O conjunto de imagens utilizadas nos experimentos é composto por imagens volumétricas (3D) com o objetivo de possibilitar experimentos relacionados aos métodos de
visualização e análise quantitativa 3D, descritos na Seção 3.6 e na Seção 3.7. Dessa forma, para a aplicação do método de identificação de microeletrodos foi necessário converter as imagens do canal de luz de transmissão para uma representação 2D por meio da operação de Projeção de Intensidades Mínimas (MinIP) (ver Seção 2.4.1.4).
Os parâmetros KENEL_SIZEE e SE_BOTHATE são utilizados na etapa de pré- processamento das imagens do canal de luz de transmissão antes de aplicar a transformada de Hough circular. O parâmetro KERNEL_SIZEE é para a filtragem da mediana. A filtragem botton-hat corrige a não homogeneidade do fundo da imagem destacando as estruturas que casam com um elemento estruturante em forma de disco com diâmetro SE_BOTHATE. Para evitar a detecção de falso-positivos e reduzir o custo computacional, apenas estruturas circulares com medida de raio entre os parâmetros MIN_RAD e MAX_RAD são consideradas. Esses parâmetros são estimados de acordo com o conhecimento a priori das dimensões dos microeletrodos da MEA. As MEAs consideradas para os experimentos são do tipo MEA-60 da Multichannel Systems (Seção 3.2) e possuem microelétrodos com 30 µm de diâmetro. O parâmetro MIN_RAD foi definido em 15 µm e o parâmetro MAX_RAD em 25 µm porque os objetos aparecem um pouco maiores na imagem devido ao borramento inserido pelo processo de imageamento. O parâmetro SE_BOTHATE foi definido como o diâmetro de um círculo de raio MAX_RAD × NE. Os valores dos parâmetros, em pixels, são obtidos por meio da divisão dos valores reais (em µm) pela dimensão lateral do pixel. Os demais parâmetros considerados pelo plug-in do Peng são GRDTHRES, FLTR e MULTIRAD. O parâmetro GRDTHRES controla a limiarização na imagem da magnitude do campo vetorial após a construção do acumulador. Valores grandes do parâmetro FLTRLM_4 permitem detectar círculos menos perfeitos. O parâmetro MULTIRAD define a tolerância com que o método detecta círculos concêntricos, fixado como 1,0 para todas as imagens, de forma que nenhum circulo concêntrico seja localizado.
A imagem na Figura 4.7 mostram os resultados das principais etapas do método de identificação dos microeletrodos para as imagens relativas aos quadrantes ’11, ‘18’, ‘81’ e’88’ obtidas das culturas MEA02 e MEA13 respectivamente. (A) As imagens originais do canal de transmissão (visualizada por MinIP). (B) Pré-processamento das imagens. Notem como as estruturas que representam os microeletrodos são realçadas em relação às imagens originais devido à transformada botton-hat. (C) Identificação dos microeletrodos por meio da transformada de Hough circular. (D) Computação da triangulação de Delaunay e identificação dos triângulos compostos por algum vértice errado. (E) Após a primeira rodada de remoção dos microeletrodos identificados erroneamente (critério #1 – perímetro). (F) Após a segunda
etapa de remoção dos microeletrodos identificados erroneamente (critério #2 – ângulo reto). (G) Correção dos microeletrodos não identificados e correção de pequenas variações no posicionamento dos demais microeletrodos por meio de regressão linear. As linhas horizontais e verticais são obtidas por meio da regressão linear dos microeletrodos remanescentes. Os marcadores ‘×’ representam onde foram incluídos microeletrodos não identificados. (H) Identificação final dos microeletrodos após correção utilizando triangulação de Delaunay. (I) Imagem binaria contando cujos objetos represaram os microeletrodos identificador. Esta imagem utilizada para o método de registro de imagens e para as análises quantitativas 2D e 3D.
Figura 4.7: Resultado das etapas de identificação automática de microeletrodos nas imagens do canal de luz de transmissão. Cada linha mostra os resultados para as imagens de cada um dos quadrantes da cultura MEA_02. (A) Imagem original (MinIP). (B) Imagem pré-processada. (C)
Microeletrodos identificados por meio da transformada de Hough circular. (D) Triangulação de Delaunay dos microeletrodos identificados para detecção automática de erros. (E) Após remover microeletrodos falso-positivos de acordo com o critério de perímetro (vermelho). (F) Após remover microeletrodos falso-positivos que não respeitam o critério de ângulo reto. (G) Grade construída por regressão linear para identificar microeletrodos falso negativos. (H)
Resultado da correção automática. (I) Imagem final com os microeletrodos identificados.
A Tabela 4.2 descreve os parâmetros utilizados para obter estes resultados, bem como os valores de validação relacionados à eficiência do método para cada uma das imagens. Pode-se observar que o método proposto foi capaz de identificar corretamente todos os eletrodos presentes em todas as imagens exceto pelas imagens 11 e 18 da cultura MEA_11. A presença de alta quantidade de neuroglia e artefatos torna o fundo destas imagens muito sujo, dificultando a identificação dos limites entre fundo e objetos. Em imagens com fundo homogêneo (e mais claro) valores para KERNEL_SIZEE=5 e NE=5 resultam em bons
resultados (MEA_01, MEA02, MEA04 e MEA05), já para imagens com fundo mais escuro e menos homogêneo foi necessário definir KERNEL_SIZEE=3 (MEA_11 e MEA_13). O parâmetro FLTR deve ser definido empiricamente, entretendo esta é uma tarefa fácil visto que o usuário/pesquisador pode facilmente visualizar quando um microelétrodo é identificado corretamente ou não. Note que é mais importante minimizar o numero de microeletrodos não identificados (falsos negativos) em detrimento de maximizar os microeletrodos identificados erroneamente, uma vez que é mais fácil remover microeletrodos do que inserir novos por meio do processo de correção automatizado. Para possibilitar a continuidade aos experimentos os microeletrodos não identificados na MEA_11 foram inseridos manualmente.
Tabela 4.2: Valores dos parâmetros e efetividade dos passos do método utilizado para a identificação dos microeletrodos para cada quadrante (QUAD) das culturas imageadas. REF é
o número real de microeletrodos em cada quadrante. CORR é o número de microeletrodos identificados corretamente, FP é o número de falso-positivos e FN é o número de falso-
negativos.
MEA DISH Q UAD REF KERNEl_SIZEE NE FLTR CO RR HO UGH FP FN CO RR DELAUNAY FP FN
MEA_01 11 15 5 5 4 15 0 0 15 0 0 18 14 5 5 4 14 3 0 14 0 0 81 15 5 5 4 15 1 0 15 0 0 88 15 5 5 4 15 3 0 15 0 0 MEA_02 11 15 5 5 6 15 3 0 15 0 0 18 14 5 5 6 14 6 0 14 0 0 81 15 5 5 6 15 3 0 15 0 0 88 15 5 5 5 14 8 1 15 0 0 MEA_04 11 15 5 5 5 13 2 2 15 0 0 18 14 5 5 5 14 2 0 14 0 0 81 15 5 5 5 13 4 2 15 0 0 88 15 5 5 5 15 4 0 15 0 0 MEA_05 11 15 5 5 5 14 2 1 15 0 0 18 14 5 5 5 13 6 1 14 0 0 81 15 5 5 5 14 3 1 15 0 0 88 15 5 5 5 15 2 0 15 0 0 MEA_11 11 15 3 5 13 6 5 4 9 0 6 18 14 3 5 13 13 12 1 13 0 1 81 15 3 5 13 15 16 0 15 0 0 88 15 3 5 13 13 22 2 15 0 0 MEA_13 11 15 3 5 12 15 7 0 15 0 0 18 14 3 5 12 13 5 1 14 0 0 81 15 3 5 11 15 0 0 15 0 0 88 15 3 5 11 15 2 0 15 0 0
Os resultados obtidos por este método (itens (I) na Figura 4.7) são utilizados para gerar os resultados descritos nas seguintes etapas: registro das imagens (Seção 4.4); análise quantitativa 2D (Seção 4.6); visualização 3D (Seção 4.7) e análise quantitativa 3D (Seção 4.8).