GEREÇ ve YÖNTEM

Bu çalışmada, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurul Başkanlığından yerel etik kurul onayı alındı (31 Mayıs 2010 tarih ve 2010/10

sayılı). Denekler etik kurul onayında belirtilen şartlara uygun olarak Dicle üniversitesi Tıp Fakültesi bünyesindeki Prof. Dr. Selahattin Payzın Deneysel Araştırma Merkezinden (DÜSAM) elde edildi Çalışmaya 30 adet erkek, 250-300 gr ağırlığında, izogenetik (inbret) Sprague-Dawley albino sıçan dahil edildi. Sıçanlar standart toplu kafeslerde barındırıldı. Sıçanlar standart yem ve su ile beslendi. Çalışma süresince, oda ısısı yaklaşık 21 ’ de sabit tutuldu. Laboratuar ışıklandırması 12 saat gündüz ve 12 saat gece olacak şekilde ayarlandı. Odanın nem derecesi % 45 10 düzeyinde sabit tutuldu. Tüm prosedürler tek cerrah tarafından uygulandı.

Deney planı

Sıçanlar randomizasyon listesine göre seçilerek her bir grup 10 sıçandan oluşacak şekilde üç grup oluşturuldu. Grup I herhangi bir İ/R ve ilaç uygulaması yapılmayan grup (sham grubu), grup II İ/R ve 1cc kuyruk veni kanülizasyonu ile intravenöz izotonik uygulanan grup (İ/R, kontrol grubu), grup III İ/R ve 5 mg/kg kuyruk veni kanülizasyonu ile intravenöz infüzyon ile propofol (Propofol % 1, Fresenius Kabi AB, Germany) uygulanan grup (İ/R, Propofol), şeklinde planlandı. Tüm sıçanlarda anestezi için 75 mg/kg ketamin (Ketalar flakon; Pfizer Ltd Şti, İstanbul, Türkiye) ve 10 mg/kg xylazine (Rompun flakon, Bayer Inc, Almanya) intramusküler uygulandı. Tüm sıçanların abdominal bölgeleri tıraşlandıktan sonra %10’luk povidon iyodin solüsyonu (Batticon, Adeka İlaç Ltd Şti., Samsun, Türkiye) ile dezenfekte edildi.

Anestezi süresince oluşabilecek hipotermiden korunmak amacıyla tüm sıçanlar masa lambası ile ısıtıldı. Ameliyat öncesi karın ön duvarı orta hattından laterale doğru 3cm genişliğindeki alan yüzeyel inferior epigastrik damarların medial dallarını korumak amacıyla sağlam bırakılacak şekilde planlama yapıldı. Uyluk iç yanından yapılacak olan insizyon işaretlendi. Flep korunan alanın dış tarafındaki karın bölgesinde 3x6 cm. alanda planlandı.

Grup I (Sham grubu)

Bu gruptaki 10 rata cerrahi işlem uygulanmadan önce sol uyluk bölgesine oksijen saturasyon probu, kuyruk bölgesine sistolik arter basıncını ve kalp atım sayısını ölçmek için proplarlar yerleştirildi ve ölçümler yapıldı. 6x3 cm abdominal

edildi, 2 saat sonra tekrar parsiyel oksijen satürasyonu, sistolik arter basıncı ve kalp atım sayısı ölçülerek kayıt edildi. Flep kaldırıldıktan 7 gün sonra yaşayan flep alanı transparan asetat üzerinde 1mm2_{’lik bölümler çizilerek belirlendi. 14.}

gün doku biyopsisi ve intrakardiak kan örnekleri alındı. Doku örnekleri histopatolojik çalışma için formaldehit solüsyonunda, kan örnekleri biyokimyasal çalısma için -40 °C de saklandı.

Grup II (İ/R, Kontrol grubu)

Bu gruptaki 10 rata cerrahi işlem uygulanmadan önce sol uyluk bölgesine oksijen saturasyon probu, kuyruk bölgesine sistolik arter basıncını ve kalp atım saysını ölçmek için problarlar yerleştirildi ve ölçümler yapıldı. 6x3 cm abdominal epigastrik flep kaldırıldıktan sonra pedikül korunarak inferior epigastrik artere klemp yardımı ile 2saat iskemi yapıldı. Flep 3/0 ipekle yerine sütüre edildi, 2 saat sonra kuyruk veni kanülizasyonu yapılarak intravenöz olarak 1cc izotonik enjeksiyonu sonrası tekrar parsiyel oksijen satürasyonu, sistolik arter basıncı ve kalp atım sayısı ölçülerek farklılıklar kaydedildi. Flep kaldırıldıktan 7 gün sonra yaşayan flep alanı transparan asetat üzerinde 1mm2_{’lik bölümler çizilerek}

belirlendi. 14. gün doku biyopsisi ve intrakardiak kan örnekleri alındı. Doku örnekleri histopatolojik çalışma için formaldehit solüsyonunda, kan örnekleri biyokimyasal çalısma için -40 °C de saklandı.

Grup III ( İ/R, Propofol grubu)

Bu gruptaki 10 rata cerrahi işlem uygulanmadan önce sol uyluk bölgesine oksijen saturasyon probu, kuyruk bölgesine sistolik arter basıncını ve kalp atım sayısını ölçmek için problarlar yerleştirildi ve ölçümler yapıldı. 6x3 cm abdominal epigastrik flep kaldırıldıktan sonra pedikül korunarak inferior epigastrik artere klemp yardımı ile 2saat iskemi yapıldı. Flep 3/0 ipekle yerine sütüre edildi, 2 saat sonra kuyruk veni kateterizasyonu ile intravenöz infüzyon ile 5mg/kg propofol (Propofol % 1, Fresenius Kabi AB, Germany) enjeksiyonu sonrası tekrar parsiyel oksijen satürasyonu, sistolik arter basıncı ve kalp atım sayısı ölçülerek farklılıklar kaydedildi. Flep kaldırıldıktan 7 gün sonra yaşayan flep alanı transparan asetat üzerinde 1mm2_{’lik bölümler çizilerek belirlendi. 14. gün doku biyopsisi ve}

formaldehit solüsyonunda, kan örnekleri biyokimyasal çalışma için -40 °C de saklandı.

İşlemler/gruplar Grup1(sham) Grup2(kontrol) Grup3(propofol)

Flep elevasyonu

+ + +

İskemi (2 saat) _ + +

Tedavi _ 1 cc izotonik 5 mg/kg propofol

Flep canlılığı (7.gün) + + + Biyopsi alımı (14.gün) + + +

Tablo1:gruplara uygulanan işlemler

Flep modeli

Rat uygun pozisyonda tespit edildi. 6x3 cm’lik flep sınırlarının çiziminden sonra üst, medial ve lateral flep sınırları karın duvarı kaslarına kadar pannikulus karnosus’u da dahil ederek kesildi, diseke edildi. Flep içinde dağılan damarlar ve pedikül flebin alt yüzünde görüldü, pedikül ve lateralde yağlı doku içindeki dallarının yaralanması engellendi. Alt sınır kesisi pedikülü güvenceye almak için,

kasık yağ yastığı flepte bırakılarak kontrollü şekilde inferior epigastrik arter iskeletize edildi ve flep eleve edildi.

Resim1: Ratın pozisyonu Flepler 6x3 cm olacak şekilde planlandı.

Resim2: flebin eni 3cm Resim3:flebin boyu 6cm

Cerrahi işlem öncesi hemodinamik parametrelerin ölçümü için daha önceden tıraşlanan sol uyluk bölgesine pediatrik tipte saturasyon probu yerleştirilerek monitörize edildi. Ratın kuyruk kısmına ise sistolik arter basıncı ve kalp atım sayısını ölçmek için problar yerleştirildi.

Flep uygun şekilde diseke edilerek inferior epigastrik arter dallanma noktaları ortaya kondu. Pedikül tamamen iskeletize edildikten sonra klemp yardımı ile 2 saat iskemi uygulandı.

Resim6: pedikülü ve pedikülün klemplenmesi

Resim7:postop görüntü

2 saatlik iskemi sonrası 2 saat reperfüzyon yapıldı. kuyruk veni kanülasyonu yapılan ratlara (i.v) çok yavaş infüzyon şeklinde 5mg/kg propofol uygulandıktan

sonra ratların tekrar kalp atım sayıları, sistolik arter basınçları ve oksijen saturasyonları ölçülerek kayıt altına alındı.

Resim8: postop kalp atım sayısı, arteriyel basınç ve satürasyon ölçümü

Kalp atım sayısı ve sistolik arteriyel basınç MAY BPHR 9610 Blood pressure and heart rate recorder system ile ölçülerek kayıt altına alındı. Satürasyon PETAŞ

Resim9: hemodinamik parametre ölçüm cihazları

Flep Canlılık Oranlarının Belirlenmesi:

Yedinci gün fleplerde nekrotik ve canlı alanların belirginleştiği görüldü. 1mm2 _{‘ lik alanlar şeklinde çizilen transparan asetat üzerine canlı ve nekrotik}

nekrotik alan total flep alanına bölünerek yüzde olarak ve mm2 _{olarak fleplerde}

sağkalım oranı hesaplandı.

Kalp atım sayısı, arteriyel basıç ve parsiyel oksijen basıncı ölçümü:

Cerrahi işlem öncesi ve reperfüzyon sonrası ikinci saatte MAY BPHR 9610

Blood pressure and heart rate recorder system probları ratların kuyruklarına takılarak kalp atım sayısı ve sistolik arter basınçları ölçüldü. Parsiyel oksijen basınçlarının ölçümü için sol inguinal bölge traşlandı, PETAŞ marka monitör ve pediatrik satürasyon probu kullanılarak satürasyon değişiklileri kayıt edildi.

Biyokimyasal ölçümler:

Biyokimyasal analizler için dokular ph 7.0’de 2 ml fosfat tamponu ile homojenize edildi. 4000 rpm’de santrifüj edildikten sonra süpernat’tan 0,5 ml alındı, 4,5 ml fosfat tamponu ile seyreltildi ve biyokimyasal analizler yapıldı.

Malondialdehit (MDA) doku düzeyi ölçümü:

Dokuda malondialdehid (MDA) ölçümü Ohkawa metoduna uygun olarak MDA’ nın tiyobütirik asit ile oluşturduğu renğin ölçülmesi yoluyla belirlendi. Epigastrik ada flebi dokusunun homojenatları 10 volüm 0.15M KCl tamponadında Ultra-Turrax homojeneri ile hazırlandı. 5000 rpm’ deki santrifüjden sonra elde edilen 0,4 ml doku süpernatantının üzerine 0,2 ml % 8‘ lik sodyum dodesil sülfat, 1,5 ml % 20’lik asetik asit ve 1.5ml % 8’lik tiyobarbitürik asit eklendi. Karışım 60 dakika inkübe edildi. Üzerine 1ml distile su eklendikten sonra 4000 rpm’ de 10 dakika santrifüj edildi ve süpernatantın absorbansı 532 nm’ de köre karşı okundu. Standart olarak 1,1,3,3-tetraetoksipropan kullanılarak hesaplanan MDA düzeyleri nmol/mg protein ve umol/L olarak ifade edildi.

Total antioksidan kapasite Erel yöntemi ile ölçüldü. Bu ölçüm yönteminde 2,2 ´- azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6- sülfonik asit) radikali (ABTS radikali) kullanılmaktadır. ABTS radikali, antioksidan konsanrasyonuna ve antioksidan kapasiteye göre mavi ve yeşil rengini kaybetmektedir. Bu renk değişikliği, absorbans değeri 660 nm’de ölçülerek değerlendirme yapılmaktadır. Bu ölçüm metodunun prensibi hidrojen peroksit varlığında ABTS molekülünün

molekülüne okside olmasına dayanmaktadır. 30 mmol/L asetat tamponu ve pH: 3.6’da koyu yeşil renkte olan radikalin, asetat tamponu 0.4 mol/L, pH: 5.8 olduğunda rengi açılmaktadır. Renk değişimi ile örnek içindeki antioksidan miktarı arasında ters ilişki bulunmaktadır. Reaksiyon hızı standart yöntem olan Trolox ile kalibre edilmektedir. Sonuçlar trolox equiv./L olarak belirlendi.

Öncelikle reaktifler hazırlandı. Birinci reaktif 32,8 gr CH3COONa’nın 1000 ml distile su içinde eritilmesi ile 0.4 mol/L asetat tampon solüsyonu (pH: 5.8 olacak şekilde) oluşturuldu. 22.8 ml asetik asit, 1000 ml su ile seyreltilerek, 0.4 mol/L konsantrasyona getirildi. 940 ml sodyum asetat solüsyonu ile 60 ml asetik asit solüsyonu karıştırıldı. İkinci reaktif ise 2.46 gr CH3COONa, 1000 ml distile suda eritilerek 30 mmol/L asetat tampon solüsyonu (pH: 3.6) hazırlandı. 1.705 ml Asetik asit 1000 ml distile su ile seyreltilerek, 30 mmol/L konsantrasyonda karışım elde edildi. 75 ml sodyum asetat solüsyonu, 925 ml asetik asit solüsyonu ile karıştırıldı. pH:3.6 olacak şekilde ayarlandı. Sonra 278 μl H2O2 solüsyonu, 1000 ml tampon solüsyonu ile seyreltilerek 2 mmol/L konsantrasyona getirildi. Daha sonra 0.549 gr ABTS radikali, 100 ml hazırlanan solüsyonda eritilerek 10 mmol/L konsantrasyona getirildi. Bir saat oda ısısında bekletildi ve karakteristik ABTS renginin oluşması sağlandı. Spektrofotometrik ayarlardan sonra Aeroset otomatik analizatöre (Abott Aeroset® C8000™ cihazına) uygulandı.

Erel tarafından geliştirilen tam otomatik kalorimetrik bir yöntemdir. 140 mM’lık NaCI çözeltisi içerisine 25 mM H2SO4 çözülerek ana solüsyon hazırlandı. Birinci reaktifte ana solüsyonda önce % 10 oranında gliserol çözülüp daha sonra total volümde 250 μM Xlenol orange çözülerek hazırlandı. Ana solüsyon içerisine önce 10 mM o-Dianisidine dihidrocloride çözülüp sonra 5 mM amonyom ferröz sülfat çözülerek ikinci reaktif hazırlandı. Örnekte bulunan oksidanlar ferröz iyon-o-dianisidine kompleksini ferrik iyona oksitlerler. Ortamda bulunan gliserol bu reaksiyonu hızlandırarak yaklaşık üç katına çıkarmaktadır. Ferrik iyonlar asidik ortamda xylenol orange ile renkli bir kompleks oluştururlar. Örnekte bulunan oksidanların miktarıyla ilişkili olan rengin şiddeti spektrofotometrik olarak ölçüldür. Sonuçlar μmol H2O2 Eqv. / L olarak belirlendi.

Süperoksit Dismutaz (SOD) doku düzeyi ölçümü

SOD enzim aktivitesi Sun ve arkadaşlarının modifiye ettiği spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Bu metodun prensibi nitroblue tetrazolium (NBT)’ un süperoksit üreticisi olan ksantin-ksantin oksidaz sistemi tarafında indirgenmesi esasına dayanmaktadır. Süperoksit dismutaz aktivitesi ünite/mg doku proteini olarak ifade edildi.

Reaktifler

- 3mmol/L stok ksantin çözeltisi

- 0.6 mol/L EDTA

- 150 mmol/L NBT (nitroblue tetrazolium) - 400 mmol/L Na2CO3

- 1 g/L BSA (sığır serum albumini) - O.8 mmol/L CuCl2

Distile su ile %10 (w/v) homojenize edilen doku 5.000 g’de 30 dakika +4ºC’ de santrifüj edilip süpernatan alındı. 500 μl kloroform etanol çözeltisi üzerine süpernatandan 500 μl eklenip, vortekslendi. Daha sonra 5.000 g’de 2 saat +4°C’de santrifüj edilip süpernatan alındı. Reaktif karışımı hazırlandıktan sonra, 100 μl süpernatan 2.85 μl reaktif karışımı ve 50 μl ksantin oksidaz enzim çözeltisi eklendikten sonra karışım vortekslendi. Oda sıcaklığında (25°C) 20 dakika inkübasyondan sonra üzerine 1 ml CuCl2 eklenerek 560 nm dalga boyunda spektrofotometrik ölçüm yapıldı.

% inhibisyon= Kör Absorbansı- Numune Absorbansı x 100 Kör Absorbansı % 50 inhibisyonu 1 Ü aktivitenin sağladığı düşünülerek hesaplandı. Süpernatandan da Lowry metodu ile protein tayini yapılarak süperoksit dismutaz aktivitesi Ü/mg protein olarak verildi.

Paroksonaz (PON ) doku düzeyi ölçümü

Paroksonaz enziminin substratı olan paraoksonu hidrolizi sonucu oluşan p- nitrofenolün dakikada oluşturduğu absorbans artışının 25°C’ lik ortam ısısında ve 405 nm’de spektrofotometrik olarak ölçümü ile enzim aktivitesi saptanır. Kas doku örnekleri eritildikten sonra 10 μL serum içerisinde 2mM CaCl2 ve 1 mM paraokson bulunan 50 mM Tris-HCl asit tamponu (PH:8) ile 1 ml’ ye tamamlanıp homojenize edildi ve homojenatlar 10.000 g’de 15 dakika süreyle santrifüje edildi. Sonra süpernatantlar PON ölçümlerine mani olan tip B esterazları engellemek için 10 M paraokson varlığında 15 dakika süreyle inkübe edildi. Köre sadece 1 mM CaCl2 ve 1 mM paraokson bulunan Tris-HCl asit tamponu (PH:8, 50 mM) kondu. P-nitrofenolün meydana getirdiği absorbans artışı 30 sn aralarla 25°C’ lik ortam ısında ve 405 nm’ de kaydedildi. P-nitrofenol miktarı,

17000 (PH:8) molar ekstinksiyon katsayısı kullanılarak hesaplandı. 1

ünite paraoksonaz aktivitesi 1 dakikada 1 nmol p-nitrofenol oluşturuldu. Paraoksonaz aktivitesi U/L gr yaş doku olarak verildi.

Katalaz aktivitesi Aebi metoduna göre tayin edildi (100). Hidrojen peroksitin KAT tarafından yıkılması 240 nm dalga boyunda izlendi. Hazırlanmış olan 300 ml, 50 mM fosfat tamponu pH:7, renkli bir cam şişeye konuldu. Fosfat tamponu kuartz küvete konulup 240 nm dalga boyundaki okumada kör olarak kabul edildi. Renkli kaba konulan tampona % 18’lik hidrojen peroksit çözeltisinden her seferinde 10-20 μl eklendi, her eklemeden sonra karıştırılıp, kuartz küvete alınıp köre karşı okuması yapıldı ve absorbans 0.500 optik dansite oluncaya kadar bu işleme devam edildi. Hidrojen peroksitli tampon hazırlandıktan sonra KAT aktivitesine bakıldı Serum pipetlendikten hemen sonra kuartz küvetin ağzı kapatıldı ve alt üst edildi. H2O2’deki absorbans azalması 240 nm’de her 15 saniyede olmak üzere 5 dk. Boyunca izlenerek kaydedildi. Hesaplama 30 saniyelik lineer absorbans azalmasının en yüksek (OD1) ve en düşük (OD2) değerleri alınarak yapıldı. Formülde yerine konularak aktivite hesaplandı.

Hesaplama: k= 2,3xlog(OD1/OD2)/Δt(sn) Sonuçlar desilitre serum başına katal (k/dl) şeklinde ifade edildi.

Histopatolojik değerlendirmeler:

Ratlar çalışma sonrası 14. Günde intrakardiak kan alımı sonrası sakrafiye edidi. Biyopsiler flebin pediküle en yakın noktasından tüm ratlarda standart şekilde alındı. Patolojik değerlendirme için alınan doku biyopsi örnekleri % 10’luk formaldehit solüsyonuna alınarak 72 saat tespit için bekletildikten sonra rutin histopatolojik takipten geçirilerek H&E boyasıyla boyanıp uzman patolog tarafından değerlendirildi.

Alınan doku örnekleri, oda ısısında, %10’luk formalin solüsyonu içerisinde 72 saat tespit edildi. Tespit edilen dokular standart doku takip yönteminden geçirilerek hazırlanan parafin bloklardan mikrotomla lamlara 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Her denekten alınan 10 adet seri kesit histolopatolojik değerlendirmenin yapılabilmesi amacıyla hematoksilen-eozin ile boyandı. Dejeneratif bulguların değerlendirilmesi ardarda alınan seri kesitlerde, her kesitten gelişigüzel seçilen 5 ayrı alanda, her bir alan için 50 büyük büyütme alanında yapıldı. . Zemin boyası olarak Mayer’in Hemotoksilen’i kullanıldı. Bu şekilde

boyanan camlar ışık mikroskopta değerlendirildi. Oluşturulan kesitlerde 200’lük büyütmede ödem, inflamasyon, vaskülarizasyon, epitel rejenerasyonu ve fibrozis Yok(0), hafif(1), orta(2), belirgin(3) şeklinde katagorize edildi.

İstatistiksel Değerlendirme:

Bu çalışmada kullanılan değişkenlerin normal dağılım varsayımına uygunluğu Kolmogorov-Smirnow testi , homojenliği ise Levene testi ile araştırılmıştır. Parametrik veya non-parametrik test varsayımları göz önüne alınarak, Gruplararası ortalama farkların araştırılmasında, bağımlı gruplarda (paired ) Students’ t-testi, bagımsız gruplarda Kruskal-Wallis test, Mann-Whitney U, Varyans Analizi (Oneway Anova), çoklu karşılaştırmalarda (post hoc tests) Tukey Hsd ve sayılabilir ölçümlerin değerlendirmelerde ise chi-square istatistik test analizleri kullanılmıştır. Bütün istatistiksel analizlerde % 95 lik güven aralığı uygulanmış olup; tanımlayıcı istatistikler ve analizler Medcalc Version 10.1.6.0 Windows XP Bilgisayar paket programı kullanılarak yapılmıştır. istatistiksel sonuçlar p<0,05 için anlamlı kabul edilmiştir.