme descrito na Seção 4.7.1. (C) A imagem reamostrada, apresentando os voxel com aspecto cubico ao longo do eixo-Z. É importante observar que a resolução no eixo Z foi aumentada para a correção do efeito anisotrópico dos voxels, ao mesmo tempo em que a resolução nos eixos X-Y foi reduzida para possibilitar o processamento das superfícies poligonais em tempo real na próxima etapa do método. As imagens resultantes do processo de reamostragem por interpolação são submetidas a mais uma etapa de pré-processamento cujos resultados são mostrados na seção seguinte.
Figura 4.23: Resultado do processo de filtragem do ruído no domínio de Anscombe seguido da reamostragem da imagem por interpolação tri-cúbica aplicados sobre a imagem volumétrica da
cultura MEA_02. (A) Imagem volumétrica original. (B) Resultado da filtragem do ruído utilizando o filtro de médias não locais, no domínio de Anscombe, com pré-filtragem pelo filtro
da mediana. (C) Imagem reamostrada utilizando interpolação tri-cúbica. A imagem foi subamostrada por um fator de 4 nos eixos X e Y, e super-amostrada no eixo-Z para apresentar
aspecto isotrópico. A coluna da esquerda mostra a visão dos eixos X-Y da seção óptica central (4 para A e B e 8 para C). A coluna da direita mostra seções transversais (X-Z) em diferentes
valores de Y. Os quadros em vermelho mostram detalhes de cada imagem. 4.7.3 Pré-processamento das Imagens Volumétricas
A Figura 4.24 mostram as imagens resultantes da sequencia de etapas que compõe o pré-processamento das imagens volumétricas após a interpolação para as imagens da cultura MEA_02. As etapas são descritas em detalhes na Seção 3.6.3, sendo elas: (A) filtragem pela mediana 3D e reconstrução morfológica (em níveis de cinza) para preenchimento de buracos no interior dos objetos; (B) remoção do fundo da imagem por meio da subtração, em cada seção óptica, da imagem resultante da segmentação 2D; (C) Correção da oclusão de neurônios pelos microeletrodos e trilhas; (E) separação de agrupamentos de neurônios subtraindo-se o SKIZ da imagem resultante da segmentação 2D de todas as seções ópticas.
Figura 4.24: Sequencia de operações da etapa de pré-processamento das imagens da cultura MEA_02. A coluna da esquerda mostra a visão da seção óptica central (8) visto a partir de X-Y.
A coluna da direita mostra 15 seções obtidas ao longo do eixo Y a partir de X-Z. (A) Imagem original, resultante do processo de interpolação. (B) resultado da filtragem pela mediana 3D e
do preenchimento de buracos. (C) Correção da oclusão dos neurônios pelos microeletrodos e trilhas, seguida pela supressão do fundo. (D) Ilustração do processo de supressão do fundo e
separação de agrupamentos de neurônios. As regiões em cinza são o fundo da imagem resultante do método de segmentação 2D e as regiões em branco são o SKIZ. (E) Resultado da
subtração do fundo e do SKIZ da imagem segmentada. Esta imagem será submetida à reconstrução das superfícies tridimensionais.
Estas imagens volumétricas são utilizadas como entrada para a etapa seguinte, em que são geradas superfícies poligonais. Na sequencia as superfícies são submetidas ao processamento para computação de medidas quantitativas 3D.